CN108469479A - 液相色谱-串联质谱法测定血浆中格列吡嗪浓度的方法 - Google Patents

液相色谱-串联质谱法测定血浆中格列吡嗪浓度的方法 Download PDF

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CN108469479A CN201810222518.8A CN201810222518A CN108469479A CN 108469479 A CN108469479 A CN 108469479A CN 201810222518 A CN201810222518 A CN 201810222518A CN 108469479 A CN108469479 A CN 108469479A
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Abstract

本方法属于医药检测领域，涉及液相色谱‑串联质谱法测定血浆中格列吡嗪浓度的方法，尤其是测定比格犬血浆中格列吡嗪浓度的方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)血浆样品的制备；(2)蛋白沉淀处理；(3)液相色谱‑串联质谱法测定。即向样品中加入内标工作溶液格列齐特溶液，甲醇沉淀，涡旋，离心。然后采用液相色谱‑串联质谱法测定血浆中格列吡嗪的浓度。本方法采用甲醇沉淀蛋白方法，液质检测，方法操作简单，检出限低，重现性好等优点，适用于药代动力学研究，毒代动力学研究，生物等效性研究等。

Description

液相色谱-串联质谱法测定血浆中格列吡嗪浓度的方法
技术领域
本方法属于医药检测领域，涉及液相色谱-串联质谱法测定血浆中格列吡嗪浓度的方法，尤其是测定比格犬血浆中格列吡嗪浓度的方法。
背景技术
由于生活水平的改善，老龄化加剧，糖尿病患者数量逐年呈现为上升趋势；据不完全统计，世界各国发生糖尿病的发病率均在呈上涨趋势，而其中II型糖尿病患者占到90％以上。近年来，糖尿病在发达国家中的上升率为45％，在发展中国家的上升率高达200％，而越来越多的资料显示，糖尿病现阶段在中国、印度、非洲某些发展中国家十分常见和流行。近年来，我国糖尿病患者的增加趋势一直在上涨，2003年的统计显示，我国糖耐量异常患者约为3320万人，到2025年，我国糖耐量异常患者可能会增加到3320万人，而其中确诊糖尿病患者约为4610万人。
格列吡嗪为亲脂性弱酸，第二代磺脲类降血糖药，并有降脂和抗凝血作用。化学名为5-甲基-N-[2-[4-[[[(环己氨基)羰基]氨基]磺酰基]苯基]乙基]-吡嗪甲酰胺。其体内作用机理是直接刺激胰岛素β细胞的分泌功能，促使内源性胰岛素的释放增加而降低血糖，临床疗效确切，常用于治疗Ⅱ型糖尿病该方法的建立可以应用于药代动力学研究，毒代动力学研究，生物等效性研究等。
发明内容
本发明目的旨在采用一种简单，快速，灵敏度高，重现性好的方法，测定比格犬血浆中格列吡嗪的含量。本发明采用蛋白沉淀方法作为样本的前处理技术，采用C18柱，利用液相色谱串联质谱作为检测器对格列吡嗪进行检测分析。克服了其他方法复杂，检测限高等问题，快速检测比格犬血浆中格列吡嗪的含量，测定结果灵敏，快速，重现性好。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明通过对蛋白沉淀试剂的条件进行优化，对流动相的参数，质谱的参数等进行优化，选用最优的条件，满足了定量检测的要求。
本发明测定比格犬血浆中格列吡嗪的含量的方法，具体步骤如下：
(1)血浆样品的制备；
(2)蛋白沉淀处理；
(3)液相色谱-串联质谱法测定；
其中，
步骤(1)中向血浆样品、混合空白基质样品中加入内标工作溶液，混匀；所述的内标工作溶液为格列齐特溶液，其浓度为：200ng/mL，加入量为：50μL
步骤(2)中向步骤(1)中的血浆样品、混合空白基质样品中加入甲醇，涡旋1-2min，13000-15000rpm/min离心10-15分钟。样品与甲醇的体积比为：1：2-1：5；优选为1：2-1：3；
步骤(3)中液相色谱条件如下：
