CN107102135A

CN107102135A - 用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂

Info

Publication number: CN107102135A
Application number: CN201710155146.7A
Authority: CN
Inventors: 吉村徹; 千叶陵太郎; 吉田荣作
Original assignee: Abbott Japan Co Ltd
Current assignee: Abbott Japan Co Ltd
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2017-08-29
Also published as: WO2012161288A1; US20130130275A1; JP2017151120A; WO2012161288A8; JP2014515476A; CN103620409B; JP6441407B2; CN103620409A; US10107826B2

Abstract

描述了用于减少针对测试样品中的PIVKA‑II的免疫检验的非特异性结合的方法和试剂盒，其中使所述测试样品与抗凝血酶原抗体在一种或多种以下添加剂的存在下反应：脱脂乳、皂苷、CaCl₂、MgCl₂和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂。

Description

用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂

本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/JP2012/063398，国际申请日为2012年05月15日，中国国家申请号为201280024237.2，进入中国国家阶段的进入日为2013年11月19日，发明名称为“用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂”。

相关申请信息

本申请要求于2011年5月20日提交的美国临时申请系列号61/488,421的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。

技术领域

本申请公开内容大体上涉及用于检测测试样品中的靶分析物的免疫检验方法、试剂和试剂盒，特别是涉及用于通过减少非特异性抗原-抗体相互作用而改善样品中PIVKA-II的测定的免疫检验方法、试剂和试剂盒。

背景技术

最近数十年免疫检验技术已经广为人知，并且现在常出于各种各样的诊断目的而用于医学以检测测试样品中的靶分析物。免疫检验利用抗体与其相应的抗原的高度特异性结合，其中所述抗原是靶分析物。通常，通过诸如放射标记物或荧光标记物等某种形式的标记物实现抗体或抗原的定量。夹心免疫检验包括使样品中的靶分析物与抗体位置(其通常结合在固相载体上)结合，使经标记的抗体与捕获分析物结合，然后测定结合的标记抗体的量，其中所述标记物生成与靶分析物的浓度成比例的信号，这是因为除非分析物存在于样品中，否则标记的抗体不结合。

可以以多种形式中的任一种进行免疫检验方法。典型的异相夹心免疫测定使用固相作为载体，所述载体上结合有与靶分析物上的至少一种表位具有反应性的第一(捕获)抗体。第二(检测)抗体也与靶分析物上的至少一种表位具有反应性，并且可以缀合至可检测标记物，所述可检测标记物提供在检测抗体与捕获的靶分析物结合之后测定的信号。

PIVKA-II(“维生素K缺乏或拮抗剂诱导蛋白–II”)，也称为脱羧基凝血酶原(DCP)，是用于诊断肝细胞癌(HCC)和确定肝细胞癌(HCC)预后的肿瘤标志物。PIVKA-II也存在于维生素K缺乏或使用华法林的患者中。PIVKA-II检测方法的灵敏性对于建立在临床症状出现之前的诊断是重要的。可利用针对PIVKA-II的免疫检验，但是所用抗体和可存在于样品中的除PIVKA-II之外的抗原之间的非特异性结合相互作用减少了常用的截止水平的灵敏性和准确性。非特异性抗体/抗原相互作用能够增加假阳性诊断结果的风险和个体不能及时准确地获得诊断的风险。因此需要改善PIVKA-II免疫检验的灵敏性和准确性的方法。

发明内容

在一个方面，本申请公开内容提供测定测试样品中的PIVKA-II的方法，所述方法包括使所述测试样品与抗凝血酶原抗体在选自由以下添加剂组成的组的至少一种添加剂的存在下反应：脱脂乳、皂苷、CaCl₂、MgCl₂和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂。所述添加剂可以在包含所述抗体和有效量的所述至少一种添加剂的免疫检验试剂中提供。所述抗体例如可包含抗凝血酶原单克隆抗体，例如MCA1-8。

在另一方面，本申请公开内容提供一种改善针对PIVKA-II的特异性结合检验的灵敏性的方法，其中所述特异性结合检验包括第一反应和第二反应，所述第一反应产生包含与能够特异性结合PIVKA-II的一抗结合的PIVKA-II的第一复合物，所述第二反应包括使所述第一复合物与能够特异性结合PIVKA-II且与可检测标记物缀合的二抗接触，所述方法包括：向所述第二反应添加有效量的选自由脱脂乳、皂苷、CaCl₂、MgCl₂和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂组成的组的至少两种化合物。在以上方法中，向所述第二反应中添加有效量的所述至少两种化合物可以包括例如向所述第二反应添加稀释液，其中所述稀释液包含所述二抗和有效量的所述至少两种化合物。所述二抗例如包含抗凝血酶原单克隆抗体，例如MCA1-8。

在任何方法中，所述免疫检验，也称为特异性结合检验，可以在固相上进行。所述固相可以包含磁性或顺磁性微粒。在任何以上方法中，可以使用至少两种、三种、四种添加剂。在示例性方法中，使用两种添加剂，它们是脱脂乳和皂苷。在任何以上方法中，所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂可以选自由以下物质组成的组：3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；ASB-14(酰氨基磺基甜菜碱-14)；和ASB-16(酰氨基磺基甜菜碱-16)。例如，在示例性方法中，脱脂乳、皂苷和3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)是所选择的添加剂。作为选择，所选择的添加剂可以是脱脂乳、皂苷和3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。在另一备选方案中，所选择的添加剂可以是脱脂乳、皂苷和3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。在又一备选方案中，所选择的添加剂是CaCl₂和MgCl₂中的一种和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂，其中所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂选自由以下物质组成的组：3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。在任何所述方法中，免疫检验可以包含竞争性免疫检验。可以在自动或半自动测定装置中进行免疫检验。免疫检验可以包含例如夹心检验。

在另一方面，本申请公开内容提供用于改善针对PIVKA-II的特异性结合检验的灵敏性的免疫检验试剂，所述试剂包含有效量的选自由脱脂乳、皂苷、CaCl₂、MgCl₂和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂组成的组的至少一种添加剂。免疫检验试剂可以包含这些添加剂中的至少两种、至少三种或至少四种。

在另一方面，本申请公开内容提供用于执行针对PIVKA-II的免疫检验的试剂盒，所述试剂盒包含能够特异性结合PIVKA-II的特异性结合试剂，和选自由以下添加剂组成的组的至少一种或至少两种、至少三种或至少四种添加剂：脱脂乳、皂苷、CaCl₂、MgCl₂和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂。在试剂盒中，在免疫检验试剂中组合多于一种的添加剂。所述试剂盒还可以包含用于使测试样品与抗体在所述至少一种、至少两种、至少三种或至少四种添加剂的存在下反应，并用于将所述测试样品中的PIVKA-II的量定量的说明书。所述试剂盒还包含固相，其可以包括诸如磁性或顺磁性微粒等微粒。

附图说明

图1是使用经标记的抗凝血酶原单克隆抗体(MCA 1-8IgG/F(ab’)2)缀合物来测定测试样品中的PIVKA-II的夹心免疫检验形式的示意图。

图2是将使用不含添加剂的缀合物稀释液或者含有皂苷、脱脂乳或3-16作为缀合物稀释液中的添加剂的稀释液，根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较的柱状图。

图3是将使用不含添加剂的缀合物稀释液或含有皂苷、脱脂乳和3-16的组合作为缀合物稀释液中的添加剂的稀释液，根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较的柱状图。

图4是将使用不含添加剂的缀合物稀释液或含有所测试的数种磺基甜菜碱两性离子洗涤剂之一、皂苷和脱脂乳的组合的稀释液，根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较的柱状图。

图5是将使用作为缀合物中的经标记的抗体的MCA1-8IgG、MCA1-8F(ab’)2、F3-4750IgG或F3-6542IgG，和不含添加剂的缀合物稀释液或含有30mM CaCl₂或30mM MgCl₂的稀释液在pH5.5和pH6.0时大体上根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较的柱状图。

