CN108717083A

CN108717083A - 人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析方法及系统

Info

Publication number: CN108717083A
Application number: CN201810046611.8A
Authority: CN
Inventors: 尚婵; 丁利; 贾继明; 王鹏; 田蕊; 邹皓月
Original assignee: Beijing Hehe Diagnostic Medical Technology Ltd By Share Ltd; Suzhou Hehe Medical Inspection Co Ltd
Current assignee: Beijing Hehe Diagnostic Medical Technology Ltd By Share Ltd; Suzhou Hehe Medical Inspection Co Ltd
Priority date: 2018-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2018-10-30

Abstract

人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析方法及系统。本发明的目的是提供一种在线固相萃取技术与高效液相色谱耦合法，可同时测定人体血清中地西泮与氯氮平两种药物浓度。通过方法学验证，表明该方法检测准确，检测速率快，提取回收率高，可重复性好。此外，本发明还提供了用于对人体血清中地西泮与氯氮平进行检测的在线固相萃取分析系统。

Description

人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析方法及系统

技术领域

本本发明公开了一种采用在线固相萃取与高效液相色谱联合应用技术，建立了同时测定人体血清中地西泮与氯氮平的分析方法，此外，本发明还提供了用于对人体血清中地西泮与氯氮平进行检测的在线固相萃取分析系统。

背景技术

地西泮为苯二氮卓类长效药物，具有抗焦虑、镇静催眠、抗惊厥、抗癫痫及促进中枢性肌肉松弛作用；氯氮平为目前公认的治疗精神分裂症最有效的抗精神病药物，在临床上广泛用于失眠、抑郁症、癫痫等神经系统疾病的控制。地西泮与氯氮平合用，常用来治疗精神分裂症。但由于患者精神异常，易因过量服药导致中毒，危害患者的健康及生命安全，所以临床上对其进行血药浓度监控十分必要。经调研发现，目前国内尚未有采用高效液相色谱法同时测定地西泮与氯氮平两种药物的分析方法。

基于色谱技术的临床检验工作，其面临的首要挑战就是生物样本的制备。据统计，在生物样本分析工作中，80%左右的工作量及研究经费用于样本的前处理及分析样本的制备，以获得合格的、适用于现代分析仪器的检测样本。目前，生物样本的前处理方法一般常用：沉淀蛋白法、液液萃取法及固相萃取法。然而，沉淀蛋白法及液液萃取法均存在试剂用量大，而且样品损失率高的缺点。固相萃取法则存在成本消耗较高，样品洗脱不均一等问题。

因此，急需建立一种可同时测定人体血清中地西泮与氯氮平两种药物的分析方法；并开发一种节约成本、提高样品回收率的生物样品前处理的新分析系统。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，利用在线固相萃取技术与高效液相色谱联用方法，建立一种简便、快捷、可同时测定人体血清中地西泮与氯氮平的分析方法。本发明在提高检测效率的同时大大降低了血清中杂质对待测物的干扰，增加了色谱柱的使用寿命，改善了测定结果的准确度和重复性。

本发明的内容是通过以下技术方案来实现的：

一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析系统，该系统包括两部分，第一部分为：左泵、进样器、六通阀和固相萃取柱；第二部分为：右泵、分析柱和检测器；所述进样器在系统中串联于左泵的下游，所述检测器在系统中串联于分析柱的下游，所述六通阀用于切换该系统的两种工作状态；在第一种工作状态下，固相萃取柱在系统中串联于进样器的下游，分析柱在系统中串联于右泵的下游；在第二种工作状态下，固相萃取柱在系统中串联于右泵的下游，分析柱在系统中串联于固相萃取柱的下游。

一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析方法，所述方法包括将经过预处理的待测血清样品进行在线固相萃取技术进行处理，再经分析柱分离与紫外检测，获得相关药物的浓度，所述方法依次包括以下步骤：

采用乙酸乙酯萃取待测血清样品，随后进行氮吹，再用甲醇复溶，取上清液泵入在线固相萃取柱；

利用流动相A通过在线固相萃取柱进行杂质洗脱，将待测的地西泮与氯氮平保留于所述在线固相萃取柱上；

通过六通阀的切换，将所述在线固相萃取柱与分析柱在流路上进行串联，利用流动相B进行洗脱，将在线固相萃取柱上保留的地西泮与氯氮平转移到分析柱上进行成分分离；

采用分析色谱柱分离样品中的成分，流出液进入紫外检测器中进行分析。

3、如权利要求2中所述一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析的方法，其特征在于，所述步骤在样品进行氮气吹干过程中，采用40～60℃进行加热处理，促进溶剂的挥发。

