CN110632217B - 一种hplc-icp-ms法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种HPLC‑ICP‑MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法及应用，属于血液样本检测技术领域。为解决现有方法无法准确测定粒细胞内AsIII、AsV、DMAV和MMAV四种不同砷化合物的浓度的问题，本发明提供了一种HPLC‑ICP‑MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，包括确定检测条件、配制标准溶液、绘制标准曲线、收集与处理粒细胞样本、样本检测与数据处理。本发明能够有效提取粒细胞内各砷化合物并进行准确定量。将本发明应用于检测APL患者外周血粒细胞内四种砷化合物浓度，可以明确各砷形态的代谢及分布特征，为揭示亚砷酸作用机制、减少毒性反应提供技术基础，辅助临床实现个体化用药和靶向治疗。
Description
技术领域
本发明属于血液样本检测技术领域，尤其涉及一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法及应用。
背景技术
亚砷酸注射液-As2O3是我国于1971年自主研发的用于治疗急性早幼粒细胞白血病-APL的药物，该药物的应用能够显著提高APL患者的治愈率。亚砷酸进入人体内之后以三价无机砷-AsⅢ的形式存在。通过肝代谢产生五价一甲基砷酸-MMAⅤ和五价二甲基砷酸-DMAⅤ，经过氧化还原反应生成五价无机砷-AsⅤ。有研究发现亚砷酸发挥治疗作用与PML/RARA融合蛋白密切相关。亚砷酸或其代谢产物能通过细胞膜上的通道蛋白进入到细胞内靶向PML/RARA融合蛋白，致使蛋白发生构象改变和多聚化，引起蛋白降解，从而诱导早幼粒细胞分化为成熟粒细胞并分布到外周血中。外周血成分包含血浆、血清、红细胞、白细胞。白细胞包含淋巴细胞、粒细胞、单核细胞。已有文章测定人血浆、尿液、红细胞、唾液、脑脊液、指甲中四种砷化合物含量，但四种砷化合物在粒细胞内的分布规律仍没有相关研究。
目前测定砷化合物的技术手段主要有高效液相色谱氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)和高效液相电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)。HPLC-HG-AFS方法灵敏度低于HPLC-ICP-MS，不能满足细胞样本检测时对仪器灵敏度的要求。ICP-MS采用等离子体技术，在一定程度上显示出非常高的灵敏度，应用于各种痕量元素的检测。其中AshleyW.Newton等人利用ICP-MS法测定髋关节置换术后患者全血、血浆、尿液中钴、铬、镍的分布差异。但现有技术仍无法准确测定粒细胞内AsIII、AsV、DMAV和MMAV四种不同砷化合物的浓度。
发明内容
为解决现有方法无法准确测定粒细胞内AsIII、AsV、DMAV和MMAV四种不同砷化合物浓度的问题，本发明提供了一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法及应用。
本发明的技术方案：
一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，包括如下步骤：
步骤一、确定HPLC-ICP-MS检测条件：
步骤二、配制AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷化合物的标准溶液：
分别配制AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷化合物的储备液；在0.5-64ng/mL范围内逐级稀释AsIII、MMAV和DMAV的储备液、在1.0-128ng/mL范围内逐级稀释AsV的储备液，得到不同浓度的四种砷化合物的标准溶液；
步骤三、绘制四种砷化合物的标准曲线：
在步骤一确定的HPLC-ICP-MS色谱条件下依次将步骤二配制的四种砷化合物的标准溶液进样分析，以砷化合物的浓度x为横坐标，砷化合物的峰面积y为纵坐标，进行线性回归分析，分别绘制四种砷化合物的标准曲线方程；
步骤四、收集与处理粒细胞样本：
