JPH04232462A

JPH04232462A - アンギオテンシンｉｉの特異的検定のためのキット

Info

Publication number: JPH04232462A
Application number: JP3165730A
Authority: JP
Inventors: Dominique Simon; ドミニク・シモン; Jean Marchand; ジャン・マルシャン; Gabriel Badouaille; ガブリエル・バドゥエイユ; Bernard Romestand; ベルナール・ロームスタン; Jean-Alain Fehrentz; ジャン　−　アラン・フェーランツ
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 1990-07-05
Filing date: 1991-07-05
Publication date: 1992-08-20
Also published as: IE912313A1; AU7949391A; US5296354A; DE69119656T2; GR3020787T3; CA2046188C; DE69119656D1; ATE138386T1; FR2664386B1; TW262536B; AU650028B2; DK0466565T3; KR920003057A; IE74710B1; IL98708A0; FR2664386A1; CA2046188A1; IL98708A; PT98193B; ZA915155B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、アンギオテンシンＩＩの特異的免疫検定の
ためのキット、およびこのキットを用いるアンギオテン
シンＩＩの免疫検定法に関する。

【０００１】アンギオテンシンＩＩは、レニン−　アン
ギオテンシン系の生物学的活性生成物である、効力の強
い昇圧剤である。レニンは血漿のアンギオテンシノ−ゲ
ンに作用してデカペプチド（１−１０）、すなわちアン
ギオテンシンＩを生成する。後者は、変換酵素およびア
ミノペプチダ−ゼの作用によりオクタペプチド（１−８
　）、すなわちアンギオテンシンＩＩ、に変換され、次
いでヘプタペプチド（２−７　）、すなわちアンギオテ
ンシンＩＩＩ　を生成する。アンギオテンシンＩ（以下
、Ａｎｇ　Ｉ　と記す）　　　　　　　　　　１　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０　　　　　　　　Ｈ−Ａｓｐ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ　　　　（Ｉ）　　　　アンギ
オテンシンＩＩ（以下、Ａｎｇ　ＩＩと記す）　　　　
　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　８　　　　　　　　　Ｈ−Ａｓｐ−
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｈｅ−ＯＨ　　　　　　　　　　　　（ＩＩ）　　　　
アンギオテンシンＩＩＩ　（以下、Ａｎｇ　ＩＩＩ　と
記す）　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　８　　　　　　　　　Ｈ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈ
ｅ−ＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩＩ）

【０００２】最近の刊行物は、Ａｎｇ　ＩＩＩ　それ自
体が２つのペプチドに分解することを示している（Ｄ．
Ｊ．ＣＡＭＢＥＬＬ　ら、Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、
１９９０、８　、１６５−１７２　）。これらの分解ペ
プチドのうち、下記配列を有するヘキサペプチド（以下
、ヘキサペプチドＩＶと記す）　　　　　　　　　　３　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　８　　　　　　　　Ｈ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉ
ｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　（ＩＶ）および下記配列を有
するペンタペプチド（以下、ペンタペプチドＶと記す）　　　　　　　　　　４　　　　　　　　　　　　　　
　８　　　　　　　　Ｈ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　（Ｖ）については特別に言及されるこ
とがある。これらの分解ペプチドはヒト血漿中に存在す
る。これらは他の哺乳動物の血漿中においても見出され
る。

【０００３】レニン−　アンギオテンシン系のホルモン
面の探求は、高血圧症の診断および治療において非常に
重要である。現在のところ、臨床状況で行なわれている
この探求は、血漿レニンの酵素活性および変換酵素活性
の測定、および活性レニンの血漿濃度の測定に限られて
いる。系の活性ペプチドである　Ａｎｇ　ＩＩ　の直接
検定は、いくつかの理由により実施が困難である。

【０００４】−　　Ａｎｇ　ＩＩの血漿濃度は非常に低
く（正常体において３ないし２０ｐｇ／ｍｌであり、　
３×１０−１２　ないし　２×１０−１１　Ｍに相当す
る）、非常に高い親和性を有する抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗
体の使用を要する。

【０００５】−　　Ａｎｇ　ＩＩは、血漿中に存在し、
アンギオテンシノ−ゲンの分解に由来する種々のペプチ
ド、特に　Ａｎｇ　Ｉおよび上記全てのＡｎｇ　ＩＩＩ
もしくは他の分解ペプチドに対して構造類似性を有し、
これは検定を妨げるものである。

【０００６】このため、Ｊ．ＮＵＳＳＢＥＲＧＥＲらは
、ヒト血漿中の　Ａｎｇ　ＩＩ　および　ＩＩＩの区別
ができないラジオイムノアッセイを開示している（Ｈｏ
ｒｍｏｎ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．　、１９８４、１６（
ＩＩ）、６０６−６１０　および　Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅ
ｎｓ．　、ｓｕｐｐｌ．、１９８８、６　（４）　、Ｓ
４２４−Ｓ４２５　）。さらに、欧州特許出願　２７３
，４５３はいくつかの抗−Ａｎｇ　ＩＩモノクロ−ナル
抗体を開示しているが、それらの全ては　Ａｎｇ　ＩＩ
Ｉとの交叉反応性を示し、それらのうちの１つで観察さ
れた最も低い交叉反応性は３２％である。したがって、
Ａｎｇ　ＩＩとこの抗体との反応は特異的ではない。

【０００７】さらに、このモノクロ−ナル抗体は、１０
９　Ｍ−１オ−ダ−の低い親和性しか持たず、これは血
漿の検定を行なうには不十分である（Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．　、１９８７
、１４３　、１３３−１３９　）。