色谱柱：Phenomenex C18(2.6μm,100A,2.1×50mm)；
流动相：A相:甲醇，B相：含有0.1％～0.2％甲酸以及5～10mmol乙酸铵的纯水；洗针液1为85％～95％的乙腈；洗针液2为40％～50％的乙腈；等度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；自动进样器温度：2～8℃；
质谱条件如下：
离子源：电喷雾电离源(ESI源)；
检测方式：正离子模式；多反应离子检测(MRM)；
离子源温度：120℃；毛细管电压：3.2；入口电压：3kV；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：550L/hr；脱溶剂气温度：500℃；监测离子对：446.3→321.1(格列吡嗪)，324.1→127.1(格列齐特)；锥孔电压均为28～32；碰撞能：15～20(格列吡嗪)，18～22(格列齐特)；停留时间：0.2。
进一步地，本发明包含如下步骤：
(1)储备溶液的制备
精密称量两份适量格列吡嗪，溶解后作为制备标准曲线的储备液以及制备质控样品的储备液。精密称量适量格列齐特，作为内标溶液的储备液。
(2)工作溶液的制备
用10％甲醇稀释上述格列吡嗪储备溶液分别制得标准曲线样本工作溶液以及质控样本工作溶液，于8℃条件下茶色容量瓶中储存。用10％甲醇稀释上述格列齐特储备溶液制得内标工作溶液，于8℃条件下茶色容量瓶中储存。
(3)模拟血浆样本的制备
制备标准曲线样本，制备质控样本，制备测试样本，制备空白样本，制备空白质控样本，制备定量上限不添加内标样本。
(4)预制备样本的制备
向上一步得到的标准曲线样本，质控样本，测试样本，混合样本中，加入内标工作溶液，混匀；向空白样本，空白质控样本，定量上限不添加内标样本，混合空白基质中，加入稀释液，混匀；
(5)蛋白沉淀处理过程
向步骤(4)样本中加入纯甲醇，涡旋，离心处理。
(6)上清液分析
吸取上清液进行液质分析。液相色谱条件如下：色谱柱：Phenomenex C18(2.6μm,100A,2.1×50mm)；流动相：A:100％甲醇，B：100％纯水含有0.2％甲酸以及10mmol乙酸铵；洗针液1为90％乙腈；洗针液2为40％乙腈；等度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；自动进样器温度：8℃；质谱条件如下：离子源：电喷雾电离源(ESI源)；检测方式：正离子模式；多反应离子检测(MRM)；离子源温度：120℃；毛细管电压：3.2；入口电压：3kV；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：550L/hr；雾化气和干燥气：氮气；；锥孔电压：60V；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；监测离子对：446.3→321.1(格列吡嗪)，324.1→127.1(格列齐特)；锥孔电压均为30；碰撞能：16(格列吡嗪)，20(格列齐特)；停留时间：0.2。
(7)比格犬血浆中格列吡嗪含量测定结果的计算
步骤(1)中，储备液使用10％甲醇进行溶解，制备好的储备液需放置于8度冰箱中，密封保存。
步骤(2)中，系列标准曲线样本工作溶液的浓度为20.14ng/mL，40.28ng/mL，100.7ng/mL，402.8ng/mL，1007ng/mL，4028ng/mL，8056ng/mL。质控样本工作溶液浓度为51.6ng/mL，258ng/mL，6192ng/mL。内标工作溶液浓度为200ng/mL。
步骤(3)中，血浆样本量为100μL；内标，稀释液，标准曲线，质控工作溶液的加入量为50μL。
步骤(4)中，向标准曲线，质控，样品混合样本样本中，加入内标工作溶液50μL，混匀；向混合空白基质中，加入稀释液50μL，混匀；向另一份混合空白基质中，加入内标工作溶液50μL，混匀；向定量上限不添加内标混合样本中，加入稀释液50μL，混匀。
步骤(5)中，向所有预制备样本中加入300μL纯甲醇，涡旋1分钟，13000rpm/min离心10分钟。