(1)收集粒细胞样本：收集全血样本于EDTA抗凝管中，加入红细胞裂解液破碎红细胞，离心去上清，用PBS缓冲液清洗沉淀，得到白细胞样本并将样本转移至流式管中；
在所得白细胞样本中加入抗体，室温条件下进行孵育，15分钟后加入PBS缓冲液终止孵育，离心，弃上清，在沉淀中加入PBS缓冲液混匀，用200目过滤网过滤后将所得样品放入流式细胞仪进行分选；
(2)处理粒细胞样本：取所得粒细胞样本，用HPLC流动相进行稀释，加入质量浓度为5％的氨水，充分混匀得到处理液，再将质量浓度为30％的双氧水加入所述的处理液中，涡旋混匀，静置20min，得到预处理样本，按一定体积比将预处理样本与质量浓度为20％的高氯酸混匀并置于4℃条件下高速离心，取上清液用0.22μm滤膜过滤得到检测样本；
步骤五、样本检测与数据处理：
将步骤四所得检测样本依据步骤一确定的HPLC-ICP-MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用相应砷化合物的标准曲线，外标法定量，计算得出粒细胞样本中各砷化合物的浓度。
进一步的，步骤一所述HPLC-ICP-MS检测条件为：
高效液相色谱条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：0.9mL/min；流动相：3mmol/L无水磷酸二氢钠，13mmol/L无水乙酸钠，0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠和4mmol/L硝酸钾组成的混合溶液；进样体积为50μL；
电感耦合等离子体质谱条件：检测模式：DRC加氧模式，喷雾器气流量：0.9L/min，辅助气流量：1.2L/min，等离子气流量：18L/min，电感耦合等离子射频功率：1600W，氧气流量：0.6ml/min。
进一步的，步骤二所述四种砷化合物的标准溶液中AsIII、DMAV、MMAV的标准溶液中砷化合物的浓度均依次为64、32、16、4、1和0.5ng/mL，AsV的标准溶液中砷化合物的浓度依次为128、64、32、16、4和1ng/mL。
进一步的，步骤三所述四种砷化合物的标准曲线方程分别为：
AsIII：y＝9924.3x+644.46，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
DMAV：y＝14625x+2914.6，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
MMAV：y＝13488x+2616.2，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
AsV：y＝14060x+10134，r2＝0.9999，线性范围为1～128ng/ml。
进一步的，步骤四(1)所述的提取白细胞的方法为将全血样本与红细胞裂解液按体积比为1：10混合破碎红细胞，混匀后静置15min，离心取上清，清洗所得沉淀即获得白细胞样本。
进一步的，步骤四(1)所述PBS缓冲液均为pH值为7的1倍PBS缓冲液；所述离心均为4℃条件下1460rpm离心5min。
进一步的，步骤四(1)所述的抗体为FITC-A CD14、PerCP-A CD45、APC-A CD3和APC-A CD19。
进一步的，所述抗体的添加量为每1mL全血提取所得白细胞样本中加入FITC-ACD14 10μl、PerCP-A CD45 10μl、APC-A CD3 3μl和APC-A CD19 3μl。
进一步的，步骤四(1)所述孵育条件为暗处孵育15min。
进一步的，步骤四(2)所述流动相、5％氨水和30％双氧水的加入量为每1mL全血提取所得粒细胞样本加入流动相49μl、5％氨水1μl、30％双氧水50μl；所述预处理样本与所述20％高氯酸的体积比为90：10；所述高速离心为4℃条件下13200rpm离心15min。
本发明提供的任一一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法在检测砷剂治疗APL患者外周血粒细胞内四种砷化合物浓度中的应用。
