CN105092762B - 一种牛肉中齐帕特罗、西布特罗、克仑普罗和班布特罗促生长剂残留量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种牛肉中齐帕特罗、西布特罗、克仑普罗和班布特罗等促生长剂残留量的测定方法，该方法包括牛肉样品用β‑葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶水解，在pH为1.0±0.2下离心，上清液pH调至9.5±0.2，依次用乙酸乙酯、叔丁基甲醚萃取，合并有机相，吹干，再用甲酸溶解，过阳离子交换固相萃取柱，依次用2%甲酸、水、甲醇淋洗，再用氨化甲醇洗脱，洗脱液吹干，用甲酸甲醇水溶液溶解，膜过滤，滤液上液质联用仪，根据标准曲线得出牛肉中所述促生长剂的残留量。本发明方法可对齐帕特罗、西布特罗、克仑普罗和班布特罗4种促生长剂实现快速检测，监控以上四种药物在牛肉中的残留。
Description
技术领域
本发明涉及一种牛肉中齐帕特罗、西布特罗、克仑普罗、班布特罗等促生长剂药物残留量的测定方法。
背景技术
齐帕特罗、西布特罗、克仑普罗、班布特罗等药物对动物具有明显地促生长、增加瘦肉率、改善生产性能等作用。但是残留有这些药物的的牛肉如果被人食用后，会出现心悸、四肢肌肉颤动、心律失常等副作用，严重影响人类的健康。目前还没有相关的牛肉中残留以上四种药物的测定方法。为了保证广大居民食品安全，杜绝和监控以上四种药物在牛肉中的残留，防止在突发事件中的被动，需要对牛肉组织中上述四种促生长剂药物含量进行检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种牛肉中齐帕特罗、西布特罗、克仑普罗、班布特罗等促生长剂药物残留量的测定方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种牛肉中促生长剂残留量的测定方法，所述促生长剂为齐帕特罗、西布特罗、克仑普罗和班布特罗，包括如下步骤：
（1）样品的提取：取一定量的牛肉样品，绞碎，加入β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，在pH=5.2下，水解16h，然后用高氯酸调节pH至1.0±0.2，离心；
（2）样品的净化：将离心得到的上清液pH调节至9.5±0.2，依次用乙酸乙酯、叔丁基甲醚萃取，合并有机相，氮气吹干，再用2%vol甲酸水溶液溶解，得到的溶液过阳离子交换固相萃取柱，依次用2%vol甲酸水溶液、水、甲醇淋洗，抽干，再用氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用甲酸甲醇水溶液溶解，膜过滤，得滤液；
（3）步骤（2）所得的滤液上液质联用仪，得到所述促生长剂的色谱峰面积，液相色谱条件：C18柱，用0.1%vol甲酸水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱；
（4）将所述促生长剂标准品添加到空白样品中，制备成一系列浓度的空白添加试样，按步骤（1）-（3）处理，得到浓度-峰面积的标准曲线；
（5）根据步骤（3）和步骤（4）的结果即可得出牛肉中所述促生长剂的残留量。
进一步，步骤（2）所述的甲酸甲醇水溶液为v:v=20:80的0.1%vol甲酸甲醇溶液-0.1%vol甲酸水溶液。
进一步，步骤（3）梯度洗脱时，甲醇体积百分比随时间变化如下：0～4min 20%；4～5min 60%；5～6min 80%。
附图说明
图1为促生长剂的液相色谱—串联质谱图，从上至下依次为西布特罗、齐帕特罗、克伦普罗和班布特，各种促生长剂的浓度都为0.5μg/mL。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
试剂和仪器
促生长剂：齐帕特罗、西布特罗、克伦普罗、班布特罗标准品，纯度均大于98.0%。甲酸（HCOOH）：分析纯。乙酸乙酯（C4H8O2）：分析纯。甲醇（CH3OH）：色谱纯。高氯酸（HClO4）：优级纯。氢氧化钠（NaOH）：优级纯。氨水(NH4OH)：优级纯。乙酸铵（CH3COONH4）。0.1 mol/L 高氯酸溶液。5 mol/L 氢氧化钠溶液。5%vol 氨水甲醇溶液（氨化甲醇）。0.1%vol 甲酸水溶液。β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶(β-glucuronidasc/arylsulfatasc)：酶活性≥100,000units/min。
标准储备液：分别称取上述4 种促生长剂标准品10.0 mg，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，于4℃条件下保存。
标准工作液：分别吸取上述各储备溶液，用甲醇稀释，配成浓度为1.0μg/mL 的混和标准储备溶液。根据需要，用甲醇稀释上述标准储备溶液，配制成不同浓度的标准工作液。
MCX阳离子交换固相萃取小柱(60mg，3mL) 或其他等效柱。微孔滤膜：0.22μm。液相色谱-串联质谱仪（简称液质联用仪）。电子分析天平：感量0.1 mg。冷冻高速离心机。氮吹仪。固相萃取装置。超声清洗仪。涡旋混合器。恒温振荡水浴。
促生长剂残留量的测定
2.1 牛肉样品的处理