步骤(6)中，液相色谱条件中的等度洗脱，A相与B相的比例为3：2。格列吡嗪保留时间约2.3min；格列齐特保留时间约为2.8min。
具体地，本发明可以采用如下方法制备：
(1)储备溶液的制备
精密称量两份适量格列吡嗪，于容量瓶中，用10％甲醇溶液溶解，定容，混匀，作为制备标准曲线的储备液以及制备质控样品的储备液。精密称量适量格列齐特，与容量瓶中，用10％甲醇溶液溶解，定容，混匀作为内标溶液的储备液，储存于8度冰箱中保存。
(2)工作溶液的制备
用10％甲醇稀释上述格列吡嗪储备溶液分别制得标准曲线样本工作溶液以及质控样本工作溶液，于8℃条件下茶色容量瓶中储存。系列标准曲线样本工作溶液的浓度为20.14ng/mL，40.28ng/mL，100.7ng/mL，402.8ng/mL，1007ng/mL，4028ng/mL，8056ng/mL。质控样本工作溶液的浓度为51.6ng/mL，258ng/mL，6192ng/mL。用10％甲醇稀释上述格列齐特储备溶液制得内标工作溶液浓度为200ng/mL，于8℃条件下茶色容量瓶中储存。若其对待测物的干扰不超过有效标准曲线最低定量下限样本中待测物平均响应的20.0％，该内标即可使用。
(3)标准曲线样本的制备
对于每个浓度水平的标准曲线样本的制备过程，例如，使用移液器取空白血浆100μL加入50μL系列标准工作溶液中，混合均匀。
(4)质控样本的制备
对于每个浓度水平的质控样本的制备过程，例如，使用移液器取空白血浆100μL加入50μL质控工作溶液中，混合均匀。
(5)测试样本的制备
对于每个测试样本的制备过程，例如，使用移液器取测试样本100μL加入50μL10％甲醇溶液中，混合均匀。
(6)空白样本的制备
对于每个空白样本的制备过程，例如，使用移液器取空白血浆100μL加入50μL10％甲醇溶液中，混合均匀。
(7)空白质控样本的制备
对于每个空白质控样本的制备过程，例如，使用移液器取空白血浆100μL加入50μL质控工作溶液中，混合均匀。
(8)定量上限不添加内标样本的制备
对于每个定量上限不添加内标样本的制备过程，例如，使用移液器取空白血浆100μL加入50μL稀释液中，混合均匀。
(9)预制备样本的制备
向步骤(4)，(5)，(6)，混合样本样本中，加入内标工作溶液50μL，混匀；向步骤(7)，混合空白基质中，加入稀释液50μL，混匀；向步骤(8)，混合空白基质中，加入内标工作溶液50μL，混匀；向步骤(9)，混合样本中，加入稀释液50μL，混匀。
(10)蛋白沉淀处理过程
向步骤(9)样本中加入300μL纯甲醇，涡旋1min，13000rpm/min离心10分钟。
(11)上清液分析
吸取上清液进行液质分析。液相色谱条件如下：色谱柱：Phenomenex C18(2.6μm,100A,2.1×50mm)；流动相：A:100％甲醇，B：100％纯水含有0.2％甲酸以及10mmol乙酸铵；洗针液1为90％乙腈；洗针液2为40％乙腈；等度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；自动进样器温度：8℃；质谱条件如下：离子源：电喷雾电离源(ESI源)；检测方式：正离子模式；多反应离子检测(MRM)；离子源温度：120℃；毛细管电压：3.2；入口电压：3kV；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：550L/hr；雾化气和干燥气：氮气；；锥孔电压：60V；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；监测离子对：446.3→321.1(格列吡嗪)，324.1→127.1(格列齐特)；锥孔电压均为30；碰撞能：16(格列吡嗪)，20(格列齐特)；停留时间：0.2。
(12)血浆中格列吡嗪含量测定结果的计算
关于质谱条件的优化：
先期考察了不同质谱参数对离子信号的影响，考察了锥孔电压，碰撞能，其中锥孔电压为30，格列吡嗪碰撞能为16，格列齐特为20时离子信号相应最高，信号稳定。
关于色谱条件的优化：
