CN106483298B - 用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒 - Google Patents

用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于医疗检测领域,具体涉及一种用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包含的试剂有Cyfra21‑1磁分离试剂,酶标记的Cyfra21‑1抗体溶液,标准品,洗涤液以及化学发光底物溶液。

Description

用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒
技术领域
本发明属于医疗检测领域,具体涉及一种用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒及其制备方法。
背景技术
肺癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤,其发病率以每年3%的速度上升。近年来对肺癌的治疗虽然取得很大进展,但效果仍不理想,其5年生存率仍在20%~30%,而中晚期癌治疗效果更差。研究表明,早期诊断率是提高生存率的关键所在,而目前所用标志物在敏感性、特异性方面还不能达到要求。
细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)是一分子量为40×103的酸性蛋白质,是上皮细胞骨架的一部分,在恶性上皮细胞中,激活的蛋白酶加速了细胞角蛋白的障碍,使得大量细胞角蛋白片段释放入血,尤其是cyfra21-1在肺癌中含量丰富,其与CEA和NSE联合检测对肺癌的鉴别诊断,病情监测有重要价值。Cyfra21-1对乳腺癌,膀胱癌,卵巢癌也是很好的辅助诊断和治疗监测指标。还应与其他有关的肿瘤标志物联合检测,以同时提高临床诊断的特异性和灵敏度。
对Cyfra21-1的定量分析,目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析(ELISA),其中RIA必须用I等放射性元素标记,检测设备复杂,必须用专门的仪器测定,其放射性核素的半衰期短,不能长期保存,同时也给实验操作人员带来了放射性伤害。ELISA检测灵敏度不够高,检测范围窄,影响因素较多,易造成假阴性和假阳性等缺点也不能满足临床的要求,因此,化学发光免疫分析方法(CLIA)应运而生。
磁性微球作为体外诊断的固相载体,起到识别、捕获、控制与运输目标待检分子的载体作用。由于其在整个反应过程中均是悬浮在待检样本中,与传统的多孔板载体相比,其整个反应基本处于液态或准液态状态,载体与待检物之间发生分子碰撞的几率大大增加。另外,由于磁性微球较大的表面积提高了负载目标待检分子的效率,因而使得其生物反应效率较传统多孔板方式大为提高;一般多孔板上的生物反应需要在1~3小时之间,而基于磁性微球的生物反应仅需十几分钟。另外,由于磁性微球卓越的超顺磁特性,使得采用全自动磁性分离方式与检测可以轻松地实现。
专利CN200710121167公开一种细胞角蛋白19片段的化学发光免疫分析方法,但是其仍然是将相关抗体固定在传统的多孔板上进行相关检测。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的定量测定试剂盒,其包含的试剂有Cyfra21-1磁分离试剂,酶标记的Cyfra21-1抗体溶液,标准品,洗涤液以及化学发光底物溶液。
所述Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。
所述酶标记的Cyfra21-1抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗Cyfra21-1单克隆抗体和1mg/ml BSA的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。
所述标准品为不同浓度的Cyfra21-1标准品溶液,其分别含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1标准品的50mmol/l PBS缓冲液,pH7.4。
洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1%的Tween-20配制而成。
所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液;发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液,且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺,所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液,且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。
本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的制备方法,具体步骤如下:
1)Cyfra21-1磁分离试剂的制备:采用化学交联法将Cyfra21-1单克隆抗体和磁性微球偶联,磁性微球直径在1.0μm左右,制备后用PBS缓冲液冲洗三次,然后用1%的BSA溶液封闭3小时,磁性分离微球,用PBS缓冲液冲洗三次,然后用50mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮,加入终浓度0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂和0.1mg/ml的PEG200,调pH值至7.4即得;
2)酶标记的Cyfra21-1抗体溶液的制备:采用NaIO4法标记Cyfra21-1单克隆抗体,反应后透析纯化,然后用20mmol/L的PBS缓冲液溶解,加入终浓度1mg/ml BSA,调pH值至7.4即得;
3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。
具体实施方式
下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是,以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明,并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1试剂盒制备
1)Cyfra21-1磁分离试剂的制备:
采用0.05mol/L的PBS缓冲液将聚苯乙烯磁性微球悬浮,磁性微球直径在1.0μm左右,磁性微球的质量分数为2.5%;然后向微球溶液中添加终浓度为1mg/ml的Cyfra21-1单克隆抗体(所述单克隆抗体与下述酶标记用Cyfra21-1单克隆抗体为配对抗体,购自上海领潮生物科技有限公司),摇匀10分钟,然后向体系中加入3.5mg/ml碳亚二胺,摇床反应20小时,PBS缓冲液清洗三次,磁性分离获得微球,然后用1%的BSA溶液封闭3小时,磁性分离微球,用PBS缓冲液冲洗三次,磁性分离,然后将偶联有抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球分散在0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液中,调pH值为7.4,从而获得Cyfra21-1磁分离试剂。
2)酶标记的Cyfra21-1抗体溶液的制备:采用本领域常规NaIO4法获得辣根过氧化物酶标记的Cyfra21-1单克隆抗体,反应后透析纯化,然后用50mmol/L的PBS缓冲液溶解,加入终浓度1mg/ml BSA,调pH值至7.4即得;
3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。
制备后试剂盒组成如下:
Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。
酶标记的Cyfra21-1抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗Cyfra21-1单克隆抗体和1mg/ml BSA的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。
标准品为不同浓度的Cyfra21-1标准品溶液,其分别含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1标准品的50mmol/l PBS缓冲液,pH7.4。
洗涤液由在浓度为20mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1%的Tween-20配制而成。
所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液;发光底物A为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液,且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺,所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液,且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。
实施例2试剂盒检测方法
a.向微孔板分别加入血清样本和Cyfra21-1标准品,每孔20μl;
b.依次向每孔加入酶标记的Cyfra21-1抗体溶液和Cyfra21-1磁分离试剂各50μl,振荡30s后,置37℃水浴30分钟。
c.采用磁分离器,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的微孔板连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
d.加200μl洗涤液至每孔中,振荡混匀30s,磁分离去洗涤液,重复三次。
e.加发光底物A、B每孔各50μl,充分混匀,立刻加入化学发光仪中检测信号值。
实施例3Cyfra21-1磁分离试剂的稳定性考察
采用不同的溶液组成的磁分离试剂,在37℃下以60转/分钟摇动放置一个月,采用实施例2的方法测定Cyfra21-1标准品(浓度4ng/ml),其他检测试剂同实施例1,计算不同放置时间测定的化学信号值与0天时测定的化学信号值的百分比。各组磁分离试剂组成如下:
组1:同实施例1
组2:Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。
组3:Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。
组4:Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4。
具体结果如下:
N=5 组1 组2 组3 组4
5天 99.1% 82.4% 91.6% 89.3%
15天 98.8% 72.7% 83.3% 78.2%
30天 98.2% 64.1% 71.9% 68.7%
另外,需要说明的是将整个试剂盒置于37℃下保存一个月后,试剂盒性能没有明显改变。与0天测定值相比差别<2%。
实施例4Cyfra21-1试剂盒性能考察
采用实施例1制备的Cyfra21-1检测试剂盒进行下列测定:
1)分别取Cyfra21-1标准品溶液,分别含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1标准品;按照实施例2的方法进行测定,以化学发光值(RLU)为Y轴,以标准品浓度为x轴,绘制标准曲线;结果表明:本发明实施例1试剂盒线性良好,线性方程为y=29821X+945;线性系数R>0.999。
2)对20次零标准品的测定,取其2倍的平均偏差,其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度,结果表明实施例1试剂盒灵敏度为0.03ng/ml
实施例5实施例1试剂盒其他性能指标
精密性:批内变异CV%≤4.3%;批间变异CV%≤4.7%
线性系数:r≥0.9990
线性范围:0.10-16ng/ml
特异性:与CEA、AFP、CA199等常规肿瘤标志物交叉反应率低于0.2%。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案,其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合,这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内,就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (2)