本发明所述方法用以检测AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷化合物在接受砷剂治疗的APL患者外周血粒细胞内的浓度，根据外周血中无机砷(AsIII+AsV)与甲基砷(DMAV+MMAV)的浓度对比、以及甲基砷中MMAV与DMAV的浓度对比，明确各砷化合物在APL患者粒细胞内的分布特征及作用机制，但所述方法不能用于疾病诊断和治疗。
本发明的有益效果：
本发明建立的HPLC-ICP-MS检测方法，精密度高、检测限低、定量准确，满足了细胞样本检测时对检测仪器灵敏度的要求，弥补了现有方法无法准确测定粒细胞内AsIII、AsV、DMAV和MMAV四种不同砷化合物浓度的不足，并能够对四种不同砷化合物浓度进行准确定量。
将本发明应用于检测接受砷剂治疗的APL患者外周血粒细胞内四种砷化合物浓度，可以明确各砷形态的代谢及分布特征，为揭示亚砷酸作用机制、减少毒性反应提供技术基础，有助于辅助临床实现个体化用药和靶向治疗。
附图说明
图1为实施例7测定的接受亚砷酸治疗的APL患者外周血粒细胞中各砷化合物的色谱图；
图2为实施例7中接受亚砷酸治疗的APL患者外周血白细胞的全扫描谱图；
图3为实施例7中接受亚砷酸治疗的APL患者外周血白细胞加入抗体后，PerCP-ACD45识别的粒细胞(Granu)、淋巴细胞(Lym)的流式细胞图；
图4为实施例7中接受亚砷酸治疗的APL患者外周血白细胞加入抗体后，FITC-ACD14识别的单核细胞(Mono)流式细胞图；
图5为实施例7中接受亚砷酸治疗的APL患者外周血白细胞加入抗体后，APC-ACD3、APC-A CD19识别的淋巴细胞(Lym)流式细胞图；
图6为实施例7中接受亚砷酸治疗的APL患者外周血白细胞加入抗体后，除去淋巴细胞(Lym)及单核细胞(Mono)后的粒细胞(Granu)流式分选图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
本实施例使用的仪器与试剂：
仪器：高效液相-电感耦合等离子体质谱HPLC-ICP-MS NexI0N 350D(铂金埃尔默仪器有限公司)，超纯水仪(Thermofisher科技有限公司)，超声波清洗仪(美国必能信)，千分之一精密电子天平(Sartorius公司)，多功能低温高速离心机(Eppendorf公司)，涡旋混合仪(德国必能信)；流式细胞仪型号为BD FACSAria IIu。
试剂：亚砷酸根标准溶液GBW08666(中国计量科学院)、砷酸根标准溶液GBW08667(中国计量科学院)、一甲基砷标准溶液GBW08668(中国计量科学院)、二甲基砷标准溶液GBW08669(中国计量科学院)，无水磷酸二氢钠、硝酸钾、无水乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠(99.00％，优级纯)购于国药集团化学试剂有限公司，红细胞裂解液-FACS lysingsolution Catalog No.349202(美国BD公司)，抗体(美国BD公司)，PBS溶液(美国索莱宝科技有限公司)，高纯氩气(99.99％)购自哈尔滨黎明气体有限公司。
本实施例提供的HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，包括如下步骤：
步骤一、确定HPLC-ICP-MS检测条件：
高效液相色谱条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：0.9mL/min；流动相：3mmol/L无水磷酸二氢钠，13mmol/L无水乙酸钠，0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠和4mmol/L硝酸钾组成的混合溶液；进样体积为50μL；
电感耦合等离子体质谱条件：检测模式：DRC加氧模式，喷雾器气流量：0.9L/min，辅助气流量：1.2L/min，等离子气流量：18L/min，电感耦合等离子射频功率：1600W，氧气流量：0.6ml/min；
步骤二、配制四种砷化合物的标准溶液：
分别配制AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷化合物的储备液；在0.5-64ng/mL范围内逐级稀释AsIII、MMAV和DMAV的储备液、在1.0-128ng/mL范围内逐级稀释AsV的储备液，得到不同浓度的四种砷化合物的标准溶液；
步骤三、绘制四种砷化合物的标准曲线：