图6是包含两张柱状图的示意图，所述柱状图将在缀合物稀释液含有脱脂乳的各种组分之一作为添加至缀合物稀释液的添加剂时，使用MCA1-8IgG或MCA1-8F(ab’)2作为缀合物中的经标记的抗体，根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较。

图7是使用含有150mM的7种金属氯化物盐之一的缀合物稀释液，根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较的柱状图。

具体实施方式

本申请公开内容提供改善用于检测和测定测试样品中的PIVKA-II的免疫检验特异性的改进的免疫检验方法、试剂和试剂盒。本文所述方法部分基于以下发现：某些添加剂，当单独包含或组合包含在含有抗凝血酶原MAb的缀合物稀释液中时，可以改善针对PIVKA-II的免疫检验的灵敏性。具体而言，发现添加剂脱脂乳、皂苷、磺基甜菜碱两性离子洗涤剂、CaCl₂和MgCl₂在单独使用或以任何组合使用时改善针对PIVKA-II的某些免疫检验的灵敏性。

本文所述的检验方法可应用于使用能够特异性结合PIVKA-II的特异性结合试剂的任何检验系统，包括使用结合至诸如磁性或顺磁性表面等固相的此类结合试剂进行的免疫检验，并且还可在自动和半自动免疫检验系统中有用地进行。

A.定义

该小节中使用的小节标题和此处的全部公开内容不意图具有限制作用。

如本文所用，单数形式的“一种”、“一个”和“所述”包括复数的指代物，除非上下文明确地指出例外。对于本文数值范围的描述，明确涵盖了该范围中具有同样精度的各个中间值。例如，对于范围6-9，除了6和9之外还涵盖数字7和8，对于范围6.0-7.0，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

如本文所用，术语“约”是指与所述值有近似+/-10％的偏差。应该理解的是本文提供的任何给定值都包含该偏差，无论该给定值是否特别提到。

除非本文另外定义，本文使用的所有科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

a)分析物

如本文所用，术语“分析物”是指待检测的物质，其可能存在于样品(即，生物样品)中。分析物可以是具有天然存在的特异性结合伴侣或可以为其制备特异性结合伴侣的任何物质。因此，分析物是在免疫检验中能够与一种或多种特异性结合伴侣相结合的物质。本文所述的分析物的一个实例是内源性抗原，包括但不限于PIVKA-II，其是能够作为例如肝细胞癌(HCC)的量度或作为发展例如肝细胞癌(HCC)的风险的量度而进行评估的抗原。

b)结合伴侣

如本文所用，术语“结合伴侣”是结合对的成员，即其中一种分子与另一种分子结合的分子对。将相互特异性结合的结合伴侣命名为“特异性结合伴侣”。除了免疫检验中常用的抗原和抗体结合伴侣之外，其它特异性结合伴侣包括例如生物素和亲和素，糖和凝集素，互补核苷酸序列，效应子和受体分子，辅因子和酶，以及酶抑制剂和酶等。此外，特异性结合伴侣可以包括为最初特异性结合伴侣的类似物的伴侣，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合伴侣包括抗原、抗原片段、抗体和抗体片段(无论是单克隆抗体还是多克隆抗体)，以及它们的复合物，例如通过重组DNA方法形成的抗原、抗原片段、抗体和抗体片段、以及它们的复合物。

c)表位

术语“表位”、“抗原决定簇”或“目的表位”在本文中可以相互替换地使用，是指在任何分子上的位点，该位点能够被识别并且能够与其特异性结合伴侣上的互补位点结合。分子特异性结合伴侣是特异性结合对的一部分。例如，表位可以是多肽、蛋白、半抗原、糖抗原(例如但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖)或多糖，其特异性结合伴侣可以是，但不限于，抗体，其可以是自身抗体。通常表位包含在较大的抗原片段(即，能够结合抗体区域或片段)内，并且是指已知接触特异性结合伴侣的确切残基。抗原片段可以含有超过一个的表位。

d)特异性结合

如本文所用，术语“特异结合”、“特异性”和“特异性结合”，表征了作为配对具有相互选择性反应的能力的两种分子(例如抗原和抗体)之间的相互作用。词语“与……特异性结合”例如是指抗体与其靶抗原(例如，诸如PIVKA-II等内源性抗原)特异性结合、而与其它实体不特异性结合的能力。可以例如通过诊断免疫检验(例如，放射性免疫检验(“RIA”)和酶联免疫吸附检验(“ELISA”)(例如参见Paul等，Fundamental Immunology，第2版，RavenPress,New York,第332-336页(1989))、(Sweden),(KineticExclusion Assay，获自Sapidyne Instruments(Boise,Id.))或本领域技术人员已知的其它技术来鉴定与分析物特异性结合的抗体或抗体片段。术语“特异性结合”是指对靶分子/序列的结合优先性(例如亲和性)是非特异性靶分子(缺乏特异性识别位点的随机生成的分子)的至少2倍，更优选至少5倍，最优选至少10倍或20倍。

e)固相

如本文所用，“固相”是指不可溶或能够通过随后的反应变得不可溶的任何材料。可以针对其固有能力选择固相，以吸引和固定捕获剂。作为选择，固相可以固定有交联剂，所述交联剂具有吸引和固定捕获剂的能力。交联剂可以例如包括带电物质，所述带电物质相对于捕获剂自身或相对于与捕获剂缀合的带电物质带有相反的电荷。通常，交联剂可以是固定(吸附在)在固相上并且具有通过结合反应固定捕获剂的能力的任何结合伴侣(优选是特异性的)。在进行检验前或在进行检验期间，交联剂能够使捕获剂间接结合至固相材料。固相可以例如是塑料、衍生塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，包括但不限于，例如试管、微量滴定孔、板、珠、微粒、芯片和本领域普通技术人员已知的其它构造。

f)微粒

如本文所用，术语“微粒”是指能够通过超速离心回收的小颗粒。微粒通常具有量级为约1微米以下的平均直径。

g)可检测标记物

如本文所用，术语“可检测标记物”是指任何部分，该部分通过与该部分(moiety)偶联的分子状态的光学、电学或其它物理指标的改变生成可测定信号。此类物理指标包括光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学和化学手段，例如但不限于荧光、化学荧光和化学发光等。在关于经标记的检测剂使用时，“直接标记物”是通过任何手段附着至检测剂的可检测标记物。在关于经标记的检测剂使用时，“间接标记物”是特异性结合检测剂的可检测标记物。因此，间接标记物包括下述部分：其是检测剂部分的特异性结合伴侣。生物素和亲和素是所采用的此类部分的实例，其例如通过使生物素化抗体与经标记的亲和素接触以产生间接标记的抗体来应用。优选的可检测标记物包括吖啶化合物，例如美国专利号5543524、5,565,570、5,783,699、EP-A830629中公开的吖啶化合物，和如WO2008/124749中描述的吖啶-9-羧酸苯基酯。指示剂可用于接触可检测标记物，以产生可检测信号。因此，例如，在常规酶标记物中，可以使以酶标记的抗体与底物(指示剂)接触，以产生可检测信号，例如有色反应产物。

h)抗体

如本文所用，术语“抗体”是指基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白。该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体和它们的片段，以及由免疫球蛋白基因序列工程化的分子。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。将轻链归类为κ或λ。将重链归类为γ、μ、α、δ或ε，它们进而定义了免疫球蛋白类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

已知通常的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对具有一个“轻链”(约25kD)和一个“重链”(约50-70kD)。每个链的N末端定义了主要负责抗原识别的约100～110或更多个氨基酸的可变区。术语“可变轻链(VL)”和“可变重链(VH)”分别是指这些轻链和重链。

抗体以完整免疫球蛋白存在，或以通过用各种肽酶消化而产生的表征清楚的多个片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键之下对抗体进行消化，以产生F(ab′)2，其是Fab的二聚体，Fab自身为通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab′)2可以在温和条件下还原，以断裂铰链区中的二硫键，由此将(Fab′)2二聚体转化成Fab′单体。Fab′单体基本上是具有一部分铰链区的Fab(对于其它抗体片段的更详细描述，请参见FUNDAMENTALIMMUNOLOGY,W.E.Paul等，Raven Press,N.Y.(1993))。虽然根据对完整抗体的消化定义了各种抗体片段，本领域技术人员会意识到，此类Fab′片段可以通过化学或通过利用重组DNA方法重新合成。