【０００８】４Ｄ８と呼ばれ、会議録「治療の標的とし
てのレニン−　アンギオテンシン系（Ｔｈｅ　Ｒｅｎｉ
ｎ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ａｓ　ａ
　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｔａｒｇｅｔ）」（バ−ゼ
ル、１９８９年１０月　２９−３１日、ＳＡＮＯＦＩコ
ミュニケ−ション）に記載された抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗
体は、１０１１Ｍ−１オ−ダ−の高い親和性を有してい
る。しかしながら、これは　１００％のオ−ダ−で　Ａ
ｎｇ　ＩＩ　およびヘキサペプチド（ＩＶ）との交叉反
応性を示し、約５０％のペンタペプチド（Ｖ）との交叉
反応性を示す。実際、Ａｎｇ　ＩＩに対する非常に高い
親和性を有し、かつ　Ａｎｇ　ＩＩ　および分解ペプチ
ドと交叉反応を示さない抗体を得ることは非常に困難で
あり、現時点では知られていない。

【０００９】さらに、現時点では、Ａｎｇ　ＩＩの特異
的検定は、血液試料に対して連続して複数の工程を施す
必要があるという方法論的な問題を提示する（Ｊ．ＮＵ
ＳＳＢＥＲＧＥＲら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１９
８６、　８、４７６−４８２　）。１．異なるアンギオ
テンシン類および分解ペプチドを抽出して、それらを含
有する血漿抽出物を調製し、２．アンギオテンシノ−ゲ
ンの代謝に由来し、血漿中に存在する異なるアンギオテ
ンシン類を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によ
り分離し、３．溶出後に採取した画分のラジオイムノア
ッセイを行なう。

【００１０】血漿からのアンギオテンシン類の抽出は、
Ａｎｇ　ＩＩ検定の全ての技法に共通の、必須の工程で
ある。これは、Ｊ．ＮＵＳＳＢＥＲＧＥＲら、Ｈｙｐｅｒｔｅ
ｎｓｉｏｎ、１９８５　（７）、ｓｕｐｐｌ．１、Ｉ−
１−Ｉ−７　に記載の方法に従って、シリカカラムを用
いるクロマトグラフィにより行なわれる。

【００１１】ＨＰＬＣによる分離工程の結果として、こ
の技法の実施は厄介で退屈なものである。このため、ル
−チン条件の下では、大量の血漿試料の検定には用いる
ことができない。

【００１２】媒体中に存在する　Ａｎｇ　Ｉ、Ａｎｇ　
ＩＩＩ　および分解ペプチドの濃度に関係なく　Ａｎｇ
ＩＩ　のレベルを正確に測定することができ、ル−チン
形態の臨床利用に適合する時間で実施することが可能な
特異的検定を開発する試みがなされている。このような
特異的検定は、−　　実験条件下での異なる動物種にお
けるレニン−　アンギオテンシン系の生理機能の研究、 −　　ヒトにおける病理学上の状況の診断、または−　
　高血圧症の治療の診断および監視のいずれかに非常に
重要である。

【００１３】一般に、Ａｎｇ　ＩＩは血漿で検定される
。この発明によると、血漿または　Ａｎｇ　ＩＩが存在
するいかなる生物学的液体においてもＡｎｇ　ＩＩ　の
検定を行なうことが可能である。この発明による検定は
、Ａｎｇ　ＩＩの特異的な測定を見出そうとするいかな
る動物種、特にヒト、においても行なうことができる。

【００１４】この発明により、Ａｎｇ　ＩＩに対する抗
体（実際の検定用）および　Ａｎｇ　ＩＩＩに特異的な
抗体の他に、適当であれば、Ａｎｇ　Ｉ　もしくは分解
ペプチドに各々特異的な１種以上の抗体を同時に使用す
ることにより、　Ａｎｇ　ＩＩ　の特異免疫検定を行な
うことが可能であることが見出されている。Ａｎｇ　Ｉ
ＩＩ　に特異的な抗体および　Ａｎｇ　Ｉもしくは分解
ペプチドに特異的な抗体は、各々１０％未満の　Ａｎｇ
　ＩＩ　との交叉反応を示す抗体を意味するものと理解
されている。したがって、各々特異的な抗体に捕獲され
たＡｎｇ　ＩＩＩ　および、適当であるならば、Ａｎｇ
　Ｉ　および分解ペプチドは、事実上、もはや抗−　Ａ
ｎｇ　ＩＩ抗体との交叉反応に利用することはできない
。このため、Ａｎｇ　ＩＩ検定は完全に特異的になる。すなわち、試料中の関連ペプチドの存在による妨害の全
てから完全に解放される。この発明によると、Ａｎｇ　
ＩＩの測定は下記の２工程のみを必要とする。１．異なるアンギオテンシン類および分解ペプチド類を
抽出して、それらを含有する生物学的液体の抽出物を調
製し、２．この抽出物に含まれる　Ａｎｇ　ＩＩ　の実際の免
疫検定を行なう。

【００１５】したがって、Ａｎｇ　ＩＩの特異的検定の
手順において最も遅く、かつ最も骨の折れる工程である
、ＨＰＬＣによる抽出物中の異なるアンギオテンシン類
の分離は回避される。

【００１６】用いられる免疫検定は競合的検定である。抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体に結合した標識　ＡｎｇＩＩ　
が、検定しようとする試料中に含有される非標識　Ａｎ
ｇ　ＩＩ　によって置き換えられる。既知量の　Ａｎｇ
　ＩＩ　を含有する標準を用いて作成した検量線を参照
することにより、試料中に存在する　Ａｎｇ　ＩＩ　濃
度を決定することが可能となる。

【００１７】Ａｎｇ　ＩＩは、トリチウム（　３Ｈ）も
しくはヨウ素−１２５（　１２５Ｉ）のような放射性元
素、または例えばアセチルコリンエステラ−ゼ、ペルオ
キシダ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼもしくはβ−　ガ
ラクトシダ−ゼのような酵素、または蛍光標識、または
発光標識のいずれかで標識される。

