CN103941021B - 一种检测白细胞介素‑6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素‑6的方法 - Google Patents

一种检测白细胞介素‑6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素‑6的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种检测白细胞介素‑6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素‑6的方法。该试剂盒包括生物素化抗体、酶标记抗体、化学发光底物和亲和素偶联的超顺磁微粒；生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与抗白细胞介素‑6单克隆抗体A偶联的产物；酶标记抗体为酶与抗白细胞介素‑6单克隆抗体B偶联的产物。本发明提供的试剂盒具有检测灵敏度高，特异性好，检测时间短，检测过程简单，并能方便用于全自动检测仪器等优点。

Description

一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞 介素-6的方法
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素-6的方法。
背景技术
白细胞介素-6(IL-6)是细胞因子的核心成员，1980被发现，1986年被统一命名为IL-6，相对分子量为Mr26000，它是由212个氨基酸组成的多功能糖蛋白，主要由单核-巨噬细胞、T淋巴细胞和纤维母细胞合成，可以促进肝脏合成急性期蛋白，激活T淋巴细胞，并诱导B淋巴细胞的终末期分化，使之成为具有分泌免疫球蛋白的免疫活性细胞。IL-6所具有的多种生物学功能，在抗感染、肿瘤、免疫性疾病及免疫调节等诸多方面发挥重要作用。在异常情况下，IL-6的升高可能对机体产生不利影响，造成组织损害和加重病情发展。随着医学研究的不断深入，IL-6在临床诊断上的重要性日益增加。目前IL-6在临床诊断上的应用主要有以下方面：
1、炎症反应
感染、创伤、大手术等因素可诱发全身炎症反应综合征(SIRS)，严重时可发展为多器官功能障碍综合征(MODS)，甚至死亡。IL-6是一种重要的促炎细胞因子，异常释放会导致机体多器官细胞代谢障碍和功能损害。国内有学者报道，重度多发性创伤患者从受伤当日至出院前血中IL-6明显升高。Miyaoka等发现，在正颌外科手术后继发SIRS患者的IL-6浓度明显高于未继发SIRS的患者，IL-6是SIRS患者预后的一个预测因素。也有研究发现，SIRS患者第1天血清IL-6浓度明显升高，并且在发生MODS患者中明显高于未发生MODS患者，在死亡患者中明显高于存活者，说明IL-6浓度的高低预示着SIRS患者病程的进展。
多项研究表明，IL-6对新生儿败血症的诊断也有重要意义。金雅磊等报导，脐血IL-6水平与新生儿败血症的发生有一定关系，IL-6可作为新生儿败血症的早期诊断指标。金益人等研究表明新生儿败血症及败血症休克早期血清IL-6水平升高，与病情、预后有关，早期检测意义较大。陈小琴、陈云的研究表明，IL-6对新生儿败血症诊断的敏感性、特异性、阴阳性预测值均优于CRP和PCT，而三个指标联合应用则效果更好，揭示了IL-6对新生儿败血症的良好诊断价值。
2、肿瘤免疫
生物体通过多层次、精确的内部调节机制，完成发育、分化、代谢等各项正常的生理活动。一旦这些调控系统出现紊乱，细胞失去对分化、增值、凋亡等过程正确及时的调控，正常的组织形态就会出现恶性转化，导致肿瘤的发生。IL-6的失调就可能导致肿瘤的发生。
近年来研究发现IL-6与肿瘤的发生关系密切，并与其诊断和预后相关联。有文献报道通过对胆管癌(BDC)患者、肝细胞癌(HCC)患者及正常人血清IL-6水平的研究，发现IL-6的浓度在BDC中明显高于HCC和正常人的水平，BDC经过光子治疗后IL-6的水平恢复正常，因此血清IL-6测定对于诊断BDC具有重要参考意义，且可作为用光子疗法治疗BDC的效果监测指标。Hsia等发现在肝癌中，应用血清学测定IL-6较良性肝脏疾病和非肝细胞癌肿瘤高，IL-6可以帮助鉴别甲胎蛋白(AFP)不高的一组肝细胞癌病人，因此IL-6可以用于辅助肝细胞癌的诊断。Tan等在对鼻咽癌的研究中发现，EB病毒(EBV)的病毒载量与IL-6的水平可作为肿瘤诊断的标志物，也是判断预后的指标。