CN104991020B - 雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱‑串联质谱检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱‑串联质谱检验方法，包括如下步骤：取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min；分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容，过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱‑串联质谱仪分析。本发明的检测方法简单高效、快速灵敏、准确度高，具有广泛的实用性，能够应用于生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。

Description

雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液 相色谱-串联质谱检验方法

技术领域

本发明属于生物样品检验领域，具体涉及雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法。

背景技术

雷公藤(TriptergiumwilfordiiHook.f)是卫矛科一年生藤本植物，是我国传统医学中的一种常用中草药。雷公藤为卫矛科植物雷公藤的根。分布于长江流域以南及西南，主产于长江中、下游地区。有报道称，目前从雷公藤属植物中分离得100余种成分，主要是二萜类、三萜类、倍半萜类及生物碱类等，研究表明，生物碱、二萜类等许多成分既是有效成分又是有毒成分，以二萜类化合物毒性最强，主要对心、肝、胃肠道及骨髓等器官损伤严重。

雷公藤甲素和雷公藤氯内酯醇(tripchlorolide)是雷公藤中活性最高的环氧二萜内酯化合物，同时也是雷公藤引起毒副作用的主要成分，对心、肝、骨髓、胸、脾、肾及生殖系统等都有一定的毒性。

雷公藤红素是雷公藤三萜类成分，是雷公藤中分离到的第1个单体，虽具有多种药理活性，但却是主要的毒性成分，且在雷公藤药物尤其是根皮、茎皮重含量很高。

发明内容

本发明提供雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法，适用于生物样品(血、尿、肝、肾等)中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性定量检验，也适用于体外样品和可疑物证的检验。

本发明的原理是以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物样品进行提取、净化及浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪进行检测，以保留时间(Rt)、质谱特征离子碎片峰和相对丰度作为定性判断依据；与平行操作的添加标准品响应值比较，根据峰面积之比，用外标法进行定量分析。

具体的，本发明一方面的目的在于提供雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min；分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；

b)样品分析：

色谱柱：kinetex C18；进样量：1μL～10μL；流动相：A为含0.1％甲酸的10mM甲酸铵【本发明0.1％甲酸的10mM甲酸铵是指：浓度为10mmol/L的甲酸铵水溶液中甲酸的体积分数为0.1％，以下不再赘述】，B为甲醇；梯度洗脱【本发明中的A、B均为体积分数，以下不再赘述】：0.2min，A为95％，B为5％；3.0min，A为5％，B为95％；5.0min，A为5％，B为95％；5.1min，A为95％，B为5％；7.0min，A为95％，B为5％；流速为0.5mL/min；

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：5500V；离子源温度：650℃；雾化气压力：55psi；气帘气压力：50psi；辅助气压力：50psi。

在本发明的另一个实施方案中，尤其是对于新鲜血液样品，其中a)样品前处理还能够替换为：取生物液体样品或生物组织样品剪碎于具塞试管中；加入pH 5.8磷酸盐缓冲液，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱；取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再以3mL去离子水和0.5％甲醇水溶液【本发明中0.5％甲醇水溶液是指：甲醇水溶液中甲醇的体积分数为0.5％，以下不再赘述】先后淋洗小柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50℃快速浓缩仪上吹干，残渣用初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。

在本发明的一个具体的实施方式中，其中a)样品前处理步骤中，还包括另取3份相同基质的空白样品，1份作为空白样品，另2份添加雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准100ng制备成添加样品，混匀；或者还包括另取相同基质的空白样品两份，分别添加相应目标物标准品(添加量应与案件样品粗测量相近)制备成添加样品，混匀。

在本发明的一个具体的实施方式中，液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样品为肝脏、肾脏。

在本发明的一个具体的实施方式中，C18柱为3.0mm×50mm，2.6μm柱或等效色谱柱。

在本发明的一个优选的实施方式中，取液体样品1.0mL-2.0mL；或者组织样品1.0g-2.0g。

在本发明的一个优选的实施方式中，乙酸乙酯的加入量为5.0mL-10.0mL。

在本发明的一个优选的实施方式中，残渣用500μL-1000μL初始流动相定容。

在本发明的一个优选的实施方式中，磷酸盐缓冲液的加入量为3mL-5mL。

本发明另一方面的目的在于提供生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检验方法的应用，应用于法庭科学领域，尤其是应用于生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。优选地，所述生物样品为血、尿、肝、肾。

