CN107271599A

CN107271599A - 一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线spe lc-ms/ms分析方法

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Publication number: CN107271599A
Application number: CN201610214033.5A
Authority: CN
Inventors: 张玉荣; 姜凤丽; 倪春芳; 梁晨; 汪蓉
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF CRIMINAL SCIENCE AND TECHNOLOGY
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF CRIMINAL SCIENCE AND TECHNOLOGY
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2017-10-20

Abstract

一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线SPE LC‑MS/MS分析方法，该分析方法中唾液样品采用在线固相萃取，固相萃取过程中选择HySphere Resin GP(10mm×2mm)柱；色谱分离采用C18色谱柱，以流动相水(含2mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸)和流动相乙腈(含2mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸)梯度洗脱；质谱采用电喷雾电离(ESI)，多反应监测(MRM)模式检测目标化合物。本发明首次建立了一个简单、灵敏、稳定的、全自动的在线SPE LC‑MS/MS方法用来定量人唾液中的地西泮及其5种代谢物(去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物和替马西泮葡萄糖醛酸结合物)。

Description

一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线SPE LC-MS/MS分析方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线SPELC-MS/MS分析方法，更具体涉及一种定量检测人唾液中地西泮及其5种代谢物的在线SPELC-MS/MS分析方法。

背景技术

人的唾液绝大部分是由水分组成，其他包括有机物(黏蛋白、唾液淀粉酶、溶菌酶、免疫球蛋白、尿素、尿酸和游离氨基酸等)、无机物(Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Cl^-、HCO^3-)以及细胞碎片等。近几年来，唾液受到了法医毒物分析工作者越来越多的青睐和欢迎，将其用于药毒物的筛查。尽管唾液中的药毒物浓度不能用于推算血液中的真实浓度水平，但可以反映个体的近期用药情况，仍有非常重要的分析价值。与血液和尿液相比，唾液具有易收集、对人体无损害、不易掺假和替换、前处理简单等优点，成为了血液和尿液检材的良好替代品。

目前已报道的唾液中地西泮及其代谢物的分析方法都是基于固相萃取液质联用(SPE LC-MS)、液液萃取液质联用(LLE LC-MS)，这些方法的样品前处理比较复杂、费时，并且只分析了地西泮的游离代谢物(去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮)，没有对其Ⅱ相代谢物进行分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线SPE LC-MS/MS分析方法，建立一种全自动的在线固相萃取液质联用(online SPE LC-MS/MS)方法，用于定量检测唾液中的地西泮及其5种代谢物(去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物)，克服了离线萃取技术操作繁琐、费时费力的缺点，降低了操作误差。

为达到上述目的，本发明的主要技术方案如下：

一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线SPE LC-MS/MS分析方法，所述的SP ELC-MS/MS的检测条件如下：

1)在线固相萃取(online SPE)条件：

对唾液样品进行在线固相萃取，在线固相萃取小柱是HySphere Resin GP(10mm×2mm)柱。具体萃取过程如下：

活化：1mL甲醇，1mL/min；

平衡：1mL超纯水，1mL/min；

载样：0.5mL超纯水，0.7mL/min；

淋洗1：1mL超纯水，1mL/min；

淋洗2：1mL 15％甲醇，1mL/min；

洗脱：250μL乙腈，0.1mL/min；

2)LC-MS色谱条件：

色谱柱：WatersMS C18，2.1mm×150mm，3.5um；

柱温：40℃；

进样量：50μL；

流动相由A、B组成，其中A为含2mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸的水；B为含2mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸的乙腈；

3)MS质谱条件：

电离模式：ESI+；扫描方式：MRM；离子喷雾电压：5500V；离子喷雾温度：600℃；气帘气：30psi；喷雾气：50psi；辅助加热气：60psi；碰撞室出口电压：10V；

所述地西泮的代谢物包括：去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物。

进一步，LC-MS色谱检测过程中所述流动相的梯度洗脱程序如表1所示：

表1

本发明的MS质谱分析过程中各分析物的MRM参数及内标如表2所示，其中标注“a”的子离子是定量离子：

表2

再，所述唾液样品在检测之前进行预处理：取唾液样品于离心管中，然后加入超纯水和混合内标工作液，涡旋，离心，取上清液进样；所述混合内标工作液为含地西泮-d5、奥沙西泮-d5、去甲西泮-d5、替马西泮-d5、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物-d5的甲醇，其中，地西泮-d5、奥沙西泮-d5、去甲西泮-d5、替马西泮-d5、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物-d5的浓度均为500ng/mL。