Clinchy等报道结肠癌病人术后将外周血单个核细胞(PBMC)培养，测定上清液中的IL-6，发现浓度>5000pg/mL IL-6病人有极差的预后，IL-6水平越低预后越好，故认为PBMC培养的IL-6水平可以作为结肠癌预后指标。以上实验都表明常规的肿瘤诊断联合测定IL-6的水平在肿瘤的诊断和预后中具有重要意义。Salgado R等研究表明循环中的IL-6与转移性乳腺癌的低生存率有关，并且与病变范围有关，通过96个未接受系统治疗的进展转移性的乳腺癌患者，测定血清中IL-6水平，统计学分析表明高水平的IL-6对其预后有独立的价值。Tempfer等通过73个不同分期的卵巢癌病人，在未接受治疗前按酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定血清中的IL-6水平，结果表明IL-6水平与FIOGO分期、淋巴结转移、肿瘤的分级无关，但IL-6升高与肿瘤复发和低生存率有显著关系。Yamaoka等研究发现，早起胃癌伴活动性幽门螺杆菌(HP)感染者其IL-6水平较无HP感染早期胃癌明显升高，在HP治疗后又明显下降，说明IL-6水平与HP感染有关。同时，胃癌组织与正常胃粘膜组织相比，IL-6水平明显增高，因此，推断IL-6与伴有HP感染的胃癌有关。
3、心血管疾病
IL-6参与了冠状动脉粥样硬化的形成，是冠脉事件的预测因子，与心力衰竭的进展相关。此为，IL-6与心脏粘液瘤和不稳定型心绞痛等心血管疾病也有一定的关系。
一项3090例冠心病病人的病例对照研究表明，发生冠脉事件组的IL-6水平明显高于没有发生冠脉事件的对照组(65pg/mL：2.34pg/mL)，IL-6每增加1pg/mL，急性心肌梗塞(AMI)和猝死的相对优势增加1.70(1.23～2.45)。血清IL-6水平反映了冠脉病变的严重程度和不稳定型心绞痛及AMI的预后，是比CRP和ICAM-1更好的冠脉事件的预测因子。Mendoza等研究发现心脏粘液瘤复发时，IL-6的浓度常明显增高，认为IL-6有可能成为测定心脏粘液瘤复发的一个标志。此外，IL-6作为粘液瘤细胞的自分泌生长因子，其过度表达也可能导致肿瘤复发、远处转移和栓塞。冯小平等研究发现，测定血清中IL-6和HS-CRP的水平对不稳定性心绞痛(UAP)的诊断有价值，有助于UAP的早期诊断和病变程度的判断。一些研究也表明，IL-6还与脑梗死、2-型糖尿病、慢性肾功能衰竭等疾病的发生与发展有关。
目前临床上对IL-6的检测，基本都是采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)，该方法采用抗体包被固相板孔，并采用酶催化底物产生颜色变化的方式进行检测；该方法需要进行多步操作，整个检测过程耗时2～4小时；而且该方法通常只适用手工操作，不利于全自动检测仪器的检测，加大了实验结果人为因素引起的误差；并且ELISA方法具有灵敏度较低(通常只能达到ng/mL的灵敏度水平)，检测时间长等缺点，限制了该方法进一步的应用。因此，提供一种分析灵敏度更高的IL-6检测试剂盒具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素-6的方法。该试剂盒具有检测灵敏度高，特异性好，检测时间短，检测过程简单，并能方便用于全自动检测仪器等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测白细胞介素-6的试剂盒，包括生物素化抗体、酶标记抗体、化学发光底物和亲和素偶联的超顺磁微粒；
生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与抗白细胞介素-6单克隆抗体A偶联的产物；
酶标记抗体为酶与抗白细胞介素-6单克隆抗体B偶联的产物。
该试剂盒的检测原理为：当样本中含有抗原“白细胞介素-6”时，生物素化抗体、抗原与酶标记抗体在37℃中进行反应，形成生物素化抗体-抗原-酶标记抗体免疫复合物；然后再加入亲和素偶联的超顺磁微粒，37℃中反应，形成磁微粒-生物素化抗体-抗原-酶标记抗体免疫复合物；经过洗涤除去未参与反应的物质，加入酶对应的化学发光底物，免疫复合物上的酶作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，由特定仪器检测发光信号。
在本发明中，抗白细胞介素-6单克隆抗体A与抗白细胞介素-6单克隆抗体B均为识别白细胞介素-6的抗体，但抗白细胞介素-6单克隆抗体A识别抗原的表位与抗白细胞介素-6单克隆抗体B识别抗原的表位不同。