本发明的有益效果在于：本发明样品处理采用液液萃取或者固相萃取，操作简单，样品用量少；采用LC-MS/MS灵敏度高，能有效的排除假阳性，定性、定量准确度高。

附图说明

图1表示雷公藤甲素的液相色谱-质谱提取离子流图；

图2表示雷公藤内酯酮的液相色谱-质谱提取离子流图；

图3表示雷公藤内酯甲的液相色谱-质谱提取离子流图；

图4表示雷公藤红素的液相色谱-质谱提取离子流图。

具体实施方式

实施例1定性分析

1、试剂

本发明试验用水为一级水(见GB/T 6682-2008规定)：

a)磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠为分析纯；

b)甲醇、乙腈、二乙胺、异丙醇、醋酸铵、甲酸、乙酸乙酯、环已烷均为色谱纯；

c)磷酸盐缓冲液(pH 5.8)：取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,，分别置于1000mL容量瓶中，加一级水溶解、稀释至刻度；

d)含0.1％甲酸的10mM醋酸铵：称取0.384g的醋酸铵,加入一定量的一级水溶解，并加入0.5mL甲酸混匀，将混合液用一级水稀释至500mL；

e)标准溶液：

1)雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准储备液：精确称取雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准品各10mg，分别于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，配制成1.0mg/mL雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准储备液，冷藏保存6个月；

2)雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准工作液：精确量取1.0mg/mL雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准储备液各10mL，分别于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0.10mg/mL的雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准工作液，冷藏保存1个月。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储备溶液用甲醇稀释而得，冷藏保存为1个月。

2、仪器和材料

a)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)和三重四极杆质量分析器；

b)电子天平：感量0.1mg和0.01g；

c)高速离心机；

d)振荡器；

e)浓缩仪；

f)移液器：量程10μL～100μL，100μL～1000μL，1000μL～5000μL；

g)pH试纸：范围1～14；

h)固相萃取小柱：HLB固相萃取柱或等效固相小柱；

i)微孔有机滤膜：0.22μm。

3、样品萃取

3.1、液液萃取

取血液等液体样品1.0mL～2.0mL或肝等组织样品1.0g～2.0g剪碎于具塞试管中。另取3份相同基质的空白样品，1份作为空白样品，添加雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准品100ng制备成添加样品，混匀。

上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入5.0mL～10.0mL乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min。分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干。残渣用500μL～1000μL初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。

3.2、固相萃取(适用于新鲜血液)

按3.1项制备好样品，加入pH 5.8磷酸盐缓冲液3mL～5mL，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱。取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再以3mL去离子水和0.5％甲醇水溶液【本发明中0.5％甲醇水溶液是指：甲醇水溶液中甲醇的体积分数为0.5％，以下不再赘述】先后淋洗小柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50℃快速浓缩仪上吹干，残渣用500μL～1000μL初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。

4、仪器检测

液相色谱-串联质谱仪条件

以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：

色谱柱：kinetex C18(3.0mm×50mm，2.6μm)柱或等效色谱柱；

流动相及梯度洗脱条件见表1；

表1流动相和梯度洗脱条件

进样量：1μL～10μL；

扫描方式：正离子扫描(ESI+)；

检测方式：多反应监测(MRM)；

电喷雾电压：5500V；

离子源温度：650℃；

雾化气压力：55psi；

气帘气压力：50psi；

辅助气压力：50psi；

监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。

表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能

*雷公藤内酯甲M+18

5、记录和计算

记录各样品及标准品平行进样2～3次中目标物的保留时间及峰面积值，按公式(1)计算回收率：

式中：

R－回收率；

A添－添加样品中标准物质的峰面积平均值；

W纯－标准物质浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V添－添加样品的定容体积，单位为毫升(mL)；