在步骤一确定的HPLC-ICP-MS色谱条件下依次将步骤二配制的四种砷化合物的标准溶液进样分析，以砷化合物的浓度x为横坐标，砷化合物的峰面积y为纵坐标，进行线性回归分析，分别绘制四种砷化合物的标准曲线方程；
步骤四、收集与处理粒细胞样本：
(1)收集粒细胞样本：收集全血样本于EDTA抗凝管中，加入红细胞裂解液破碎红细胞，离心去上清，用PBS缓冲液清洗沉淀，得到白细胞样本并将样本转移至流式管中；
在所得白细胞样本中加入抗体，室温条件下进行孵育，15分钟后加入PBS缓冲液终止孵育，离心，弃上清，在沉淀中加入PBS缓冲液混匀，用200目过滤网过滤后将所得样品放入流式细胞仪进行分选，
(2)处理粒细胞样本：取所得粒细胞样本，用步骤一所述的流动相进行稀释，加入质量浓度为5％的氨水，充分混匀得到处理液，再将质量浓度为30％的双氧水加入所述的处理液中，涡旋混匀，静置20min，得到预处理样本，按一定体积比将预处理样本与质量浓度为20％的高氯酸混匀并置于4℃条件下高速离心，取上清液用0.22μm滤膜过滤得到检测样本；
步骤五、样本检测与数据处理：
将步骤四所得检测样本依据步骤一确定的HPLC-ICP-MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用相应砷化合物的标准曲线，外标法定量，计算得出粒细胞样本中各砷化合物的浓度。
实施例2
本实施例提供的HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，包括如下步骤：
步骤一、确定HPLC-ICP-MS检测条件：
高效液相色谱条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：0.9mL/min；流动相：3mmol/L无水磷酸二氢钠，13mmol/L无水乙酸钠，0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠和4mmol/L硝酸钾组成的混合溶液；进样体积为50μL；
电感耦合等离子体质谱条件：检测模式：DRC加氧模式，喷雾器气流量：0.9L/min，辅助气流量：1.2L/min，等离子气流量：18L/min，电感耦合等离子射频功率：1600W，氧气流量：0.6ml/min；
步骤二、配制四种砷化合物的标准溶液：
分别配制浓度均为1000ng/mL的AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷化合物的储备液；将AsIII、DMAV、MMAV的储备液逐级稀释得到浓度均依次为64、32、16、4、1和0.5ng/mL的三种砷化合物的标准溶液、将AsV的储备液逐级稀释得到浓度依次为128、64、32、16、4和1ng/mL的标准溶液；
步骤三、绘制四种砷化合物的标准曲线：
在步骤一确定的HPLC-ICP-MS色谱条件下依次将步骤二配制的四种砷化合物的标准溶液进样分析，以砷化合物的浓度x为横坐标，砷化合物的峰面积y为纵坐标，进行线性回归分析，分别绘制四种砷化合物的标准曲线方程，所得四种砷化合物的标准曲线方程分别为：
AsIII：y＝9924.3x+644.46，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
DMAV：y＝14625x+2914.6，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
MMAV：y＝13488x+2616.2，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
AsV：y＝14060x+10134，r2＝0.9999，线性范围为1～128ng/ml。
步骤四、收集与处理粒细胞样本：
(1)收集粒细胞样本：收集全血样本于EDTA抗凝管中，加入红细胞裂解液破碎红细胞，离心去上清，用PBS缓冲液清洗沉淀，得到白细胞样本并将样本转移至流式管中；
在所得白细胞样本中加入抗体，室温条件下进行孵育，15分钟后加入PBS缓冲液终止孵育，离心，弃上清，在沉淀中加入PBS缓冲液混匀，用200目过滤网过滤后将所得样品放入流式细胞仪进行分选，
