JP3995316B2 - ホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法 - Google Patents
ホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は血中に存在するホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来技術の問題点】
各種の癌において細胞核内に局在する癌関連物質が細胞の癌化に伴い過剰に発現することが知られている。一方、腫瘍免疫機構により癌細胞が破壊される結果、担癌生体の血中に過剰に発現した癌関連物質が遊離し、体液性抗体の産生を誘発することが知られている。ヒストンやｐ５３などに対する自己抗体はそのような例である（文献１〜３）。これらの自己抗体も癌の診断への応用が試みられてきた。その理由は抗原が微量しか存在しない場合でも、その抗原に対して産生される抗体量は生体内で増幅されているので測定が容易であり、癌の早期発見につながると期待されるためである。しかしながら、これらの自己抗体の測定は、実際には陽性率が低く、癌と非癌との判別が困難なものが多かった。
【０００３】
ヒストンやｐ５３同様に細胞核内に局在し、癌において過剰発現している蛋白質としては各種ステロイドホルモンレセプターが知られてるが、ステロイドホルモンのレセプターであるアンドロゲンレセプター（ＡＲ）やエストロゲンレセプター（ＥＲ）に対する自己抗体は、健常人の血中にもごく微量ながら存在する。たとえばＡＲは血清１μｌあたり数ｆｍｏｌのオーダーで存在し、女性よりも男性の方が濃度が高いことが知られている（文献４，５）。しかしながら、これらのホルモンレセプターに対する自己抗体と疾患との関連を明らかにした例は知られていない。
【０００４】
一方、乳癌、前立腺癌等のホルモン標的臓器由来の癌の多くはホルモンレセプターを発現していて、癌の発生あるいは増殖・進展過程において種々のホルモンが影響を与えている。これらの癌はホルモン依存性癌と呼ばれ、ホルモン療法が有効であることが知られている。たとえば、乳癌の一部にはＥＲやプロゲステロンレセプター（ＰｇＲ）を発現しているものがあり、そのような例では抗ホルモン剤の投与や、卵巣摘出等のホルモン療法が有効である。したがって乳癌ではホルモンレセプターの発現の有無が診断上重要であり、手術や生検で摘出した組織を検体としてホルモンレセプターの測定が行われている。そのためにこれらのホルモンレセプター測定用に各種の抗体が開発されてきた（文献６，７）。しかしながら、ホルモンレセプターを発現しているホルモン依存性癌患者の血液中に遊離のホルモンレセプターが存在しているか否か、また、それらのホルモンレセプターに対する自己抗体が存在するか否かについて言及した例はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血中のホルモンレセプターに対する自己抗体の測定方法を確立し、より簡易で早期発見が可能な癌の診断方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者らはホルモン依存性癌患者の血中にホルモンレセプターに対する自己抗体が多量に出現することを見いだし、以下に示すホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法を発明した。
【０００６】
（１）血中に存在するホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法。
（２）ホルモンレセプターがエストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、またはアンドロゲンレセプターであることを特徴とする（１）の検出方法。
（３）癌がホルモン依存性癌であることを特徴とする（２）の検出方法。
（４）ホルモン依存性癌が乳癌、前立腺癌、あるいは卵巣癌であることを特徴とする（３）の検出方法。
（５）自己抗体の測定方法が免疫学的方法であることを特徴とする（１）から（４）の検出方法。
（６）免疫学的測定方法が競合法、またはサンドイッチ法であることを特徴とする（５）の検出方法。
（７）化学合成、または遺伝子組み換えによって得られたホルモンレセプターの部分ペプタイドを用いることを特徴とする（５）から（６）の検出方法。
（８）ホルモンレセプターの部分ペプタイドを不溶性担体に固相化して用いることを特徴とする（７）の検出方法。
【０００７】
本発明は、血中のホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法であり、測定対象となるのは、具体的にはエストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、またはアンドロゲンレセプターに対する自己抗体である。これらのホルモンレセプターに対する自己抗体は健常人の血中にも微量ながら存在するが、前記のホルモンレセプターを発現している一部の癌の患者血中においては顕著に増大する。
【０００８】
これらのホルモンレセプターを発現している癌はホルモン依存性癌と呼ばれ、ホルモンが癌の発生あるいは増殖・進展過程に影響している。ホルモン依存性癌としては乳癌、前立腺癌、あるいは卵巣癌の一部がこれに属する。
【０００９】
血中の自己抗体の測定方法としては、免疫学的測定法が適している。すなわち、ヒトのホルモンレセプターを動物に免疫して得た抗体を用いて、この抗体と検体中の自己抗体とをホルモンレセプターに対して競合させる競合法や、抗体が２分子の抗原と結合できることを利用して、ホルモンレセプターに結合した自己抗体に対してさらに第２のホルモンレセプターや、抗ヒトＩｇＧを結合させて、形成される免疫複合体を検出するサンドイッチ法が代表的であり、本発明においてはどちらの方法も適用可能である。
【００１０】
免疫学的測定において使用するホルモンレセプターは、ヒトの組織から抽出精製したものでも、遺伝子組み換えや化学合成等により人工的に製造したものでもかまわない。しかし、以下に述べる理由により遺伝子組み換えや化学合成によって得られるホルモンレセプターの部分ペプタイドを用いるのが好ましい。
【００１１】
第一にホルモンレセプターをヒトの組織から抽出し精製するのは、材料の入手が困難な上に作業も手間がかかる。また、一定の品質を持つものが得にくい。第二に癌関連物質に対する自己抗体の中にはモノクローナルな抗体も見いだされることから（文献８，９）、抗原である癌関連物質は、分子全体ではなく特定の領域のみが多量に発現している可能性が高いためである。また、遺伝子組み換えや化学合成によって得られる合成ペプタイドは、必要に応じて後述するような固相との反応や標識物質との結合に必要な官能基やリンカー分子を導入することも可能である。
【００１２】