本发明的有益效果：

本发明首次建立了一个简单、灵敏、稳定的、全自动的在线SPE LC-MS/MS方法用来定量人唾液中的地西泮及其5种代谢物(去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物和替马西泮葡萄糖醛酸结合物)。

本发明所述SPE LC-MS/MS方法中地西泮、去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物和替马西泮葡萄糖醛酸结合物的检测限为0.05-0.1ng/mL，检测限为0.1-0.25ng/mL；地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物和替马西泮葡萄糖醛酸结合物的线性范围是0.1-100ng/mL，奥沙西泮的线性范围是0.25-250ng/mL，各分析物的相关系数R在线性范围内均大于0.99，线性关系良好；各分析物的日内精密度为0.6-12.8％，日内准确度为96.7-114.7％；日间精密度为1.0-9.2％，日间准确度为95.6-108.1％；所有分析物的方法回收率为65.1-80.8％。经过方法学验证，所建方法符合美国FDA对生物样品分析方法的要求。

附图说明

图1为本发明实施例2不同比例的甲醇溶液与分析物回收率的关系示意图。

图2为本发明实施例3空白唾液中定量离子色谱图。

图3为本发明实施例3各分析物定量离子在检测限处的色谱图。

图4为本发明实施例3各分析物定量离子在定量限处的色谱图。

图5为本发明实施例3唾液样品中各分析物标准品定量离子的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。列出的实施例是对本发明最佳实施方式的描述，但最佳实施方式并不对本发明的范围有任何限制。

本发明所用试剂及仪器如未特殊说明，其来源如下：

1、标准品

地西泮对照品粉末、奥沙西泮对照品粉末均购自中国药品生物制品检定所；去甲西泮对照品溶液(1.0mg/mL)、替马西泮对照品溶液(1.0mg/mL)、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物对照品溶液(100μg/mL)、替马西泮葡萄糖醛酸结合物锂盐(100μg/mL)、地西泮-d5(100μg/mL)：Gerilliant公司、奥沙西泮-d5(100μg/mL)、去甲西泮-d5(100μg/mL)、替马西泮-d5(100μg/mL)、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物-d5(100μg/mL)均购自Gerilliant公司。

2、试剂

超纯水由ELGA纯水仪制备，甲醇、乙腈、异丙醇(色谱级)购于Merck公司，甲酸铵、甲酸(色谱级)购于GNW科技股份有限公司。

3、仪器

Spark1240液相系统：Spark公司；

AB 4000QTRAP质谱仪：SCIEX公司；

CP225D电子天平：Sartorius AG公司；

DL-360B型智能超声波清洗器：上海之信仪器有限公司；

飞鸽牌低速离心机TDL-80-2B：上海安亭科学仪器厂；

Eppendorf Centrifuge 5424离心机：Eppendorf公司；

Vortex-Genie 2涡旋振荡器：Scientific Industries公司；

HySphere Resin GP cartridges(10mm×2mm)：Spark公司；

Salivette唾液收集器：Sarstedt公司。

实施例1

1)溶液的配制

1.1储备液和工作液的配制

地西泮储备液：精密称取地西泮对照品粉末1mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为100μg/mL的地西泮储备液。

奥沙西泮储备液：精密称取奥沙西泮对照品粉末1mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为100μg/mL的奥沙西泮储备液。

去甲西泮储备液：精密移取去甲西泮对照品溶液1mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度为100μg/mL的去甲西泮储备液。

替马西泮储备液：精密移取替马西泮对照品溶液1mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度为100μg/mL的去甲西泮储备液。

奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物储备液：精密移取奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物对照品溶液1mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度为10μg/mL的奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物储备液。

替马西泮葡萄糖醛酸结合物储备液：精密移取替马西泮葡萄糖醛酸结合物对照品溶液1mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度为10μg/mL的替马西泮葡萄糖醛酸结合物储备液。

混合内标储备液：精密移取地西泮-d5、奥沙西泮-d5、去甲西泮-d5、替马西泮-d5、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物-d5对照品溶液各1mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度均为10μg/mL的混合内标储备液。

混合工作液：精密移取地西泮储备液100μL、去甲西泮储备液100μL、奥沙西泮储备液250μL、替马西泮储备液100μL、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物储备液1000μL、替马西泮葡萄糖醛酸结合物储备液1000μL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度分别为1μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、1μg/mL、1μg/mL的地西泮、去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物混合工作液。

混合内标工作液：精密移取混合内标储备液500μL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度均为500ng/mL的地西泮-d5、奥沙西泮-d5、去甲西泮-d5、替马西泮-d5、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物-d5的混合内标工作液。

