CN115078309A - 一种基于stat3蛋白生物效应的安宫牛黄丸质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于STAT3蛋白生物效应的安宫牛黄丸质量评价方法，它是采用表面等离子体共振(SPR)检测技术，具体包括如下步骤：1)蛋白芯片的构建；2)供试品溶液的制备；3)对照品溶液的制备；4)分别取供试品溶液和对照品溶液进样进行SPR检测，分析流过蛋白芯片表面与STAT‑3蛋白结合，测定对应的响应值(RU值)。质量评价标准为供试品RU值与对照品RU值的比值应不小于1。本发明经方法学优化和验证，准确性高，能反映出安宫牛黄丸临床治疗的有效性，进一步完善了安宫牛黄丸的质量控制体系，具备实际应用推广价值。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及基于STAT3蛋白生物效应的安宫牛黄丸质量评价方法。
背景技术
安宫牛黄丸由牛黄、水牛角浓缩粉、麝香、珍珠、朱砂、雄黄、黄连、黄芩、栀子、郁金、冰片等十一味中药材组成，具有清热解毒、镇惊开窍的功效，用于热病，邪入心包，高热惊厥，神昏谵语，中风昏迷及脑炎、脑膜炎、中毒性脑病、脑出血、败血症见上述证候者。《中国药典》(2020年版一部)安宫牛黄丸质量标准包括性状、鉴别、检查、含量测定等项目。鉴别项主要包括水牛角浓缩粉、珍珠、朱砂、雄黄、黄连、黄芩、栀子、郁金的显微鉴别以及胆酸、盐酸小檗碱、冰片、麝香酮的鉴别方法。含量测定以胆红素、黄芩苷、盐酸小檗碱的含量为指标。虽然安宫牛黄丸的质量标准涵盖了处方中全部药味的质量控制，但由于中药成分的复杂性，相当多药效物质基础尚未得到充分阐明，以个别指标性化学成分控制中药质量的模式存在与临床有效性、安全性关联不紧密的问题。
中国发明专利CN109633037B公开了安宫牛黄丸的UPLC指纹图谱构建方法和检测方法，建立的UPLC指纹图谱在30min内共标定了25个共有峰，并指认了其中的17个色谱峰，可更为全面、准确地控制制剂的化学成分，但指纹图谱容易受到药材品种、产地、种植条件、采收期、炮制加工方法、实验条件等多种因素影响，并且在指纹图谱与药理作用的相关性方面缺乏研究，故限制了其实际应用。
目前未见利用生物效应评价法进行安宫牛黄丸质量控制的相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种反映和评价安宫牛黄丸药理作用的生物效应检测方法，用以弥补现有安宫牛黄丸质量标准与临床有效性、安全性关联不紧密的问题，进一步完善产品的质量控制体系。
本发明还提供了一种基于STAT3蛋白生物效应的安宫牛黄丸质量评价方法，它是采用SPR检测，具体包括如下步骤：
1)蛋白芯片的构建：取STAT3蛋白加水溶解，再加醋酸钠缓冲液稀释成10～40μg/ml的蛋白溶液，取蛋白溶液，与传感器芯片偶联，即得；
2)供试品溶液的制备：取安宫牛黄丸，加80％甲醇溶液提取，提取液离心，取上层清液干燥，加DMSO复溶，过滤，滤液加PBS溶液混匀，即得；
3)对照品溶液的制备：取小檗碱，加DMSO溶解，溶解液加PBS溶液和含DMSO的PBS溶液混匀，即得；
4)分别取步骤2)所得供试品溶液和步骤3)所得对照品溶液，置于载有步骤1)所得蛋白芯片的表面等离子共振测试孔板中；
SPR检测条件：运行时间：60s；流速：30μl/min，解离时间：60s，温度：25℃。运行缓冲液：5％DMSO的PBS。
进一步地，步骤1)所述蛋白溶液为20μg/ml。
进一步地，步骤1)所述偶联为氨基偶联；所述氨基偶联的参数为传感器芯片型号：CM7或CM5，接触时间：420s，流速：10μl/min，温度：25℃，偶联试剂：EDC和NHS，封闭用试剂乙醇胺，运行缓冲液：1×HBS-EP。
进一步地，所述芯片型号：CM7，所述蛋白溶液、EDC和NHS、乙醇胺的体积比为100：200：140；所述EDC和NHS的体积比为1：1。
进一步地，步骤2)所述安宫牛黄丸与80％甲醇溶液的质量体积比为0.1g：5～25ml；所述提取为超声提取，时间20～60min，功率20～80kHz,100～500W；所述离心的速度5000～25000r，时间5～25min；所述DMSO的加入量为上清液的15～25倍。
进一步地，步骤3)所述溶解液中小檗碱的浓度为10mM；所述溶解液、PBS溶液和含DMSO的PBS溶液的体积比为5μl：95μl：900μl。
更进一步地，所述含DMSO的PBS溶液中DMSO浓度为5％。
进一步地，所述SPR检测的安宫牛黄丸的RU值与小檗碱的RU值的比值不小于1。
本发明还提供了一种STAT3蛋白作为生物质量标志物在安宫牛黄丸质量检测中的应用。
进一步地，所述检测是采用表面等离子体共振法检测安宫牛黄丸生物效应。
本发明通过构建安宫牛黄丸成分靶点-脑卒中疾病靶点的PPI网络，筛选安宫牛黄丸临床治疗脑卒中的潜在靶点，建立生物质量标志物筛选模型，最终筛选得到STAT3靶点蛋白作为安宫牛黄丸的最佳生物质量标志物。
