CN108707200B - 狭山野豌豆中多糖的制备方法 - Google Patents

狭山野豌豆中多糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及狭山野豌豆中多糖的制备方法。采用的技术方案是：取狭山野豌豆，以水为溶剂，料液比为1g:25mL，按狭山野豌豆的重量，加入5.0％的纤维素酶和2.5％的木瓜蛋白酶，调节pH值为6.0～6.5，提取温度为50℃，提取3次，每次提取时间为60min，得提取液。本发明，具有提取条件温和，提取时间短，提取效率高，便于分离纯化，安全无污染的优点，适于狭山野豌豆多糖的制备。

Description

狭山野豌豆中多糖的制备方法
技术领域
本发明属于中药提取领域，具体地涉及一种狭山野豌豆中药中多糖的制备方法。
背景技术
狭山野豌豆(V.amoenaFisch.var.angustaFreyn.)为豆科(Leguminosae)野豌豆属(Vicia L.)植物，主要分布在我国东北、华北、西北等地，其地上部分作为中药透骨草入药。2015年版《中国药典》一部中收载的中成药“坎离砂”、“养血荣筋丸”、“疏痛安涂膜剂”处方中均有透骨草，且四部附录(成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片)中收录了狭山野豌豆V.amoenaFisch.var.angustaFreyn.作为透骨草使用。
狭山野豌豆“味甘、性平”，“能补、能和、能缓”，属于补肝肾型祛风湿药，其祛风湿作用是通过调节免疫，进而补益肝肾，达到祛风湿的目的。狭山野豌豆中多糖成分是其免疫调节的活性部位之一，多糖通过调节免疫，发挥补益肝肾、祛风湿的功效。现有技术中，多糖的提取方法主要有水提法、酸碱提取法、酶提取法、超声波提取法和微波提取法，存在的问题是提取率低。所以，优化狭山野豌豆中多糖成分的提取和分离工艺，可以为狭山野豌豆这一东北丰富植物资源的开发与利用提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是建立狭山野豌豆多糖的制备方法。
本发明采用的技术方案是：狭山野豌豆中多糖的制备方法，包括如下步骤：取狭山野豌豆，以水为溶剂，加入酶，提取温度为50-100℃，提取1-3次，每次提取时间为30-90min，得提取液。
进一步的，上述的狭山野豌豆中多糖的制备方法，狭山野豌豆与水的料液比为1g:20-30mL。
进一步的，上述的狭山野豌豆中多糖的制备方法，所述的酶的加入量为狭山野豌豆重量的1-10％。
进一步的，上述的狭山野豌豆中多糖的制备方法，所述的酶为纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶和木聚糖酶的一种二种以上的混合。
进一步的，上述的狭山野豌豆中多糖的制备方法，所述的酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶的组合。
进一步的，上述的狭山野豌豆中多糖的制备方法，所述的纤维素酶的加入量为狭山野豌豆重量的4-6％，木瓜蛋白酶的加入量为狭山野豌豆重量的1-3％。
进一步的，上述的狭山野豌豆中多糖的制备方法，取狭山野豌豆，以水为溶剂，料液比为1g:25mL，按狭山野豌豆的重量，加入5.0％的纤维素酶和2.5％的木瓜蛋白酶，调节pH值为6.0～6.5，提取温度为50℃，提取3次，每次提取时间为60min，得提取液。
上述的狭山野豌豆中多糖的制备方法，包括纯化步骤：将提取液旋转蒸发得浓缩液，向其中加入无水乙醇，使体系中乙醇的体积百分浓度为90％，搅拌均匀，静置12-36h，3000r/min离心，收集沉淀。更进一步的，静置24h。
本发明的有益效果是：本发明的复合酶提取法提取狭山野豌豆多糖相比于其他方法，具有提取条件温和，提取时间短，提取效率高，便于分离纯化，安全无污染的优点，且酶具有高度的专一性和选择性，在实际应用过程中较少的加入量即可达到要求，适于狭山野豌豆多糖的制备。
附图说明
图1是水提法各因素水平效应曲面图。
具体实施方式
实施例1
(一)水提法正交设计试验
取狭山野豌豆干燥地上部分5g，共9份，以提取次数、提取时间、料液比三个因素进行正交设计试验，测定多糖含量，计算多糖提取率，对结果进行方差分析，确定最优提取条件。因素水平表见表1，L9(34)正交设计试验方案及结果分析见表2、表3、图1。
表1正交试验设计因素水平表
Figure BDA0001762456760000021
表2正交设计试验结果
Figure BDA0001762456760000022
Figure BDA0001762456760000031
表3方差分析表
Figure BDA0001762456760000032
影响水提法提取狭山野豌豆多糖的提取因素：提取次数(A)、提取时间(B)、料液比(C)中，提取次数(A)为显著影响因素。各因素各水平的趋势为：A3>A2>A1；B3>B2>B1；C3>C2>C1。通过以上结果及节约时间和能源等因素的角度综合考虑，将提取条件定为A3B2C2，即狭山野豌豆多糖最佳提取工艺条件为：提取次数：3次；提取时间：60min；料液比，1g:25mL。
(二)酶提取法对多糖提取率的影响
(1)果胶酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶对多糖的影响