本发明提供的试剂盒与白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒相比具有如下优点：1)本发明属于酶促化学发光技术，与ELISA试剂产生显色示踪信号相比，具有检测灵敏度高、检测限性范围宽、可以延长检测时间。2)采用生物素-亲和素多级放大体系，由于一个亲和素分子能够结合多个生物素分子，因此把生物素-亲和素系统与高灵敏度的化学发光法结合起来，可以大大提高化学发光试剂产品的敏感度，实现pg级别甚至更低水平的检测灵敏度。3)ELISA采用传统的微孔板式包被固定相，而本发明采用磁微粒偶联抗体作为固定分离相，具有更大的抗体包被表面积，增大了与被检测物的接触几率，整个免疫反应均在近似液态中进行，能大大缩短反应时间，且磁微粒固相对磁场响应性的特点，使反应物的分离、洗涤过程变的非常简便，更适合应用到全自动分析仪器上。
作为优选，超顺磁微粒的直径为500nm～5μm。
优选地，超顺磁微粒的直径为1～3μm。
作为优选，超顺磁微粒的浓度为1～10mg/mL。
在本发明提供的一些实施例中，超顺磁微粒表面的活性基团为羧基(-COOH)或氨基(-NH2)。
作为优选，超顺磁微粒表面的活性基团为羧基(-COOH)。
在本发明提供的一些实施例中，亲和素为链霉亲和素蛋白。
作为优选，亲和素的浓度为1～5mg/mL。
在本发明提供的一些实施例中，酶标记抗体中的酶为辣根过氧化物酶(HRP)。
当酶为辣根过氧化物酶时，所对应的化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺。
在本发明提供的一些实施例中，当化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺时，化学发光底物液中还包括增强剂和氧化剂。
在本发明提供的另一些实施例中，酶标记抗体中的酶为碱性磷酸酶(ALP)。
当酶为碱性磷酸酶时，所对应的化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)。
本发明还提供了该试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
获得亲和素偶联的超顺磁微粒；
获得生物素化抗体；
获得酶标记抗体；
取亲和素偶联的超顺磁微粒、生物素化抗体、酶标记抗体和化学发光底物组合，即得。
在本发明提供的一些实施例中，亲和素偶联的超顺磁微粒的制备原理为：超顺磁微粒表面的活性基团为羧基或氨基，通过化学交联试剂活化超顺磁微粒，使之分别与亲和素蛋白的氨基或羧基基团共价结合，形成稳定的标记物。
在本发明提供的一些实施例中，亲和素为链霉亲和素蛋白。
作为优选，亲和素的浓度为1～5mg/mL。
作为优选，超顺磁微粒的直径为500nm～5μm。
优选地，超顺磁微粒的直径为1～3μm。
作为优选，超顺磁微粒的浓度为1～10mg/mL。
在本发明提供的一些实施例中，超顺磁微粒表面的活性基团为羧基(-COOH)或氨基(-NH2)。
作为优选，超顺磁微粒表面的活性基团为羧基(-COOH)。羧基基团的磁微粒在化学交联剂EDC【1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐】作用下，与链霉亲和素蛋白(SA蛋白)的氨基基团形成酰胺键而共价结合。
在本发明提供的一些实施例中，生物化抗体的制备原理为：由于生物素是小分子物质，不能直接与抗体进行偶联，需要经过修饰之后，才能与蛋白偶联。优选N-羟基丁二酰亚胺酯修饰生物素后形成生物素N羟基丁二酰亚胺酯(biotin-hydroxysuccinimide，缩略词为BNHS)，再与抗白细胞介素-6单克隆抗体偶联。优选地，用于偶联生物素的抗白细胞介素-6单克隆抗体与偶联酶的抗白细胞介素-6单克隆抗体为针对白细胞介素-6不同表位的抗体。
在本发明提供的一些实施例中，酶标记抗体中的酶为辣根过氧化物酶(HRP)。
当酶为辣根过氧化物酶时，所对应的化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺。
在本发明提供的一些实施例中，当化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺时，化学发光底物液中还包括增强剂和氧化剂。
在本发明提供的另一些实施例中，酶标记抗体中的酶为碱性磷酸酶(ALP)。
当酶为碱性磷酸酶时，所对应的化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)。