本发明采用STAT3蛋白垂钓芯片进行安宫牛黄丸的化学成分垂钓，经生物质量标志物活性验证筛选得到10个活性化合物，经方法学优化和验证，建立了基于STAT3的安宫牛黄丸生物效应检测方法，该方法简单，操作方便，准确性高，能反映出安宫牛黄丸临床治疗的有效性，进一步完善安宫牛黄丸的质量控制体系，具备实际应用推广价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。
附图说明
图1 5种蛋白在芯片上的预富集结果
图2安宫牛黄丸对STAT3蛋白的SPR预筛选结果
图3安宫牛黄丸对DKK-1蛋白的SPR预筛选结果
图4垂钓组分的LC-Q-TOF-MS图
图5三种蛋白浓度的预富集结果
图6小檗碱的浓度选择
图7 STAT3在CM7上的预富集结果
图8 STAT3在NTA上的预富集结果
图9 STAT3在CM5上的预富集结果
具体实施方式
实施例1本发明安宫牛黄丸质量检测
1)蛋白芯片的构建：
取STAT3蛋白加无菌水溶解，得500μg/ml的蛋白母液，取8μl蛋白母液，加192μl的10mM pH5.0醋酸钠缓冲液混匀，得20μg/ml的蛋白溶液；
启动表面等离子共振仪，设置通道1为空白单元，通道2为偶联单元，取蛋白溶液100μl，与CM7芯片氨基偶联，偶联参数为：接触时间：420s，流速：10μl/min，温度：25℃，偶联试剂为各100μl的EDC和NHS(来自氨基偶联试剂盒，EDC和NHS的体积比为1：1)，采用140μl的乙醇胺(ethanolamine，来自氨基偶联试剂盒)用于封闭；运行缓冲液：1×HBS-EP；
2)供试品溶液的制备：
取0.1g安宫牛黄丸丸剂，置于25ml三角瓶中，加入80％甲醇10ml，超声提取30min(50kHz,350W)，用80％甲醇补足减失重，14000r离心10min，精密吸取上清液2ml，4℃离心浓缩挥干，加入200μl DMSO复溶，过0.22μm孔滤膜，精密吸取10μl，加入190μl PBS 1×溶液，混匀即得；
3)对照品溶液的制备：
精密称取小檗碱，用DMSO配制成母液浓度10mM，取5μl对照品母液，加入95μl PBS1×和900μl含5％DMSO的PBS溶液的混匀，即得；
4)分别取步骤2)所得供试品溶液和步骤3)所得对照品溶液，置于载有步骤1)所得蛋白芯片的表面等离子共振测试孔板中；
SPR检测条件：运行时间：60s；流速：30μl/min；解离时间：60s；温度：25℃；运行缓冲液：5％DMSO的PBS。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果：
试验例1
一、生物质量标志物(蛋白靶点)的筛选
1.实验仪器与试药
Biacore T200(美国GE公司)、Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)蛋白：STAT3(英国Abcam，ab268982)、DKK-1(英国Abcam，ab155623)、VEGFR1(英国Abcam，ab84771)、TRPM7(英国Abcam，批号ab153385)、PKM2(英国Abcam，ab153385)
缓冲液：HBS-EP+10×缓冲溶液(美国GE，BR-1006-69)、PBS 10×缓冲溶液(美国GE，BR-1006-72)、DMSO(德国VETEC，V900090)、CM5传感芯片(美国GE，BR-1005-30)、无菌水为MillQ超纯水经高压灭菌后使用；氨基偶联试剂盒(美国GE，BR-1000-50)、醋酸钠pH4.5(美国GE，BR-1003-50)、醋酸钠pH5.0(美国GE，BR-1003-51)、醋酸钠pH5.5(美国GE，BR-1003-52)、NaOH 50(美国GE，BR-1003-58)、阳性药雷公藤红素(成都曼思特生物科技有限公司A0106)、阴性药Aliertib(MLN 8237)，购买于Med Chem Express公司、安宫牛黄丸(龙晖药业有限公司，批号：2021004、2021005、2021006)。
2.实验方法与结果
2.1溶液制备
2.1.1蛋白溶液制备
精密吸取STAT3，DKK，VEGFR1，TRPM7，PKM2蛋白，加无菌水稀释为500μg/ml的蛋白母液，供蛋白芯片构建使用；
2.1.2芯片构建的缓冲液的配制
本实验缓冲液选用的是HBS-EP，将10×HBS-EP稀释10倍，配置500ml的运行缓冲液。
2.1.3 Biacore蛋白芯片筛选运行缓冲液的配制
用超纯水将PBS 10×缓冲液稀释10倍得到PBS 1×缓冲液，取PBS 1×缓冲液，加入DMSO制成5％(ml/ml)DMSO的PBS溶液，作为Biacore蛋白芯片筛选运行缓冲液。
2.1.4供试品的制备
样品溶液的制备：取0.1g安宫牛黄丸丸剂，置于25ml三角瓶中，加入80％甲醇10ml，超声提取30min(50kHz,350W)，用80％甲醇补足减失重，14000r离心10min，精密吸取上清液2ml，离心浓缩挥干，加入200μl DMSO复溶，过0.22μm孔滤膜，精密吸取10μl，加入190μl PBS 1×溶液，混匀即得。
阳性药雷公藤红素的配制：精密称取雷公藤红素适量，用DMSO配制成母液浓度10mM，取5μl对照品母液，加入95μl PBS 1×和900μl含5％DMSO的PBS溶液混匀，配置成溶液浓度为50μM的含5％DMSO的PBS溶液，即得。阴性药Aliertib同法制备。