(2)处理粒细胞样本：取所得粒细胞样本，用步骤一所述的流动相进行稀释，加入质量浓度为5％的氨水，充分混匀得到处理液，再将质量浓度为30％的双氧水加入所述的处理液中，涡旋混匀，静置20min，得到预处理样本，按一定体积比将预处理样本与质量浓度为20％的高氯酸混匀并置于4℃条件下高速离心，取上清液用0.22μm滤膜过滤得到检测样本；
步骤五、样本检测与数据处理：
将步骤四所得检测样本依据步骤一确定的HPLC-ICP-MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用相应砷化合物的标准曲线，外标法定量，计算得出粒细胞样本中各砷化合物的浓度。
实施例3
本实施例提供的HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，包括如下步骤：
步骤一、确定HPLC-ICP-MS检测条件：
高效液相色谱条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：0.9mL/min；流动相：3mmol/L无水磷酸二氢钠，13mmol/L无水乙酸钠，0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠和4mmol/L硝酸钾组成的混合溶液；进样体积为50μL；
电感耦合等离子体质谱条件：检测模式：DRC加氧模式，喷雾器气流量：0.9L/min，辅助气流量：1.2L/min，等离子气流量：18L/min，电感耦合等离子射频功率：1600W，氧气流量：0.6ml/min；
步骤二、配制四种砷化合物的标准溶液：
分别配制浓度均为1000ng/mL的AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷化合物的储备液；将AsIII、DMAV、MMAV的储备液逐级稀释得到浓度均依次为64、32、16、4、1和0.5ng/mL的三种砷化合物的标准溶液、将AsV的储备液逐级稀释得到浓度依次为128、64、32、16、4和1ng/mL的标准溶液；
步骤三、绘制四种砷化合物的标准曲线：
在步骤一确定的HPLC-ICP-MS色谱条件下依次将步骤二配制的四种砷化合物的标准溶液进样分析，以砷化合物的浓度x为横坐标，砷化合物的峰面积y为纵坐标，进行线性回归分析，分别绘制四种砷化合物的标准曲线方程，所得四种砷化合物的标准曲线方程分别为：
AsIII：y＝9924.3x+644.46，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
DMAV：y＝14625x+2914.6，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
MMAV：y＝13488x+2616.2，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
AsV：y＝14060x+10134，r2＝0.9999，线性范围为1～128ng/ml。
步骤四、收集与处理粒细胞样本：
(1)收集粒细胞样本：收集全血样本于EDTA抗凝管中，精密量取1ml全血至15ml离心管中，加入10ml红细胞裂解液破碎红细胞，混匀后静置15min，将样本置于4℃条件下1460r/min离心5min去上清，用pH为7.0的1×PBS缓冲液10ml清洗所得沉淀两次，即在沉淀中加入PBS溶液10ml混匀，1460r/min离心5min，弃上清，重复两次后得到白细胞样本并将样本转移至流式管中；
在所得白细胞样本中加入抗体FITC-A CD14 10μl、PerCP-A CD45 10μl、APC-ACD3 3μl、APC-A CD19 3μl，混匀放至暗处室温条件下进行孵育，15分钟后加入1ml PBS缓冲液终止孵育，将样本置于4℃条件下1460r/min离心5min，弃上清，在沉淀中加入1ml PBS缓冲液混匀，用200目过滤网过滤后将所得样品加入流式细胞仪进行分选，
(2)处理粒细胞样本：取所得粒细胞样本，用步骤一所述的流动相进行稀释，加入质量浓度为5％的氨水，充分混匀得到处理液，再将质量浓度为30％的双氧水加入所述的处理液中，涡旋混匀，静置20min，得到预处理样本，按一定体积比将预处理样本与质量浓度为20％的高氯酸混匀并置于4℃条件下高速离心，取上清液用0.22μm滤膜过滤得到检测样本；
步骤五、样本检测与数据处理：