A纯－标准物质的峰面积平均值；

M添－添加样品中标准物质的添加量，单位为微克(μg)。

6、定性结果评价

6.1、阴性结果评价

如果样品未出现与标准品Rt值相同的色谱峰，且添加样品相应目标物的回收率在60％以上，则阴性结果可靠。

如果添加样品中未出现与标准品Rt值相同的色谱峰或回收率低于60％，则阴性结果不可靠。

如果添加样品的添加含量≤0.02μg/mL时，可不计算回收率，则阴性结果按以下方式评价：

如果案件样品未出现与标准品Rt值相同的色谱峰，添加样品的色谱峰信噪比大于10，则阴性结果可靠。

如果添加样品中未出现与标准品Rt值相同的色谱峰或添加样品的色谱峰的信噪比小于等于10，则阴性结果不可靠。

6.2阳性结果评价

如果样品中出现与目标物相同的两对定性离子对，其色谱峰保留时间与添加样品中目标物的色谱峰保留时间比较，相对误差在±2.5％之内，且所选择的相对离子对丰度比与添加样品中的相对离子对丰度比之相对误差不超过表3规定的范围，空白样品中未出现相应的色谱峰，则阳性结果可靠。相关的液相色谱-串联质谱图参见图1～图4。

如果空白样品中出现与添加样品中目标物保留时间一致的色谱峰，且定性离子对及相对丰度一致，则阳性结果不可靠。

本发明中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素在血样中的检出限为1ng/mL。

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度	＞50％	＞20％～50％	＞10％～20％	≤10％
					允许的相对偏差	±20％	±25％	±30％	±50％

实施例2定量分析

1、试剂同实施例1

2、仪器与材料同实施例1

3、样品萃取

准确量取案件样品1.0mL～2.0mL或1.0g～2.0g平行两份；另取相同基质的空白样品两份，分别添加相应目标物标准品(添加量应与案件样品粗测量相近)制备成添加样品，混匀。其他同实施例1。

4、仪器检测同实施例1

5、记录和计算

5.1、计算药物含量

记录各样品平行进样2～3次中目标物峰面积值，按公式(2)计算含量：

式中：

W－单位质量样品中目标物质的含量，单位为微克每克(μg/g)或微克每毫升(μg/mL)；

A样－样品中目标物的峰面积平均值；

M添－添加样品中标准物质的添加量，单位为微克(μg)；

V样－样品的定容体积，单位为毫升(mL)；

A添－添加样品中目标物的峰面积平均值；

M样－样品的取样量，单位为克(g)或毫升(mL)；

V添－添加样品的定容体积，单位为毫升(mL)。

5.2、计算相对相差

记录两份平行操作的样品含量，按公式(3)计算相对相差：

式中：

RD－相对相差；

X1、X2－两份样品平行定量测定的含量数值；

－两份样品平行定量测定含量的平均值。

6、定量结果评价

如果案件样品中目标物含量的RD＞20％，定量数据不可靠。如果目标物含量的RD≤20％，定量数据可靠。其含量按两份案件样品的平均值计算。

实施例3利用非新鲜血液对本发明的方法进行评价

1、试剂，同实施例1。

2、仪器和材料，同实施例1。

3、样品萃取

分别取空白的非新鲜血液2.0mL于具塞试管中，分别添加雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准品制备成添加样品，混匀。

上述样品中分别加一定量的氢氧化钠溶液调pH为9，加入10.0mL乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min。分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相(对二次提取后的无机相进行高效液相色谱分析，样品的提取率为99.9％)，置于50℃浓缩仪上挥干。残渣用500μL初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。

4、仪器检测

液相色谱-串联质谱仪条件

以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：

色谱柱：kinetex C18(3.0mm×50mm，2.6μm)柱或等效色谱柱；

流动相及梯度洗脱条件见表1；

表1流动相和梯度洗脱条件

进样量：1μL～10μL；

扫描方式：正离子扫描(ESI+)；

检测方式：多反应监测(MRM)；

电喷雾电压：5500V；

离子源温度：650℃；

雾化气压力：55psi；

气帘气压力：50psi；

辅助气压力：50psi；

监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。

表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能

*雷公藤内酯甲M+18。

雷公藤内酯甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为87.6％、93.5％、97.8％；RSD％分别为3.6、3.2、1.0。

雷公藤内酯酮添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为87.7％、92.8％、96.7％；RSD％分别为3.5、3.0、1.0。

雷公藤甲素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为88.3％、94.1％、97.4％；RSD％分别为3.8、3.1、1.1。

雷公藤红素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为87.1％、93.9％、98.5％；RSD％分别为3.2、3.3、1.0。

雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素在10～500ng/mL浓度范围内均有着良好的线性关系。

雷公藤内酯甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.32、2.97、2.15，RSD％(日间)分别为3.06、2.82、4.06。

雷公藤内酯酮添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.30、2.78、2.13，RSD％(日间)分别为3.12、2.68、4.02。