在方法开发阶段，考察了水-甲醇，水-乙腈以及在水中加入不同种类不同比例的添加剂对保留时间和峰形的影响。实验结果表明，若采用水-甲醇作为流动相时化合物峰形最好。另外又考察了甲酸与乙酸铵不同添加剂对保留时间的影响。若使用甲酸作为添加剂，保留时间靠前，与基质无法分离；若使用乙酸铵作为添加剂，响应低，所以综合考虑选择了两种添加剂。而含有2％的甲酸和10mmol乙酸铵的水溶液作为水相响应最高，出峰时间合适。
关于前处理方法的优化：
在方法开发阶段，比较了甲醇沉淀法(比例为1：1；1：2；1：3；1：4；1：5)和乙腈沉淀法(比例为1：1；1：2；1：3；1：4；1：5)，实验结果表明甲醇沉淀蛋白法(血浆与甲醇的比例为1：3)的效果最好，响应最高，峰形最优。
本方法采用甲醇沉淀蛋白方法，液质检测，方法操作简单，检出限低，重现性好等优点，适用于药代动力学研究，毒代动力学研究，生物等效性研究等。
附图说明
图1为格列吡嗪质谱碎片图；
图2为空白血浆色谱图；
图3为浓度为20.1ng/mL的格列吡嗪与浓度为200ng/mL的格列齐特色谱图；
具体实施方式
本发明采用蛋白沉淀前处理技术，使用液相色谱串联质谱法对比格犬血浆中格列吡嗪的含量进行测。
本发明的具体实施方法如下：
(1)储备液的制备
精密称量两份适量格列吡嗪，于容量瓶中，用10％甲醇溶液溶解，定容，混匀，作为制备标准曲线的储备液以及制备质控样品的储备液。精密称量适量格列齐特，与容量瓶中，用10％甲醇溶液溶解，定容，混匀作为内标溶液的储备液，储存于8度冰箱中保存。
(2)工作溶液的制备
用10％甲醇稀释上述格列吡嗪储备溶液分别制得标准曲线样本工作溶液以及质控样本工作溶液，于8℃条件下茶色容量瓶中储存。系列标准曲线样本工作溶液的浓度为20.14ng/mL，40.28ng/mL，100.7ng/mL，402.8ng/mL，1007ng/mL，4028ng/mL，8056ng/mL，制备方式见表1.。质控样本工作溶液的浓度为51.6ng/mL，258ng/mL，6192ng/mL，制备方式见表2。用10％甲醇稀释上述格列齐特储备溶液制得内标工作溶液浓度为200ng/mL，制备方式见表3，于8℃条件下茶色容量瓶中储存。
表1.标准曲线样本工作溶液：
注：以上浓度为理论浓度，实际浓度以实际称量为准
表2.质控样本工作溶液:
注：以上浓度为理论浓度，实际浓度以实际称量为准
表3.内标工作溶液：
(3)标准曲线样本和质控样本的制备
对于每个浓度水平的标准曲线样本和质控样本的制备过程，例如，采用移液器向100μL的空白血浆中加入50.0μL标准曲线工作溶液，混合均匀。可以根据实际情况适当调整体积。
标准曲线样本浓度：10.1ng/mL(定量下限，LLOQ)，20.1ng/mL，50.4ng/mL,201ng/mL，504ng/mL，2014ng/mL，4028ng/mL(定量上限，ULOQ)。
质控样本浓度：定量下限(LLOQ QC，10.1ng/mL)，低浓度(LQC，25.8ng/mL)，中浓度(MQC，258ng/mL)，高浓度(HQC，3090ng/mL)。
(4)样本处理(见表4)
表4样本处理
(5)利用Waters AcquityTM超高液相色谱和Tandem Quadrupole Detector(TQD)MS/MS质谱系统测定比格犬血浆中格列吡嗪的含量
表5液相色谱条件
表6质谱条件
(6)比格犬血浆中格列吡嗪含量测定结果的计算
本项目采用软件MassLynx V4.1或其他版本(Applied Biosystems,U.S.A)进行数据采集、积分和测试样品浓度计算。对理论浓度与响应值(待测物与内标峰面积比值)进行线性回归，权重因子为1/x2。
(7)方法学验证
标准曲线与线性范围
标准曲线：精密量取一定量的对照品储备溶液，用10％甲醇水溶液稀释液稀释制成系列标准曲线溶液，向适量格列吡嗪标准液中分别加入比格犬空白血浆100μL，配制成浓度分别为20.14ng/mL，40.28ng/mL，100.7ng/mL，402.8ng/mL，1007ng/mL，4028ng/mL，8056ng/mL的血浆样品，按照以上方法操作，记录各色谱峰的峰面积，以配置的格列吡嗪浓度为横坐标，以相应的色谱峰面积为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得到的各批标准曲线回归方程见下表。定量上限为4028ng/mL，定量下限为10.1ng/mL。以下表明该方法线性关系良好。