2.2蛋白芯片构建
2.2.1蛋白预富集
1)取4μl配体(5种蛋白溶液)，分别加入96μl pH5.5的醋酸钠缓冲液中充分混匀，配体的最终浓度约为20μg/ml。
2)蛋白预富集Flow rate：10μl/min；Flow path：Flow path 2，选择Sample andReagent Rack1模式进行预富集；Contact time：120s。
3)预富集结果见图1，其中TRPM7和PKM2与CM5芯片不能富集，VEGFR1的蛋白偶联量过低(靶蛋白固定量RU值＝靶蛋白分子量×待测物RU值/待测分子量，待测物RU值设置为100RU)，未能达到预期富集量(一般10000以上)。STAT3和DKK-1可以和CM5芯片偶联，并达到预期富集量(10000以上)，所以根据五种蛋白的预富集结果选择STAT3和DKK-1作进一步的偶联考察。
2.2安宫牛黄丸对STAT3和DKK-1蛋白的SPR预筛选
取安宫牛黄丸样品、阳性药雷公藤红素、阴性药Aliertib的测试溶液，分别精密吸取100μl置于Biacore测试96孔板中，样品在芯片筛选运行时间contact time：60s；Flowrat：30μl/min，Dissociation time：60s，温度：25℃。Running Buffer：5％DMSO的PBS，上述样品液与STAT3蛋白和DDK-1实验结果见图2和图3。由图可知，在STAT3蛋白芯片上，安宫牛黄丸提取物样品与其有良好的响应信号，优于阳性雷公藤红素，而芯片模型中的阴性和溶剂均呈现空白；但是对于DKK-1蛋白芯片，虽然阳性(采用DKK-1中和抗体，20μg/ml)有响应信号，阴性和溶剂均呈现空白信号，安宫牛黄丸响应值远低于安宫牛黄丸在STAT3上的响应值，因此经过蛋白靶点的初筛，确定STAT3蛋白作为进一步研究的靶点。
3.讨论
根据安宫牛黄丸的临床功效定位，选择功能相关靶点蛋白STAT3(调控Th17/Treg)，DKK-1(调控Wnt通路)，VEGF受体(调控VEGF通路)，TRPM离子通道(调控离子通道)，PKM2/MMP(调控血脑屏障通透性)，通过初步构建Q-biomarker筛选模型，结果表明蛋白STAT3作为靶点响应较好，可以作为进一步生物质量标志物垂钓的蛋白，因此以STAT3蛋白芯片做进一步的垂钓研究。
二、安宫牛黄丸的靶点Q-biomarker垂钓及成分鉴定
构建生物质量标志物STAT3的蛋白垂钓芯片，进行安宫牛黄丸的化学成分垂钓筛选，垂钓组分经LC-MS鉴定和对照品比对。
1.仪器与试药
仪器：Biacore T200(美国GE公司)、超高压输液系统(型号I-class plus)串联Zevo XS型高分辨飞行时间质谱仪(美国Waters公司)、CPA225D十万分之一分析天平(Sartorius公司)、Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。
蛋白：STAT3(英国abcam，ab268982)。
缓冲液：HBS-EP+10×缓冲溶液(美国GE，BR-1006-69)、PBS 10×缓冲溶液(美国GE，BR-1006-72)、DMSO(德国VETEC，V900090)。
无菌水为MillQ超纯水，经高压灭菌后使用。
CM5传感芯片(美国GE，BR-1005-30)、氨基偶联试剂盒(美国GE，BR-1000-50)、醋酸钠pH4.5(美国GE，BR-1003-50)、醋酸钠pH5.0(美国GE，BR-1003-51)、醋酸钠pH5.5(美国GE，BR-1003-52)、NaOH 50(美国GE，BR-1003-58)、用于定性鉴定用的14种化合物购自成都曼思特生物科技有限公司。安宫牛黄丸(龙晖药业有限公司，批号：2021004、2021005、2021006)、甲醇、乙腈(质谱纯，德国默克公司)、甲酸(色谱纯，批号F190210，阿拉丁试剂上海有限公司)，其余试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2.1溶液配制
2.1.1芯片构建的缓冲液的配制
本实验缓冲液选用的是HBS-EP，将10×HBS-EP稀释10倍，配置500ml的运行缓冲液。
2.1.2供试品制备
垂钓供试品的制备：取0.1g安宫牛黄丸丸剂，置于25ml三角瓶中，加入80％甲醇10ml，超声提取30min(50kHz,350W)，用80％甲醇补足减失重，14000r离心10min，精密吸取上清液2ml，离心浓缩挥干，加入200μl DMSO复溶，过0.22μm孔滤膜，精密吸取10μl，加入190μl PBS 1×溶液，混匀即得。
对照品溶液配制：精密称取黄连碱、巴马汀、四氢黄连碱、表小檗碱、甲基黄连碱、去亚甲基小檗碱、小檗碱、药根碱、黄芩素、黄芩苷甲酯、异槲皮苷对照品适量，采用纯甲醇稀释为1.0mg/ml的对照品母液，然后采用50％甲醇稀释成1μg/ml左右供定性鉴定使用。
2.2配体偶联