上述溶液放置在4℃的冰箱中保存。

1.2淋洗液和洗脱液的配制

5％甲醇溶液：精密移取甲醇5mL于100mL的容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即配得5％甲醇溶液。

10％甲醇溶液：精密移取甲醇10mL于100mL的容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即配得5％甲醇溶液。

15％甲醇溶液：精密移取甲醇15mL于100mL的容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即配得15％甲醇溶液。

20％甲醇溶液：精密移取甲醇20mL于100mL的容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即配得20％甲醇溶液。

25％甲醇溶液：精密移取甲醇25mL于100mL的容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即配得25％甲醇溶液。

70％乙腈溶液：精密移取70mL于100mL的容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即配得70％乙腈溶液。

80％乙腈溶液：精密移取80mL于100mL的容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即配得80％乙腈溶液。

90％乙腈溶液：精密移取90mL于100mL的容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即配得90％乙腈溶液。

上述溶液放置在4℃的冰箱中保存。

1.3空白唾液的收集

把Salivette唾液收集器放在口中轻轻咀嚼3-5min，取出后离心10min(2294rpm)，离心出来的液体即是空白唾液，将其转移到试管中，放置在-20℃的冰箱中保存。

1.4标准曲线样品和质控样品的制备

标准曲线工作液：将混合工作液用甲醇逐级稀释得到地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物浓度为1、2、8、40、200、500、800、1000ng/mL，奥沙西泮浓度为2.5、5、20、100、500、1250、2000、2500ng/mL的标准曲线系列工作液。

质控工作液：将混合工作液用甲醇逐级稀释得到地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物浓度为2、500、800ng/mL，奥沙西泮浓度为5、1250、2000ng/mL的低、中、高质控工作液。

标准曲线样品：精密移取标准曲线系列工作液10μL于2mL塑料离心管中，然后精密加入人空白唾液100μL，得到地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物浓度浓度为0.1、0.2、0.8、4、20、50、80、100ng/mL，奥沙西泮浓度为0.25、5、2、10、50、125、200、250ng/mL的系列标准曲线唾液样品。

质控样品：精密移取低、中、高质控工作液10μL于2mL塑料离心管中，然后精密加入人空白唾液100μL，得到地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物浓度为0.2、50、80ng/mL，奥沙西泮浓度为0.5、125、200ng/mL的低、中、高质控样品。

2)预处理方法

精密移取100μL唾液样品于2mL塑料离心管中，然后加入100μL超纯水和10μL混合内标工作液，涡旋，14000rpm离心10min，取上清液50μL进样。

3)在线固相萃取(online SPE LC)方法

采用全自动的Spark online SPE-LC系统对唾液样品进行在线固相萃取，在线固相萃取小柱是HySphere Resin GP(10mm×2mm)柱。具体萃取过程如下：

活化：1mL甲醇 1mL/min；

平衡：1mL超纯水 1mL/min；

载样：0.5mL超纯水 0.7mL/min；

淋洗1：1mL超纯水 1mL/min；

淋洗2：1mL 15％甲醇 1mL/min；

洗脱：250μL乙腈 0.1mL/min。

4)液质条件

4.1色谱条件

色谱柱：WatersMS C18，2.1mm×150mm，3.5um；

保护柱：WatersMS C18，2.1mm×10mm，3.5um；

柱温：40℃；

进样量：50μL；

流动相A：2mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸的水；

流动相B：2mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸的乙腈；

梯度洗脱程序按表1进行。

4.2质谱条件

电离模式：ESI+；扫描方式：MRM；离子喷雾电压：5500V；离子喷雾温度：600℃；气帘气(Curtain Gas)：30psi；母离子Q1、子离子Q3分辨率(Resolution Q1、Q3)：Unite；碰撞气(CAD)：Medium；喷雾气(GS1)：50psi；辅助加热气(GS2)：60psi；Q0入口电压(EP)：10V；碰撞室出口电压(Collision cell exit potential)：10V；各分析物的MRM优化参数及内标应用参见表2，其中标注“a”的子离子是定量离子。

实施例2

1)在线固相萃取小柱的选择

地西泮、去甲西泮、替马西泮和奥沙西泮是弱碱性化合物，奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物和替马西泮葡萄糖醛酸结合物是弱酸性化合物并且极性非常大，本实施例选择三种在线萃取小柱：HySphere Resin SH小柱、HySphere C18HD小柱和HySphere Resin GP小柱来考察各分析物在小柱上的保留作用。