为避免多糖含量测定结果出现假阳性现象，考察提取酶与多糖共存时，对多糖是否存在水解效应，本实验在多糖提取液中加入提取酶，并在提取酶各自最适条件下进行试验，测定多糖的含量变化。方法如下：
取狭山野豌豆干燥地上部分5g，按1g:25mL的料液比加入蒸馏水，100℃水浴回流提取3次，每次60min，收集提取液，浓缩，转移至100mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，得待测样品。
编号1：取25mL待测样品，向其中加入无水乙醇，使体系中的乙醇浓度达到90％，搅拌均匀，静置24h，离心(3000r/min)，沉淀部分挥干乙醇，加蒸馏水溶解，转移至50mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，测定多糖含量。
编号2：取25mL待测样品，加入狭山野豌豆干燥地上部分重量0.02％的果胶酶，调节pH值至4.0，50℃水浴加热60min，冷却至室温，向其中加入无水乙醇，使体系中的乙醇浓度达到90％，搅拌均匀，静置24h，离心(3000r/min)，沉淀部分挥干乙醇，加蒸馏水溶解，转移至50mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，测定多糖含量。
编号3：取25mL待测样品，加入狭山野豌豆干燥地上部分重量3.0％的木瓜蛋白酶，调节pH值至6.5，50℃水浴加热60min，冷却至室温，向其中加入无水乙醇，使体系中的乙醇浓度达到90％，搅拌均匀，静置24h，离心(3000r/min)，沉淀部分挥干乙醇，加蒸馏水溶解，转移至50mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，测定多糖含量。
编号4：取25mL待测样品，加入狭山野豌豆干燥地上部分重量5.0％的纤维素酶，调节pH值至5.0，50℃水浴加热60min，冷却至室温，向其中加入无水乙醇，使体系中的乙醇浓度达到90％，搅拌均匀，静置24h，离心(3000r/min)，沉淀部分挥干乙醇，加蒸馏水溶解，转移至50mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，测定多糖含量。
编号5：取25mL待测样品，加入狭山野豌豆干燥地上部分重量5.0％的木聚糖酶，调节pH值至5.0，50℃水浴加热60min，冷却至室温，向其中加入无水乙醇，使体系中的乙醇浓度达到90％，搅拌均匀，静置24h，离心(3000r/min)，沉淀部分挥干乙醇，加蒸馏水溶解，转移至50mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，测定多糖含量。结果如表4。
表4果胶酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶对多糖的影响试验结果
Figure BDA0001762456760000041
由表4可见，果胶酶在一定程度上对多糖有水解作用，而木瓜蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶对狭山野豌豆多糖几乎无水解作用。因此，选择木瓜蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶进一步考察提取酶用量等条件对多糖提取率的影响。
(2)酶提取条件单因素试验
取狭山野豌豆干燥地上部分5g，共5份，在pH值为6.5的条件下，以1g:25mL的料液比加入蒸馏水，按狭山野豌豆干燥地上部分的重量，分别加入1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的木瓜蛋白酶，50℃水浴加热60min，提取3次，计算多糖提取率。
取狭山野豌豆干燥地上部分5g，共5份，在pH值为5.0的条件下，以1g:25mL的料液比加入蒸馏水，按狭山野豌豆干燥地上部分的重量，分别加入3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％的纤维素酶，50℃水浴加热60min，提取3次，计算多糖提取率。
取狭山野豌豆干燥地上部分5g，共5份，在pH值为5.0的条件下，以1g:25mL的料液比加入蒸馏水，按狭山野豌豆干燥地上部分的重量，分别加入3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％的木聚糖酶，50℃水浴加热60min，提取3次，计算多糖提取率。
结果见表5、表6、表7。
表5木瓜蛋白酶用量对狭山野豌豆多糖提取率的影响
Figure BDA0001762456760000051
表6纤维素酶用量对狭山野豌豆多糖提取率的影响
Figure BDA0001762456760000052
表7木聚糖酶用量对狭山野豌豆多糖提取率的影响
Figure BDA0001762456760000053
Figure BDA0001762456760000061
通过单因素试验确定酶提取法提取狭山野豌豆多糖的提取率大小为：纤维素酶>木瓜蛋白酶>木聚糖酶，其中，木聚糖酶提取率最低，且在实验过程中发现木聚糖酶在水中溶解性较差，木瓜蛋白酶、纤维素酶在水中溶解性较好。因此，确定酶提取法提取狭山野豌豆多糖的最适提取酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶，最佳加入量分别为4.5％和2.0％。