表7.标准曲线参数汇总
批次 斜率 截距 R2 LLOQ ULOQ 拟合方程
1 41.2475 63.3929 0.9974 10.1 4028 y＝41.2475x+63.3929
2 41.4 133.968 0.995856 10.1 4028 y＝41.4x+133.968
3 46.4566 109.221 0.991975 10.1 4028 y＝46.4566x+109.221
4 26.7207 73.4231 0.991969 10.1 4028 y＝26.7207x+73.4231
5 29.628 21.8773 0.993732 10.1 4028 y＝29.628x+21.8773
平均 37.1 80.4 0.994 - - -
SD 8.47 43.2 0.00 - - -
％CV 22.8 53.7 0.242 - - -
n 5 5 5 - - -
基质效应
提取6个不同来源的比格犬血浆作为空白样本。提取后，向空白血浆提取物中添加待测物和内标制得低浓度质控样本(LQC)、中间浓度质控样本(MQC)和高浓度浓度质控样本(HQC)(每个浓度每个基质3个重复，n＝3)，作为测试样本。
制备与上述测试样本(LQC,MQC及HQC)具有相同待测物及内标浓度的纯溶液作为参比溶液(每个浓度水平3个重复，n＝3)。
内标校正的基质效应计算：以待测物及其内标峰面积比值计算内标校正的基质效应，每个浓度每个批次基质的测试样本中添加的待测物与其内标的平均峰面积除以同浓度参比溶液中添加的待测物与其内标的平均峰面积。基质效应的计算公式：基质效应＝提取过的空白基质样品中分析物和内标的峰面积比值/净溶液中分析物和内标的峰面积比值。结果见表8.结果表明，该方法没有基质效应。
提取回收率
采用和常规质控样本同一批次的空白血浆配制空白样本。提取后，向空白样本提取物中添加待测物和内标制得到低浓度质控样本(LQC)、中间浓度质控样本(MQC)和高浓度浓度质控样本(HQC)(每个浓度6个重复，n＝6)，作为提取回收率测试样本。
提取回收率通过比较常规质控样本(每个浓度6个重复，n＝6)与测试样本中添加的同浓度的待测物及内标的响应信号(峰面积)比值进行评估。
待测物及其内标独立的提取回收率计算：每个浓度每个常规质控样本中待测物(或者内标)峰面积除以同浓度回收率测试样本中添加的待测物(或者内标)的平均峰面积。结果见表9，表10。结果表明，提取回收率合格。
专属性
选取6个来源不同的空白基质，提取后作为专属性样本。计算公式为：待测物干扰值＝专属性样本待测物通道的峰面积/LLOQ待测物峰面积均值，内标干扰值＝专属性样本内标通道的峰面积/LLOQ内标峰面积均值。结果表11.结果表明，该方法专属性良好。
表11.专属性
批内批间的精密度和准确度
通过分析3个独立的验证分析批(日内精密度和准确度)的标准曲线样本和质控样本来评估日间精密度和准确度。用于计算日间精密度和准确度的质控样本来源于考察日内精密度和准确度时所配制的质控样本(LLOQ，LQC，GMQC，MQC和HQC)，每个验证分析批每个浓度水平6个重复。结果见表12.结果表明结果符合要求。其结果见表12，所得的批内准确度(除LLOQ QC以外的所有浓度质控)范围为-12.9％～14.2％，批内精密度和准确度(LLOQQC)范围为-17.7％～11.7％。批间准确度(除LLOQ QC以外的所有浓度质控)范围为：1.9％～9.3％。批间精密度和准确度(LLOQ QC)范围为-4.0％。批内精密度(除LLOQ QC以外的所有浓度质控)的相对标准偏差(RSD)值低于11.9％，批内精密度(LLOQ QC)的相对标准偏差(RSD)值低于15.8％。批间精密度(除LLOQ QC以外的所有浓度质控)的相对标准偏差(RSD)值低于11.1％，批间精密度(LLOQ QC)的相对标准偏差(RSD)值低于12.0％。能够满足比格犬血浆中格列吡嗪定量分析的要求。