競合法においてもサンドイッチ法においてもホルモンレセプターを固相に結合させておく必要があるが、固相化方法は公知の蛋白質の固相化方法を用いることができる。すなわちマイクロプレート、ポリスチレンビーズ等の固相に物理吸着や架橋剤によりホルモンレセプターを結合させておく。必要に応じて官能基やリンカー分子を導入したホルモンレセプターを用いて固相との結合を強固にしたり、ホルモンレセプターの反応性を損なわないようにすることもできる。
【００１３】
また、競合法においては検体中の自己抗体と競合する抗体を、サンドイッチ法においては抗ヒトＩｇＧや固相化しない方のホルモンレセプターを検出可能なように標識しておく。標識に際しても公知の免疫学的検出方法で用いられる標識物質、標識方法を用いることができる。標識物質としてはたとえば125I、3H等の放射性物質、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、蛍光物質、発光物質等が使用可能である。標識方法は標識物質に応じて適宜選択される。
【００１４】
また、被標識物質は直接標識されている必要はない。被標識物質に特異的に結合する物質を標識しておいて、それを被標識物質に結合させる間接的な標識方法も適用可能である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の癌の検出方法を、ＡＲに対する自己抗体を競合法により測定する場合を例に具体的な実施の形態を説明する。
【００１６】
抗原となるホルモンレセプターは合成ペプタイドを使用することにし、公知のＡＲのアミノ酸配列から親水性の高い領域を選択し、２０残基前後の部分ペプタイドを化学合成した。ただし、癌において異常発現している領域までは特定できないので、数種類の部分ペプタイドを合成し、反応性の良好なものを選択することが必要である。
【００１７】
合成ペプタイドの反応性の確認は以下の手順で行う。
１）合成ＡＲペプタイド抗原を物理吸着により、マイクロタイタープレートに固相化する。
２）第一反応
合成ＡＲペプタイド抗原固相化プレートの各ウェルにホルモンレセプターに対する自己抗体価が高いと思われる患者血清を加えてインキュベーションする。
３）第二反応
ウェル内の溶液を吸引除去後各ウェルを洗浄し、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を加えインキュベーションする。
４）第三反応
ウェル内の溶液を吸引除去後各ウェルを洗浄し、発色剤と基質を加えインキュベーションする。
５）反応停止
反応停止液を加えて発色反応を停止する。
６）吸光度の測定
各ウェルの吸光度を測定する。
【００１８】
合成したペプタイドを用いて抗体を作成した。先に述べた理由により本発明において使用する抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもさし支えない。合成したペプタイドを常法により家兎に免疫し、抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体を得た。こうして得られた抗体は、直接放射性同位元素や酵素で標識して用いることもできるが、本発明の実施例ではさらに市販の酵素標識抗家兎抗体を結合させて検出することにした。
【００１９】
抗ＡＲ自己抗体の測定は、以下の手順で行った。
１）合成ＡＲペプタイド抗原を物理吸着により、マイクロタイタープレートに固相化する。
２）第一反応
合成ＡＲペプタイド抗原固相化プレートの各ウェルに抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体溶液と、検体または抗ＡＲ自己抗体標準血清を加えてインキュベーションする。
３）第二反応
ウェル内の溶液を吸引除去後各ウェルを洗浄し、酵素標識抗家兎ＩｇＧラット抗体溶液を加えインキュベーションする。
４）第三反応
ウェル内の溶液を吸引除去後各ウェルを洗浄し、発色剤と基質を加えインキュベーションする。
５）反応停止
反応停止液を加えて発色反応を停止する。
６）吸光度の測定
各ウェルの吸光度を測定する。
７）血中ＡＲ自己抗体値の算出
抗ＡＲ自己抗体標準血清の吸光度と比較して、検体中のＡＲ自己抗体値を算出する。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、血中のホルモンレセプターに対する自己抗体を測定することで癌、特にホルモン依存性の癌を検出することが可能である。癌組織に由来し、本来血中に存在しない物質に対する自己抗体を測定する癌の検出方法は従来も存在したが、本発明の自己抗体の測定ではより高感度に癌を検出することが可能である。
【００２１】
健常人においても血中に微量のホルモンレセプターに対する自己抗体が存在することは知られていたが、ホルモン依存性癌の患者においてホルモンレセプターに対する抗体が増加し、診断に応用可能であることを示したのは本発明が初めてである。また、乳癌においてホルモン療法を行うためにホルモンレセプターの測定が行われているが、これは存在が明らかになった癌についてホルモン療法が適用可能かどうかを調べるためのものであり、本発明とは本質的に異なるものである。
【００２２】
【実施例】
実施例１：ＡＲペプタイド抗原の作製
１．各種ＡＲペプタイドの合成
ＡＲペプタイド抗原はＡＲのアミノ酸配列のＡ、Ｄ、Ｈドメインの中から親水性の高い領域をひとつずつ選択し、そのうちの２０残基をＦｍｏｃ法で化学合成し、ＡドメインのペプタイドをペプタイドＡとし、Ｄ、ＨドメインのペプタイドをそれぞれペプタイドＤ、ペプタイドＨとした。
【００２３】
２．ＡＲ抗原固相化マイクロタイタ−プレートの作製
上記３種の合成ＡＲペプタイド抗原の０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液をポリ塩化ビニルマイクロタイタープレート(Dynex Technologies製、PVC Microtiter"U"Bottom Plates)のＡ列の１２ウェルにペプタイドＡを各ウェルに３１．３μｇ／ウェルになるように加えた。同様にＢ列にペプタイドＤを、Ｃ列にペプタイドＨを加え、４℃で４８時間インキュベーションする。各ウェルの抗原溶液を回収し、マイクロプレート洗浄機（ライフテック製、ミニラボウォッシャー）を用いて１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で２回洗浄する。その後、１％ＢＳＡ ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を各ウェルに満たしてシールをし、アッセイを行うまでこの状態で４℃で保存した。
【００２４】
３．第一反応