将步骤四所得检测样本依据步骤一确定的HPLC-ICP-MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用相应砷化合物的标准曲线，外标法定量，计算得出粒细胞样本中各砷化合物的浓度。
实施例4
本实施例一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，包括如下步骤：
步骤一、确定HPLC-ICP-MS检测条件：
高效液相色谱条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：0.9mL/min；流动相：3mmol/L无水磷酸二氢钠，13mmol/L无水乙酸钠，0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠和4mmol/L硝酸钾组成的混合溶液；进样体积为50μL；
电感耦合等离子体质谱条件：检测模式：DRC加氧模式，喷雾器气流量：0.9L/min，辅助气流量：1.2L/min，等离子气流量：18L/min，电感耦合等离子射频功率：1600W，氧气流量：0.6ml/min；
步骤二、配制四种砷化合物的标准溶液：
分别配制浓度均为1000ng/mL的AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷化合物的储备液；将AsIII、DMAV、MMAV的储备液逐级稀释得到浓度均依次为64、32、16、4、1和0.5ng/mL的三种砷化合物的标准溶液、将AsV的储备液逐级稀释得到浓度依次为128、64、32、16、4和1ng/mL的标准溶液；
步骤三、绘制四种砷化合物的标准曲线：
在步骤一确定的HPLC-ICP-MS色谱条件下依次将步骤二配制的四种砷化合物的标准溶液进样分析，以砷化合物的浓度x为横坐标，砷化合物的峰面积y为纵坐标，进行线性回归分析，分别绘制四种砷化合物的标准曲线方程，所得四种砷化合物的标准曲线方程分别为：
AsIII：y＝9924.3x+644.46，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
DMAV：y＝14625x+2914.6，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
MMAV：y＝13488x+2616.2，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml；
AsV：y＝14060x+10134，r2＝0.9999，线性范围为1～128ng/ml。
步骤四、收集与处理粒细胞样本：
(1)收集粒细胞样本：收集全血样本于EDTA抗凝管中，精密量取1ml全血至15ml离心管中，加入10ml红细胞裂解液破碎红细胞，混匀后静置15min，将样本置于4℃条件下1460r/min离心5min去上清，用pH为7.0的1×PBS缓冲液10ml清洗所得沉淀两次，即在沉淀中加入PBS溶液10ml混匀，1460r/min离心5min，弃上清，重复两次后得到白细胞样本并将样本转移至流式管中；
在所得白细胞样本中加入抗体FITC-A CD14 10μl、PerCP-A CD45 10μl、APC-ACD3 3μl、APC-A CD19 3μl，混匀放至暗处室温条件下进行孵育，15分钟后加入1ml PBS缓冲液终止孵育，将样本置于4℃条件下1460r/min离心5min，弃上清，在沉淀中加入1ml PBS缓冲液混匀，用200目过滤网过滤后将所得样品加入流式细胞仪进行分选，
(2)处理粒细胞样本：取所得粒细胞样本，加入49μl步骤一所述的流动相进行稀释，加入1μl质量浓度为5％的氨水，充分混匀得到处理液，再将50μl质量浓度为30％的双氧水加入所述的处理液中，涡旋混匀，静置20min，得到预处理样本，取预处理样本90μl，加入20％高氯酸10μl，涡旋混合均匀并于4℃下13200rpm离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤得到检测样本；
步骤五、样本检测与数据处理：
将步骤四所得检测样本依据步骤一确定的HPLC-ICP-MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用相应砷化合物的标准曲线，外标法定量，计算得出粒细胞样本中各砷化合物的浓度。