表12.批内批间的精密度和准确度
样品分析
按上述步骤处理后测样，得到响应结果，带入标准曲线中计算，结果见表13。
下表包含序号、待测物名称、受试者编号、给试周期、给药理论天数(天)、取样时间点(小时)、取样时间说明、检测浓度(ng/mL)、样品注释、样品检测状态是否正常及结果是否可接受。吸收相样品浓度低于定量下限的值报告为“0”，消除相样品浓度低于定量下限的值报告为“ND”(定量下限为：10.1ng/mL)
表13.一条犬样品中待测物的计算浓度(ng/mL)
实验结果表明：所建方法成功应用于比格犬血浆中格列吡嗪的含量测定。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.液相色谱-串联质谱法测定血浆中格列吡嗪浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)血浆样品的制备；
(2)蛋白沉淀处理；
(3)液相色谱-串联质谱法测定；
其中，
步骤(1)中向血浆样品、混合空白基质样品中加入内标工作溶液，混匀；
所述的内标工作溶液为格列齐特溶液，其浓度为：200ng/mL，加入量为：50μL
步骤(2)中向步骤(1)中的血浆样品、混合空白基质样品中加入甲醇，涡旋，离心；样品与甲醇的体积比为：1：2-1：5；
步骤(3)中液相色谱条件如下：
色谱柱：Phenomenex C18(2.6μm,100A,2.1×50mm)；
流动相：A相:甲醇，B相：含有0.1％～0.2％甲酸以及5～10mmol乙酸铵的纯水；洗针液1为85％～95％的乙腈；洗针液2为40％～50％的乙腈；等度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；自动进样器温度：2～8℃；
质谱条件如下：
离子源：电喷雾电离源(ESI源)；
检测方式：正离子模式；多反应离子检测(MRM)；
离子源温度：120℃；毛细管电压：3.2；入口电压：3kV；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：550L/hr；脱溶剂气温度：500℃；监测离子对：446.3→321.1(格列吡嗪)，324.1→127.1(格列齐特)；锥孔电压均为28～32；碰撞能：15～20(格列吡嗪)，18～22(格列齐特)；停留时间：0.2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中向步骤(1)中的血浆样品、混合空白基质样品中加入甲醇，涡旋1min，13000rpm/min离心10分钟；样品与甲醇的体积比为：1：2-1：3；
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(3)中液相色谱条件如下：
色谱柱：Phenomenex C18(2.6μm,100A,2.1×50mm)；
流动相：A相:甲醇，B：含有0.1％～0.2％甲酸以及5～10mmol乙酸铵的纯水；洗针液1为85％～95％乙腈；洗针液2为40％～50％乙腈；等度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；自动进样器温度：8℃；
质谱条件如下：
离子源：电喷雾电离源(ESI源)；
检测方式：正离子模式；多反应离子检测(MRM)；
离子源温度：120℃；毛细管电压：3.2；入口电压：3kV；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：550L/hr；雾化气和干燥气：氮气；；锥孔电压：60V；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；监测离子对：446.3→321.1(格列吡嗪)，324.1→127.1(格列齐特)；锥孔电压均为30；碰撞能：16(格列吡嗪)，20(格列齐特)；停留时间：0.2。
4.如权利要求1-3任何一项所述的方法，其特征在于，
(1)储备溶液的制备
精密称量两份适量格列吡嗪，溶解后作为制备标准曲线的储备液以及制备质控样品的储备液，精密称量适量格列齐特，作为内标溶液的储备液；