上記合成ＡＲペプタイド抗原固相化プレートの各ウェルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を吸引除去後、縦の列の各ウェルに１種類の検体を分注するようにして、ホルモンレセプターに対する自己抗体価が高いと思われる患者から採取した１０種の血清検体を１０μｌずつ各ウェルに分注する。１％ＢＳＡ ０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎａ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）９０μｌを各ウェルに加え、３７℃で２時間反応させる。
【００２５】
４．第二反応
第一反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを２回洗浄し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧウサギ抗体(ZYMED製)を１％ＢＳＡ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍希釈した溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃で１時間３０分反応させる。
【００２６】
５．第三反応
第二反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを３回洗浄し、発色剤ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］二アンモニウム塩，ナカライテスク製）濃度が３ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶解し、そこに基質として２０％過酸化水素水を０．０４％の濃度で加える。この溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃３０分反応させる。
【００２７】
６．反応停止
第三反応終了後、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）を各ウェルあたり１００μｌ加え、反応を停止する。
各ウェルの発色を波長４２０ｎｍで吸光度を測定し、もっとも吸光度の高かったペプタイドＡを検体測定用に使用することにした。
【００２８】
実施例２：ＡＲ抗体の測定
ＡＲ抗体の測定はマイクロプレート固相化ＡＲ合成ペプタイド抗原に対するＡＲの血中自己抗体と抗ヒトＡＲ家兎抗体との競合結合反応に基づいた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で行った。
【００２９】
１．抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体の作製
実施例１で作製したペプタイドＡをフロイントのコンプリート・アジュバントと等量混合し、充分乳化させた後に家兎に免疫した。免疫は２週間毎に行い、４ケ月後に一部採血して得られる抗血清を、４０％硫安分画〜透析〜濃縮し抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体とした。
【００３０】
２．ＡＲ抗原固相化マイクロタイタ−プレートの作製
実施例１で作製したペプタイドＡの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液をポリ塩化ビニルマイクロタイタープレートの各ウェルに３１．３μｇ／ウェルになるように加え、４℃で４８時間インキュベーションする。各ウェルの抗原溶液を回収し、マイクロプレート洗浄機を用いて１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で２回洗浄する。その後、１％ＢＳＡ ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を各ウェルに満たしてシールをし、アッセイを行うまでこの状態で４℃で保存した。
【００３１】
３．標準ＡＲ抗体の調製
血清中のＡＲ抗体が高濃度を示した乳癌患者血清を１％ＢＳＡ ０．０５Ｍ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて、２倍から１２８倍まで倍々希釈を行い、原血清を１２８Ｕ／ｍｌとし、ＡＲ標準抗体としては１Ｕ／ｍｌ（原血清１２８倍希釈）から６４Ｕ／ｍｌ（原血清２倍希釈）までを用いた。
【００３２】
４．血中ＡＲ抗体の測定方法
１）第一反応
２．で作製したペプタイドＡ固相化プレートの各ウェルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を吸引除去後、各ウェルに１％ＢＳＡ ０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎａ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍に希釈した抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体９０μｌと標準ＡＲ抗体血清または被検血清１０μｌを加え、３７℃で２時間反応させる。
【００３３】
２）第二反応
第一反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを２回洗浄し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗家兎ＩｇＧラット抗体(ZYMED製)を１％ＢＳＡ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍希釈した溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃で１時間３０分反応させる。
【００３４】
３）第三反応
第二反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを３回洗浄し、発色剤ＡＢＴＳ濃度が３ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶解し、そこに基質として２０％過酸化水素水を０．０４％の濃度で加える。この溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃３０分反応させる。
【００３５】
４）反応停止
第三反応終了後、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）を各ウェルあたり１００μｌ加え、反応を停止する。
【００３６】
５）吸光度の測定
各ウェルの発色を波長４２０ｎｍで吸光度を測定する。
【００３７】
６）血中ＡＲ抗体値の算出
標準ＡＲ抗体を含まない時の吸光度に対する各ＡＲ抗体標準濃度の吸光度の割合（阻害率％）を算出し、ＡＲ抗体阻害標準曲線を描く。次に、標準ＡＲ抗体を含まない時の吸光度に対する各検体の吸光度の阻害率を計算し、その阻害率をＡＲ抗体阻害標準曲線に照らし合わせ、各検体血清中のＡＲ抗体濃度を求める。
【００３８】
健常人の測定結果をもとにカットフ値を４Ｕ／ｍｌに設定し、乳癌と前立腺癌の陽性率を算出した。