因此，如本文所用，术语“抗体“也包括通过对全抗体进行修改而产生的抗体片段或者利用重组DNA方法重新合成的抗体片段。优选抗体包括单链抗体(作为单多肽链存在的抗体)，更优选单链Fv抗体(sFv或scFv)，其中可变重链和可变轻链结合在一起(直接或通过肽连接物)，从而形成连续多肽。单链Fv抗体是共价连接的VH-VL异二聚体，其可以由包含VH-编码序列和VL-编码序列(这两种编码序列直接连接或通过肽编码连接物连接)的核酸表达。Huston等，(1988)PROC.NAT.ACAD.SCI.USA,85:5879-5883。虽然VH和VL作为单链多肽而相互连接，VH和VL结构域非共价地联接。本领域技术人员已知scFv抗体和许多其它结构，它们将来自抗体V区的天然聚集但通过化学手段分离的轻链和重链多肽，转化成折叠为与抗原结合位点的结构基本上类似的三维结构的分子(例如参见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778)。

(i)测试样品

如本文所用，术语“测试样品”大体上是指针对靶分析物而测试或怀疑含有靶分析物的生物材料，所述靶分析物即目的分析物，例如PIVKA-II。生物材料可以源自任何生物来源，但优选是可能含有靶分析物的生物流体。生物材料的实例包括但不限于粪便、全血、血清、血浆、红细胞、血小板、支气管灌洗液、骨髓穿刺液、胸腔积液、细胞间液、唾液、晶状体液、脑脊髓液、汗、尿、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹膜液、阴道液、月经、羊水、精液以及肿瘤组织或任何其它身体组分或者能够含有目的分析物的任何组织培养上清液。用于本文所述方法的示例性测试样品源自全血、血清或血浆。测试样品可以通过常规方法获得，所述例行方法例如但不限于静脉穿刺、组织活检，包括针刺活检、拭子、擦拭物和流体收集。测试样品获自动物，优选哺乳动物，更优选人类。

测试样品可以获自生物来源后直接使用，或在进行预处理以改变样品特性后使用。例如，所述预处理可以包括从血液制备血浆和稀释黏性流体等。预处理的方法可以包括离心、过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、使干扰成分失活、添加试剂、裂解等。如果对于测试样品使用此类预处理方法，所述预处理方法使得保留在测试样品中的靶分析物的浓度与未处理测试样品(即，未进行任何此类预处理方法的测试样品)中的浓度成比例。

B.针对PIVKA-II的免疫检验

i.免疫检验

PIVKA-II通常作为患者肝细胞癌(也称为肝细胞瘤，或HCC)临床诊断的一部分而进行测定。通常PIVKA-II从血清或血浆样品中测定，并且进行免疫检验，其可以例如在其上吸附有PIVKA-II特异性单克隆或多克隆抗体的固相上进行，所述固相例如是磁珠、玻璃珠、塑料板和胶乳等。然后使经包被的固相与血清或血浆接触，引起第一反应，所述第一反应形成样品中的任何PIVKA-II抗原与抗-PIVKA-II抗体的复合物。在洗涤反应混合物以分离结合的和游离的(B/F)抗原后，通过添加标记有可检测标记物的人凝血酶原特异性多克隆或单克隆抗体而进行第二反应，所述可检测标记物例如但不限于酶、荧光材料或放射性同位素。在第二次洗涤以进行B/F分离后，对结合至通过抗原-抗体反应而形成的免疫复合物的可检测标记物的吸光度或发光进行测定，从而确定血清或血浆中PIVKA-II的量。

非特异性相互作用，特别是凝血酶原特异性抗体与可存在于样品中的除PIVKA-II之外的抗原的非特异性相互作用，可以干扰和减少上述检验的灵敏性。非特异性相互作用可能因抗体中的杂质、凝血酶原与靶抗原(PIVKA-II)的相似性，或因其它抗原至固相(磁珠和玻璃珠等)的物理吸附而引起，其可能导致假阳性检测，从而使测定不精确。

如本文所述，针对PIVKA-II的免疫检验的灵敏性和特异性可以通过包在免疫检验试剂中含某些添加剂而得到改善。因此本申请公开内容提供用于改善针对PIVKA-II的免疫检验的灵敏性的方法。在所述方法中，所述添加剂包括选自脱脂乳、皂苷、CaCl₂、MgCl₂和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂中的至少一种。将一种或多种添加剂添加至免疫检验反应，在所述免疫检验反应中，可能含有PIVKA-II的测试样品与能够特异性结合PIVKA-II的抗凝血酶原抗体接触。为获得对灵敏性的最大改善，在检验中使用至少两种或至少三种所述添加剂。所述添加剂可以分开添加至反应，或可以在单一组合物(例如检验稀释液)中提供，特别例如在含有经标记的抗凝血酶原抗体(例如在夹心检验形式中用作检测试剂的单克隆抗体)的缀合物稀释液中提供。因此，在本文所述的PIVKA-II免疫检验方法中，无需对样品采取实质稀释，或无需使用大量的检验缓冲液，即可减少或消除可能存在于测试样品中的抑制性物质的影响。同时，改善的PIVKA-II免疫检验简单且方便地提供了对样品中的PIVKA-II的高度灵敏可靠的测定。在全自动或半自动系统上进行免疫检验和在短时间内测试大量样品时，这是特别有利的。

虽然本文所述方法涉及PIVKA-II免疫检验、试剂和试剂盒，预期所述方法可以更普遍地应用于针对其它靶分析物的免疫检验，并且当使测试样品与针对目的抗原的抗体反应时包含至少一种本文所述的添加剂，可以改善测定测试样品中的其它靶分析物的灵敏性。

本申请公开内容的方法可应用于各种免疫检验形式的任一种。可以对这些形式进行简单修改从而在其中分析物抗原(例如PIVKA-II)与抗凝血酶原抗体反应的特异性结合反应中包括本文所述的一种或多种添加剂。对于免疫检验的综述，参见METHODS IN CELLBIOLOGY第37卷:ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY,Asai编.Academic Press,Inc.New York(1993)；和BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7TH EDITION,Stites&Terr编.(1991)，通过参考并入它们的全部内容。本文所述方法可应用于任何免疫检验形式，条件是其利用特异性抗原-抗体反应，该反应的灵敏性可能受非特异性相互作用的不利影响。因此，可以将其应用至任何例行使用的免疫检验形式，包括但不限于竞争性免疫检验形式和非竞争性免疫检验形式，例如夹心形式。在非竞争性免疫检验形式中，可以根据与抗体结合的分析物的量与存在于测试样品中的分析物的浓度的已知正相关性测定分析物的量。

免疫检验可以使用捕获剂，其是与靶分析物/抗原(例如与PIVKA-II)结合的结合伴侣。用于本申请公开内容的免疫检验方法的捕获剂包括与靶分析物(例如PIVKA-II)结合的捕获剂，包括对靶分析物具有特异性的抗体。可以将捕获剂附着到固相。当使用固相时，固相固定的捕获剂与靶分析物的结合形成固相固定的复合物。还可以使用经标记的检测剂，其是特异性结合伴侣，例如能够特异性结合诸如PIVKA-II等靶分析物的抗体，其直接或间接标记有可检测标记物，所述可检测标记物例如但不限于酶、荧光材料或放射性同位素。检测剂中的特异性结合伴侣可以是例如抗凝血酶原抗体，其可以例如是抗凝血酶原单克隆抗体。在使检测试剂与固相固定的复合物反应时，形成“夹心结构”，其中靶分析物结合在两种抗体试剂之间。必要时，通常通过洗涤将结合的实体与游离的经标记的抗体分离，通过检查包含与反应性抗体结合的抗原的复合物，检测/定量来自结合标记物的信号。在夹心免疫检验的示例性形式中，检测分析物包括检测来自固相固定的复合物的信号。