精密吸取16μl蛋白母液加入384μl的10mM pH5.0醋酸钠缓冲液冲液，混匀供偶联使用。偶联参数设置为Chip type：CM5，Flow cells per cycle：4(用于垂钓，4个通道单元均进行偶联，每个通道单元蛋白溶液100μl)，method：amine氨基偶联，ligand:STAT3蛋白，偶联方式：specify contact time and flow rate，contact time：420s，流速：10μl/min。温度：25℃。偶联试剂为各100μl的EDC和NHS(来自氨基偶联试剂盒)，采用140μl的乙醇胺(ethanolamine，来自氨基偶联试剂盒)用于封闭。
2.3垂钓及回收
垂钓和回收实验参数：contact time：180s，flow rate 5μl/min，incubationtime:20s，wash solution:超纯水，recovery solution:0.5％TFA，Deposition solution：50mM NH4HCO3(作为收集液，使结合在芯片表面的活性成分解离下来)。Cycle：7，Number Ofreplicates：17times。
对照组实验：用一张新的CM5芯片，不做配体偶联，直接在空白CM5芯片上进行Inject and recover，垂钓的实验操作与参数同实验组，回收到的样品作为negativecontrol，供LC-MS检测。
2.4UPLC-MS分析
2.4.1色谱条件
CORTECSTM UPLC C18(2.1×100mm,1.6μm)，流动相乙腈(B)-0.1％甲酸水(A)，梯度洗脱(0-0.5min,12-12％B；0.5-2.0min,12-25％B；2.0-4.0min,25-32％B；
4.0-6.0min,32％B；6.0-10.0min,32-65％B；10.0-12.0min 65％B,体积流量0.25ml/min，柱温45℃，进样量2μl。
2.4.2质谱条件
Zevo XS高分辨飞行时间质谱仪，采用电喷雾离子源(ESI)正、负离子模式进行检测，正离子毛细管电压3.0kv，负离子毛细管电压2.5kv，采用MS1 Scan模式，质量数扫描范围m/z 50～2000，脱溶剂气流N2，流速800L·h-1，脱溶剂温度400℃，锥孔气流N2，流速50L·h-1，离子源温度120℃。在该色谱和质谱条件下，采集得到的总离子流色谱图，见图4。
2.5质谱结果
根据安宫牛黄丸的UPLC-Q-TOF-MS总离子流共鉴定化学成分10个，具体鉴定方法：首先，根据高分辨质谱总离子流色谱峰所得到的精确质量数，即获得各个色谱峰的分子离子峰信息(MS1)，然后在Masslynx 4.2软件中的Tools Elemental Composition软件在10ppm的质量偏差范围内计算其精确分子式，以单味药进行归属，并且经过初步鉴定的化学成分进行对照品购买比对，对各个色谱峰进行准确鉴定，最终经对照品比对共鉴定化合物10个：甲基黄连碱、去亚甲基小檗碱、四氢黄连碱、巴马汀、表小檗碱、药根碱、黄连碱、小檗碱、黄芩素、黄芩苷甲酯。
三、垂钓成分的Q-biomarker亲和活性验证
将筛选出来的成分进行不同浓度对Q-biomarker活性的影响，进行亲和动力学参数的计算，以验证亲和活性。
1.仪器与试药
仪器：Biacore T200(美国GE公司)、超高压输液系统(型号I-class plus)串联Zevo XS型高分辨飞行时间质谱仪(美国Waters公司)、CPA225D十万分之一分析天平(Sartorius公司)、Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。
蛋白：STAT3(英国abcam，ab268982)。
缓冲液：HBS-EP+10×缓冲溶液(美国GE，BR-1006-69)、PBS 10×缓冲溶液(美国GE，BR-1006-72)、DMSO(德国VETEC，V900090)。无菌水为MillQ超纯水，经高压灭菌后使用。
CM5传感芯片(美国GE，BR-1005-30)、氨基偶联试剂盒(美国GE，BR-1000-50)、醋酸钠pH4.5(美国GE，BR-1003-50)、醋酸钠pH5.0(美国GE，BR-1003-51)、醋酸钠pH5.5(美国GE，BR-1003-52)、NaOH 50(美国GE，BR-1003-58)、用于定性鉴定用的14种化合物购自成都曼思特生物科技有限公司。安宫牛黄丸(龙晖药业有限公司，批号：2021004、2021005、2021006)、甲醇、乙腈(质谱纯，德国默克公司)、甲酸(色谱纯，批号F190210，阿拉丁试剂上海有限公司)，其余试剂均为分析纯。
2.实验方法与结果
2.1溶液配制
2.1.1芯片构建缓冲液的配置
本实验缓冲液选用的是HBS-EP，用超纯水将10×HBS-EP稀释10倍得到500ml 1×HBS-EP，配置500ml的即蛋白预富集和偶联运行缓冲液。
2.1.2 SPR筛选和亲和力分析的运行缓冲液的配制
用超纯水将PBS 10×缓冲液稀释10倍得到PBS 1×缓冲液，取PBS 1×缓冲液，加入DMSO制成5％(ml/ml)DMSO的PBS溶液，作为Biacore蛋白芯片筛选运行缓冲液。
2.1.3供试品制备
供试品制备：精密称取69种对照品适量，用DMSO配制成母液浓度10mM，取5μl对照品母液，加入95μl PBS 1×和900μl含5％DMSO的PBS溶液的混匀，配置成溶液浓度为50μM的含5％DMSO的PBS溶液，即得。