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１に示したように、乳癌患者と前立腺癌患者での陽性率はそれぞれ５３．６％、７６．９％であったが、健常人と前立腺肥大症の陽性率はともに０％であった。
【００４１】
実施例３：ＥＲペプタイド抗原の作製
１．各種ＥＲペプタイド抗原の作製
ＥＲペプタイド抗原はＥＲアミノ酸配列のＡ／Ｂ、Ｄ、Ｆドメインの中から親水性の高い領域をひとつずつ選択し、そのうちの２０残基をＦｍｏｃ法で化学合成し、Ａ／ＢドメインのペプタイドをペプタイドＡ／Ｂとし、Ｄ、ＦドメインのペプタイドをそれぞれペプタイドＤ、ペプタイドＦとした。実施例１と同様の方法で、ペプタイドＡ／Ｂ、Ｄ、Ｆをマイクロタイタープレートにそれぞれ固相化し、ホルモンレセプターに対する自己抗体価が高いと思われる患者血清との反応性からペプタイドＤを選択した。
【００４２】
実施例４：ＥＲ抗体の測定
ＥＲ抗体の測定はＡＲ抗体の測定と同様にマイクロプレート固相化ＥＲ合成ペプタイド抗原に対するＥＲの血中自己抗体と抗ヒトＥＲ家兎抗体との競合結合反応に基づいた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で行った。
【００４３】
１．抗ＥＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体の作製
実施例３で作製したペプタイドＤをフロイントのコンプリート・アジュバントと等量混合し、充分乳化させた後に家兎に免疫した。免疫は２週間毎に行い、４ケ月後に一部採血して得られる抗血清を、４０％硫安分画〜透析〜濃縮し抗ＥＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体とした。
【００４４】
２．ＥＲ抗原固相化マイクロタイタ−プレートの作製
実施例３で作製したペプタイドＤの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液をポリ塩化ビニルマイクロタイタープレートの各ウェルに３１．３μｇ／ウェルになるよう０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０にて調製し、４℃で４８時間インキュベーションする。各ウェルの抗原溶液を回収し、マイクロプレート洗浄機を用いて１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で２回洗浄する。その後、１％ＢＳＡ ０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０）緩衝液を各ウェルを満たしてシールをし、アッセイを行うまでこの状態で４℃で保存した。
【００４５】
３．標準ＥＲ抗体の調製
血清中のＥＲ抗体が高濃度を示した乳癌患者血清を１％ＢＳＡ ０．０５Ｍ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて、２倍から１２８倍まで倍々希釈を行い、原血清を１２８Ｕ／ｍｌとし、ＥＲ標準抗体としては１Ｕ／ｍｌ（原血清１２８倍希釈）から６４Ｕ／ｍｌ（原血清２倍希釈）までを用いた。
【００４６】
４．血中ＥＲ抗体の測定方法
１）第一反応
上記ペプタイドＤ固相化プレートの各ウェルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を吸引除去後、各ウェルに１％ＢＳＡ ０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎａ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍に希釈した抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体９０μｌと標準ＡＲ抗体血清または被検血清１０μｌを加え、３７℃で２時間反応させる。
【００４７】
２）第二反応
第一反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを２回洗浄し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗家兎ＩｇＧラット抗体を１％ＢＳＡ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍希釈した溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃で１時間３０分反応させる。
【００４８】
３）第三反応
第二反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを３回洗浄し、発色剤ＡＢＴＳ濃度が３ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶解し、そこに基質として２０％過酸化水素水を０．０４％の濃度で加える。この溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃３０分反応させる。
【００４９】
４）反応停止
第三反応終了後、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液ｐＨ４．０を各ウェルあたり１００μｌ加え、反応を停止する。
【００５０】
５）吸光度の測定
各ウェルの発色を波長４２０ｎｍで吸光度を測定する。
【００５１】
６）血中ＥＲ抗体値の算出
標準ＥＲ抗体を含まない時の吸光度に対する各ＥＲ抗体標準濃度の吸光度の割合（阻害率％）を算出し、ＥＲ抗体阻害標準曲線を描く。次に、標準ＥＲ抗体を含まない時の吸光度に対する各検体の吸光度の阻害率を計算し、その阻害率をＥＲ抗体阻害標準曲線に照らし合わせ、各検体血清中のＥＲ抗体濃度を求める。
【００５２】
健常人の測定結果をもとにカットフ値を３Ｕ／ｍｌに設定し、乳癌と前立腺癌の陽性率を算出した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
表２に示したように、乳癌患者と前立腺癌患者での陽性率はそれぞれ５４．５％、４０．０％であったが、健常人の陽性率は０％であった。
【００５５】
参考文献
１．特開平４−３２７６６
２．特表平７−５０５７１９
３．特開平９−２２９９３３
４．Pro.N.A.S. 82, 8345-8348(1985)
５．J.Clinical Endoclinology and Metabolism 64, 246-254(1987)
６．特表昭６３−５００８９５
７．特公平６−１３５５８
８．腫瘍マーカー研究会誌 8, 43-45(1992)
９．Cancer 9, 2205-2211(1985)
【産業上の利用分野】
本発明は血中に存在するホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来技術の問題点】