【００１８】この発明によると、Ａｎｇ　ＩＩＩ　に特
異的な抗体および、適当であれば、Ａｎｇ　Ｉ　もしく
は分解ペプチドに各々特異的な１種以上の抗体が反応媒
体に添加される。これらは、対応する抗原−　抗体複合
体を形成することにより、試料中に存在する　Ａｎｇ　
ＩＩＩおよび、適当であれば、Ａｎｇ　Ｉ　および分解
ペプチドをマスクする。これにより、試料中に存在する
　Ａｎｇ　ＩＩＩおよび、適当であれば、Ａｎｇ　Ｉ　
および分解ペプチドと抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体との交叉
反応の発生が回避される。また、この発明の主題は、−
　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体、 −　　標識　Ａｎｇ　ＩＩ　溶液、 −　　既知であり、かつ増加する濃度の　Ａｎｇ　ＩＩ
　標準を含有する溶液、 −　　必要な洗浄溶液、 −　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体溶液（この抗体は１
０％未満、好ましくは　５％未満の　Ａｎｇ　ＩＩ　と
交叉反応を示す）、および、適当であれば、

【００１９】−　　抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体溶液および
／または抗−　ヘキサペプチド（ＩＶ）抗体溶液および
／または抗−　ペンタペプチド（Ｖ）抗体溶液（これら
の抗体は１０％未満、好ましくは　５％未満のＡｎｇ　
ＩＩ　と交叉反応を示す）を具備する　Ａｎｇ　ＩＩ　
の特異的検定のためのキットでもある。Ａｎｇ　ＩＩが
酵素で標識されている場合には、このキットは、さらに
、 −　　この酵素の基質および、適当であれば、酵素の活
性を可視化するために必要な１種以上の試薬を含有する
溶液、 −　　酵素反応を停止させるための溶液、を有する。

【００２０】この検定キットに用いられる抗−　Ａｎｇ
　ＩＩ抗体は、ポリクロ−ン性であってもモノクロ−ン
性であってもよく、溶液もしくは固体支持体に結合した
状態で使用することもできる。固体支持体としては、チ
ュ−ブ、マイクロタイタ−プレ−トおよび磁性もしくは
他の粒子を挙げることができる。この発明によると、好
ましい抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体はモノクロ−ン性であり
、当業者に公知の方法により固体支持体に結合している
と好都合である。

【００２１】抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体は、ポリクロ
−ナル抗体であってもモノクロ−ナル抗体であってもよ
い。抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体、抗−　ヘキサペプチド（
ＩＶ）抗体および抗−　ペンタペプチド（Ｖ）抗体につ
いても同様である。

【００２２】使用される抗体が溶液の形態である場合に
は、検定しようとする試料中に存在し、対応する抗−　
ペプチド抗体によって捕獲される各々のペプチドの適切
な希釈が、検定に先立って決定される。また、この発明
の主題は、この発明による検定キットを用いる方法でも
ある。この方法は、下記工程を具備することを特徴とす
る。ａ）下記成分を含有する反応媒体を調製し、−　　検定
しようとする生物学的液体の抽出物、−　　抗−　Ａｎ
ｇ　ＩＩ抗体、 −　　標識　Ａｎｇ　ＩＩ　、 −　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体、 −　　および、適当であれば、抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体
および／または抗−ヘキサペプチド（ＩＶ）抗体および
／または抗−　ペンタペプチド（Ｖ）抗体ｂ）各々下記成分を含有する、検定に有用な反応媒体を
同時に調製し、 −　　Ａｎｇ　ＩＩ標準、 −　　抗　Ａｎｇ　ＩＩ　抗体、 −　　標識　Ａｎｇ　ＩＩ　、 −　　抗　Ａｎｇ　ＩＩＩ抗体、 −　　および、適当であれば、抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体
および／または抗−ヘキサペプチド（ＩＶ）抗体および
／または抗−　ペンタペプチド（Ｖ）抗体ｃ）これらの媒体を　４℃ないし室温で１２ないし７２
時間インキュベ−トし、ｄ）抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体に結合した　Ａｎｇ　ＩＩ
　を遊離　Ａｎｇ　ＩＩ　から分離し、ｅ）最後に、適切な方法により結果の読取りを行なう。好ましくは、この発明による方法は、血漿抽出物中の　
Ａｎｇ　ＩＩ　の特異的検定に用いられる。

【００２３】抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体が溶液の形態で用
いられる場合には、工程ａ）およびｂ）は、検定しよう
とする生物学的液体の抽出物または　Ａｎｇ　ＩＩ　標
準の２５ないし　５００μｌを下記成分を含有する媒体
と混合することにより行なう。 −　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体溶液　２５　ないし　５
００μｌ−　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体溶液　２５
　ないし　５００μｌ

【００２４】−　　適当であれば
、抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体溶液　２５　ないし　５００
μｌおよび／または抗−　ヘキサペプチド（ＩＶ）抗体
溶液　２５　ないし　５００μｌおよび／または抗−　
ペンタペプチド（Ｖ）抗体溶液　２５　ないし　５００
μｌ、および −　　標識　Ａｎｇ　ＩＩ　溶液　２５　ないし　５０
０μｌ適当であれば、標識　Ａｎｇ　ＩＩ　溶液を添加
する前に、　３ないし２４時間のプレインキュベ−ショ
ンを行なうことができる。工程ｄ）は、通常用いられて
いる下記方法のいずれかにより行なうことができる。

【００２５】使用する抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体が属し、
それ自体が固相（例えば、チュ−ブ、マイクロタイタ−
プレ−トまたは磁性もしくは他の粒子のような不溶性支
持体）上に不溶化されている、動物種の免疫グロブリン
に対する抗体を用いる免疫学的結合、または、ポリエチ
レングリコ−ルのような沈殿剤を用いる抗原−　抗体複
合体の物理化学的な沈殿、または、チャコ−ル　−デキ
ストラン複合体を用いる遊離抗原の分離（Ｊ．ＮＵＳＳ
ＢＥＲＧＥＲら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．　、
１９８４、１０３　（２）　、３０４−３１２　）。

【００２６】抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体が固体支持体に結
合している場合には、この発明による方法の他の態様に
従い、反応媒体の調製（工程ａ）およびｂ））をこの支
持体の存在下で行なう。例えば、その内部において下記
成分が混合される、抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体を固相化し
たチュ−ブを用いることができる。 −　　検定しようとする生物学的液体の抽出物または　
Ａｎｇ　ＩＩ　標準の　２５　ないし　５００μｌ、−
　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体溶液　２５　ないし　
５００μｌ、