图1显示用于测定PIVKA-II的示例性免疫检验形式，其中通过两步化学发光夹心形式测定PIVKA-II。例如，使含有诸如PIVKA-II等靶分析物的测试样品(“试样”)接触一抗，并且一抗捕获所述靶分析物。如图1所述，一抗可以例如是抗-PIVKA-II单克隆抗体，例如美国专利申请系列号12/401,361(公开号US2010/0233175)中所述的3C10。如图1所示，将一抗可选地包被在诸如微粒等固相上。洗涤以除去游离的未结合抗原后，通过靶分析物(例如诸如PIVKA-II等抗原)与一抗的结合而形成第一复合物。然后使所述第一复合物与能够特异性结合PIVKA-II的经标记的二抗接触。如图1所示，通过添加人凝血酶原特异性抗体(优选本文其它地方所述的标记有可检测标记物的单克隆抗体)进行第二反应。如图1所示，例如，所述抗凝血酶原抗体可以是抗凝血酶原单克隆抗体MCA 1-8IgG(获自Atto Mol Inc.,5FNishiikesankei Bldg.3-23-7Nishiikebukuro,Toshimaku,Tokyo,Japan)，或MCA 1-8F(ab’)2，所述标记物可以是吖啶化合物。使经标记的二抗与第一复合物发生结合充分时间后，所获得的第二复合物由一抗、抗原(靶分析物PIVKA-II)和二抗组成，其可选地结合至固相。第二次洗涤以除去未结合抗原后，对由可检测标记物产生的诸如吸光度或发光等信号进行测定，其中由经标记的二抗产生的信号与靶分析物的浓度成比例，所述靶分析物的浓度通过免疫检测复合物的形成速率(k1)与免疫检测复合物的离解速率(k2)确定。

例如包括PIVKA-II的分析物，也能够以竞争性免疫检验进行测定，其中所述信号与存在于测试样品中的分析物的浓度负相关。在示例性竞争形式中，使测试样品与抗体(其可以固定至或可以不固定至固相)接触，并且还与竞争性经标记的抗原接触。经标记的抗原可以是间接或直接标记的。该步骤在足以使经标记的抗原和分析物抗原与抗体特异性结合的条件下进行。经标记的抗原和分析物抗原相互竞争与抗体的结合。因此，测试样品中分析物抗原(例如PIVKA-II)的水平越高，经标记的抗原与抗体的结合越低。可以使测试样品与经标记的抗原和所述抗体同时接触，或以任何顺序依次接触。这种类型的竞争免疫检验可以使用固相固定的抗体方便地进行。在该情况下，存在于测试样品中的分析物抗原与抗体的结合形成固相固定的复合物，因此检测需要检测来自固相固定的复合物的信号。必要时，通常通过洗涤将结合的实体与游离的经标记的抗体分离，检测来自任何结合标记物(替换分析物抗原)的信号。

为了改善本文所述PIVKA-II免疫检验的灵敏性，通过使怀疑含有PIVKA-II的测试样品与能够特异性结合PIVKA-II的抗体在本文所述的一种或多种添加剂的存在下，在足以使抗体与存在于测试样品中的任何PIVKA-II结合的条件下接触，对PIVKA-II免疫检验进行改进。通过检测包含与反应性抗体结合的PIVKA-II抗原的复合物而检测/定量PIVKA-II。

将所选择的下述添加剂添加至免疫检验稀释液可以减少背景非特异性结合，并增强抗原-抗体相互作用。如本文所述，可以使用添加剂来改善PIVKA-II检验的灵敏性。在本文所述的免疫检验中可以单独或组合使用的添加剂包括：脱脂乳、皂苷、CaCl₂、MgCl₂和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂。可以使用任何磺基甜菜碱型洗涤剂，包括但不限于以3-14、3-16、3-18、ASB-14和ASB-16的名称出售的那些磺基甜菜碱洗涤剂，优选3-14、3-16和3-18。在示例性方法中，使用3-16。为了便于参考和与文献中的常例保持一致，本文使用产品名称来指代这些磺基甜菜碱洗涤剂，其相应的化学名称如下：

3-8 3-(N,N-二甲基辛基氨基)丙烷-磺酸盐

3-10正癸基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐

3-12正十二烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐

3-14正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐

3-16正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐

3-18正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐(也由Affymetrix Inc.,Santa Clara,CA作为3-18出售)

ASB-14“酰氨基磺基甜菜碱-14”3-[N,N-二甲基(3-肉豆蔻酰基氨基丙基)氨基]丙烷磺酸盐

ASB-16“酰氨基磺基甜菜碱-16”

磺基甜菜碱型两性离子洗涤剂可以从多个商业来源获得，包括EMD BiosciencesGroup of Merck Chemicals以名称出售的牌合成两性离子品牌洗涤剂。型洗涤剂也可从多个商业来源获得，包括例如Sigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO)，和来自Affymetrix,Inc.(Santa Clara,CA)，名称为)。ASB洗涤剂还例如描述于M.Chevallet等，ELECTROPHORESIS 19:1901(1998)。

“脱脂乳”是指已经从其除去奶油从而使乳含有小于1％的乳脂的任何奶。皂苷可以是通过受控制备工艺制备的任何商业上获得的植物来源的皂苷，例如由皂荚树(皂树，Quillaja saponaria)制造的皂苷，或其它来源，并且例如可获自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO)和Mallinckrodt Baker(Phillipsburg,NJ)。皂苷通常作为结晶粉末提供。当包含作为添加剂时，每种添加剂的量在以下表1中给出，其中任何固体(例如粉末)添加剂的量以％w/v给出，液体添加剂的量包含％w/v或％v/v：

表1:稀释液添加剂

ⅱ.抗体

用于本文所述免疫检验方法的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体通过将免疫原注射(例如皮下注射或肌肉内注射)入合适的非人哺乳动物(例如小鼠或兔)中而产生。通常，免疫原应该诱导高滴度的针对靶抗原具有相对高亲和性的抗体的产生。

可以将所述方法应用至利用试剂的免疫检验，所述试剂包含多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、亲和性成熟的抗体或所述抗体的片段(例如Fab、Fab′或Fab′2片段)，或者多克隆抗体、单克隆抗体和抗体片段的组合，其中借助于基因重组仅除去活性位点，只要所述抗体提供与诸如PIVKA-II等目的分析物的特异性反应性即可。本领域技术人员容易意识到，可以通过许多商业服务(例如Berkeley Antibody Laboratories,BethylLaboratories,Anawa,Eurogenetec,等等)中的任一种制备抗体。所用抗体优选是能够识别PIVKA-II的抗体，其可以包括抗凝血酶原抗体。

对于许多应用，优选单克隆抗体(mAb)。用于产生分泌mAb的杂交瘤的普通方法是公知的(Kohler和Milstein(1975)Nature,256:495)。简言之，如Kohler和Milstein所述，该技术包括从具有黑素瘤、畸胎癌或子宫颈癌、胶质瘤或肺癌的5个单独癌患者的区域性引流淋巴结(其中样品获自手术试样)分离淋巴细胞，收集细胞，将细胞与SHFP-1融合。针对与癌细胞系结合的抗体的产生筛选杂交瘤。mAb中特异性的构象可以使用例行筛选技术(例如酶联免疫吸附检验，或"ELISA")确定目的mAb的基本反应模式实现。

虽然单克隆抗体对于分析物/抗原具有高度特异性，多克隆抗体可以优选用作各捕获抗体，从而固定尽可能多的分析物/抗原。然后固有对分析物/抗原的较高结合特异性的单克隆抗体可以优选用作各检测抗体。在任何情况下，当使用捕获和检测抗体时，每种抗体识别在靶分析物上的非重叠表位，并且优选能够同时与靶分析物上的不同表位结合，每种抗体不干扰其它抗体的结合。