各種の癌において細胞核内に局在する癌関連物質が細胞の癌化に伴い過剰に発現することが知られている。一方、腫瘍免疫機構により癌細胞が破壊される結果、担癌生体の血中に過剰に発現した癌関連物質が遊離し、体液性抗体の産生を誘発することが知られている。ヒストンやｐ５３などに対する自己抗体はそのような例である（文献１〜３）。これらの自己抗体も癌の診断への応用が試みられてきた。その理由は抗原が微量しか存在しない場合でも、その抗原に対して産生される抗体量は生体内で増幅されているので測定が容易であり、癌の早期発見につながると期待されるためである。しかしながら、これらの自己抗体の測定は、実際には陽性率が低く、癌と非癌との判別が困難なものが多かった。
【０００３】
ヒストンやｐ５３同様に細胞核内に局在し、癌において過剰発現している蛋白質としては各種ステロイドホルモンレセプターが知られてるが、ステロイドホルモンのレセプターであるアンドロゲンレセプター（ＡＲ）やエストロゲンレセプター（ＥＲ）に対する自己抗体は、健常人の血中にもごく微量ながら存在する。たとえばＡＲは血清１μｌあたり数ｆｍｏｌのオーダーで存在し、女性よりも男性の方が濃度が高いことが知られている（文献４，５）。しかしながら、これらのホルモンレセプターに対する自己抗体と疾患との関連を明らかにした例は知られていない。
【０００４】
一方、乳癌、前立腺癌等のホルモン標的臓器由来の癌の多くはホルモンレセプターを発現していて、癌の発生あるいは増殖・進展過程において種々のホルモンが影響を与えている。これらの癌はホルモン依存性癌と呼ばれ、ホルモン療法が有効であることが知られている。たとえば、乳癌の一部にはＥＲやプロゲステロンレセプター（ＰｇＲ）を発現しているものがあり、そのような例では抗ホルモン剤の投与や、卵巣摘出等のホルモン療法が有効である。したがって乳癌ではホルモンレセプターの発現の有無が診断上重要であり、手術や生検で摘出した組織を検体としてホルモンレセプターの測定が行われている。そのためにこれらのホルモンレセプター測定用に各種の抗体が開発されてきた（文献６，７）。しかしながら、ホルモンレセプターを発現しているホルモン依存性癌患者の血液中に遊離のホルモンレセプターが存在しているか否か、また、それらのホルモンレセプターに対する自己抗体が存在するか否かについて言及した例はない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血中のホルモンレセプターに対する自己抗体の測定方法を確立し、より簡易で早期発見が可能な癌の診断方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者らはホルモン依存性癌患者の血中にホルモンレセプターに対する自己抗体が多量に出現することを見いだし、以下に示すホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法を発明した。
【０００６】
（１）血中に存在するホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法。
（２）ホルモンレセプターがエストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、またはアンドロゲンレセプターであることを特徴とする（１）の検出方法。
（３）癌がホルモン依存性癌であることを特徴とする（２）の検出方法。
（４）ホルモン依存性癌が乳癌、前立腺癌、あるいは卵巣癌であることを特徴とする（３）の検出方法。
（５）自己抗体の測定方法が免疫学的方法であることを特徴とする（１）から（４）の検出方法。
（６）免疫学的測定方法が競合法、またはサンドイッチ法であることを特徴とする（５）の検出方法。
（７）化学合成、または遺伝子組み換えによって得られたホルモンレセプターの部分ペプタイドを用いることを特徴とする（５）から（６）の検出方法。
（８）ホルモンレセプターの部分ペプタイドを不溶性担体に固相化して用いることを特徴とする（７）の検出方法。
【０００７】
本発明は、血中のホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法であり、測定対象となるのは、具体的にはエストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、またはアンドロゲンレセプターに対する自己抗体である。これらのホルモンレセプターに対する自己抗体は健常人の血中にも微量ながら存在するが、前記のホルモンレセプターを発現している一部の癌の患者血中においては顕著に増大する。
【０００８】
これらのホルモンレセプターを発現している癌はホルモン依存性癌と呼ばれ、ホルモンが癌の発生あるいは増殖・進展過程に影響している。ホルモン依存性癌としては乳癌、前立腺癌、あるいは卵巣癌の一部がこれに属する。
【０００９】
血中の自己抗体の測定方法としては、免疫学的測定法が適している。すなわち、ヒトのホルモンレセプターを動物に免疫して得た抗体を用いて、この抗体と検体中の自己抗体とをホルモンレセプターに対して競合させる競合法や、抗体が２分子の抗原と結合できることを利用して、ホルモンレセプターに結合した自己抗体に対してさらに第２のホルモンレセプターや、抗ヒトＩｇＧを結合させて、形成される免疫複合体を検出するサンドイッチ法が代表的であり、本発明においてはどちらの方法も適用可能である。
【００１０】
免疫学的測定において使用するホルモンレセプターは、ヒトの組織から抽出精製したものでも、遺伝子組み換えや化学合成等により人工的に製造したものでもかまわない。しかし、以下に述べる理由により遺伝子組み換えや化学合成によって得られるホルモンレセプターの部分ペプタイドを用いるのが好ましい。
【００１１】
第一にホルモンレセプターをヒトの組織から抽出し精製するのは、材料の入手が困難な上に作業も手間がかかる。また、一定の品質を持つものが得にくい。第二に癌関連物質に対する自己抗体の中にはモノクローナルな抗体も見いだされることから（文献８，９）、抗原である癌関連物質は、分子全体ではなく特定の領域のみが多量に発現している可能性が高いためである。また、遺伝子組み換えや化学合成によって得られる合成ペプタイドは、必要に応じて後述するような固相との反応や標識物質との結合に必要な官能基やリンカー分子を導入することも可能である。
【００１２】
競合法においてもサンドイッチ法においてもホルモンレセプターを固相に結合させておく必要があるが、固相化方法は公知の蛋白質の固相化方法を用いることができる。すなわちマイクロプレート、ポリスチレンビーズ等の固相に物理吸着や架橋剤によりホルモンレセプターを結合させておく。必要に応じて官能基やリンカー分子を導入したホルモンレセプターを用いて固相との結合を強固にしたり、ホルモンレセプターの反応性を損なわないようにすることもできる。
【００１３】