作为优选，抗白细胞介素-6单克隆抗体A识别抗原的表位与抗白细胞介素-6单克隆抗体B识别抗原的表位不同。
本发明还提供了一种非诊断目的检测白细胞介素-6的方法，其特征在于，使用本发明提供的试剂盒进行操作，包括如下步骤：
取生物素化抗体、酶标记抗体与待测样本发生特异性结合反应，获得第一反应物；
取亲和素偶联的超顺磁微粒与第一反应物发生特异性结合反应，获得第二反应物；
取化学发光底物与第二反应物发生酶促反应，测定发光信号，获得白细胞介素-6的浓度值。
该试剂盒的检测原理为：当样本中含有抗原“白细胞介素-6”时，生物素化抗体、抗原与酶标记抗体在37℃中进行反应，形成生物素化抗体-抗原-酶标记抗体免疫复合物；然后再加入亲和素偶联的超顺磁微粒，37℃中反应，形成磁微粒-生物素化抗体-抗原-酶标记抗体免疫复合物；经过洗涤除去未参与反应的物质，加入酶对应的化学发光底物，免疫复合物上的酶作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，由特定仪器检测发光信号。
作为优选，特异性结合反应具体为在37℃的条件下反应5～15min。
在本发明提供的一些实施例中，生物素化抗体、酶标记抗体与待测样本发生的特异性结合反应具体为在37℃的条件下反应10min。
在本发明提供的一些实施例中，亲和素偶联的超顺磁微粒与第一反应物发生的特异性结合反应具体为在37℃的条件下反应5min。
作为优选，酶促反应具体为在37℃的条件下反应5～10min。
本发明提供了一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素-6的方法。该试剂盒包括生物素化抗体、酶标记抗体、化学发光底物和亲和素偶联的超顺磁微粒；生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与抗白细胞介素-6单克隆抗体A偶联的产物；酶标记抗体为酶与抗白细胞介素-6单克隆抗体B偶联的产物。通过对本发明提供的试剂盒进行方法学评价，显示该试剂盒的回收率在97.9～102.6％之间，批内变异系数在3.46～4.97％之间，批间变异系数在5.47～7.92％之间，分析灵敏度为0.5pg/mL，与市售的罗氏IL-6化学发光试剂具有较强的相关性。而市售的IL-6ELISA检测试剂盒的分析灵敏度为5pg/mL，检测范围为5～800pg/mL；该试剂盒是基于抗原和抗体的特异性免疫反应进行检测的，因此具有很好的特异性。由此可见，本发明提供的试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好的优点。
附图说明
图1示实施例8中的标准曲线；
图2示实施例11中的相关性分析图。
具体实施方式
本发明公开了一种检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素-6的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的检测白细胞介素-6的试剂盒以及非诊断目的检测白细胞介素-6的方法中所用材料或试剂均可由市场购得。其中，抗IL-6单克隆抗体A和抗IL-6单克隆抗体B均购自Thermo Fisher，抗IL-6单克隆抗体A识别白细胞介素-6的表位与抗IL-6单克隆抗体B识别白细胞介素-6的表位不同；鲁米诺化学发光底物液购自Thermo Fisher；重组人IL-6蛋白(标准品)购自Thermo Scientific；正常人血清购自Hytest公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1亲和素偶联的超顺磁微粒的制备
取表面活性基团为羧基基团的超顺磁微粒(直径为500nm～5μm)10mg，置于磁分离器上2min，弃去上清液；加入0.05mol/mL PBS缓冲液4mL，吹打均匀，置于磁分离器上分离2min，弃去上清液，重复洗涤2次。清洗完毕后，加入50mg/mL EDC溶液(pH7.0)1200μL活化超顺磁微粒，吹打均匀后，置于振荡器上，反应1h，获得活化后的超顺磁性微粒。然后加入亲和素为链霉亲和素(SA)蛋白进行偶联，具体操作为：SA用10mmol PBS缓冲液溶解，向活化后的超顺磁性微粒中加入5mg/mL SA溶液1500μL，置于振荡器上反应3～6h。偶联完成后，加入1％牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，缩略词为BSA)3mL封闭磁微粒表面的剩余的羧基集团，混匀后，置于振荡器上反应30min；加入0.1mol/mL PBST缓冲液5mL，混合均匀，置于磁分离器上分离，弃去上清液，重复洗涤3次；最后加入0.1mol/mL PBS和0.5％BSA的保存液复溶，获得亲和素偶联的超顺磁微粒，亲和素偶联的超顺磁微粒的浓度为0.5～2mg/mL，置于4℃备用。