阳性药雷公藤红素的配制：精密称取雷公藤红素适量，用DMSO配制成母液浓度10mM，取5μl对照品母液，加入95μl PBS 1×和900μl含5％DMSO的PBS溶液的混匀，配置成溶液浓度为50μM的含5％DMSO的PBS溶液，即得。阴性药Aliertib同法制备。
2.1.4溶剂校正溶液的配制
根据表1，分别配制含4.5％DMSO和5.8％DMSO的PBS 1×溶液。
表1溶剂校正溶液的配制
2.2鉴定成分对STAT3的SPR的检测
检测鉴定的垂钓组分10个(黄连碱、巴马汀、四氢黄连碱、表小檗碱、甲基黄连碱、去亚甲基小檗碱、小檗碱、药根碱、黄芩素、黄芩苷甲酯)和阳性药雷公藤红素、阴性药Aliertib的测试溶液以及空白溶剂，分别精密吸取100μl置于Biacore测试96孔板中，样品在芯片检测运行时间contact time：60s；Flow rat：30μl/min，Dissociation time：60s，温度：25℃。Running Buffer：5％DMSO的PBS)更换相应试管架，根据操作面板调整EP管位置。最终筛选出10个结果呈阳性的成分：黄连碱、巴马汀、四氢黄连碱、表小檗碱、甲基黄连碱、去亚甲基小檗碱、小檗碱、药根碱、黄芩素、黄芩苷甲酯。
2.3 10个垂钓成分的SPR亲和力KD分析
将筛选出的十个成分进行亲和力分析。依次配制浓度为50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.7813μM、0.3906μM、0.1953μM、0.0977μM、0.0488μM、0μM的含5％DMSO的PBS的供试品溶液。
亲和力分析参数设置：Flow path：2-1，Chip type：CM5，ontact time：180s。Flowrat：30μl/min，Dissociation time：300s，温度：25℃。
实验结果见表2。
表2十种活性成分的亲和力的KD值(Mol)
3.讨论
根据表中的结果可以看出，十个成分的KD值数量级都一样，其中由于小檗碱在安宫牛黄丸中含量较高，也是药典的指标性成分之一，因此选择小檗碱作为生物分析方法构建的阳性对照品，绿原酸作为阴性对照。
四、Q-biomarker的方法学的建立及验证
1.实验仪器与试药
仪器：Biacore T200(美国GE公司)、CPA225D十万分之一分析天平(Sartorius公司)、Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。
蛋白：STAT3(英国abcam，ab268982)
缓冲液：HBS-EP+10×缓冲溶液(美国GE，BR-1006-69)、PBS 10×缓冲溶液(美国GE，BR-1006-72)、DMSO(德国VETEC，V900090)
无菌水为MillQ超纯水，经高压灭菌后使用；
CM5传感芯片(美国GE，BR-1005-30)、氨基偶联试剂盒(美国GE，BR-1000-50)、醋酸钠pH4.5(美国GE，BR-1003-50)、醋酸钠pH5.0(美国GE，BR-1003-51)、醋酸钠pH5.5(美国GE，BR-1003-52)、再生试剂盒(美国GE，BR-1005-56)、NaOH 50(美国GE，BR-1003-58)、阳性药小檗碱(成都曼思特生物科技有限公司A0152)、阴性药绿原酸(成都曼思特生物科技有限公司A0022)、安宫牛黄丸(龙晖药业有限公司，批号：2021004、2021005、2021006)。
2.实验方法与结果
2.1专属性实验
为了验证安宫牛黄丸与STAT3不是非特异性结合，用IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和空白芯片来进行验证。
2.1.1供试品的制备
样品溶液的制备：取0.1g安宫牛黄丸丸剂，置于25ml三角瓶中，加入80％甲醇10ml，超声提取30min(50kHz,350W)，用80％甲醇补足减失重，14000r离心10min，精密吸取上清液2ml，离心浓缩挥干，加入200μl DMSO复溶，过0.22μm孔滤膜，精密吸取10μl，加入190μl PBS 1×溶液，混匀即得。
阳性药小檗碱的配制：精密称取小檗碱适量，用DMSO配制成母液浓度10mM，取5μl对照品母液，加入95μl PBS 1×和900μl含5％DMSO的PBS溶液混匀，配置成溶液浓度为50μM的含5％DMSO的PBS溶液，即得。阴性药绿原酸同法制备。
2.1.2蛋白芯片构建
STAT3芯片同前实验构建，IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ芯片用于方法学的专属性研究，再用一张没有偶联蛋白的芯片作为空白对照。
2.1.3安宫牛黄丸对STAT3、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ蛋白的SPR检测
取安宫牛黄丸样品、阳性药小檗碱、阴性药绿原酸的测试溶液，分别精密吸取100μl置于Biacore测试96孔板中，样品在芯片筛选运行时间contact time：60s；Flow rat：30μl/min，Dissociation time：60s，温度：25℃。Running Buffer：5％DMSO的PBS，四组RU值见表3。