结果显示，就峰面积而言，HySphere Resin SH小柱对各分析物的保留作用最强，但是，各分析物在小柱上很难被洗脱下来，特别是地西泮，峰展宽大约5min，此外，地西泮、去甲西泮和替马西泮不能完全分离；当选用HySphere C18HD小柱时，各分析物可以被很好地分离开来，但其表现出比较差的保留作用，特别是对奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物和替马西泮葡萄糖醛酸结合物，当用10％甲醇溶液作为淋洗液时，它们就会被淋洗下来；HySphereResin GP小柱相对于HySphere C18HD小柱对各分析物具有较好的保留作用，且可以把分析物完全分开，因此本发明选择HySphere Resin GP小柱作为在线固相萃取小柱。

2)在线固相萃取中淋洗溶液的优化

Spark在线固相萃取系统可设置12种不同的溶液来淋洗杂质。本实施例考察了不同比例的甲醇溶液(5％、10％、15％、20％、25％)作为淋洗溶液时对分析物峰面积的影响。用回收率即分析物在唾液基质的峰面积与其在超纯水中的峰面积的比值作为考察的指标，具体结果见图1。

由图1可知，当甲醇浓度从5％增加至25％时，地西泮、去甲西泮、替马西泮和奥沙西泮的回收率没有明显的变化；随着甲醇比例的增加，奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物和替马西泮葡萄糖醛酸结合物的回收率逐渐降低，当使用20％的甲醇溶液作为淋洗溶液时，奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物的回收率有了很大的降低，因此，本发明选择15％的甲醇溶液作为淋洗溶液。

3)在线固相萃取中洗脱溶液的优化

本实施例考察了250μL不同比例的乙腈溶液(70％、80％、90％、100％)作为洗脱液时各分析物的峰面积的大小。结果显示，用100％的纯乙腈作为洗脱液时，各分析物的峰面积最大。因此，选择100％的纯乙腈作为洗脱溶液。

实施例3方法学验证

1)专属性

取6个来源不同的空白唾液，将混合内标工作液替换成相同体积的甲醇，其他按实施例1中预处理方法进行预处理，然后进样，考察所建方法的专属性，各分析物的色谱图参见图2。

由图2可知，在各分析物及内标出峰位置未见内源性杂质干扰，因此，专属性实验符合要求。

2)灵敏度

取空白唾液，添加一定量的分析物标准品，按实施例1中预处理方法进行预处理，然后进样。要求各分析物在检测限(LOD)处的信噪比S/N≥3，定量限(LOQ)处的信噪比S/N≥10。

本实施例中各分析物的检测限和定量限参见表3，由表3可知，地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物的检测限为0.05ng/mL，奥沙西泮的检测限为0.1ng/mL；地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物的定量限为0.1ng/mL，奥沙西泮的定量限为0.25ng/mL。

各分析物在检测限处的MRM色谱图参见图3，由图3可知，地西泮、去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物在检测限处的S/N分别是14.5、6、5.8、3.3、6.8、19.5。

各分析物在定量限处的MRM色谱图参见图4，由图4可知，地西泮、去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物在定量限处的S/N分别是38.4、28.1、32.3、16.3、21.8、155.3。

添加各分析物标准品的色谱图参见图5，由图5可知，地西泮、去甲西泮、奥沙西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物的保留时间分别是9.02min、7.97min、7.37min、8.10min、6.48min、6.71min。

3)标准曲线

将地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物浓度为0.1、0.2、0.8、4、20、50、80、100ng/mL，奥沙西泮浓度为0.25、5、2、10、50、125、200、250ng/mL的系列标准曲线唾液样品按实施例1中预处理方法进行预处理，然后进样。以分析物的浓度为横坐标，分析物面积与内标物面积的比值为纵坐标，用加权最小二乘法(1/X2)进行回归计算，得到的回归直线方程就是标准曲线。

各分析物的线性范围和相关系数参见表3。由表3可知，地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物的线性范围是0.1-100ng/mL，奥沙西泮的线性范围是0.25-250ng/mL。各分析物的相关系数R在线性范围内均大于0.99，线性关系良好。

4)精密度和准确度

将实施例1制备的低、中、高质控样品按实施例1中预处理方法进行预处理，然后进样分析。每个浓度重复测定5次，连续测定3天。精密度用RSD表示，准确度＝测得浓度/理论浓度×100％，具体结果见表4。由表4可知，各分析物的日内精密度在0.6-12.8％之间，日内准确度在96.7-114.7％之间；日间精密度在1.0-9.2％之间，日间准确度在95.6-108.1％之间。