(2)工作溶液的制备
用10％甲醇稀释上述格列吡嗪储备溶液分别制得标准曲线样本工作溶液以及质控样本工作溶液，于8℃条件下茶色容量瓶中储存，用10％甲醇稀释上述格列齐特储备溶液制得内标工作溶液，于8℃条件下茶色容量瓶中储存；
(3)模拟血浆样本的制备
制备标准曲线样本，制备质控样本，制备测试样本，制备空白样本，制备空白质控样本，制备定量上限不添加内标样本；
(4)预制备样本的制备
向上一步得到的标准曲线样本，质控样本，测试样本，混合样本中，加入内标工作溶液，混匀；向空白样本，空白质控样本，定量上限不添加内标样本，混合空白基质中，加入稀释液，混匀；
(5)蛋白沉淀处理过程
向步骤(4)样本中加入纯甲醇，涡旋，离心处理；
(6)上清液分析
吸取上清液进行液质分析，液相色谱条件如下：色谱柱：Phenomenex C18(2.6μm,100A,2.1×50mm)；流动相：A:100％甲醇，B：100％纯水含有0.2％甲酸以及10mmol乙酸铵；洗针液1为90％乙腈；洗针液2为40％乙腈；等度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；自动进样器温度：8℃；质谱条件如下：离子源：电喷雾电离源(ESI源)；检测方式：正离子模式；多反应离子检测(MRM)；离子源温度：120℃；毛细管电压：3.2；入口电压：3kV；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：550L/hr；雾化气和干燥气：氮气；；锥孔电压：60V；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；监测离子对：446.3→321.1(格列吡嗪)，324.1→127.1(格列齐特)；锥孔电压均为30；碰撞能：16(格列吡嗪)，20(格列齐特)；停留时间：0.2。
(7)比格犬血浆中格列吡嗪含量测定结果的计算。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中，储备液使用10％甲醇进行溶解，制备好的储备液需放置于8度冰箱中，密封保存。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中，系列标准曲线样本工作溶液的浓度为20.14ng/mL，40.28ng/mL，100.7ng/mL，402.8ng/mL，1007ng/mL，4028ng/mL，8056ng/mL。质控样本工作溶液浓度为51.6ng/mL，258ng/mL，6192ng/mL，内标工作溶液浓度为200ng/mL。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤(3)中，血浆样本量为100μL；内标，稀释液，标准曲线，质控工作溶液的加入量为50μL。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤(4)中，向标准曲线，质控，样品混合样本样本中，加入内标工作溶液50μL，混匀；向混合空白基质中，加入稀释液50μL，混匀；向另一份混合空白基质中，加入内标工作溶液50μL，混匀；向定量上限不添加内标混合样本中，加入稀释液50μL，混匀。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤(5)中，向所有预制备样本中加入300μL纯甲醇，涡旋1分钟，13000rpm/min离心10分钟。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤(6)中，液相色谱条件中的等度洗脱，A相与B相比例为3：2。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110385116A (zh) * 2019-06-28 2019-10-29 沈阳信达泰康医药科技有限公司 一种磁性纳米复合材料及其制备和应用
CN110927305A (zh) * 2019-11-07 2020-03-27 徐州立兴佳正医药科技有限公司 一种液质联用测定血浆中格列吡嗪浓度的方法