由结果可知，在STAT3蛋白芯片上，安宫牛黄丸提取物样品与其有良好的响应信号，优于阳性小檗碱，而阴性和溶剂均呈现空白；对于IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ芯片则的检测结果均为阴性结果(同样阳性药小檗碱在IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ没有检测信号，呈现阴性结果)，另外，空白芯片(无蛋白偶联)上同样也是阴性结果，因此经过特异性实验可以验证安宫牛黄丸与STAT3具有特异性结合。
表3安宫牛黄丸在STAT3芯片、IGF-Ⅰ芯片、IGF-Ⅱ芯片和空白芯片上的检测结果
2.2精密度、重复性和稳定性试验
2.3.1精密度试验
取安宫牛黄丸样品(批号2021005)，按2.3.1的方法制备供试品溶液，精密吸取6个100μl置于Biacore测试96孔板中，样品在芯片筛选运行时间contact time：60s；Flow rat：30μl/min，Dissociation time：60s，温度：25℃。Running Buffer：5％DMSO的PBS，6次筛选的RU值分别为842.9、839.3、839.3、841.1、831.7、874.3，RU值的RSD为1.8％，表明仪器精密度良好。小檗碱用同样方法筛选6次，RU值分别为36.5、36.9、37.8、38.4、37.4、35.3，RU值的RSD为2.9％。
2.3.2重复性试验
取同一批安宫牛黄丸样品(批号2021005)6份，按2.3.1的方法制备供试品溶液，精密吸取100μl置于Biacore测试96孔板中，样品在芯片筛选运行时间contact time：60s；Flow rat：30μl/min，Dissociation time：60s，温度：25℃。Running Buffer：5％DMSO的PBS，6次筛选的RU值分别为，792.7、869.4、912.6、813.2、920.6、837.9，RU值的RSD为6.1％，表明该方法的重复性良好。
2.3.3样品稳定性试验
取安宫牛黄丸样品(批号2021005)，按2.2.1的方法制备供试品溶液，精密吸取100μl置于Biacore测试96孔板中，分别于0，2，4，8，12，24h进行SPR筛选，样品在芯片筛选运行时间contact time：60s；Flow rat：30μl/min，Dissociation time：60s，温度：25℃。Running Buffer：5％DMSO的PBS，6次筛选的RU值分别为，792.7、779、784.2、698.2、829.3、839.3，RU值的RSD为6.3％，表明供试品溶液在室温下24h稳定。
2.4蛋白浓度的耐用性及优选
1)10μg/ml蛋白溶液：2μl蛋白母液+98μl不同pH醋酸钠缓冲液；
20μg/ml蛋白溶液：4μl蛋白母液+96μl不同pH醋酸钠缓冲液；
40μg/ml蛋白溶液：8μl蛋白母液+92μl不同pH醋酸钠缓冲液
2)蛋白预富集Flow rate：10μl/min；Flow path：Flow path 2，选择Sample andReagent Rack1模式进行预富集；Contact time：120s。三种蛋白浓度分别进行预富集。
3)预富集结果见图5，从图中可以看出，浓度为10μg/ml时的偶联量明显低于其他两个浓度，而浓度为40μg/ml时的偶联量与浓度为20μg/ml时的偶联量相差不多，可能芯片达到饱和，不能偶联更多的蛋白，所以最终选择20μg/ml的蛋白溶液作为偶联时的浓度。
2.4对照品浓度选择
2.4.1小檗碱溶液配制
依次配制浓度为50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.7813μM、0.3906μM、0.1953μM、0.0977μM、0.0488μM、0μM的含5％DMSO的PBS的供试品溶液。
2.4.2小檗碱的亲和力筛选
亲和力分析参数设置：Flow path：2-1，Chip type：CM5，ontact time：180s。Flowrat：30μl/min，Dissociation time：300s，温度：25℃。
实验结果见图6，KD值为5.275×10-5Mol，最后选择50μM作为对照品的浓度。
2.5供试品的优化
2.5.1供试品制备
分别取12份0.1g的丸剂，置于12个25ml三角瓶中，分别加入20％、40％、60％、75％、80％、100％甲醇和乙醇10ml，超声提取30min(50kHz,350W)，用对应的溶剂补足减失重，14000r离心10min，过0.22μm孔滤膜，用50％甲醇稀释25倍得供试品溶液。
2.5.2色谱条件
CORTECSTM UPLC C18(2.1×100mm,1.6μm)，流动相乙腈(B)-0.1％甲酸水(A)，梯度洗脱(0-0.5min,12-12％B；0.5-2.0min,12-25％B；2.0-4.0min,25-32％B；4.0-6.0min,32％B；6.0-10.0min,32-65％B；10.0-12.0min 65％B,体积流量0.25ml/min，柱温45℃，进样量2μl。