实施例5
为验证实施例4提供的HPLC-ICP-MS检测方法的准确度与精密度，本实施例进行了该方法的加标回收率与重复性实验。
试验方法：分别在1、24、64ng/mL三个加标水平下，取空白粒细胞分别加入低、中、高水平砷标液，按实施例4提供的检测方法测定HPLC-ICP-MS方法加标回收率及重复性，粒细胞的AsIII+AsV、MMAV、DMAV的加标回收率和精密度(n＝3)见表1：
表1
由表1数据可知，在1、24、64ng/mL三个加标水平下砷化合物的加标回收率均在±15％内；一日内重复测定5次，连续测定5天，得到日内精密度和日间精密度均在±15％内。这说明了实施例4提供的检测方法精密度和重复性较好，可用于精确的定量分析。
实施例6
为验证实施例4提供的HPLC-ICP-MS检测方法的稳定性，本实施例进行了稳定性实验。
试验方法：分别在1、24、64ng/mL三个加标水平下，分别将低、中、高水平砷标液加入空白粒细胞中，按实施例4提供的方法测定HPLC-ICP-MS方法的室温、冻融及30天长期稳定性，粒细胞的AsIII+AsV、MMAV、DMAV的室温、冻融及长期稳定性(n＝3)见表2：
表2
由表2数据可知，砷化合物在1、24、64ng/mL三个加标水平下的回收率均在±15％内，稳定性符合标准。
实施例7
本实施例利用实施例4提供的HPLC-ICP-MS检测方法测定正接受亚砷酸治疗的APL患者粒细胞中四种砷化合物浓度，具体步骤如下：
步骤一、样本收集与处理：
(1)收集粒细胞样本：收集全血样本于EDTA抗凝管中，取1ml全血至15ml离心管中，按照体积比1：10的比例加入10ml红细胞裂解液，摇匀放置15min后，4℃条件下1460r/min离心5min，弃上清，得到白细胞沉淀。向沉淀加入10ml pH为7.0的1×PBS缓冲液，清洗细胞两遍，将细胞转移至流式管中，加入抗体FITC-A CD14 10μl、PerCP-A CD45 10μl、APC-A CD33μl、APC-A CD19 3μl，轻弹混匀置于暗处室温条件下孵育，15min后，加入1ml PBS缓冲液混匀终止孵育，将样本置于4℃条件下1460r/min离心5min，弃上清，在细胞沉淀中加入PBS缓冲液1ml，用200目过滤网过滤，用流式细胞仪进行分选，分选后得到粒细胞。
图2-图6是流式细胞仪的分选过程，首先图2为白细胞的全扫描谱图；其中包括淋巴细胞、粒细胞和单核细胞；图3为PerCP-A CD45识别的粒细胞(Granu)、淋巴细胞(Lym)的流式细胞图；图4为FITC-A CD14识别的单核细胞(Mono)流式细胞图；图5为APC-A CD3、APC-A CD19识别的淋巴细胞(Lym)流式细胞图；图6为除去淋巴细胞(Lym)及单核细胞(Mono)后得到的粒细胞(Granu)流式分选图。
从图2-图6的对比可以看出，相对于现有粒细胞提取方法，本发明向白细胞中加入抗体FITC-A CD14、PerCP-A CD45、APC-A CD3和APC-A CD19，通过流式细胞仪实现了白细胞中淋巴细胞、粒细胞和单核细胞的精确分选，可以尽可能完全的提取全血中的粒细胞，减少粒细胞损失，并可以准确定量粒细胞数目，从而减少误差，更加准确定量全血粒细胞中四种砷化合物浓度。
(2)粒细胞样本的处理：取粒细胞沉淀，加入49μl流动相稀释细胞沉淀，加入1μl5％氨水，混匀，加入50μl 30％双氧水，涡旋混匀，放置20min，得到预处理样本，取90μl预处理样本加入10μl 20％高氯酸，涡旋混合均匀并于4℃下13200rpm离心15min，取上清液用于仪器检测。
步骤二、样本的检测与数据处理
取经步骤一处理所得检测样本50μl按照实施例4提供的HPLC-ICP-MS检测方法进行分析，由峰面积定量，保留时间定性，利用相应砷化合物的标准曲线，外标法定量，计算得出粒细胞样本中各砷化合物的浓度。
该患者粒细胞样本色谱图见图1，经检测其每毫升全血的粒细胞样本中砷化合物浓度如表3所示：
表3
由图1可以看出，本实施例提供的检测方法得到的不同砷形态峰形完整、清晰，由表3可以看出，在该APL患者外周血粒细胞中，AsV、DMAV、MMAV均有分布，并且无机砷(AsIII+AsV)的浓度高于甲基砷(DMAV+MMAV)；在甲基砷中，MMAV的浓度高于DMAV。