进一步地，所述固相萃取柱采用Ph-1作为固定相；所述分析柱采用C18作为固定相。

进一步地，所述步骤中流动相A为水-甲醇，采用梯度洗脱的方式进行待测样品的在线除杂。

进一步地，所述步骤中流动相B为30 mM醋酸铵-甲醇，采用梯度洗脱的方式进行待测样品的分离。

进一步地，所述方法采用包含左泵和右泵的双梯度泵进行实施，所述左泵用于实施所述步骤，所述右泵用于实施所述步骤和。

进一步地，所述步骤、和中流动相的流速为0.5～1.5 mL/min。

进一步地，所述检测器为紫外检测器，检测波长为254 nm。

本发明的有益效果是：本发明采用固相萃取柱配合六通阀切换的方式，建立了一种在线固相萃取-高效液相色谱法同时测定人体血清中地西泮与氯氮平的分析方法。经过预处理的待测血清样品经在线固相萃取柱的再次纯化除杂后转移到分析柱上进行分析检测，降低的样品中杂质对待测物的干扰，减少了样品损失，提高了分析效率，增加了分析柱的使用寿命。该发明提供了一种简便、快捷的用于同时测定人体血清中地西泮与氯氮平的分析方法。

附图说明

图1为本发明的一个实施方式所述在线固相萃取分析工作流程示意图，图1A和图1B分别示出通过六通阀进行切换的两种流路工作状态；

图2A-2C为示出不同切阀时间对血清中地西泮与氯氮平的杂质净化影响的色谱图；

图3为示出血清样品中未使用在线固相萃取净化，和使用在线固相萃取净化（本发明的方法）的色谱图的比较，图3A为未使用在线固相萃取净化方法的结果，图3B为采用本发明所述方法的结果。

具体实施方式

图1为本发明一个实施方式所述的在线固相萃取分析工作流程示意图，其中采用了包含左泵和右泵的双梯度。具体而言，在图1A所示的工作状态下，将六通阀按照1-2、3-4、5-6的方式联通，利用左泵的驱动使得待测血清样品由自动进样器进入固相萃取柱（优选采用Ph-1作为填料），用流动相A（例如甲醇-水溶液）去除杂质，并将地西泮、氯氮平富集在固相萃取柱上。随后切换六通阀按照1-6、2-3、4-5的方式联通，使得进入图1B所示的工作状态。利用右泵的驱动，采用合适的流动相B（例如甲醇-30 mM的醋酸铵溶液）将富集于固相萃取柱的地西泮、氯氮平转移至分析柱（优选采用C18作为填料），最后在图1B所示的工作状态下，使用流动相B进行分离和检测。

为在该发明实施方式中，图3为不同切阀时间对血清中地西泮与氯氮平的杂质净化影响的色谱图；通过设置合适的在线转移时间，使得在完成在线转移后立即将六通阀切换回图1所示的工作状态，从而保证在右泵的驱动下进行分离和检测的同时，在左泵的驱动下进行下一个周期的进样和固相萃取，如此循环往复。在需要对多组样品进行测定的场合中，采用这种实施方式可以更进一步的总体节约测定时间。

在本发明中，双梯度泵的使用可以使得整套系统的布局更加紧凑。作为一个替代的实施方式，本领域技术人员同样可以容易的采用两个独立的泵进行工作。

血清中含有各种血清蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。为了降低成本，减少洗脱时间，提高色谱柱的使用效率，因此在测试前要对待测血清样品进行前处理。在本发明中，本领域技术人员可选本领域中合适的萃取剂对待测血清进行前处理。为了获得更好的萃取效果，可以对萃取溶剂、萃取时间和萃取比例等参数进行适当的调整。优选的萃取条件是使用乙酸乙酯溶液作为萃取溶剂，1:8（血清：乙酸乙酯）的体积比例，震荡5min，萃取效率最高。

在本发明中，本领域技术人员可选用本领域中合适的固定填料作为固相萃取柱填料，并选择合适的流动相A来洗脱杂质。在一个优选的实施方式中，选取Ph-1作为在线固相萃取柱填料，以甲醇-水(10:90，v/v)作为流动相A（洗脱溶液），既能实现地西泮、氯氮平在固相萃取柱上的有效富集，又能对样品基质起到良好的净化作用。