多克隆抗体通过将免疫原注射(例如皮下注射或肌肉内注射)入合适的非人哺乳动物(例如小鼠或兔)中而产生。通常，免疫原应该诱导高滴度的针对靶抗原具有相对高亲和性的抗体的产生。如果需要，抗原可以通过本领域公知的缀合技术缀合至载体蛋白。常用的载体包括钥孔戚血蓝素(KLH)、甲状腺球蛋白、胎牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。然后使用缀合物来对动物进行免疫。然后从取自动物的血液样品获得抗体。用于产生多克隆抗体的技术广泛描述于文献中(例如参见Methods of Enzymology,"Production ofAntisera with Small Doses of Immunogen:Multiple Intradermal Injections,"Langone等，eds.(Acad.Press,1981))。可以例如通过与结合有靶抗原的基质结合并从该基质洗脱而对由动物产生的多克隆抗体进一步纯化。本领域技术人员会知道免疫学领域中常用的各种技术，对多克隆抗体以及单克隆抗体进行纯化和浓缩(例如参见Coligan等，(1991)Unit 9,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley Interscience)。

如果需要，内源性抗原(例如目的分析物)可以通过本领域公知的缀合技术缀合至载体蛋白。常用的载体包括钥孔戚血蓝素(KLH)、甲状腺球蛋白、胎牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。然后使用缀合物来对动物进行免疫。

然后从取自动物的血液样品获得抗体。用于产生多克隆抗体的技术广泛描述于文献中(例如参见METHODS OF ENZYMOLOGY,“Production of Antisera with Small Dosesof Immunogen:Multiple Intradermal Injections,”Langone等，eds.(Acad.Press,1981))。可以例如通过与结合有靶抗原的基质结合并从该基质洗脱而对由动物产生的多克隆抗体进一步纯化(例如参见Coligan等，(1991))。

如本文所用，术语“抗体”包含可结合抗原的抗体片段，例如，单链抗体(scFv或其它)，其可以使用噬菌体展示或酵母菌展示技术产生/筛选。在感染细菌的病毒(噬菌体)表面上表达抗体片段的能力使得可以例如从大于10¹⁰种未结合克隆的文库中分离单个结合抗体片段。为了在噬菌体表面上表达抗体片段(噬菌体展示)，将抗体片段基因插入编码噬菌体表面蛋白(例如pIII)的基因中，抗体片段-pIII融合蛋白展示在噬菌体表面上(McCafferty等，(1990)NATURE 348:552-554；Hoogenboom等，(1991)NUCLEIC ACIDSRES.19:4133-4137)。

由于在噬菌体表面上的抗体片段是功能性的，可以通过抗原亲和色谱将带有含可结合抗原的抗体片段的噬菌体与未结合噬菌体分离(McCafferty等，(1990)NATURE 348:552-554)。根据抗体片段的亲和性，对于每轮亲和选择获得20倍～1,000,000倍的富集因子。但是，通过以洗脱噬菌体感染细菌，可以培养更多的噬菌体，并对其进行另一轮选择。以此方式，一轮1000倍的富集在两轮选择中可以变成1,000,000倍(McCafferty等，(1990)NATURE 348:552-554)。因此，即使当富集低时(Marks等，(1991)J.MOL.BIOL.222:581-597)，多轮亲和性选择可以分离稀有的噬菌体。由于对抗原进行噬菌体抗体文库选择引起富集，在低至3～4轮选择后，大多数克隆结合抗原。因此，仅相对少量的克隆(数百)需要就与抗原的结合进行分析。

可以通过在噬菌体上展示非常大的多样性V-基因库(gene repertoires)，无需之前的免疫，即可产生人抗体(Marks等，(1991)J.MOL.BIOL.222:581-597)。在一个实施方式中，通过PCR从未免疫供体分离存在于人外周血淋巴细胞中的天然VH和VL库。可以使用PCR将V-基因谱系在任意处共同剪接，以创建能够被克隆至噬菌体载体中的scFv基因库，从而创建三千万个噬菌体抗体(Id.)的文库。从单个“天然”噬菌体抗体文库，已经分离出针对超过17种不同抗原的结合抗体片段，所述抗原包括半抗原、多糖和蛋白(Marks等，(1991)J.MOL.BIOL.222:581-597；Marks等，(1993).BIO/TECHNOLOGY 10:779-783；Griffiths等，(1993)EMBO J.12:725-734；Clackson等，(1991)NATURE 352:624-628)。已经针对包括人凝血酶原、免疫球蛋白、肿瘤坏死因子和CEA在内的自身蛋白产生抗体(Griffiths等，(1993)EMBO J.12:725-734)。抗体片段对于用于选择的抗原是高度特异的，并且在1nM～100nM范围中具有亲和性(Marks等，(1991)J.MOL.BIOL.222:581-597；Griffiths等，(1993)EMBOJ.12:725-734)。较大的噬菌体抗体文库导致更多对较大比例的抗原具有较高结合亲和性的抗体的分离。

本领域技术人员容易意识到，可以通过许多商业服务(例如Berkeley AntibodyLaboratories,Bethyl Laboratories,Anawa,Eurogenetec,等等)中的任一种制备抗体。

iii.固相

根据本申请公开内容的免疫检验可以使用固相作为用于捕获剂的载体。固相可以是对于结合捕获剂具有足够的表面亲和性的任何合适的材料。有用的固体载体包括：天然聚合物糖和其合成改性、交联或取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联海藻酸、取代和交联的瓜尔胶、纤维素酯(特别是硝酸和羧酸的纤维素酯)、混合纤维素酯和纤维素醚；含氮的天然聚合物，例如蛋白和衍生物，包括交联或改性明胶；天然烃聚合物，例如胶乳和橡胶；合成聚合物，例如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯乙酸酯和其部分水解衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、共聚物和以上缩聚物的三元共聚物，例如聚酯、聚酰胺和其它聚合物，例如聚氨酯或聚环氧化物；无机材料，例如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙、碱金属和碱土金属的硅酸盐、铝和镁；和铝或二氧化硅或水合物，例如粘土、氧化铝、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可以用作具有以上聚合材料的过滤器)；以及以上类别的混合物或共聚物，例如通过在先前存在的天然聚合物上引发合成聚合物的聚合而获得接枝共聚物。所有这些材料可以以合适的形状使用，例如膜、片、管、颗粒或板，或可以将它们包被在、结合至或层压至合适的惰性载体，例如纸、玻璃、塑料膜或织物等。

对于包括单克隆抗体在内的各种试剂，硝酸纤维素具有优良的吸收和吸附品质。尼龙也拥有类似的特性，也是合适的。

用于穿流检验装置的优选的固相材料包括滤纸，例如多孔玻璃纤维材料或其它纤维基质材料。此类材料的厚度不是关键的，是一个选择问题，极大地依赖于测试样品或所检验分析物的性质，例如测试样品的流动性。

作为选择，固相可以组成微粒。用于本申请公开内容的微粒可以由本领域技术人员从任何合适类型的颗粒材料中选择，并且包括由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、胶乳、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚碳酸酯或类似材料构成的颗粒。此外，微粒可以是磁性或顺磁性微粒，从而便于在磁场内操作微粒。

可以将微粒悬浮在可溶性试剂和测试样品的混合物中，或可以由载体材料保留和固定。在后一情况中，在载体材料上或在载体材料中的微粒不能实质上移动至载体材料内的其它位置。作为选择，可以通过沉降或离心将微粒从可溶性试剂和测试样品的混合物中的悬浮液中分离出。当微粒是磁性或顺磁性的时，可以通过磁场将微粒从可溶性试剂和测试样品的混合物中的悬浮液中分离出。

可以采用本发明的方法以用于利用微粒技术的系统中，包括自动系统和半自动系统，其中所述固相包含微粒。此类系统包括在未决美国申请系列号425,651和美国专利号5,089,424(它们分别对应于公开的EPO申请EP 0 425 633和EP 0 424 634)以及美国专利号5,006,309中描述的系统。

固相可以包括一个或多个电极。捕获剂可以直接或间接固定在电极上。在一种实施方式中，例如，捕获剂可以固定至磁性或顺磁性微粒，然后使用磁体将其定位在电极表面附近。在检测基于电化学相互作用时，可使用其中一个或多个电极充当固相的系统。这种类型的示例性系统例如描述于美国专利号6,887,714中。以下对于电化学检测进一步描述基本方法。