本实施例在收集与处理粒细胞样本时先加入红细胞裂解液破碎全血中红细胞，随后加入抗体，用流式细胞仪进行分选得到粒细胞样本。向样本中加入流动相、氨水、双氧水，最后加入高氯酸沉淀蛋白，离心后的上清液进行检测，利用HPLC对四种砷化合物进行分离，利用ICP-MS对四种砷化合物进行定量，并在5min内完全出峰，首次准确、快速、灵敏的对粒细胞中AsIII、AsV、DMAV、MMAV四种砷化合物进行定量。
Claims (6)
1.一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、确定HPLC-ICP-MS检测条件：
步骤二、配制AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷化合物的标准溶液：
步骤三、绘制四种砷化合物的标准曲线：
步骤四、收集与处理粒细胞样本：
（1）收集粒细胞样本：从全血样本中提取白细胞，在所得白细胞样本中加入抗体进行孵育，所述的抗体为FITC-A CD14、PerCP-A CD45、APC-A CD3和APC-A CD19，所述抗体的添加量为每1mL全血提取所得白细胞样本中加入FITC-A CD14 10μl 、PerCP-A CD45 10μl、APC-A CD3 3μl和APC-A CD19 3μl，孵育后所得样本经分选得到粒细胞样本；
（2）处理粒细胞样本：取所得粒细胞样本，用HPLC流动相进行稀释，加入质量浓度为5%的氨水，充分混匀得到处理液，再将质量浓度为30%的双氧水加入所述的处理液中，涡旋混匀，静置20min，得到预处理样本，按一定体积比将预处理样本与质量浓度为20%的高氯酸混匀并置于4℃条件下高速离心，取上清液用0.22μm滤膜过滤得到检测样本；
步骤五、样本检测与数据处理；
步骤一所述HPLC-ICP-MS检测条件为：
高效液相色谱条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150 mm×4.1 mm，5 μm；流速：0.9 mL/min；流动相：3 mmol/L无水磷酸二氢钠，13 mmol/L无水乙酸钠，0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二钠和4 mmol/L硝酸钾组成的混合溶液；进样体积为50 µL；
电感耦合等离子体质谱条件：检测模式：DRC加氧模式，喷雾器气流量：0.9L/min，辅助气流量：1.2L/min，等离子气流量：18L/min，电感耦合等离子射频功率：1600W，氧气流量：0.6ml/min。
2.根据权利要求1所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤二所述四种砷化合物的标准溶液中AsIII、DMAV、MMAV的标准溶液中砷化合物的浓度均依次为64、32、16、4、1和0.5 ng/mL，AsV的标准溶液中砷化合物的浓度依次为128、64、32、16、4和1 ng/mL。
3.根据权利要求2所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤四（1）所述的提取白细胞的方法为将全血样本与红细胞裂解液按体积比为1：10混合破碎红细胞，混匀后静置15min，离心取上清，清洗所得沉淀即获得白细胞样本。
4.根据权利要求3所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤四（1）所述孵育为暗处孵育15min。
5.根据权利要求4所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤四（2）所述流动相、5%氨水和30%双氧水的加入量为每1mL全血提取所得粒细胞样本加入流动相49μl、5%氨水1μl、30%双氧水50μl；所述预处理样本与所述20%高氯酸的体积比为90：10；所述高速离心为4℃条件下13200 rpm离心15 min。
6.权利要求1-5任一所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法在检测砷剂治疗的APL患者外周血粒细胞内四种砷化合物浓度中的应用。
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