2.5.3质谱条件
Zevo XS高分辨飞行时间质谱仪，采用电喷雾离子源(ESI)正、负离子模式进行检测，正离子毛细管电压3.0kv，负离子毛细管电压2.5kv，采用MS1 Scan模式，质量数扫描范围m/z 50～2000，脱溶剂气流N2，流速800L·h-1，脱溶剂温度400℃，锥孔气流N2，流速50L·h-1，离子源温度120℃。在该色谱和质谱条件下，采集得到的总离子流色谱图，并且以药典指标性成分黄芩苷为对照。
2.5.4结果
根据不同溶剂提取的安宫牛黄丸的UPLC-Q-TOF-MS总离子流的结果，发现80％甲醇提取的安宫牛黄丸的效果较优于其他溶剂提取的安宫牛黄丸。
2.6DMSO量的耐用性及优选
2.6.1供试品制备
样品溶液的制备:取0.1g丸剂，置于25ml三角瓶中，加入80％甲醇10ml，超声提取30min(50kHz,350W)，用80％甲醇补足减失重，14000r离心10min，精密吸取2ml，离心浓缩挥干，加入不同体积(100、200、400、1000μl)DMSO复溶(100复溶比为1:5，200复溶比为1:10，400复溶比为1:20，1000复溶比为1:50)，过0.22μm孔滤膜，即得不同复溶比例的供试品。
阳性药小檗碱的配制：精密称取小檗碱适量，用DMSO配制成母液浓度10mM，取5μl对照品母液，加入95μl PBS和900μl含5％DMSO的PBS溶液的混匀，配置成溶液浓度为50μM的含5％DMSO的PBS溶液，即得。阴性药绿原酸同法制备。
2.6.2不同复溶比例的安宫牛黄丸对STAT3的筛选
取安宫牛黄丸样品、阳性药小檗碱、阴性的测试溶液，分别精密吸取100μl置于Biacore测试96孔板中，样品在芯片筛选运行时间contact time：60s；Flow rat：30μl/min，Dissociation time：60s，温度：25℃。Running Buffer：5％DMSO的PBS。从结果来看，200μl以上已经达到饱和，所以选择200μl进行复溶。
2.7芯片的耐用性及优选
CM5传感芯片是通用型芯片，CM7传感芯片是研究小分子时需要较高的偶联水平时用的芯片，NTA传感芯片适用于偶联带有His标签的分子。
2.7.1供试品制备
样品溶液的制备：取0.1g安宫牛黄丸丸剂，置于25ml三角瓶中，加入80％甲醇10ml，超声提取30min(50kHz,350W)，用80％甲醇补足减失重，14000r离心10min，精密吸取上清液2ml，离心浓缩挥干，加入200μl DMSO复溶，过0.22μm孔滤膜，精密吸取10μl，加入190μlPBS溶液，混匀即得。
阳性药小檗碱的配制：精密称取小檗碱适量，用DMSO配制成母液浓度10mM，取5μl对照品母液，加入95μl PBS和900μl含5％DMSO的PBS溶液的混匀，配置成溶液浓度为50μM的含5％DMSO的PBS溶液，即得。阴性药同法制备。
2.7.2芯片构建
2.7.2.1蛋白预富集
1)取4μl配体(5种蛋白溶液)，分别加入96μl pH5.5的醋酸钠缓冲液中充分混匀，配体的最终浓度约为20μg/ml。
2)蛋白预富集Flow rate：10μl/min；Flow path：Flow path 2，选择Sample andReagent Rack1模式进行预富集；Contact time：120s。
3)CM7预富集结果见图7，NTA预富集结果见图8，CM5的预富集结果见图9。
2.7.2.2蛋白偶联
精密吸取8μl蛋白母液(STAT3)加入192μl的10mM pH5.0醋酸钠缓冲液冲液，混匀供偶联使用。取蛋白溶液100μl，偶联参数设置为Chip type：CM7，Flow cells pe：2(偶联通道设置第二个通道单元)，method：amine氨基偶联，ligand:STAT3蛋白，偶联方式：specifycontact time and flow rate，contact time：420s，流速：10μl/min。温度：25℃。偶联试剂为各100μl的EDC和NHS(来自氨基偶联试剂盒)，采用140μl的乙醇胺(ethanolamine，来自氨基偶联试剂盒)用于封闭，运行缓冲液：1×HBS-EP。STAT3的偶联量约30000RU。由结果可见，芯片CM7的STAT3偶联量高于芯片CM5。
2.8不同批次安宫牛黄丸SPR检测
根据3批次安宫牛黄丸和5批次自制样品来进行STAT3的SPR筛选。
2.8.1供试品的制备
安宫牛黄丸溶液的制备：取0.1g安宫牛黄丸丸剂，置于25ml三角瓶中，加入80％甲醇10ml，超声提取30min(50kHz,350W)，用80％甲醇补足减失重，14000r离心10min，精密吸取上清液2ml，4℃离心浓缩挥干，加入200μl DMSO复溶，过0.22μm孔滤膜，精密吸取10μl，加入190μlPBS溶液，混匀即得。