准确称取绞碎混合均匀的牛肉组织样品5.0 g（精确到0.1g），置于50 mL离心管中，加入0.2mol/L乙酸铵缓冲溶液（pH=5.2）10 mL，加入20μL 的β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，37℃水解16h，加0.1mol/L的高氯酸5ml，再用高氯酸调pH值到1.0±0.2，于10000r/min转速离心10min后，将上清液转移到另一离心管中。用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值到9.5±0.2，加入乙酸乙酯15 mL，涡旋混合，并震荡10min，于5000r/min转速离心10min后，用滴管吸出上层乙酸乙酯到另一50 mL 离心管中。向下层水相中加入叔丁基甲醚10ml，涡旋混合，并震荡10min，于5000r/min转速离心10min，合并乙酸乙酯相和叔丁基甲醚相，50℃下氮气吹干，用5 mL 2%（v:v）甲酸水溶液溶解，备用。
MCX阳离子交换固相萃取小柱在使用前依次用甲醇、水、2%（v:v）甲酸水溶液各3mL淋洗，再取上述甲酸溶液过固相萃取柱，依次用2%（v:v）甲酸水溶液、水、甲醇各3mL淋洗，抽干。再用5%（v:v）氨化甲醇5mL洗脱，洗脱液在50℃下氮气吹干，用0.4mL 0.1%（v:v）甲酸甲醇溶液-0.1%（v:v）甲酸水溶液（v:v=20:80）溶解。摇匀之后，过0.22µm微孔滤膜，滤液上液质联用仪测定，根据标准曲线得出4种促生长剂的含量。
2.2 4种促生长剂标准曲线的制备
分别准确量取上述4种促生长剂混合标准工作液，添加到5g空白样品中，制得浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2μg/kg的一系列空白添加试样，所得空白添加试样按照上述2.1所述步骤处理，上液相色谱串联质谱仪测定，得到标准曲线。
3. 液质联用仪测试条件
3.1色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(100 mm×3.0 mm, 1.8μm)或相当的色谱柱。
柱温：30℃。
进样量:10μL。
流动相：A 相：甲醇；B 相：浓度为0.1% (体积分数)甲酸水溶液。
梯度洗脱情况见表1。
表1 梯度洗脱程序
3.2 质谱条件
离子源：电喷雾离子源；
扫面方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
电离电压：3.2kv；
源温：100℃；
雾化温度：350；
锥孔气流：50L/h；
雾化气流速:650 L/h；
脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节气体流量使得质谱仪灵敏度达到检测要求。毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化到最佳灵敏度。定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表2.
表2 定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量
在上述仪器条件下测定基质加标标准溶液及样品溶液。各检测目标化合物以保留时间和特征离子与定量离子所对应的LC-MS/MS 色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物保留时间的相对偏差在±2.5之间；样品特征离子的相对丰度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3 的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。色谱图见图1。
表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差
各促生长剂在添加浓度为0.1-1.0μg/kg 时，本发明方法的加标回收率均介于70.1-100.5%之间。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种牛肉中齐帕特罗、西布特罗、克仑普罗和班布特罗促生长剂残留量的测定方法，包括如下步骤：
（1）样品的提取：取一定量的牛肉样品，绞碎，加入β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，在pH=5.2下，水解16h，然后用高氯酸调节pH至1.0±0.2，离心；
（2）样品的净化：离心得到的上清液pH调节至9.5±0.2，依次用乙酸乙酯、叔丁基甲醚萃取，合并有机相，氮气吹干，再用2%vol甲酸水溶液溶解，得到的溶液过阳离子交换固相萃取柱，依次用2%vol甲酸水溶液、水、甲醇淋洗，抽干，再用氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用甲酸甲醇水溶液溶解，膜过滤，得滤液；
（3）步骤（2）所得的滤液用液质联用仪进行检测，得到所述促生长剂的色谱峰面积，液相色谱条件：C18柱，用0.1%vol甲酸水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱；
（4）将所述促生长剂标准品添加到空白样品中，制备成一系列浓度的空白添加试样，按步骤（1）-（3）处理，得到浓度-峰面积的标准曲线；
（5）根据步骤（3）和步骤（4）的结果即可得出牛肉中所述促生长剂的残留量；
步骤（2）所述的甲酸甲醇水溶液为v:v=20:80的0.1%vol甲酸甲醇溶液-0.1%vol甲酸水溶液；
步骤（3）梯度洗脱时，甲醇体积百分比随时间变化如下：0～4min 20%；4～5min 60%；5～6min 80%。
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