实施例2亲和素偶联的超顺磁微粒的制备
取表面的活性基团为羧基基团的超顺磁微粒(直径为1～3μm)10mg，置于磁分离器上2min，弃去上清液；加入0.05mol/mL PBS缓冲液4mL，吹打均匀，置于磁分离器上分离2min，弃去上清液，重复洗涤2次。清洗完毕后，加入50mg/mL EDC溶液(pH7.0)1200μL活化超顺磁微粒，吹打均匀后，置于振荡器上，反应1h，获得活化后的超顺磁性微粒。然后加入亲和素为链霉亲和素(SA)蛋白进行偶联，具体操作为：SA用10mmol PBS缓冲液溶解，向活化后的超顺磁性微粒中加入5mg/mL SA溶液1500μL，置于振荡器上反应3～6h。偶联完成后，加入1％牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，缩略词为BSA)3mL封闭磁微粒表面的剩余的羧基集团，混匀后，置于振荡器上反应30min；加入0.1mol/mL PBST缓冲液5mL，混合均匀，置于磁分离器上分离，弃去上清液，重复洗涤3次；最后加入0.1mol/mL PBS和0.5％BSA的保存液复溶，获得亲和素偶联的超顺磁微粒，亲和素偶联的超顺磁微粒的浓度为0.5～2mg/mL，置于4℃备用。
实施例3生物素化抗体的制备
取生物素、N-羟基丁二酰亚胺和二环己基碳二亚胺各1mmol，一并加入二甲基甲酰胺溶液6mL中，室温(18～25℃)搅拌18h，过滤，滤液减压抽干，干燥物反复用乙醚洗涤后复溶于异丙醇，再用真空抽干法使浓缩成原量一半体积，置于低温冰箱中结晶，滤纸过滤，收集结晶物，用乙醚洗后即得到生物素N羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)。
用0.1mol/L NaHCO3溶液将抗IL-6单克隆抗体A(来源Thermo Fisher)稀释成2mg/mL的抗体溶液，每毫升抗体溶液中加入二甲基甲酰胺溶解的BNHS(20mg/mL)20μL，混匀，于室温(22℃)反应1h，在4℃环境中置于0.1mM PBS缓冲液中透析24h，透析完成后收集的反应物即为生物素化抗体。
实施例4酶标记抗体的制备
采用改进的过碘酸钠氧化法制备得到辣根过氧化物酶标记抗体：取辣根过氧化物酶(HRP)20mg溶于蒸馏水1.5mL中，加入60mmol/L NaIO40.4mL，放置4℃，混合均匀，氧化60min，然后加入0.16mol/L乙二醇0.4mL，再置4℃终止30min；加入抗IL-6单克隆抗体B(来源Thermo Fisher，其识别白细胞介素-6的抗原表位与抗IL-6单克隆抗体A识别白细胞介素-6的抗原表位不同)5mg，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜，加NaBH4(5mg/mL)0.6mL，置4℃终止2h，加入与上述混合溶液等容积的饱和硫酸铵，4℃沉淀30min后用12000r/min离心15min。沉淀物用pH7.4、0.02mol/L PBS缓冲液1mL溶解，用PBS缓冲液透析除铵，完成后-20℃保存，获得辣根过氧化物酶标记抗体。
实施例5酶标记抗体的制备
采用戊二醛一步法制备得到碱性磷酸酶标记抗体：取抗IL-6单克隆抗体1mL(2mg/mL)，加入碱性磷酸酶5mg溶解；装入透析袋，用pH为7.2、0.01mol/L PBS在4℃下透析18h，换液3次。加入2.5％戊二醛20μL，室温(20℃)放置2h。置于pH为7.2、0.01mol/L PBS中4℃透析过夜，换液3次。移入pH为7.2、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。用含1％BSA和0.02％NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。加入1/3量纯甘油，小量(0.1mL)分装，获得碱性磷酸酶标记抗体，-20℃保存。
实施例6检测白细胞介素-6的试剂盒的制备
用50mM PBS、0.2％Casien(酪蛋白)、0.02％TW-20溶液将实施例1制得的亲和素偶联的超顺磁微粒稀释至0.25mg/mL，获得亲和素偶联的超顺磁微粒工作液。