(3)复合酶提取法
纤维素酶的最适温度为50℃、最适pH值为4.5-6.5，木瓜蛋白酶的最适温度为50℃、最适pH值为6.0-7.5，因此，在采用纤维素酶和木瓜蛋白酶复合提取狭山野豌豆多糖时，设定提取温度为50℃、pH值为6.0-6.5。
取狭山野豌豆干燥地上部分5g，共6份，分别放入250mL茄形瓶中，按1g:25mL的料液比加入蒸馏水，按狭山野豌豆干燥地上部分的重量，分别加入不同比例的木瓜蛋白酶和纤维素酶，调pH值至6.0-6.5。在50℃水浴中提取60min，收集提取液，浓缩，转移至100mL量瓶中，用蒸馏水定容，测定多糖含量，计算多糖提取率，结果见表8。
表8复合酶提取狭山野豌豆多糖试验结果
Figure BDA0001762456760000062
由表8中结果可知：当木瓜蛋白酶加入2.5％、纤维素酶加入5.0％时，狭山野豌豆多糖已基本被提取出来。
(4)提取次数考察
称取狭山野豌豆干燥地上部分5g，共3份，分别置于250mL茄形瓶中，加入125mL蒸馏水、2.5％木瓜蛋白酶和5.0％纤维素酶，调节pH值为6.0-6.5，分别在50℃水浴条件下提取1、2、3次，收集提取液，浓缩，转移至100mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，测定多糖含量，计算多糖提取率，结果见表9。
表9提取次数考察结果
Figure BDA0001762456760000071
由表9结果可知：当提取次数为3次时，狭山野豌豆多糖提取率最高。
综上所述，确定最佳提取工艺为：纤维素酶加入量5.0％；木瓜蛋白酶加入量2.5％；pH值：6.0～6.5；提取温度：50℃；提取时间：60min；料液比：1g:25mL；提取次数：3次。
(三)纯化步骤的优化
取狭山野豌豆干燥地上部分5g，置于250mL茄形瓶中，加入125mL体积的水，100℃水浴回流提取3次，每次60min，收集提取液，浓缩，转移至100mL量瓶中，加蒸馏水至刻度。
取25mL上述提取液，向其中加入无水乙醇，使体系中的乙醇浓度达到90％，搅拌均匀，静置12h，离心(3000r/min，25℃)，沉淀部分挥干乙醇，加蒸馏水溶解，转移至50mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
取25mL上述提取液，向其中加入无水乙醇，使体系中的乙醇浓度达到90％，搅拌均匀，静置24h，离心(3000r/min，25℃)，沉淀部分挥干乙醇，加蒸馏水溶解，转移至50mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
取25mL上述提取液，向其中加入无水乙醇，使体系中的乙醇浓度达到90％，搅拌均匀，静置36h，离心(3000r/min，25℃)，沉淀部分挥干乙醇，加蒸馏水溶解，转移至50mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
将上述三份样品分别测定多糖含量，结果见表10。
表10多糖纯化结果
Figure BDA0001762456760000072
Figure BDA0001762456760000081
当醇沉时间为24、36h时，醇沉效果较好，从节约时间的角度考虑，将醇沉时间定为24h。
实施例2
(1)取狭山野豌豆干燥地上部分5g，共3份，分别放入250mL茄形瓶，按1g:25mL的料液比加入蒸馏水，按狭山野豌豆干燥地上部分的重量，加入2.5％的木瓜蛋白酶和5.0％的纤维素酶。调节pH值为6.0-6.5，50℃水浴提取3次，每次60min，收集提取液，浓缩，转移至100mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，测定多糖含量，结果见表11。
表11复合酶提取多糖结果
Figure BDA0001762456760000082
(2)分别取上述三份溶液各25mL，加无水乙醇使体系中的乙醇浓度达到90％。搅拌均匀并放置24h，离心(3000r/min，25℃)，沉淀部分挥干乙醇，加蒸馏水溶解，转移至50mL量瓶中，以蒸馏水为溶剂定容。结果见表12。
表12复合酶提取后醇沉多糖实验结果
Figure BDA0001762456760000083

Claims (3)

1.狭山野豌豆中多糖的制备方法，其特征在于，取狭山野豌豆，以水为溶剂，料液比为1g : 25mL，按狭山野豌豆的重量，加入5.0%的纤维素酶和2.5%的木瓜蛋白酶，调节pH值为6.0~6.5，提取温度为50℃，提取3次，每次提取时间为60min，得提取液。
2.根据权利要求1所述的狭山野豌豆中多糖的制备方法，其特征在于，包括纯化步骤：将提取液旋转蒸发得浓缩液，向其中加入无水乙醇，使体系中乙醇的体积百分浓度为90%，搅拌均匀，静置12-36h，3000r/min离心，收集沉淀。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，静置24 h。
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