【００２７】−　　適当であれば、抗−　
Ａｎｇ　Ｉ　抗体溶液　２５　ないし　５００μｌおよ
び／または抗−　ヘキサペプチド（ＩＶ）抗体溶液　２
５　ないし　５００μｌおよび／または抗−　ペンタペ
プチド（Ｖ）抗体溶液　２５　ないし　５００μ／ｌ、
−　　標識　Ａｎｇ　ＩＩ　溶液　２５　ないし　５０
０μ。

【００２８】この発明による方法のこの態様に従うと、
反応媒体からインキュベ−ション溶液を吸引し、次いで
洗浄して、固体支持体に固相化された抗体と結合してい
ないＡｎｇ　ＩＩ　を除去するためにさらに吸引するこ
とにより分離（工程ｄ））が行われる。

【００２９】通常のチュ−ブもしくは容器中で上述の混
合物を調製し、抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体を、抗−　Ａｎ
ｇ　ＩＩ抗体が結合した磁性もしくは他の粒子の形態で
添加することもできる。この場合、分離（工程ｄ））は
、上記と同様の原理ではあるが、粒子の保持を可能にす
る方法（遠心、ろ過、磁性粒子が含まれる場合には磁石
の使用）を適用することにより行なわれる。

【００３０】次いで、全ての場合において、検定しよう
とする　Ａｎｇ　ＩＩを結合する抗−　ＡｎｇＩＩ抗体
を含み、もしくはこの抗体が結合している固相に適用さ
れる読取り工程ｅ）が直接行なわれる。一般に、この読
取り工程は、Ａｎｇ　ＩＩに用いられる標識方法に依存
する。すなわち、−　　放射性標識が用いられた場合に
は放射活性の測定、または、 −　　蛍光もしくは発光標識あるいは酵素標識（使用さ
れる酵素および基質の性質に依存する）が用いられた場
合には、吸光もしくは光放射の測定、のいずれかが行な
われる。以下の記載および特許請求の範囲において、ア
ミノ酸の名称はＩＵＰＡＣ推奨の略称を用いる。加えて
、下記の略称を用いる。ＢＯＰ：ベンゾトリアゾリロキシトリス（ジメチルアミ
ノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェ−トＢｏｃ：
　ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルＭｏｂ：　ｐａｒａ−
メトキシベンジルＤＣＢ：２，６−ジクロロベンジルＴｏｓ：トシルＭＡｂ：モノクロ−ナル抗体ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンＢＧＧ：ウシγ−　グロブリンｃｐｍ：カウント／分ＰＥＧ：ポリエチレングリコ−ルＬＰＨ：カブトガニ・ヘモシアニンＳｕｌｐｈｏ−ＭＢＳ：Ｎ−（３−マレイミドベンゾイ
ロキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩Ｂｏ：非標識　Ａｎｇ　ＩＩ　もしくは非標識　Ａｎｇ
　ＩＩＩの非存在下における（標識Ａｎｇ　ＩＩ　）−
　抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体複合体の濃度Ｂ：非標識　Ａｎｇ　ＩＩ　もしくは非標識　Ａｎｇ　
ＩＩＩの各濃度に対する（標識Ａｎｇ　ＩＩ　）−　抗
−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体複合対の濃度最後に、この発明の
別の主題は、抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体の調製にある
。

【００３１】抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体は、動物を免疫原
を用いて免疫することによる通常の方法で調製される。この免疫原は、修飾タンパク質もしくは担体タンパク質
に結合したペプチド誘導体からなる（Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓ
ｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏ．　、１９７２、１１３　、７５
１−７５７　参照）。この方法に用いることが可能な動
物の例としては、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラットおよび
マウスを挙げることができる。モノクロ−ナル抗体は、
当業者に良く知られた　Ｋｏｈｌｅｒ　および　Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ　の方法により得られる。同様の方法で、抗
−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体、抗−　ヘキサペプチド（ＩＶ）
抗体および抗−　ペンタペプチド（Ｖ）抗体を調製する
ことができる。低分子量の分子（ハプテン）に関する免
疫における担体タンパク質の使用は、動物体内に誘導さ
れる特異的な抗−　ハプテン抗体の形成を可能にする。

【００３２】現時点で、最も広く用いられている担体タ
ンパク質は、動物起源のアルブミンである（市販され、
安定であり、高い免疫原性を有する）。タンパク質−　
ペプチド結合体の合成は、ペプチドのチオ基および、予
め　ｓｕｌｐｈｏ−ＭＢＳとの反応により導入されたタ
ンパク質のマレイミド基の間のチオエ−テル型共有結合
の形成により行なわれる。この発明によると、抗−　Ａ
ｎｇ　ＩＩ抗体を調製するための免疫原として選択され
るペプチド誘導体は、下記式に対応する。　　　　　　　　Ｈ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ
−Ｈｉｓ−Ｒ１　−　Ｒ２　−Ｃｙｓ−　ＮＨ２　　　
　　　　（ＶＩ）ここで、

【００３３】−　　Ｒ１　は直接的な結合または１つも
しくは２つの天然アミノ酸を含む鎖状結合（ｃｈａｉｎ
−ｌｉｎｋ）を示す。好ましくは、Ｒ１　は　−Ｐｒｏ
−もしくは他の天然アミノ酸に結合する　−Ｐｒｏ−を
表わす。 −　　Ｒ２　は式　−ＮＨ−（ＣＨ２　）ｎ　−ＣＯ−
の基を表わし、ここでｎは１ないし９であり、好ましく
はｎは５である。

【００３４】したがって、この発明によると、好ましい
抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ抗体は、担体タンパク質に結合し
たペプチド（ＶＩ）からなる免疫原を用いて動物を免疫
することにより得られる抗血清である。特に好ましいも
のは、下記式で表わされるペプチドからなる免疫原を用
いて得られた抗血清である。Ｈ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｒ’１
　−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−　ＮＨ２