用50mM PBS、1％BSA溶液将实施例3制得的生物素化抗体稀释至2μg/mL，获得生物素化抗体工作液。
用50mM PBS、1％BSA、0.05％TW-20溶液将实施例4制得的辣根过氧化物酶标记抗体稀释至0.5μg/mL，获得酶标记抗体工作液。
取鲁米诺化学发光底物液(来源Thermo Fisher)，包括发光液A和发光液B)100μL，与上述制得的亲和素偶联的超顺磁微粒工作液50μL、生物素化抗体工作液50μL、酶标记抗体工作液50μL组合，即得。
实施例7检测白细胞介素-6的试剂盒的制备
用50mM PBS、0.2％Casien(酪蛋白)、0.02％TW-20溶液将实施例2制得的亲和素偶联的超顺磁微粒稀释至0.25mg/mL，获得亲和素偶联的超顺磁微粒工作液。
用50mM PBS、1％BSA溶液将实施例3制得的生物素化抗体稀释至2μg/mL，获得生物素化抗体工作液。
用50mM PBS、1％BSA、0.05％TW-20溶液将实施例5制得的碱性磷酸酶标记抗体稀释至0.5μg/mL，获得酶标记抗体工作液。
取化学发光底物液【含3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)】100μL，与上述制得的亲和素偶联的超顺磁微粒工作液50μL、生物素化抗体工作液50μL、酶标记抗体工作液50μL组合，即得。
实施例8准确性评价
准确性测量是指用已知量白细胞介素-6(IL-6)标准品加入到正常人的血清标本中，将测量浓度值与理论浓度值进行比较，计算IL-6的回收率。具体实验方法如下：
采用重组人IL-6蛋白作为标准品(购自Thermo Scientific)，复溶后初始浓度为1000pg/mL，用正常人血清(购自Hytest公司)稀释到800pg/mL(样本1)、250pg/mL(样本2)、50pg/mL(样本3)(稀释后浓度作为理论值)。用本发明实施例6提供的试剂盒进行检测。检测的具体操作为：将50μL待测样本、50μL生物素抗体工作液、50μL酶工作液加入到反应孔中，37℃水浴反应10分钟；然后加入50μL磁珠工作液，37℃水浴反应5分钟；磁性分离，对反应形成的免疫复合物洗涤3次；然后加入化学发光底物100μL，37℃反应3分钟，用PMT光子计数器检测光电信号(RLU)值。将该值代入到事先建立好的标准曲线中(如图1所示，y＝-0.0017x3+2.4498x2+897.09x+2900，R2＝1)，计算出待测样本中IL-6的浓度值。每个浓度重复测试3次，取其平均值为测量浓度均值，按照如下公式进行计算：
回收率(％)＝测量浓度均值/理论浓度值×100％
准确性的评价标准为：回收率在85％～120％之间时，表示该试剂盒具有较高的准确性。
检测结果如表1所示。
表1标准品回收率的测量结果
样本编号 IL-6理论浓度值(pg/mL) IL-6测量浓度值(pg/mL) 回收率(％)
1 800 783.5 97.9
2 250 248.6. 99.4
3 50 51.3 102.6
由表1的检测结果可知，本发明实施例6提供的试剂盒的回收率在97.9％～102.6％之间，表明该试剂盒具有较高的准确性，符合试剂盒的规定。
取实施例7制得的试剂盒对标准品的回收率进行测量，结果与此相近，表明实施例7提供的试剂盒同样具有较高的准确性。
实施例9精密性评价
选取3份不同浓度的临床标本(编号分别为1、2、3)，分别用本发明实施例6提供的试剂盒重复测量20次。具体操作为：将50μL临床标本、50μL生物素抗体工作液、50μL酶工作液加入到反应孔中，37℃水浴反应12分钟；然后加入50μL磁珠工作液，37℃水浴反应8分钟；磁性分离，对反应形成的免疫复合物洗涤3次；然后加入化学发光底物100μL，37℃反应4分钟，用PMT光子计数器检测光电信号(RLU)值。将该值代入到事先建立好的标准曲线中，计算出临床标本中IL-6的浓度值。根据20次的测量结果，计算临床标本的平均值(Mean)和标准差(SD)，按如下公式计算变异系数(CV)。
变异系数(CV)＝平均值/标准差×100％
精密性的评价标准为：批内变异系数或批间变异系数CV<10％时，表示该试剂盒的精密性好。
检测结果如表2所示。
表2临床标本变异系数的测量结果
由表2的检测结果可知，本发明实施例6提供的试剂盒的批内变异系数在3.46～4.97％之间，批间变异系数在5.47～7.92％之间，表明该试剂盒具有较高的精密性，符合试剂盒的规定。