5)方法回收率

由于在线固相萃取技术无法进行提取后加标和柱后灌流实验，无法考察所建方法的基质效应和提取回收率。方法回收率反映的是基质效应和提取回收率的综合结果，将实施例1制备的低、中、高质控样品按预处理方法进行预处理，进样分析；取对应浓度的低、中、高质控工作液，除空白唾液改为相同体积的超纯水以外，其他按照“质控样品”的配制方法配成水标，然后按实施例1中进行预处理，进样分析。用各分析物在质控样品中的峰面积与其在水标中的峰面积的比值来表示方法回收率，其结果参见表5。

由表5可知，所有分析物的方法回收率在65.1～80.8％之间，其中地西泮的方法回收率最低，分别是65.1％(0.2ng/mL)、71.0％(50ng/mL)、69.6％(80ng/mL)。

6)收集装置的回收率

根据文献报道的方法来评估收集装置的回收率，考察收集装置对各分析物的吸附情况。通过直接吐的方式，收集空白唾液，添加质控工作液，配制成地西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物、替马西泮葡萄糖醛酸结合物浓度为0.2、50、80ng/mL，奥沙西泮浓度为0.5、125、200ng/mL的唾液样品，然后用唾液收集器收集、离心，取离心出来的液体按实施例1中预处理方法进行预处理，进样分析，此时各分析物的峰面积用A表示；质控样品按实施例1中预处理方法进行预处理后的峰面积用B表示。收集装置的回收率＝A/B×100％，结果见表5。

由表5可知，Salivette收集器对地西泮、去甲西泮和奥沙西泮有轻微的吸附，其收集装置回收率分别为72.9-80.4％，66.2-69.5％，73.7-80.1％。

7)稳定性

稳定性实验考察了以下四种情况：短期稳定性、处理后稳定性、冻融稳定性和长期稳定性。短期稳定性实验是将质控样品放置在实验台上7h后，按实施例1中预处理方法进行预处理，进样分析；处理后稳定性实验是将质控样品按实施例1中预处理方法进行预处理后，放置在4℃的进样盘中24h，然后进样分析；冻融稳定性实验是将质控样品放置在-40℃的冰箱中24h，然后室温融化30min，连续经历过三个冻融循环后按实施例1中预处理方法进行预处理，进样分析；长期稳定性实验是将质控样品放置在-40℃的冰箱中10天后按实施例1中预处理方法进行预处理，进样分析，具体结果参见表6。

由表6可知，各分析物在实验台放置7h和进样器放置24h后是稳定的，其准确度在92.9-111.3％之间。三次冻融循环之后，各分析物在浓度为50ng/mL时的准确度为116.4-122.0％，有点略微的增加。长期稳定性实验中，地西泮和奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物在浓度为50ng/mL和80ng/mL时的准确度在117-118.3％之间。

Claims

1.一种人唾液中地西泮及其代谢物的在线SPE LC-MS/MS分析方法，所述的SPE LC-MS/MS的检测条件如下：

1)在线固相萃取条件：

对唾液样品进行在线固相萃取，在线固相萃取小柱是HySphere Resin GP柱；具体萃取过程如下：

活化：1mL甲醇，1mL/min；

平衡：1mL超纯水，1mL/min；

载样：0.5mL超纯水，0.7mL/min；

淋洗1：1mL超纯水，1mL/min；

淋洗2：1mL 15％甲醇，1mL/min；

洗脱：250μL乙腈，0.1mL/min；

2)LC-MS色谱条件：

色谱柱：WatersMS C18，2.1mm×150mm，3.5um；

柱温：40℃；

进样量：50μL；

3)MS质谱条件：

电离模式：ESI+；扫描方式：MRM；离子喷雾电压：5500V；离子喷雾温度：600℃；气帘气压力：30psi；喷雾气压力：50psi；辅助加热气压力：60psi；碰撞室出口电压：10V；

2.根据权利要求1所述的在线SPE LC-MS/MS分析方法，其特征在于，LC-MS色谱检测过程中所述流动相的梯度洗脱程序如下：

3.根据权利要求1所述的在线SPE LC-MS/MS分析方法，其特征在于，MS质谱分析过程中各分析物的MRM参数及内标如下：

4.根据权利要求1所述的在线SPE LC-MS/MS分析方法，其特征在于，所述唾液样品在检测之前进行预处理：取唾液样品于离心管中，然后加入超纯水和混合内标工作液，涡旋，离心，取上清液进样；所述混合内标工作液为含地西泮-d5、奥沙西泮-d5、去甲西泮-d5、替马西泮-d5、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物-d5的甲醇，其中，地西泮-d5、奥沙西泮-d5、去甲西泮-d5、替马西泮-d5、奥沙西泮葡萄糖醛酸结合物-d5的浓度均为500ng/mL。