【００３５】ここで、Ｒ
’１　は　−Ｐｒｏ−もしくは他のアミノ酸に結合する
　Ｐｒｏ−　を表わし、およびＡｈｘ　は６−アミノヘ
キサノン酸残基を表わす。このペプチドは、　ｓｕｌｐ
ｈｏ−ＭＢＳで修飾されたウシ血清アルブミンによって
担持されている。動物がウサギである場合には、これに
より得られる抗血清は　１％未満の　Ａｎｇ　ＩＩ　と
交叉反応を示す。同様に、この発明によると、抗−　Ａ
ｎｇ　Ｉ　抗体を調製するための免疫原として選択され
るペプチド誘導体は下記式に対応する。　　　　Ｈ−Ｃｙｓ−Ｒ２　−　Ｒ３　−Ａｒｇ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−ＯＨ　　　（ＶＩＩ）ここで、

【００３６】−　　Ｒ３　は直接的な結合、または１つ
もしくは２つの天然アミノ酸を含む鎖状結合を示す。好
ましくは、Ｒ３　は、Ａｓｐ　もしくは他の天然アミノ
酸に結合するＡｓｐを表わす。 −　　Ｒ２　は上述の式（ＶＩ）と同様の意味を有する
。この発明によると、抗−　ヘキサペプチド抗体を調製
するための免疫原として選択されるペプチド誘導体は下
記式に対応する。　　　　　　　　Ｈ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ
−Ｒ１　−　Ｒ２　−Ｃｙｓ−　ＮＨ２　　　　　　　
　　　　（ＶＩＩＩ）ここで、Ｒ１　およびＲ２　は上
述の式（ＶＩ）と同様の意味を有する。最後に、この発
明によると、抗−　ペンタペプチド抗体を調製するため
の免疫原として選択されるペプチド誘導体は下記式に対
応する。　　　　　　　　Ｈ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｒ１　
−　Ｒ２　−Ｃｙｓ−　ＮＨ２　　　　　　　　　　　
　　　　（ＩＸ）ここで、Ｒ１　およびＲ２　は上述の
式（ＶＩ）と同様の意味を有する。

【００３７】Ｒ１　、Ｒ’１　およびＲ３　の定義にお
いて、他の天然アミノ酸を、Ａｌａ　、Ｖａｌ　、Ｌｅ
ｕ　、Ｉｌｅ　、Ｐｒｏ　、Ｐｈｅ　、Ｔｒｐ　、Ｍｅ
ｔ　、Ｓｅｒ　、Ｔｈｒ　、Ｃｙｓ　および　Ｔｒｙか
ら選択することができる。

【００３８】したがって、この発明によると、これらの
抗体は、式　（ＶＩＩ）で表わされるペプチド誘導体ま
たは下記式で表わされるペプチド誘導体を用いて動物を
免疫することにより得られる。Ｈ−　Ｘ１　−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−　Ｒ１　−　
Ｒ２　−　ＮＨ２ここで、

【００３９】−　　Ｒ１　は直接的な結合、または１つ
もしくは２つの天然アミノ酸を有する鎖状結合を示す。好ましくは、Ｒ１　は　−Ｐｒｏ−もしくは他のアミノ
酸に結合する　−Ｐｒｏ−を表わす。 −　　Ｒ２　は式　−ＮＨ−（ＣＨ２　）ｎ　−ＣＯ−
で表わされる基を表わし、ここでｎは１ないし９である
。好ましくはｎは５である。この式で表わされるペプチ
ド誘導体は、Ｘ１　が直接的な結合である場合には、抗
体がペンタペプチドに対して特異的であり、Ｘ１　がバ
リン残基である場合には、抗体がヘキサペプチドに対し
て特異的であり、Ｘ１　がジペプチド　Ａｒｇ−Ｖａｌ
残基である場合には、抗体がアンギオテンシンＩＩＩ　
に特異的であることを特徴とする。この発明による抗体
は、１０％未満、好ましくは　５％未満の　Ａｎｇ　Ｉ
Ｉ　との交叉反応を示す。この発明による抗体を製造す
るために用いられる上記ペプチド誘導体は、この発明の
他の主題を構成する。以下、この発明を下記例を用いて
より詳細に説明する。例１抗ＡｎｇＩＩＩの調製Ａ）ペプチド（ＶＩ）（Ｒ１　＝Ｐｒｏ　，Ｒ２　＝Ａ
ｈｘ　）の調製化合物ＶＩを、ペプチド化学で知られて
いる方法を用いて固相において合成した。

【００４０】使用した固相は、１グラムあたり０．０４
ミリモルのレベルに官能化された４−メチルベンズヒド
リルアミン樹脂である。続けて行われるアミノ酸の縮合
は、ＢＯＰ　試薬を用いて行われる。α−アミノ官能基
は、Ｂｏｃ　基により一時的に保護され、トリフルオロ
酢酸／ジクロロエタン／エタンジチオール（３５：７０
：５　ｖ／ｖ／ｖ）溶液により脱保護される。異なるア
ミノ酸の側鎖は、適当な基によって保護される（Ｃｙｓ
に対してはＭｏｂ　、Ｈｉｓ　に対してはＢｏｃ　、Ｔ
ｙｒ　に対してはＤＣＢ　、Ａｒｇ　に対してはＴｏｓ
　）。

【００４１】合成した後、このペプチドを、アニソール
を１０％含有するフッ化水素酸を、０℃で１時間作用さ
せることにより、前記樹脂から脱保護及び分離する。次
いで、このペプチドを、エーテルにより沈殿させ、アセ
トニトリル／水／トリフルオロ酢酸（６０：４０：０．
１　ｖ／ｖ／ｖ）溶液に溶解し、凍結乾燥する。精製は
、液体クロマトグラフで、減圧下逆相カラムにより行な
う。種々の分析結果は、ペプチド（ＶＩ）の期待された
構造に一致する。Ｂ）　　修飾タンパク質の調製（ＬＥＲＮＥＲ，Ｒ．Ａ
．ｅｔ　ａｌ．（１９８１）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　
Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７８，３４０３−３４
０７）ペプチド（ＶＩ）を結合するために選択されたタ
ンパク質は、スルフォ−ＭＢＳ　　（ｓｕｌｐｈｏ−Ｍ
ＢＳ）との反応により修飾されたウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）である。