捕获剂可以通过吸附固定至固相，其中其通过疏水性力保留。作为选择，通过引起捕获剂共价交联至载体的化学过程激活固相表面。

为了改变或增加固相的本征电荷，可以直接将带电物质包被至固相。根据本发明，可以使用描述于美国申请系列号150,278(对应于EP公开号0326100)和美国申请系列号375,029(EP公开号0406473)的用于固定具有带负电的聚合物的可固定反应复合物的离子捕获步骤，以实现快速的液相免疫化学反应。在这些步骤中，通过带负电的聚阴离子/免疫复合物和之前处理的带正电的基质之间的离子相互作用，将可固定免疫复合物与剩余的反应混合物分离开，并且通过使用各种信号生成系统中的任一种检测，所述信号生成系统例如包括在美国申请系列号921,979(对应于EPO公开号0273,115)中描述的化学发光系统。

如果固相是硅或玻璃，在附着特异性结合伴侣之前通常必须对表面进行激活。激活的硅烷混合物，例如三乙氧基氨基丙基硅烷(获自Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)、三乙氧基乙烯基硅烷(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wis.)和(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)，可用于分别引入反应性基团，例如氨基、乙烯基和巯基。可将此类激活表面用于直接连接捕获剂(在氨基或巯基的情况下)，或可以使激活表面与诸如戊二醛、二(琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、SPPD 9琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶二硫代]丙酸酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基-4-[N马来酰亚胺]环己烷-1-羧酸酯)、SIAB(琥珀酰亚胺基[4碘乙酰基]氨基苯甲酸酯)和SMPB(琥珀酰亚胺基4-[1马来酰亚胺基]丁酸酯)等连接物(linker)进一步反应，从而从表面分离捕获剂。可以将乙烯基氧化，以提供用于共价附着的手段。还可将乙烯基用作用于诸如聚丙烯酸等各种聚合物的聚合的锚固(anchor)，其可以提供用于特异性捕获剂的多个附着点。氨基可以与各种分子量的氧化葡聚糖反应，以提供不同尺寸和容量的亲水性连接物。氧化氧化葡聚糖的实例包括Dextran T-40(分子量40,000道尔顿)、Dextran T-110(分子量110,000道尔顿)、Dextran T-500(分子量500,000道尔顿)、Dextran T-2M(分子量2,000,000道尔顿)(它们都获自Pharmacia,Piscataway,N.J.)或Ficoll(分子量70,000道尔顿；获自Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)。另外，聚合电解质相互作用可用于使用1988年1月29日提交的美国申请系列号150,278和1989年7月7日提交的美国申请系列号375,029中描述的技术和化学，将特异性捕获剂固定在固相上，本文通过参考并入这两篇专利中的任一篇。

影响固相选择的其它考虑包括使经标记的实体的非特异性结合最小化的能力和与使用的标记系统的相容性。例如，与荧光标记物一起使用的固相应该具有足够低的背景应该，以允许信号检测。在特异性捕获剂的附着后，可以用诸如血清、蛋白或其它阻断剂等材料对固相载体的表面进一步处理，以使非特异性结合最小化。

iv.可检测标记物

如以上讨论，根据本申请公开内容的许多免疫检验使用经标记的检测剂，例如经标记的抗体或经标记的抗原。

适于在本发明的检测剂中使用的可检测标记物包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学手段可检测的任何组成。本发明中有用的标记物包括磁珠(例如Dynabeads^TM)、荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、罗丹明和绿色荧光蛋白等，参见例如Molecular Probes,Eugene,Oreg.,USA)；化学发光化合物，例如吖啶(例如吖啶-9-羧酰胺)、啡啶(phenanthridinium)、二氧杂环丁烷(dioxetanes)和鲁米诺等；放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C或32P)；催化剂，例如酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和ELISA中常用的其它酶)；和比色标记物，例如胶体金(例如粒径为40nm-80nm的金颗粒高效地散射绿光)或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠子。教导此类标记物的使用的专利包括美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。

在接触测试样品之前、期间或之后，可以使标记物附着至检测剂。所谓的“直接标记物”是直接附着至检测剂或在用于检验之前引入检测剂的可检测标记物。可以通过本领域公知的许多手段中的任一种将直接标记物附着至检测剂或引入检测剂中。

与之相反，所谓的“间接标记物”通常在检验期间的某一点与检测剂结合。通常，间接标记物与附着至检测剂或在使用之前引入检测剂中的部分结合。因此，例如，在用于检验之前可以将用作检测剂(“检测抗体”)的抗体生物素化。在检验期间，缀合有荧光团的亲和素可以结合带有生物素的检测剂，以提供容易检测的标记物。在间接标记物的另一实例中，能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的多肽，例如多肽A或多肽G，也能够用作检测抗体用标记物。这些多肽是链球菌细胞壁的正常组分。它们对来自各种物种的免疫球蛋白恒定区展示了强烈的非免疫原性反应性(参见例如Kronval,等，(1973)J.IMMUNOL.,111:1401-1406,和Akerstrom(1985)J.IMMUNOL.,135:2589-2542)。因此可以对此类多肽进行标记，并将其添加至检验混合物，其中它们会与检测抗体结合，以及与物种特异性抗体结合，将二者标记并提供由存在于测试样品中的分析物和自身抗体产生的复合信号。

用于本申请公开内容的一些标记物可能需要使用指示剂以产生可检测信号。在ELISA中，例如，酶标记物(例如β-半乳糖苷酶)会要求添加底物(例如X-gal)以产生可检测信号。

例如本发明可应用于共有的商业Abbott Point of Care电化学免疫检验系统，其执行针对数种不同抗原的夹心免疫检验。免疫传感器和其在单次使用的测试装置中运行方式描述于共有的公开号US20030170881、US20040018577、US20050054078和US20060160164，本文通过参考并入每一篇。关于制造电化学和其它类型的免疫传感器的其它背景可发现于共有的美国专利号5,063,081，通过参考也将其引入。

本申请公开内容还可以应用至多重免疫检验形式，以同时检验一个测试样品中的多个分析物。例如，固相可以包括多种不同的捕获剂，包括捕获内源性抗原或目的分析物(例如PIVKA-II)的捕获剂。因此，例如固相上可以固定有多种抗体，其中每种抗体都旨在测试在测试样品中不同分析物(例如PIVKA-II和其它内源性分析物)的存在。在示例性实施方式中，固相可以由在表面上的多个不同区域组成，其中每个区具有固定在其中的特定抗体。

多路形式可以，但不必，使用多种标记物，其中每种标记物用于检测特定抗原。例如，无需使用多种标记物即可检测多种不同分析物，其中将多种捕获剂，例如具有不同特异性的抗体，在不同的已知位置处固定至固相。由于在各个位置的捕获剂的特异性是已知的，在特定位置处信号的检测可以与在该位置处结合的抗原的存在相关。这种形式的实例包括微流体装置和毛细管阵列(沿着通道或毛细管在不同位置处分别含有不同的捕获剂)，以及微阵列，其通常在固相载体表面上含有沿着斑点(spot)基质(“靶元件”)排列的不同捕获剂。每种不同的捕获剂可以固定至不同的电极，其可以例如形成在固相载体的表面上，在微流体装置的通道中，或在毛细管中。

可选的是，本文所述的免疫检验可用于商业平台免疫检验的试剂盒中，包括例如用于定量检测靶抗原的化学发光微粒免疫检验(CMIA)，例如在Abbott's c-系统或i-系统、和/或EIA(Bead)平台上的PIVKA-II血液筛选检验，以及其它商业和/或体外诊断检验。

C.测试试剂盒

本申请公开内容还提供用于针对诸如PIVKA-II和其它内源性抗原等分析物的检验测试样品的测试试剂盒。本申请公开内容的测试试剂盒包括用于实施根据本申请公开内容的一种或多种免疫检验的一种或多种试剂。试剂盒通常包括具有容纳所述试剂的一个或多个容器的包装作为一种或多种单独的组分，或可选的是，作为其中所述试剂可相容的混合物。所述试剂盒还包括其它材料，从用户立场来看它们可能是需要的，例如缓冲剂、稀释液、标准品和/或用于样品处理、洗涤或执行任何其它检验步骤的任何其它材料。