CN112730822A (zh) * 2020-12-21 2021-04-30 浙江九旭药业有限公司 一种血浆中银杏酮酯制剂有效成分的检测方法
CN114487230A (zh) * 2022-02-10 2022-05-13 上海观合医药科技有限公司 一种高效液相色谱-串联质谱检测人血浆中来曲唑的方法
CN115598267A (zh) * 2022-12-13 2023-01-13 山东省食品药品检验研究院（Cn） 一种格列齐特中潜在遗传毒性杂质的分析方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104133006A (zh) * 2014-06-18 2014-11-05 中国民用航空局民用航空医学中心 一种超高效液相-质谱法检测血液中降血糖以及降血压药物的方法
CN104165937A (zh) * 2014-06-18 2014-11-26 中国民用航空局民用航空医学中心 一种高效液相-高分辨率飞行时间串联质谱法检测血液中降血糖以及降血压药物的方法
CN104991009A (zh) * 2015-07-28 2015-10-21 山东省分析测试中心 用于测定中药及保健品中非法添加物质的方法
CN105784865A (zh) * 2016-03-10 2016-07-20 贵州省烟草公司毕节市公司 一种检测动物血浆中氯唑沙宗的hplc-ms/ms方法
CN107741465A (zh) * 2017-11-27 2018-02-27 浙江公正检验中心有限公司 保健品中18种非法添加降糖降压药物残留量的检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104133006A (zh) * 2014-06-18 2014-11-05 中国民用航空局民用航空医学中心 一种超高效液相-质谱法检测血液中降血糖以及降血压药物的方法
CN104165937A (zh) * 2014-06-18 2014-11-26 中国民用航空局民用航空医学中心 一种高效液相-高分辨率飞行时间串联质谱法检测血液中降血糖以及降血压药物的方法
CN104991009A (zh) * 2015-07-28 2015-10-21 山东省分析测试中心 用于测定中药及保健品中非法添加物质的方法
CN105784865A (zh) * 2016-03-10 2016-07-20 贵州省烟草公司毕节市公司 一种检测动物血浆中氯唑沙宗的hplc-ms/ms方法
CN107741465A (zh) * 2017-11-27 2018-02-27 浙江公正检验中心有限公司 保健品中18种非法添加降糖降压药物残留量的检测方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110385116A (zh) * 2019-06-28 2019-10-29 沈阳信达泰康医药科技有限公司 一种磁性纳米复合材料及其制备和应用
CN110927305A (zh) * 2019-11-07 2020-03-27 徐州立兴佳正医药科技有限公司 一种液质联用测定血浆中格列吡嗪浓度的方法
CN112730822A (zh) * 2020-12-21 2021-04-30 浙江九旭药业有限公司 一种血浆中银杏酮酯制剂有效成分的检测方法
CN112730822B (zh) * 2020-12-21 2024-01-30 浙江上药九旭药业有限公司 一种血浆中银杏酮酯制剂有效成分的检测方法
CN114487230A (zh) * 2022-02-10 2022-05-13 上海观合医药科技有限公司 一种高效液相色谱-串联质谱检测人血浆中来曲唑的方法
CN115598267A (zh) * 2022-12-13 2023-01-13 山东省食品药品检验研究院（Cn） 一种格列齐特中潜在遗传毒性杂质的分析方法

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