【００４２】固体スルフォ−ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）　
２２．４ｍｇを、　ＢＳＡの０．０５Ｍリン酸カルシウ
ム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ含有）４ｍｌ　に加える。この溶液は、結果として、
８０　ＭＢＳ／ＢＳＡ当量の化学量論に等しい。この反
応は、１時間、室温でゆっくり撹拌しながら続行させ、
次いで、混合物を、４℃で１８時間、０．１　Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）２リットルに対して透析する。

【００４３】置換度の測定は、１４Ｃで放射性ラベル（
ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ）　されたシステインとの
反応によって導入されたマレイミド基の数を測定するこ
とにより行われる。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び１４Ｃが添加
されている２０ｍＭシステインからなる溶液（最終的な
システイン濃度３ｋＢｑ／ｕｍｏｌ）０．０５ｍｌを、
反応媒体０．４　ｍｌに添加する。１時間３０分３０℃
でインキュベートした後、反応媒体を適当な条件下でク
ロマトグラフカラムにより濾過する。放射活性の測定に
より、観察された修飾度を計算することが可能になる。ここで観察された修飾度は、ＢＳＡ　１ｍｏｌ　あたり
１１のマレイミド基である。Ｃ）　　ペプチド（ＶＩ）の結合

【００４４】上記調製したペプチド（ＶＩ）５　　を蒸
留水０．２５ｍｌに溶解する。この溶液を、室温で３時
間、及び４℃で１８時間インキュベートし、次いで、０
．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）　に対して幾つか
の広範な透析を行う。

【００４５】放射性ラベルされたシステインを用いた試
験を、前記ペプチドに結合した後のタンパク質に対して
行う。未修飾のマレイミド基の数を測定することにより
、ＢＳＡ　１モルあたり７モルのペプチド（ＶＩ）の置
換度の違いで示される。

【００４６】キャリアータンパク質として、リムルス　
　ポリフェムス　　ヘモシアニン（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐ
ｏｌｙｐｈｅｍｕｓ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＬＰＨ
）　、ヒト　　トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒ
ｉｎ）を用いた、その他２つの免疫原性結合体を、同様
の条件下で製造した。Ｄ）　　抗　ＡｎｇＩＩＩ　抗体（または抗血清）の調
製

【００４７】使用した動物は、ニュージーランド産ウ
サギである。一次免疫は、フロイント完全アジュバント
の存在下で、免疫原１　　を皮内に注射することからな
る。ブースターは、１か月の間隔で、フロイント完全アジュ
バントの存在下で同量の免疫原によって皮下にて行なわ
れる。Ｅ）　　抗　ＡｎｇＩＩＩ　血清の力価の測定

【００４
８】ウサギ血清の０．１　Ｍイミダゾール−ＨＣｌ　緩
衝液（ｐＨ７．４　）＋０．２　％　ＢＳＡ稀釈液１０
０ｕｌを、７４　ＴＢｑ／ｍｍｏｌ　の特異的検定を有
し、５０００ｃｐｍ　を呈する、ヨウ素１２５　でラベ
ルされた　ＡｎｇＩＩＩ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　の存
在下でインキュベートする。

【００４９】遊離の　ＡｎｇＩＩＩ　から抗体に結合し
た　ＡｎｇＩＩＩの分離を、２０％ポリエチレングリコ
ール６０００（ＰＥＧ）　１　ｍｌ、および、血清グロ
ブリン溶液（１０ｇ／ｍｌ）　１００ｕｌを添加して行
う。遠心分離した後、抗体に結合した　ＡｎｇＩＩＩ　
に対応するペレットの放射活性を測定する。ここで使用
した技術は、グリーンウッド（ＧＲＥＥＮＷＯＯＤ），
Ｆ．Ｃ．らにより開示されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ
．，１９６３，８９，１１４−１１８）　。ウサギ血清
は、ヨウ素１２５でラベルされた　ＡｎｇＩＩＩ　のう
ちせいぜい６０％に結合する。Ｆ）　　抗　ＡｎｇＩＩ
Ｉ　血清の免疫学的特徴づけａ）　　ＡｎｇＩＩＩについて調製された血清の免疫活
性の評価

【００５０】抗　ＡｎｇＩＩＩ　抗血清の稀釈
溶液　１００ｕｌ（ヨウ素化ＡｎｇＩＩＩへの結合の約
５０％に対応する）を、冷却されたＡｎｇＩＩＩ５０ｕ
ｌおよび５０００ｃｐｍ　を呈するヨウ素化ＡｎｇＩＩ
Ｉ　５０ｕｌの存在下で、４℃で１８時間インキュベー
トする。結合した　ＡｎｇＩＩＩ　と遊離の　ＡｎｇＩ
ＩＩ　との分離を、ポリエチレングリコール沈殿により
行う。ヨウ素化ＡｎｇＩＩＩ抗体の結合が、ＡｎｇＩＩ
Ｉ　２５０ｐｇを添加することにより５０％置換される
。これゆえ、この抗体は、ＡｎｇＩＩＩを認識する。ｂ）　　抗ＡｎｇＩＩＩ抗体のＡｎｇＩ及びＡｎｇＩＩ
　との交叉反応抗ＡｎｇＩＩＩ抗体の交叉反応を、Ａｎ
ｇＩ及び　ＡｎｇＩＩについて測定した。百分率は、い
ずれのペプチドにおいても１％よりも小さい。抗Ａｎｇ
ＩＩＩ抗体は、抗血清中で得られたままで使用すること
もできるし、また、タンパク質Ａ−セファロースで精製
した後に使用することもできる。例２抗ＡｎｇＩＩ　モノクローナル抗体４Ｄ８　及びヨウ素
化ＡｎｇＩＩの存在下での上記の抗ＡｎｇＩＩＩ抗体に
よるＡｎｇＩＩＩの捕獲能力