また、競合法においては検体中の自己抗体と競合する抗体を、サンドイッチ法においては抗ヒトＩｇＧや固相化しない方のホルモンレセプターを検出可能なように標識しておく。標識に際しても公知の免疫学的検出方法で用いられる標識物質、標識方法を用いることができる。標識物質としてはたとえば125I、3H等の放射性物質、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、蛍光物質、発光物質等が使用可能である。標識方法は標識物質に応じて適宜選択される。
【００１４】
また、被標識物質は直接標識されている必要はない。被標識物質に特異的に結合する物質を標識しておいて、それを被標識物質に結合させる間接的な標識方法も適用可能である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の癌の検出方法を、ＡＲに対する自己抗体を競合法により測定する場合を例に具体的な実施の形態を説明する。
【００１６】
抗原となるホルモンレセプターは合成ペプタイドを使用することにし、公知のＡＲのアミノ酸配列から親水性の高い領域を選択し、２０残基前後の部分ペプタイドを化学合成した。ただし、癌において異常発現している領域までは特定できないので、数種類の部分ペプタイドを合成し、反応性の良好なものを選択することが必要である。
【００１７】
合成ペプタイドの反応性の確認は以下の手順で行う。
１）合成ＡＲペプタイド抗原を物理吸着により、マイクロタイタープレートに固相化する。
２）第一反応
合成ＡＲペプタイド抗原固相化プレートの各ウェルにホルモンレセプターに対する自己抗体価が高いと思われる患者血清を加えてインキュベーションする。
３）第二反応
ウェル内の溶液を吸引除去後各ウェルを洗浄し、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を加えインキュベーションする。
４）第三反応
ウェル内の溶液を吸引除去後各ウェルを洗浄し、発色剤と基質を加えインキュベーションする。
５）反応停止
反応停止液を加えて発色反応を停止する。
６）吸光度の測定
各ウェルの吸光度を測定する。
【００１８】
合成したペプタイドを用いて抗体を作成した。先に述べた理由により本発明において使用する抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもさし支えない。合成したペプタイドを常法により家兎に免疫し、抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体を得た。こうして得られた抗体は、直接放射性同位元素や酵素で標識して用いることもできるが、本発明の実施例ではさらに市販の酵素標識抗家兎抗体を結合させて検出することにした。
【００１９】
抗ＡＲ自己抗体の測定は、以下の手順で行った。
１）合成ＡＲペプタイド抗原を物理吸着により、マイクロタイタープレートに固相化する。
２）第一反応
合成ＡＲペプタイド抗原固相化プレートの各ウェルに抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体溶液と、検体または抗ＡＲ自己抗体標準血清を加えてインキュベーションする。
３）第二反応
ウェル内の溶液を吸引除去後各ウェルを洗浄し、酵素標識抗家兎ＩｇＧラット抗体溶液を加えインキュベーションする。
４）第三反応
ウェル内の溶液を吸引除去後各ウェルを洗浄し、発色剤と基質を加えインキュベーションする。
５）反応停止
反応停止液を加えて発色反応を停止する。
６）吸光度の測定
各ウェルの吸光度を測定する。
７）血中ＡＲ自己抗体値の算出
抗ＡＲ自己抗体標準血清の吸光度と比較して、検体中のＡＲ自己抗体値を算出する。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、血中のホルモンレセプターに対する自己抗体を測定することで癌、特にホルモン依存性の癌を検出することが可能である。癌組織に由来し、本来血中に存在しない物質に対する自己抗体を測定する癌の検出方法は従来も存在したが、本発明の自己抗体の測定ではより高感度に癌を検出することが可能である。
【００２１】
健常人においても血中に微量のホルモンレセプターに対する自己抗体が存在することは知られていたが、ホルモン依存性癌の患者においてホルモンレセプターに対する抗体が増加し、診断に応用可能であることを示したのは本発明が初めてである。また、乳癌においてホルモン療法を行うためにホルモンレセプターの測定が行われているが、これは存在が明らかになった癌についてホルモン療法が適用可能かどうかを調べるためのものであり、本発明とは本質的に異なるものである。
【００２２】
【実施例】
実施例１：ＡＲペプタイド抗原の作製
１．各種ＡＲペプタイドの合成
ＡＲペプタイド抗原はＡＲのアミノ酸配列のＡ、Ｄ、Ｈドメインの中から親水性の高い領域をひとつずつ選択し、そのうちの２０残基をＦｍｏｃ法で化学合成し、ＡドメインのペプタイドをペプタイドＡとし、Ｄ、ＨドメインのペプタイドをそれぞれペプタイドＤ、ペプタイドＨとした。
【００２３】
２．ＡＲ抗原固相化マイクロタイタ−プレートの作製
上記３種の合成ＡＲペプタイド抗原の０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液をポリ塩化ビニルマイクロタイタープレート(Dynex Technologies製、PVC Microtiter"U"Bottom Plates)のＡ列の１２ウェルにペプタイドＡを各ウェルに３１．３μｇ／ウェルになるように加えた。同様にＢ列にペプタイドＤを、Ｃ列にペプタイドＨを加え、４℃で４８時間インキュベーションする。各ウェルの抗原溶液を回収し、マイクロプレート洗浄機（ライフテック製、ミニラボウォッシャー）を用いて１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で２回洗浄する。その後、１％ＢＳＡ ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を各ウェルに満たしてシールをし、アッセイを行うまでこの状態で４℃で保存した。
【００２４】
３．第一反応
上記合成ＡＲペプタイド抗原固相化プレートの各ウェルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を吸引除去後、縦の列の各ウェルに１種類の検体を分注するようにして、ホルモンレセプターに対する自己抗体価が高いと思われる患者から採取した１０種の血清検体を１０μｌずつ各ウェルに分注する。１％ＢＳＡ ０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎａ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）９０μｌを各ウェルに加え、３７℃で２時間反応させる。
【００２５】
４．第二反応