在本发明中，本领域技术人员可选用本领域中合适的色谱分析条件。由于本发明采用在线固相萃取方式净化样品，基本消除了基质的干扰，因此在一个优选的实施方式中，选用较短的C18分析柱（例如柱长15cm），从而在7 min内即可完成内标氟哌啶醇以及待测物地西泮与氯氮平3种组分的分离，并且色谱柱的分离度和检测灵敏度均能满足实际样品测定的需要。

在本发明中检测器可以是本领域中通常用于检测地西泮、氯氮平的任何检测器，优选紫外检测器。在一个优选的实施方式中，检测波长通常设定为254mm。

实施例

接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细的说明，但本法明不仅限于这些实例。

（1）仪器与试剂

Ultimate 3000双三元液相色谱系统(Thermo scientific公司)，配置双三元梯度泵，自动进样器，柱温箱（带一个六通阀），二极管阵列检测器，变色龙色谱管理软件；Centrifuge 5424高速离心机（Eppendorf AG，美国）；N-EVAP 111氮吹仪N-EVAP 111（Organomation，USA）；MSX（SG EA）电子天平（sartorius，German）；MIX-25P旋涡混匀器（MIUL AB，美国）。

氟哌啶醇标准品（中国食品药品检定研究院，批号100313-200301），地西泮标准品（中国食品药品检定研究院，批号171225-200302），氯氮平标准品（EuropeanPharmacopoeia Reference Standard，批号C2460000），醋酸铵（色谱级，Fisher公司），甲醇（色谱级，Fisher公司），纯化水（屈臣氏公司），乙酸乙酯（色谱级，Fisher公司），其他试剂均为分析纯；血清取自正常人的全血离心后获得。

（2）色谱条件

分析柱：Waters X Bridge C₁₈（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；固相萃取柱为：SHISEIDOCAPCELL MF Ph-1（4.0 mm×20mm）；进样量为20 μL，柱温40℃。在线净化过程中，流动相A选用甲醇-水溶液（10:90，v/v），设定流速为1 mL/min，萃取柱清洗0.5 min；分析测定过程中，流动相B选用甲醇-30 mM的醋酸铵水溶液，具体梯度如表1所述，流速为1 mL/min，紫外检测波长为254 nm。流路设置和工作状态的切换参见图1A和图1B及前文相应的说明。

表1 地西泮与氯氮平分析柱洗脱梯度

（3）标准溶液配制

精确称取氟哌啶醇（内标）、地西泮、氯氮平标准品5.0 mg，用甲醇溶解并定容于5 mL的容量瓶中，配制成浓度分别为1.0 mg/mL的标准储备液，保存于-80 °C冰箱。测定前用紫外分光光度法标定标准储备液的准确浓度，再用甲醇稀释标准储备液，配制成浓度分别为5 μg/mL的氟哌啶醇（内标）工作液以及80、60、20、10、8、6、2 μg/mL的地西泮、氯氮平混合标准工作液，-80 ℃保存，取用时置于常温下，达到常温后方可使用。

（4）样品预处理

取血清190 μL加入地西泮与氯氮平混标工作液10 μL，振荡5 min；加入内标（氟哌啶醇）10 μL，震荡30 s；加入乙酸乙酯1.6 mL，震荡5 min，14000 r离心5 min，取上清1.3 mL，N₂吹干；100 μL甲醇复溶，震荡3 min，14000 r离心5 min，取上清液进行在线固相萃取高效液相色谱分析。

（5）线性范围、检出限和精密度

分别取适量浓度已校准的地西泮与氯氮平标准储备液混合、稀释、定容配制成系列混合标准溶液，按照样品预处理方法处理样品，进样20 μL，以样品峰面积与内标峰面积的比值对地西泮与氯氮平的浓度作图，绘制标准曲线，并以3倍信噪比（S/N）计算相应的检出限（LOD）。结果见表2。各组分在线性范围内峰面积与浓度呈现良好的线性关系，相关系数不低于0.99。

（6）线性范围、检出限和精密度

表2

1. 化合物	2. 线性回归方程	3. 相关系数（R²）	4. 线性范围（mg/L）	5. 检出限（mg/L）
					6. 地西泮	7. Y=0.0019x+0.0179	8. 0.9978	9. 100.0-4000.0	10. 6.25
11. 氯氮平	12. Y=0.0019x+0.0472	13. 0.9985	14. 100.0-4000.0	15. 6.25