取实施例7制得的试剂盒对临床标本的精密性进行测量，结果与此相近，表明实施例7提供的试剂盒同样具有较高的精密性。
实施例10分析灵敏度评价
分析灵敏度是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。具体操作为：将50μL样本(零浓度样本或不含IL-6的稀释液)、50μL生物素抗体工作液、50μL酶工作液加入到反应孔中，37℃水浴反应15分钟；然后加入50μL磁珠工作液，37℃水浴反应10分钟；磁性分离，对反应形成的免疫复合物洗涤3次；然后加入化学发光底物100μL，37℃反应5分钟，用PMT光子计数器检测光电信号(RLU)值。将该值代入到事先建立好的标准曲线中，计算出零值样本的浓度值。重复20次测量零剂量点，计算其平均值()和标准差(SD)，以公式计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。
检测数据见表3。
表3零剂量点检测结果
通过测量计算，结果显示本发明实施例6提供的试剂盒的分析灵敏度为0.5pg/mL。
取实施例7制得的试剂盒进行分析灵敏度测量，结果与此相近，表明实施例7提供的试剂盒同样具有较高的分析灵敏度。
实施例11相关性评价
取50份临床标本，分别用本发明实施例6提供的试剂盒与市售的罗氏IL-6化学发光试剂进行检测。具体操作为：将50μL临床标本、50μL生物素抗体工作液、50μL酶工作液加入到反应孔中，37℃水浴反应10分钟；然后加入50μL磁珠工作液，37℃水浴反应5分钟；磁性分离，对反应形成的免疫复合物洗涤3次；然后加入化学发光底物100μL，37℃反应3分钟，用PMT光子计数器检测光电信号(RLU)值。将该值代入到事先建立好的标准曲线中，计算出临床标本中IL-6的浓度值。比较两种试剂盒检测结果的相关性。检测数据见表4。
表4相关性分析中测定的IL-6的浓度值(单位pg/mL)
将表4中本发明实施例6提供的试剂盒测定的IL-6的浓度值与罗氏IL-6化学发光试剂盒测定的IL-6的浓度值做相关性分析，相关性分析结果如图2所示，计算结果如下：
Y＝0.9787X-0.2177
R2＝0.9937
由此可见，本发明实施例6提供的试剂盒测定的IL-6的浓度值与罗氏IL-6化学发光试剂盒测定的IL-6的浓度值具有很好的相关性。
取实施例7制得的试剂盒与市售的罗氏IL-6化学发光试剂进行相关性分析，结果与此相近。
对比例1市售的IL-6ELISA检测试剂盒性能指标测定
使用前将市售的IL-6ELISA检测试剂盒中各组分平衡到室温。
洗涤液：如果洗涤液的浓缩液中形成了结晶，温热到室温，并轻轻混匀使结晶完全溶解；用去离子水或蒸馏水将洗涤浓缩液稀释10倍后使用。
底物工作液：将底物工作液中的Glo Reagent A和Reagent B按照1：2混合，使用前放置15min～4h(避光保存)，工作液每孔需要加入100μL。
标准品：用0.5mL去离子水或蒸馏水复溶标准品，复溶的母液浓度为30000pg/mL。稀释前，先静止15min并轻轻震荡混匀。加入950μL RD6-10稀释液到1500pg/mL的管子，剩下的管子加入800μL RD6-10。然后进行梯度稀释，稀释浓度为800pg/mL、400pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、15pg/mL、7.5pg/mL。
测试程序：准备好所有的试剂，拿出需要量的板孔试剂。每孔加入100μL测试稀释液RD1-83，RD1-83使用前要预先混合均匀。每孔加入100μL待测标本。盖上密封条，室温反应2小时，以500转的速度维持震荡混匀。用洗涤液洗涤4遍。加入200μL的IL-6结合物，覆盖密封膜。在震荡器上室温孵育3小时。重复洗涤4遍。每孔加入100μL底物工作液。室温避光孵育5～20分钟。然后检测光电值(RLU)。将该值代入到事先建立好的标准曲线中，计算出待测样本中IL-6的浓度值。
经过检测，结果显示该市售的IL-6ELISA检测试剂盒的分析灵敏度为5pg/mL，检测范围为5～800pg/mL。而本发明提供的检测试剂盒的分析灵敏度可达0.5pg/mL，大大提高了检测试剂盒的分析灵敏度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种检测IL-6的试剂盒，其特征在于，包括生物素化抗体工作液、酶标记抗体工作液、化学发光底物液和亲和素偶联的超顺磁微粒工作液；
所述生物素化抗体为生物素N羟基丁二酰亚胺酯与抗IL-6单克隆抗体A偶联的产物；