1.一种细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的定量测定试剂盒,其包含的试剂有Cyfra21-1磁分离试剂,酶标记的Cyfra21-1抗体溶液,标准品,洗涤液以及化学发光底物溶液;
所述Cyfra21-1磁分离试剂为含有1mg/ml的偶联有抗Cyfra21-1单克隆抗体的磁性微球,0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂,0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4;
所述酶标记的Cyfra21-1抗体溶液是含有1mg/ml辣根过氧化酶标记的抗Cyfra21-1单克隆抗体和1mg/ml BSA的50mmol/L的PBS缓冲液,pH值为7.4;
所述的标准品为不同浓度的Cyfra21-1标准品溶液,其分别含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1标准品的50mmol/l PBS缓冲液,pH7.4。
洗涤液由在浓度为20mol/L、pH 为7.4的磷酸盐缓冲液中加入1%的Tween-20 配制而成;
所述化学发光底物溶液分为发光底物A溶液和发光底物B溶液;发光底物A为0.1M、 pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液,且该缓冲液中含有终浓度为 5.0mg/mL的鲁米诺,所述发光底物B为是pH值为4.5的0.1M柠檬酸缓冲液,且该缓冲液中含有终浓度为100 mg/mL的过氧化氢和15mg/mL辣根过氧化氢酶。
2.一种权利要求1所述的定量测定试剂盒的制备方法,具体步骤如下:
1)Cyfra21-1磁分离试剂的制备:采用化学交联法将Cyfra21-1单克隆抗体和磁性微球偶联,磁性微球直径在1.0μm左右,制备后用PBS缓冲液冲洗三次,然后用1%的BSA溶液封闭3小时,磁性分离微球,用PBS缓冲液冲洗三次,然后用50mmol/L的PBS缓冲液重新悬浮,加入终浓度0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化铵,0.2mg/ml的卵磷脂和0.1mg/ml的PEG200,调pH值至7.4即得;
2)酶标记的Cyfra21-1抗体溶液的制备:采用NaIO4法标记Cyfra21-1单克隆抗体,反应后透析纯化,然后用20mmol/L的PBS缓冲液溶解,加入终浓度1mg/ml BSA,调pH值至7.4即得;
3)常规方法配置标准品、洗涤液和化学底物溶液。
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