第一反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを２回洗浄し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧウサギ抗体(ZYMED製)を１％ＢＳＡ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍希釈した溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃で１時間３０分反応させる。
【００２６】
５．第三反応
第二反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを３回洗浄し、発色剤ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］二アンモニウム塩，ナカライテスク製）濃度が３ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶解し、そこに基質として２０％過酸化水素水を０．０４％の濃度で加える。この溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃３０分反応させる。
【００２７】
６．反応停止
第三反応終了後、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）を各ウェルあたり１００μｌ加え、反応を停止する。
各ウェルの発色を波長４２０ｎｍで吸光度を測定し、もっとも吸光度の高かったペプタイドＡを検体測定用に使用することにした。
【００２８】
実施例２：ＡＲ抗体の測定
ＡＲ抗体の測定はマイクロプレート固相化ＡＲ合成ペプタイド抗原に対するＡＲの血中自己抗体と抗ヒトＡＲ家兎抗体との競合結合反応に基づいた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で行った。
【００２９】
１．抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体の作製
実施例１で作製したペプタイドＡをフロイントのコンプリート・アジュバントと等量混合し、充分乳化させた後に家兎に免疫した。免疫は２週間毎に行い、４ケ月後に一部採血して得られる抗血清を、４０％硫安分画〜透析〜濃縮し抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体とした。
【００３０】
２．ＡＲ抗原固相化マイクロタイタ−プレートの作製
実施例１で作製したペプタイドＡの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液をポリ塩化ビニルマイクロタイタープレートの各ウェルに３１．３μｇ／ウェルになるように加え、４℃で４８時間インキュベーションする。各ウェルの抗原溶液を回収し、マイクロプレート洗浄機を用いて１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で２回洗浄する。その後、１％ＢＳＡ ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を各ウェルに満たしてシールをし、アッセイを行うまでこの状態で４℃で保存した。
【００３１】
３．標準ＡＲ抗体の調製
血清中のＡＲ抗体が高濃度を示した乳癌患者血清を１％ＢＳＡ ０．０５Ｍ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて、２倍から１２８倍まで倍々希釈を行い、原血清を１２８Ｕ／ｍｌとし、ＡＲ標準抗体としては１Ｕ／ｍｌ（原血清１２８倍希釈）から６４Ｕ／ｍｌ（原血清２倍希釈）までを用いた。
【００３２】
４．血中ＡＲ抗体の測定方法
１）第一反応
２．で作製したペプタイドＡ固相化プレートの各ウェルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を吸引除去後、各ウェルに１％ＢＳＡ ０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎａ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍に希釈した抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体９０μｌと標準ＡＲ抗体血清または被検血清１０μｌを加え、３７℃で２時間反応させる。
【００３３】
２）第二反応
第一反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを２回洗浄し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗家兎ＩｇＧラット抗体(ZYMED製)を１％ＢＳＡ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍希釈した溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃で１時間３０分反応させる。
【００３４】
３）第三反応
第二反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを３回洗浄し、発色剤ＡＢＴＳ濃度が３ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶解し、そこに基質として２０％過酸化水素水を０．０４％の濃度で加える。この溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃３０分反応させる。
【００３５】
４）反応停止
第三反応終了後、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）を各ウェルあたり１００μｌ加え、反応を停止する。
【００３６】
５）吸光度の測定
各ウェルの発色を波長４２０ｎｍで吸光度を測定する。
【００３７】
６）血中ＡＲ抗体値の算出
標準ＡＲ抗体を含まない時の吸光度に対する各ＡＲ抗体標準濃度の吸光度の割合（阻害率％）を算出し、ＡＲ抗体阻害標準曲線を描く。次に、標準ＡＲ抗体を含まない時の吸光度に対する各検体の吸光度の阻害率を計算し、その阻害率をＡＲ抗体阻害標準曲線に照らし合わせ、各検体血清中のＡＲ抗体濃度を求める。
【００３８】
健常人の測定結果をもとにカットフ値を４Ｕ／ｍｌに設定し、乳癌と前立腺癌の陽性率を算出した。
【００３９】
【表１】
表１に示したように、乳癌患者と前立腺癌患者での陽性率はそれぞれ５３．６％、７６．９％であったが、健常人と前立腺肥大症の陽性率はともに０％であった。
【００４１】
実施例３：ＥＲペプタイド抗原の作製
１．各種ＥＲペプタイド抗原の作製