选择正常人血清样本（避免溶血或乳糜血样），分别加入低（2 mg/L）以及高（80 mg/L）的标准混标工作液，按照样品预处理方式处理，取上清液进行液相分析，连续进样15针后，测得仪器精密度，具体结果见表2。

选择正常人血清样本（避免溶血或乳糜血样），分别加入低（2 mg/L）、中（10 mg/L）、高（60 mg/L）三个浓度点的标准溶液，每个浓度点平行6个样本，按照样品预处理方式处理，一天之内考察三个批次（早、中、晚各一批）血清中地西泮、氯氮平的浓度，并配制相应的标准曲线，测得方法的日内精密度。具体结果见表3。

表3 方法精密度考察结果

选择正常人血清样本（避免溶血或乳糜血样），分别加入低（2 mg/L）、中（10 mg/L）、高（60 mg/L）三个浓度点的标准溶液，每个浓度点平行6个样本，按照样品预处理方式处理样本，连续考察三天，每天考察此三个浓度点血清中地西泮、氯氮平的浓度，并绘制相应的标准曲线，测得方法的日间精密度。具体结果见表3。

回收率测定

选择正常人血清样本（避免溶血或乳糜血样），分别加入低（2 mg/L）、中（10 mg/L）、高（60 mg/L）三个浓度点的标准溶液，每个浓度点平行6个样本，按照样品预处理方式进行处理，经过相同条件提取、在线固相萃取净化后测定地西泮以及氯氮平的含量。计算得到的血清中地西泮以及氯氮平的平均回收率在90%-110%，相对标准偏差（RSD）在1.05%-7.23%。

如图3所示，图3为示出血清样品中未使用在线固相萃取净化和使用在线固相萃取净化（本发明的方法）的色谱图的比较，图3A为未使用在线固相萃取净化方法的结果，图3B为采用本发明所述方法的结果。可知，经过预处理的待测血清样品经在线固相萃取柱的再次纯化除杂后转移到分析柱上进行分析检测，降低的样品中杂质对待测物的干扰，减少了样品损失，提高了分析效率，增加了分析柱的使用寿命。该发明提供了一种简便、快捷的用于同时测定人体血清中地西泮与氯氮平的分析方法。

Claims

1.一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析系统，其特征在于：该系统包括两部分，第一部分为：左泵、进样器、六通阀和固相萃取柱；第二部分为：右泵、分析柱和检测器；所述进样器在系统中串联于左泵的下游，所述检测器在系统中串联于分析柱的下游，所述六通阀用于切换该系统的两种工作状态；在第一种工作状态下，固相萃取柱在系统中串联于进样器的下游，分析柱在系统中串联于右泵的下游；在第二种工作状态下，固相萃取柱在系统中串联于右泵的下游，分析柱在系统中串联于固相萃取柱的下游。

2.一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析方法，所述方法包括将经过预处理的待测血清样品进行在线固相萃取技术进行处理，再经分析柱分离与紫外检测，获得相关药物的浓度，其特征在于，所述方法依次包括以下步骤：

3.如权利要求2中所述一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析的方法，其特征在于，所述步骤在样品进行氮气吹干过程中，采用40～60℃进行加热处理，促进溶剂的挥发。

4.如权利要求2中所述一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析的方法，其特征在于，所述固相萃取柱采用Ph-1作为固定相；所述分析柱采用C18作为固定相。

5.如权利要求2中所述一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析的方法，其特征在于，所述步骤中流动相A为水-甲醇，采用梯度洗脱的方式进行待测样品的在线除杂。

6.如权利要求2中所述一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析的方法，其特征在于，所述步骤中流动相B为30 mM醋酸铵-甲醇，采用梯度洗脱的方式进行待测样品的分离。

7.如权利要求2中所述一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析的方法，其特征在于，所述方法采用包含左泵和右泵的双梯度泵进行实施，所述左泵用于实施所述步骤，所述右泵用于实施所述步骤和。

8.如权利要求2中所述一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析的方法，其特征在于，所述步骤、和中流动相的流速为0.5～1.5 mL/min。

9.如权利要求2中所述一种人体血清中地西泮与氯氮平检测的在线固相萃取分析的方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器，检测波长为254 nm。