【００５１】抗体４Ｄ８　
はマウスの免疫グロブリンである。（会議録“Ｔｈｅ　
Ｒｅｎｉｎ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　
ａｓ　ａ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｔａｒｇｅｔ”，
Ｂａｓｌｅ，２９−３１　Ｏｃｔｏｒｂｅｒ　１９８９
　ａ　ＳＡＮＯＦＩ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　に
開示されている。）以下のものを含有する溶液を調製す
る。：−　　例１で得たウサギ抗ＡｎｇＩＩＩ抗体溶液
　１００ｕｌ−　　ＡｎｇＩＩＩ溶液５０ｕｌ、 −　　ヨウ素化ＡｎｇＩＩ　溶液（比活性７４ＴＢｑ／
ｍｍｏｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、４０００ｃｐｍ　を呈
する）５０ｕｌ、−　　ヨウ素化ＡｎｇＩＩ　を３０％
だけ結合させるように稀釈した抗ＡｎｇＩＩ　抗体（４
Ｄ８）溶液１００ｕｌ　。

【００５２】反応容量を、培養用緩衝液、すなわち、Ｂ
ＳＡ　を０．２　％含有するイミダゾ−ル−ＨＣｌ　緩
衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．４）　で４００　ｕｌまで補
う。１８時間、４℃でインキュベートを行う。

【００５３】マウスの免疫グロブリンに対する抗体で固
相化された磁性粒子（Ａｍｅｒｌｅｘ　Ｍ，Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ社販売）の懸濁液５００ｕｌ　を添加する。１５
分間、インキュベートを行い、次いで、磁性粒子を、磁
石を使用して反応媒体から分離し、磁性粒子相に含有さ
れる放射活性を測定する。測定系は、ＡｎｇＩＩＩの量を１試験あたり０　から４
０ｐｇまで変更しながら行った。コントロール試験は、
抗ＡｎｇＩＩＩ抗体なしで行った。放射活性の測定は、
その結果を、各ＡｎｇＩＩＩ量に対する（ヨウ素化Ａｎ
ｇＩＩ）−抗ＡｎｇＩＩ　抗体複合体の濃度比Ｂ／Ｂｏ
として表すことができる。これらの結果を、表１に記録
する。

【００５４】

【表１】

【００５５】表１の結果により示される如く、抗体４Ｄ
８　へのヨウ素化ＡｎｇＩＩ　の結合は、ＡｎｇＩＩＩ
の添加により減少する。この結合は、抗ＡｎｇＩＩＩ抗
体の存在により完全に回復する。さらに、この実験にお
いて、用いられた濃度で抗ＡｎｇＩＩＩ抗体を反応媒体
に添加することは、ＡｎｇＩＩ　と抗ＡｎｇＩＩ　抗体
との反応に影響しないことが証明された。例３抗ＡｎｇＩＩＩ抗体の存在下でのＡｎｇＩＩ　の特異的
検定上記態様の一つに従って、本実施例で使用したキッ
トは、固体支持体に結合した抗ＡｎｇＩＩ　モノクロー
ナル抗体からなる。さらに正確には、この抗体は、試験
管（スターチューブ（ＳｔａｒｔｕｂｅＲ　）、ＮＵＮ
Ｃ販売）の壁に結合されている。さらに、このキットは
以下の要素からなる。−　　３０％のヨウ素化ＡｎｇＩ
Ｉ　が結合するように抗ＡｎｇＩＩ　モノクローナル抗
体　４Ｄ８で固相化されたＮＵＮＣ　　スターチューブ
。−　　ＡｎｇＩＩ　国際標準で校正した検量用のＡｎ
ｇＩＩ　溶液、バッチ８６／５３８（メディカル・リサ
ーチ・カウンシル（ｔｈｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ）社製）。 −　　ヨウ素１２５　でラベルされた、例２で規定した
活性を有するＡｎｇＩＩ　溶液。 −　　上記例１で調製され、かつ１試験あたり少なくと
も１０ｐｇのＡｎｇＩＩＩが捕獲されるように稀釈され
たウサギ抗ＡｎｇＩＩＩポリクローナル抗体の溶液。こ
の検定を、０．２　％ＢＳＡ　を含有するイミダゾール
−ＨＣｌ　緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．４）中で行う。最終的な反応容量は、２５０　ｕｌである。ａ）　　ＡｎｇＩＩＩ１０ｐｇの存在下での検量線

【０
０５６】ウサギ抗ＡｎｇＩＩＩポリクローナル抗体１０
０ｕｌ　を、ＡｎｇＩＩＩ溶液５０ｕｌ（ＡｎｇＩＩＩ
１０ｐｇに対応する）、ＡｎｇＩＩ　標準の溶液５０ｕ
ｌおよびヨウ素化ＡｎｇＩＩ　の溶液５０ｕｌ（４００
０ｃｐｍ）と共に、モノクローナル抗体４Ｄ８で固相化
された試験管中で、１８時間＋４℃でインキュベートす
る。

【００５７】インキュベーション媒体を吸引し、イミダ
ゾール−ＨＣｌ　緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．４）１ｍ
ｌ　で洗浄した後、乾燥した試験管中で放射活性を測定
する。この放射活性は、抗ＡｎｇＩＩ　抗体−ヨウ素化
ＡｎｇＩＩ　複合体のものである。