所述酶标记抗体为酶与抗IL-6单克隆抗体B偶联的产物；
所述亲和素偶联的超顺磁微粒工作液由含0.2％酪蛋白和0.02％TW-20的50mM PBS的溶液将亲和素偶联的超顺磁微粒稀释至0.25mg/mL获得；
所述生物素化抗体工作液由含1％BSA的50mM PBS溶液将所述生物素化抗体稀释至2μg/mL获得；
所述酶标记抗体工作液由含1％BSA和0.05％TW-20的50mM PBS溶液将所述酶标记抗体稀释至0.5μg/mL获得；
所述化学发光底物液、所述亲和素偶联的超顺磁微粒工作液、所述生物素化抗体工作液以及所述酶标记抗体工作液的体积用量比为100μL:50μL:50μL:50μL；
所述亲和素偶联的超顺磁微粒由如下方法制备得到：
取表面活性基团为羧基基团的直径为500nm～5μm的超顺磁微粒10mg，置于磁分离器上2min，弃去上清液；加入0.05mol/mL PBS缓冲液4mL，吹打均匀，置于磁分离器上分离2min，弃去上清液，重复洗涤2次；清洗完毕后，加入50mg/mL pH 7.0的EDC溶液1200μL活化超顺磁微粒，吹打均匀后，置于振荡器上，反应1h，获得活化后的超顺磁性微粒；然后加入亲和素为链霉亲和素蛋白进行偶联，具体操作为：链霉亲和素用10mmol PBS缓冲液溶解，向活化后的超顺磁性微粒中加入5mg/mL链霉亲和素溶液1500μL，置于振荡器上反应3～6h；偶联完成后，加入1％BSA3mL封闭磁微粒表面的剩余的羧基基团，混匀后，置于振荡器上反应30min；加入0.1mol/mL PBST缓冲液5mL，混合均匀，置于磁分离器上分离，弃去上清液，重复洗涤3次；最后加入含有0.5％BSA的0.1mol/mL PBS的保存液复溶，获得亲和素偶联的超顺磁微粒，亲和素偶联的超顺磁微粒的浓度为0.5～2mg/mL；
所述生物素化抗体由如下制备方法得到：
取生物素、N-羟基丁二酰亚胺和二环己基碳二亚胺各1mmol，一并加入二甲基甲酰胺溶液6mL中，室温18～25℃搅拌18h，过滤，滤液减压抽干，干燥物反复用乙醚洗涤后复溶于异丙醇，再用真空抽干法使浓缩成原量一半体积，置于低温冰箱中结晶，滤纸过滤，收集结晶物，用乙醚洗后即得到生物素N羟基丁二酰亚胺酯；
用0.1mol/L NaHCO3溶液将抗IL-6单克隆抗体A稀释成2mg/mL的抗体溶液，每毫升抗体溶液中加入二甲基甲酰胺溶解的20mg/mL的生物素N羟基丁二酰亚胺酯20μL，混匀，于室温22℃反应1h，在4℃环境中置于0.1mM PBS缓冲液中透析24h，透析完成后收集的反应物即为生物素化抗体；
所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记抗体，由如下方法制备得到：
采用改进的过碘酸钠氧化法制备得到辣根过氧化物酶标记抗体：取辣根过氧化物酶20mg溶于蒸馏水1.5mL中，加入60mmol/L NaIO4 0.4mL，放置4℃，混合均匀，氧化60min，然后加入0.16mol/L乙二醇0.4mL，再置4℃终止30min；加入抗IL-6单克隆抗体B 5mg，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液透析，4℃过夜，加5mg/mL NaBH4 0.6mL，置4℃终止2h，加入与上述混合溶液等容积的饱和硫酸铵，4℃沉淀30min后用12000r/min离心15min；沉淀物用pH7.4、0.02mol/L PBS缓冲液1mL溶解，用PBS缓冲液透析除铵，完成后-20℃保存，获得辣根过氧化物酶标记抗体；
所述抗IL-6单克隆抗体B识别IL-6的抗原表位与所述抗IL-6单克隆抗体A识别IL-6的抗原表位不同。
2.一种非诊断目的检测IL-6的方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤：
取生物素化抗体、酶标记抗体与待测样本发生特异性结合反应，获得第一反应物；
取亲和素偶联的超顺磁微粒与所述第一反应物发生特异性结合反应，获得第二反应物；
取化学发光底物与所述第二反应物发生酶促反应，测定发光信号，获得IL-6的浓度值。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物素化抗体、酶标记抗体与待测样本发生的特异性结合反应、所述亲和素偶联的超顺磁微粒与所述第一反应物发生的特异性结合反应均具体为在37℃的条件下反应5～15min。
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