雷公藤甲素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.30、2.95、2.25，RSD％(日间)分别为3.01、2.78、4.11。

雷公藤红素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.18、2.90、2.07，RSD％(日间)分别为3.07、2.71、4.12。

以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为2ng/mL，以信噪比3/1计，该方法的最小检出限为0.5ng/mL。

实施例4利用新鲜血液对本发明的方法进行评价

1、试剂，同实施例1。

2、仪器和材料，同实施例1。

3、样品萃取

取空白的新鲜血液2.0mL于具塞试管中，分别添加雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准品制备成添加样品，混匀。

分别加入pH 5.8磷酸盐缓冲液5mL，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱。取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0.5mL/min；再以3mL去离子水和0.5％甲醇水溶液先后淋洗小柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50℃快速浓缩仪上吹干，残渣用1000μL初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。

4、仪器检测

液相色谱-串联质谱仪条件

以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：

色谱柱：kinetex C18(3.0mm×50mm，2.6μm)柱或等效色谱柱；

流动相及梯度洗脱条件见表1；

表1流动相和梯度洗脱条件

进样量：1μL～10μL；

扫描方式：正离子扫描(ESI+)；

检测方式：多反应监测(MRM)；

电喷雾电压：5500V；

离子源温度：650℃；

雾化气压力：55psi；

气帘气压力：50psi；

辅助气压力：50psi；

监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。

表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能

*雷公藤内酯甲M+18。

雷公藤内酯甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为88.2％、95.6％、99.1％；RSD％分别为3.2、3.0、1.5。

雷公藤内酯酮添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为87.7％、92.8％、96.7％；RSD％分别为3.5、3.0、1.0。

雷公藤甲素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为92.2％、97.0％、99.5％；RSD％分别为3.3、3.0、1.0。

雷公藤红素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别为89.1％、94.2％、99.7％；RSD％分别为3.4、3.2、1.4。

雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素在10～500ng/mL浓度范围内均有着良好的线性关系。

雷公藤内酯甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.35、2.86、2.45，RSD％(日间)分别为3.11、2.53、4.00。

雷公藤内酯酮添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.44、2.63、2.22，RSD％(日间)分别为3.31、2.78、4.03。

雷公藤甲素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.26、2.89、2.36，RSD％(日间)分别为3.01、2.96、4.08。

雷公藤红素添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内)分别为1.23、2.93、2.23，RSD％(日间)分别为3.10、2.51、4.03。

以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为2ng/mL，以信噪比3/1计，该方法的最小检出限为0.5ng/mL。

实施例3和实施例4中，回收率的计算、线性关系的得出、以及日内和日间精密度，均采用现有技术中的常规方法：以测得的添加各生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素或雷公藤红素的峰面积与相同浓度雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素或雷公藤红素标准工作溶液峰面积的比值来计算回收率。用测得的雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素或雷公藤红素的峰面积(Y)对生物样品待萃取标准液中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素或雷公藤红素浓度(X)求得线性回归，得到回归方程，进而得到线性关系。计算雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素或雷公藤红素峰面积的相对标准偏差，得到日内精密度；连续测三天，计算雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素或雷公藤红素峰面积三天的相对标准偏差，得到日间精密度。

Claims (3)

1.雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)取生物液体样品1.0mL-2.0mL或生物组织样品1.0g-2.0g剪碎于具塞试管中；加入pH5.8磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的加入量为3mL-5mL，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱；取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再以3mL去离子水和0.5％甲醇水溶液先后淋洗小柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50℃快速浓缩仪上吹干，残渣用500μL-1000μL初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；

b)样品分析：

色谱柱：kinetex C18；进样量：1μL～10μL；流动相：A为含0.1％甲酸的10mM甲酸铵，B为甲醇；梯度洗脱：0.2min，A为95％，B为5％；3.0min，A为5％，B为95％；5.0min，A为5％，B为95％；5.1min，A为95％，B为5％；7.0min，A为95％，B为5％；流速为0.5mL/min；

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：5500V；离子源温度：650℃；雾化气压力：55psi；气帘气压力：50psi；辅助气压力：50psi。

2.根据权利要求1所述的检验方法，其中液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样品为肝脏、肾脏。

3.根据权利要求1所述的检验方法，其中C18柱为3.0mm×50mm，2.6μm柱。