ＥＲペプタイド抗原はＥＲアミノ酸配列のＡ／Ｂ、Ｄ、Ｆドメインの中から親水性の高い領域をひとつずつ選択し、そのうちの２０残基をＦｍｏｃ法で化学合成し、Ａ／ＢドメインのペプタイドをペプタイドＡ／Ｂとし、Ｄ、ＦドメインのペプタイドをそれぞれペプタイドＤ、ペプタイドＦとした。実施例１と同様の方法で、ペプタイドＡ／Ｂ、Ｄ、Ｆをマイクロタイタープレートにそれぞれ固相化し、ホルモンレセプターに対する自己抗体価が高いと思われる患者血清との反応性からペプタイドＤを選択した。
【００４２】
実施例４：ＥＲ抗体の測定
ＥＲ抗体の測定はＡＲ抗体の測定と同様にマイクロプレート固相化ＥＲ合成ペプタイド抗原に対するＥＲの血中自己抗体と抗ヒトＥＲ家兎抗体との競合結合反応に基づいた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で行った。
【００４３】
１．抗ＥＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体の作製
実施例３で作製したペプタイドＤをフロイントのコンプリート・アジュバントと等量混合し、充分乳化させた後に家兎に免疫した。免疫は２週間毎に行い、４ケ月後に一部採血して得られる抗血清を、４０％硫安分画〜透析〜濃縮し抗ＥＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体とした。
【００４４】
２．ＥＲ抗原固相化マイクロタイタ−プレートの作製
実施例３で作製したペプタイドＤの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液をポリ塩化ビニルマイクロタイタープレートの各ウェルに３１．３μｇ／ウェルになるよう０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０にて調製し、４℃で４８時間インキュベーションする。各ウェルの抗原溶液を回収し、マイクロプレート洗浄機を用いて１ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で２回洗浄する。その後、１％ＢＳＡ ０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０）緩衝液を各ウェルを満たしてシールをし、アッセイを行うまでこの状態で４℃で保存した。
【００４５】
３．標準ＥＲ抗体の調製
血清中のＥＲ抗体が高濃度を示した乳癌患者血清を１％ＢＳＡ ０．０５Ｍ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて、２倍から１２８倍まで倍々希釈を行い、原血清を１２８Ｕ／ｍｌとし、ＥＲ標準抗体としては１Ｕ／ｍｌ（原血清１２８倍希釈）から６４Ｕ／ｍｌ（原血清２倍希釈）までを用いた。
【００４６】
４．血中ＥＲ抗体の測定方法
１）第一反応
上記ペプタイドＤ固相化プレートの各ウェルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を吸引除去後、各ウェルに１％ＢＳＡ ０．１％ＥＤＴＡ・２Ｎａ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍に希釈した抗ＡＲ家兎ポリクローナルＩｇＧ抗体９０μｌと標準ＡＲ抗体血清または被検血清１０μｌを加え、３７℃で２時間反応させる。
【００４７】
２）第二反応
第一反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを２回洗浄し、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗家兎ＩｇＧラット抗体を１％ＢＳＡ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にて２０００倍希釈した溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃で１時間３０分反応させる。
【００４８】
３）第三反応
第二反応終了後ウェル内の溶液を吸引除去し、マイクロプレート洗浄機を用いて生理食塩水２ｍｌにて各ウェルを３回洗浄し、発色剤ＡＢＴＳ濃度が３ｍｇ／ｍｌになるように０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶解し、そこに基質として２０％過酸化水素水を０．０４％の濃度で加える。この溶液を各ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃３０分反応させる。
【００４９】
４）反応停止
第三反応終了後、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍクエン酸りん酸緩衝液ｐＨ４．０を各ウェルあたり１００μｌ加え、反応を停止する。
【００５０】
５）吸光度の測定
各ウェルの発色を波長４２０ｎｍで吸光度を測定する。
【００５１】
６）血中ＥＲ抗体値の算出
標準ＥＲ抗体を含まない時の吸光度に対する各ＥＲ抗体標準濃度の吸光度の割合（阻害率％）を算出し、ＥＲ抗体阻害標準曲線を描く。次に、標準ＥＲ抗体を含まない時の吸光度に対する各検体の吸光度の阻害率を計算し、その阻害率をＥＲ抗体阻害標準曲線に照らし合わせ、各検体血清中のＥＲ抗体濃度を求める。
【００５２】
健常人の測定結果をもとにカットフ値を３Ｕ／ｍｌに設定し、乳癌と前立腺癌の陽性率を算出した。
【００５３】
【表２】
表２に示したように、乳癌患者と前立腺癌患者での陽性率はそれぞれ５４．５％、４０．０％であったが、健常人の陽性率は０％であった。
【００５５】
参考文献
１．特開平４−３２７６６
２．特表平７−５０５７１９
３．特開平９−２２９９３３
４．Pro.N.A.S. 82, 8345-8348(1985)
５．J.Clinical Endoclinology and Metabolism 64, 246-254(1987)
６．特表昭６３−５００８９５
７．特公平６−１３５５８
８．腫瘍マーカー研究会誌 8, 43-45(1992)
９．Cancer 9, 2205-2211(1985)
Claims (5)
- 血中に存在するエストロゲンレセプターまたはアンドロゲンレセプターに対する自己抗体の測定による乳癌あるいは前立腺癌の検出方法。
- 自己抗体の測定方法が免疫学的測定方法であることを特徴とする請求項１の検出方法。
- 免疫学的測定方法が競合法、またはサンドイッチ法であることを特徴とする請求項２の検出方法。
- 化学合成、または遺伝子組み換えによって得られたホルモンレセプターの部分ペプタイドを用いることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の検出方法。
- ホルモンレセプターの部分ペプタイドを不溶性担体に固相化して用いることを特徴とする請求項４の検出方法。
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