例如，根据本申请公开内容，用于执行测试样品中PIVKA-II的特异性结合检验的试剂盒，可以包括容纳改良检验稀释液的容器，所述改良检验稀释液含有以上本文所述的稀释液添加剂中的任何一种或多种，即脱脂乳、皂苷、CaCl₂、MgCl₂和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂，包括但不限于3-14、3-16、3-18、ASB-14和ASB-16，优选3-14、3-16和3-18。作为选择，试剂盒可以在单独容器中包含一种或多种添加剂，每种添加剂可以与检验稀释液制备组合，以为用于执行免疫检验的制备中制备本文所述的改良检验稀释液。如果需要，可以在测试试剂盒中以多种浓度包含任何所述添加剂。所述添加剂可以以任何便于制备检验稀释液的量包含在试剂盒中，所述检验稀释液以以上本文所述的量含有各添加剂。

根据本申请公开内容的试剂盒可以包括一种或多种一抗或捕获抗体(每种抗体与靶分析物(例如PIVKA-II)上的至少一个表位结合)和一种或多种二抗或检测抗体(每种抗体与靶分析物(例如PIVKA-II)上不同于与任何捕获抗体结合的表位的至少一个表位结合)，以及用于检测或定量靶分析物的另外的说明书。

根据本申请公开内容的试剂盒可以包括固相和固定至固相的捕获剂，其中所述捕获剂是对在测试样品中评估的分析物具有特异性的抗体。固相可以包含诸如磁性或顺磁性颗粒等材料，包括微粒、珠、试管、微量滴定板、比色皿、膜、支架分子、石英晶体、薄膜、滤纸、盘或芯片。示例性试剂盒含有包被有能够特异性结合PIVKA-II的一抗的磁性或顺磁性微粒，或电极。为多路检验而设计的测试试剂盒方便地含有一种或多种固相，包括对多种不同的目的分析物(例如PIVKA-II和其它内源性抗原)具有特异性的多种抗体。因此，例如，为多路电化学免疫检验而设计的测试试剂盒可以含有包括多个电极在内的固相，每个电极带有不同的抗体。

在将此类试剂盒用于进行夹心免疫检验时，所述试剂盒可以另外地包括经标记的抗体作为检测试剂。例如，试剂盒可以包括至少一种直接标记物，其可以是酶、寡核苷酸、纳米颗粒化学发光团、荧光团、荧光猝灭剂、化学发光猝灭剂或生物素。在示例性实施方式中，直接标记物是吖啶化合物，例如吖啶-9-羧酰胺。例如，试剂盒可以进一步包含经吖啶标记的缀合物，所述缀合物包含附着至能够特异性结合靶分析物的检测二抗的吖啶化合物。根据本申请公开内容的测试试剂盒可以替代地包含或另外还包含至少一种间接标记物。如果所用标记物通常要求指示剂以产生可检测信号，测试试剂盒优选包含一种或多种合适的指示剂。

试剂盒可以含有针对靶分析物的多克隆或非人单克隆抗体，例如包括小鼠单克隆抗体，并且这些可用作捕获抗体和/或检测抗体。例如，用于测定在含有测试样品的血清或血浆中PIVKA-II的量的试剂盒可以包括一抗和二抗，所述一抗包含小鼠单克隆抗-PIVKA-II抗体，例如3C10(参见美国专利申请系列号12/401,361，公开号为US 2010/0233175)，所述二抗包含小鼠单克隆抗凝血酶原抗体，例如MCA 1-8IgG(Atto Mol Inc.,5FNishiikesankei Bldg.3-23-7Nishiikebukuro,Toshimaku,Tokyo,Japan)，或MCA 1-8F(ab’)2。

示例性试剂盒可以含有下述成分，所述成分包括但不限于anti-PIVKA-II一抗，其可以是小鼠单克隆抗体，将其在缓冲液，优选TRIS缓冲液中包被在磁性或顺磁性微粒上，更优选的是所述缓冲液具有蛋白(牛)稳定剂和抗微生物剂作为防腐剂。所述试剂盒还可以含有在缓冲液，优选在MES(2-[N-吗啡啉]乙磺酸)缓冲液(具有蛋白(牛)稳定剂和抗微生物剂作为防腐剂)中的包含小鼠抗凝血酶原单克隆抗体的经吖啶标记的缀合物；和改良检验稀释液含有缓冲液，优选TRIS，含有本文所述的一种或多种稀释液添加剂。优选的是所述检验稀释液还包含抗微生物剂作为防腐剂。对于使用经吖啶标记的缀合物的免疫检验，试剂盒还可以包含含有1.32％(wt/vol)过氧化氢的预激发液；含有0.35N氢氧化钠的激发液；和含有磷酸盐缓冲盐水溶液和抗微生物剂防腐剂的洗涤剂。

D.本申请公开内容方法的适用性

下面以不具有限制性的举例方式给出本发明的实例。

实施例1 用于MCA1-8缀合物稀释液的候选添加剂的比较研究

如下进行自动PIVKA-II免疫检验程序(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL,60035-6050)：对预先制备的诸如抗-PIVKA MAb 3C10等抗-PIVKA-II抗体进行纯化并将其包被在磁性微粒(Abbott Laboratories,IL)上，所述磁性微粒的表面使用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)通过共价键附着有羧基。将经包被的微粒分散在包含牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液中，制备试剂A。将用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)激活的吖啶酯(Abbott Laboratories,IL)标记的来自Hyphen Biomed(法国)的抗凝血酶原抗体(批号#PA150)稀释在含有BSA的缓冲液中，以制备试剂B。制备包含Triton X-100的缓冲液作为试剂C。使用以下步骤利用自动免疫检验系统ARCHITECT i2000(AbbottLaboratories,IL)自动化地进行免疫检验。具体而言，将50uL试剂A和50uL的试剂C与50uL样品混合。使混合物在37℃温育18分钟，以使包被在磁性微粒上的抗体与样品中的反应性物质(PIVKA-II)结合。以磁体吸引磁性微粒，然后除去残留溶液。将磁性微粒用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，以除去非特异性结合在磁性微粒表面上的杂质。然后向微粒添加50uL试剂B，则形成(抗体包被的磁性微粒)—(样品中的PIVKA-II)—(经吖啶标记的抗体)的复合物。通过PBS进行洗涤步骤后，在碱性条件下添加过氧化物，则吖啶酯产生可以通过光电倍增管(PMT)检测的发光信号。

初步筛选后，对上述PIVKA-II检验程序进行修改以测试各种候选添加剂减少获自血清样品的背景相对光单位(RLU)的能力，其中将每种添加剂以各种量添加至抗凝血酶原缀合物稀释液(试剂B)中，以用于第二免疫检验反应。在该研究中，用于试剂A的抗-PIVKA MAb是MAb 3C10，用于缀合物稀释液(试剂B)中的抗凝血酶原抗体是抗凝血酶原单克隆抗体MCA1-8IgG(PI-C163E,IR5.0,300ng/mL)。初步筛选排除了用于减少背景RLU的许多提议物质，包括酪蛋白、鱼明胶、酵母提取物和其它物质，不过筛选表明一些候选物增强RLU。进行进一步评价的候选物质是脱脂乳(除去奶油，因此含有低于1％乳脂的乳)、皂苷和(合成)磺基甜菜碱型两性离子洗涤剂，其包括

3-8(3-(N,N-二甲基辛基氨基)丙烷-磺酸盐)

3-10(正癸基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)

3-12(正十二烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)

3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)

3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)

3-18，Anzergent 3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)

ASB-14("酰氨基磺基甜菜碱-14”：3-[N,N-二甲基(3-肉豆蔻酰基氨基丙基)氨基]丙烷磺酸盐)

ASB-16(“酰氨基磺基甜菜碱-16”)