自制中间体溶液的制备：取0.1g牛黄、0.2g水牛角浓缩粉、0.025g麝香、0.05g珍珠、0.1g朱砂、0.1g雄黄、0.1g黄连粉末、0.1g黄芩粉末、0.1g栀子粉末、0.1g郁金粉末、0.025g冰片，置于250ml三角瓶中，加入80％甲醇100ml，超声提取30min(50kHz,350W)，用80％甲醇补足减失重，14000r离心10min，精密吸取上清液2ml，4℃离心浓缩挥干，加入200μl DMSO复溶，过0.22μm孔滤膜，精密吸取10μl，加入190μl PBS溶液，混匀即得。
阳性药小檗碱的配制：精密称取小檗碱适量，用DMSO配制成母液浓度10mM，取5μl对照品母液，加入95μl PBS 1×和900μl含5％DMSO的PBS溶液的混匀，配置成溶液浓度为50μM的含5％DMSO的PBS溶液，即得。阴性药绿原酸同法制备。
2.8.2三批安宫牛黄丸和五批自制中间体的STAT3蛋白的SPR检测
取三批安宫牛黄丸样品和五批自制中间体、阳性药小檗碱、阴性药绿原酸的测试溶液，分别精密吸取100μl置于Biacore测试96孔板中，样品在芯片检测运行时间contacttime：60s；Flow rat：30μl/min，Dissociation time：60s，温度：25℃。Running Buffer：5％DMSO的PBS，三批安宫牛黄丸和五批自制中间体的RU值与小檗碱的RU值的比值见表4，从结果中可以看出比值至少大于1。
表4三批安宫牛黄丸和五批自制中间体的RU值与阳性小檗碱的RU值的比值
3.讨论
最终根据方法学的考察选择CM7芯片，因为它有更高的蛋白偶联量，而供试品用80％的甲醇提取，DMSO用1：10溶解(g/ml)，对照品选择小檗碱，浓度为50μM。
综上，本发明基于STAT3蛋白生物效应的安宫牛黄丸质量评价方法，简单，操作方便，准确性高，能反映出安宫牛黄丸临床治疗的有效性，进一步完善安宫牛黄丸的质量控制体系，具备实际应用推广价值。
Claims (10)
1.一种基于STAT3蛋白生物效应的安宫牛黄丸质量评价方法，其特征在于：它是采用SPR检测，具体包括如下步骤：
1)蛋白芯片的构建：取STAT3蛋白加水溶解，再加醋酸钠缓冲液稀释成10～40μg/ml的蛋白溶液，取蛋白溶液，与传感器芯片偶联，即得；
2)供试品溶液的制备：取安宫牛黄丸，加80％甲醇溶液提取，提取液离心，取上层清液干燥，加DMSO复溶，过滤，滤液加PBS溶液混匀，即得；
3)对照品溶液的制备：取小檗碱，加DMSO溶解，溶解液加PBS溶液和含DMSO的PBS溶液混匀，即得；
4)分别取步骤2)所得供试品溶液和步骤3)所得对照品溶液，置于载有步骤1)所得蛋白芯片的表面等离子共振测试孔板中；
SPR检测条件：运行时间：60s；流速：30μl/min，解离时间：60s，温度：25℃，运行缓冲液：5％DMSO的PBS。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述蛋白溶液为20μg/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述偶联为氨基偶联；所述氨基偶联的参数为传感器芯片型号：CM7或CM5，接触时间：420s，流速：10μl/min，温度：25℃，偶联试剂：EDC和NHS，封闭用试剂：乙醇胺，运行缓冲液：1×HBS-EP。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述传感器芯片型号：CM7，所述蛋白溶液、EDC和NHS、乙醇胺的体积比为100：200：140；所述EDC和NHS的体积比为1：1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述安宫牛黄丸与80％甲醇溶液的质量体积比为0.1g：5～25ml；所述提取为超声提取，时间20～60min，功率20～80kHz,100～500W；所述离心的速度5000～25000r，时间5～25min；所述DMSO的加入量为上清液的15～25倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述溶解液中小檗碱的浓度为10mM；所述溶解液、PBS溶液和含DMSO的PBS溶液的体积比为5μl：95μl：900μl。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含DMSO的PBS溶液中DMSO浓度为5％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SPR检测的安宫牛黄丸的RU值与小檗碱的RU值的比值不小于1。
9.STAT3蛋白作为生物质量标志物在安宫牛黄丸质量检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述检测是采用表面等离子体共振法检测安宫牛黄丸生物效应。
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| CN115389645B (zh) * | 2022-05-26 | 2024-03-22 | 北京中医药大学 | 人工智能芯片与液质联用集成方法在同仁牛黄清心丸关键质量属性辨识中的应用 |
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