还评价了Lipidure405、BG Solution 2和C16APS。pH保持在5.5。将候选物质以缀合物稀释液的1.0％、1.25％、1.67％、3.00％或5.00％中的一种或多种量添加，其中固体(例如粉末)添加剂以％w/v添加，液体添加剂以％w/v或％v/v添加。表2总结了所测试添加剂的各种组合，包括3-16作为磺基甜菜碱型两性离子洗涤剂。

表2

表2中，additive为添加剂，conc.为浓度，Skim Milk为脱脂乳、Saponin为皂苷

还对其它磺基甜菜碱型两性离子洗涤剂进行测试。全文将结果报道为C/A比。如图2和3中所示，使用含有皂苷、脱脂乳和3-16的稀释液获得最佳结果。图2是比较在缀合物稀释液不含有添加剂、仅含有皂苷、仅含有脱脂乳或仅含有3-16时获得的结果的柱状图。图3是比较在缀合物稀释液不含有添加剂时，以及在缀合物稀释液含有脱脂乳(1.67％)、皂苷(1.00％)和3-16(1.60％)的组合时获得的结果的柱状图。

还测试了在添加剂组合中各种磺基甜菜碱型两性离子洗涤剂的相对性能。图图4所示，使用3-16获得检验的最佳灵敏性，但是相对于不使用添加剂获得的灵敏性，使用3-14、3-18、ASB-14和ASB-16中任一种也获得灵敏性的良好改善。

实施例2 MCA1-8缀合物稀释液的Ca⁺⁺依赖性

获自上述实施例2的结果表明，也许脱脂乳和皂苷的某种或某些组分对于改善用于检测PIVKA-II的MCA1-8缀合物稀释液的灵敏性是重要的。

钙离子或镁离子可能在改善灵敏性中起作用的可能性通过进行如上所述的PIVKA-II检验程序来研究，所述程序的修改之处在于向缀合物稀释液添加一定量的Ca⁺⁺(以CaCl₂的形式)或Mg⁺⁺(以MgCl₂的形式)，并且在pH 5.5和pH6.0进行第二检验反应。测试缓冲液含有以下之一：无添加剂，或作为添加剂的30mM Ca⁺⁺或30mM Mg⁺⁺。结果总结于以下表3中，图5中所示的柱状图表明在pH 5.5和pH 6.0相对于使用不含添加剂的缀合物稀释液获得的灵敏性，含有30mM Ca⁺⁺或30mM Mg⁺⁺的缀合物稀释液展示了改善的灵敏性。

表3:

表3中，Sensitivity＝灵敏性，No Ca＝无Ca，previous Cal C＝此前的Cal C

还通过如上所述进行改良PIVKA-II检验程序调查脱脂乳的各种已知成分的贡献，所述程序用如上所述的稀释液添加剂的示例性组合中数种各种成分中的任一种代替脱脂乳。脱脂乳(1.67％)、皂苷(1.00％)和3-16(1.60％)。如图6所示，作为脱脂乳的替代物，测试酪蛋白、乳清和乳清组分(乳糖、乳清蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋白和CaCl₂)，使用1.67％酪蛋白(来自所指出的两个不同来源(Wako和Sigma-AldrichCo.))、1.67％乳清、1％乳糖、2％α-乳清蛋白、5％β-乳球蛋白、0.2％乳铁蛋白或30mMCaCl₂。如图6中左图所示，当用仅乳清，而不是酪蛋白替代脱脂乳作为稀释液中的添加剂时，灵敏性与不含添加剂的缀合物稀释液相比得到改善。如图6中右图所示，在乳清的组分中，当缀合物稀释液含有30mM CaCl₂时，获得最佳灵敏性。

如以下表4所总结并如图7所示的，使用含有150mM以下物质之一的缀合物稀释液，基本上如上所述还对除CaCl₂或MgCl₂之外的金属氯化物盐可能改善缀合物稀释液灵敏性的可能性进行了测试：NaCl、LiCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂、ZnCl₂或BaCl₂。结果显示，使用含有150mM的CaCl₂或MgCl₂的稀释液获得最佳灵敏性。

表4:

本领域技术人员容易意识到，能够对本申请公开内容中所述的方法和试剂盒进行良好改进，以实现目标并获得所述结果和优点，以及本文固有的优点。本文所述的方法、步骤、处理、分子、特异性化合物和试剂盒仅是代表性和示例性的，并不旨在限制本发明的范围。对本领域技术人员显而易见的是，可以对本文公开的本申请公开内容进行改变取代和改进，而无需背离本发明的范围和精神。

说明书中提到的所有专利和出版物指明本申请公开内容所属领域的技术人员的水平。通过引用将所有专利和出版物并入本文，其程度如同每一篇出版物被特别或单独地通过引用并入一样。

Claims

1.添加剂MgCl₂、具有牛蛋白稳定剂的2-[N-吗啡啉]乙磺酸缓冲液和抗微生物剂在制造用于测定测试样品中的PIVKA-II的试剂盒中的应用，所述试剂盒还包含抗凝血酶原抗体，其中有效量的所述添加剂和所述抗凝血酶原抗体在稀释液中提供。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述抗凝血酶原抗体包含单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的应用，其中，所述抗凝血酶原抗体包含MCA1-8。

4.如权利要求1所述的应用，其中，所述测试样品与抗凝血酶原抗体在所述添加剂的存在下在固相上进行反应。

5.如权利要求4所述的应用，其中，所述固相包含磁性微粒。

6.如权利要求5所述的应用，其中，所述磁性微粒包含顺磁性微粒。

7.如权利要求1所述的应用，其中，对测试样品中的PIVKA-II的测定包括竞争性免疫检验。

8.如权利要求1所述的应用，其中，对测试样品中的PIVKA-II的测定在自动测定装置中进行。

9.如权利要求1所述的应用，其中，对测试样品中的PIVKA-II的测定包括夹心免疫检验。

10.添加剂MgCl₂、具有牛蛋白稳定剂的2-[N-吗啡啉]乙磺酸缓冲液和抗微生物剂在制造用于改善针对PIVKA-II的特异性结合检验的灵敏性的试剂盒中的应用，其中，所述特异性结合检验包括第一反应和第二反应，

(i)所述第一反应产生第一复合物，所述第一复合物包含与能够特异性结合PIVKA-II的一抗结合的PIVKA-II，

(ii)所述第二反应包括使所述第一复合物与二抗接触，所述二抗能够特异性结合PIVKA-II且与可检测标记物缀合，

其中所述二抗和有效量的所述添加剂在稀释液中提供。

11.如权利要求10所述的应用，其中，所述二抗包含抗凝血酶原单克隆抗体。

12.如权利要求11所述的应用，其中，所述二抗包含MCA1-8。

13.如权利要求10所述的应用，其中，所述特异性结合检验在固相上进行。

14.如权利要求13所述的应用，其中，所述固相包含磁性微粒。

15.如权利要求14所述的应用，其中，所述磁性微粒包含顺磁性微粒。

16.如权利要求10所述的应用，其中，所述特异性结合检验包括竞争性免疫检验。

17.如权利要求10所述的应用，其中，所述特异性结合检验在自动测定装置中进行。

18.如权利要求10所述的应用，其中，所述特异性结合检验包括夹心检验。

19.一种用于执行针对PIVKA-II的免疫检验的试剂盒，所述试剂盒包含

(i)能够特异性结合PIVKA-II的特异性结合试剂作为一抗，

(ii)抗凝血酶原抗体作为二抗，和

(iii)添加剂MgCl₂，和具有牛蛋白稳定剂的2-[N-吗啡啉]乙磺酸缓冲液和抗微生物剂，

其中有效量的所述添加剂和所述抗凝血酶原抗体在稀释液中提供。

20.如权利要求19所述的试剂盒，所述试剂盒还包含固相。

21.如权利要求20所述的试剂盒，其中，所述固相包含微粒。

22.如权利要求21所述的试剂盒，其中，所述微粒是磁性微粒。

23.如权利要求22所述的应用，其中，所述磁性微粒包含顺磁性微粒。