【００５８】検量系は、ＡｎｇＩＩ　の量を１試験あた
り０　〜４０ｐｇに変更して調製した。この放射活性の
測定は、その結果を、各ＡｎｇＩＩ　量（第１列）に対
する（ヨウ素化　ＡｎｇＩＩ）−抗ＡｎｇＩＩ　抗体複
合体の濃度比Ｂ／Ｂｏとして表すことができる。Ａｎｇ
ＩＩＩ　１０ｐｇ　を、検量線に対応する試験ごとに添
加し（第２列）、抗ＡｎｇＩＩ　抗体と存在するＡｎｇ
ＩＩＩとの交叉反応によるＢ／Ｂｏ比の低下を観察する
。最後に、実験の第３の系（第３列）においては、Ａｎ
ｇＩＩＩおよび抗ＡｎｇＩＩＩ抗体を、検量線に対応す
る各試験ごとに添加する。この結果を、以下の表２に記録する。

【００５９】

【表２】抗ＡｎｇＩＩＩ抗体の存在により、反応媒体中でＡｎｇ
ＩＩＩが特異的に捕獲される結果、検量線の値を回復す
ることができることが確認される。さらに、例２と同様
に、用いられた濃度で抗ＡｎｇＩＩＩ抗体を添加するこ
とは、ＡｎｇＩＩ　の検量線に影響しないことが証明さ
れた。ｂ）　　血漿からのＡｎｇＩＩ　の特異的検定

【００６
０】実際上の検定は、ヒト血漿抽出物において行う。こ
の抽出物は、Ｊ．ナッスベルガー（Ｊ．ＮＵＳＳＢＥＲ
ＧＥＲ　　）らによりＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，１９
８５　（参考文献）に開示された技術に従って得られ、
次いで濃縮される。

【００６１】ウサギの抗ＡｎｇＩＩＩポリクローナル抗
体１００ｕｌ　を、ＡｎｇＩＩ　標準、または、検定を
受けた血漿抽出物の溶液１００ｕｌ　、及び、ヨウ素化
ＡｎｇＩＩ　溶液５０ｕｌ（４０００ｃｐｍ）　と共に
、モノクローナル抗体４Ｄ８　で固相化された試験管中
、１８時間＋４℃でインキュベートする。放射活性は、
例３ａ）と同様に、培養溶媒を吸引した後、乾燥した試
験管中で測定する。

【００６２】抗ＡｎｇＩＩＩ抗体なしでＡｎｇＩＩ　を
測定すると、ＡｎｇＩＩ　は、この試験において見かけ
の量８１ｐｇで測定されるが、抗ＡｎｇＩＩＩ抗体の存
在下では、この試験において、ＡｎｇＩＩ　は５７ｐｇ
しか測定されない。この差は、抗ＡｎｇＩＩＩ抗体によ
り免疫捕獲された、大量の抗ＡｎｇＩＩＩが消滅した結
果である。

【００６３】このことから、この場合にＡｎｇＩＩＩの
存在により、抗ＡｎｇＩＩ　抗体（４Ｄ８）を用いて行
われたＡｎｇＩＩ　の直接測定において、この抗体とＡ
ｎｇＩＩＩの間の交叉反応の結果、（８１−５７）／５
７（４２％と同等である）の誤差になることが推察され
る。この誤差は、抗ＡｎｇＩＩＩ抗体を併用することに
より無くすことができる。このことは本発明の課題の一
つである。例４抗ＡｎｇＩ抗体の調製ペプチド（ＶＩＩ）　（Ｒ２　＝Ａｈｘ，Ｒ３　＝Ａｓ
ｐ）を調製し、次いで、例１で開示した方法に従った免
疫によりウサギの抗血清を調製する。例５抗ヘキサペプチド抗体の調製ペプチド（ＶＩＩＩ）（Ｒ１　＝Ｐｒｏ，Ｒ２　＝Ａｈ
ｘ　）を、例１の工程Ａで開示した方法を用いて調製す
る。次いで、この抗体（ウサギ抗血清）を、例１の工程
Ｂ，ＣおよびＤで開示した方法を用いて調製し、その後
特徴づける。例６抗ペンタペプチド抗体の調製

【００６４】先の例と同様の手順で、ペプチド（ＩＸ）
　（Ｒ１　＝Ｐｒｏ，Ｒ２　＝Ａｈｘ　）を調製し、次
いで、ウサギ抗血清を、例１で開示した方法を用いた免
疫により調製し、その後、特徴づける。例７抗ＡｎｇＩＩ　４Ｄ８　およびヨウ素化ＡｎｇＩＩ　の
存在下での例４で調製した抗ペンタペプチド抗体による
ペンタペプチドの捕獲能力以下のものを含有する溶液を
調製し、例３に従って抗体で固相化された試験管に移す
。：−　　例５で調製した、抗ペンタペプチド抗体の溶
液　１００ｕｌ −　　ペンタペプチド溶液５０ｕｌ −　　ヨウ素化ＡｎｇＩＩ　溶液（比活性７４ＴＢｑ／
ｍｍｏｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、４０００ｃｐｍ　を呈
する）５０ｕｌ。

【００６５】抗ペンタペプチド抗体を、最終的に１／２
５に稀釈する。１８時間、４℃でインキュベートを行う
。インキュベーション媒体を吸引し、イミダゾール−ＨＣ
ｌ　緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）　１ｍｌ　で洗浄
した後、乾燥した試験管中で放射活性を測定する。この
放射活性は、抗ＡｎｇＩＩ　抗体−ヨウ素化ＡｎｇＩＩ
　複合体のものである。次いで、例２と同様の手順で、
以下の表３に記録した結果を得た。：

【００６６】

【表３】例８抗ＡｎｇＩＩ　抗体及び抗ペンタペプチド抗体の存在下
でのＡｎｇＩＩ　の特異的検定上記態様のうちの一つに
従って、この例で使用したキットは、固体支持体に結合
した抗ＡｎｇＩＩ　モノクローナル抗体からなる。さら
に正確には、この抗体は、試験管（スターチューブ（Ｓ
ｔａｒｔｕｂｅＲ）、ＮＵＮＣ販売）の壁に結合されて
いる。さらに、このキットは以下の要素からなる。 −　　３０％のヨウ素化ＡｎｇＩＩ　が結合するように
抗ＡｎｇＩＩ　モノクローナル抗体　４Ｄ８で固相化さ
れたＮＵＮＣ　　スターチューブ、 −　　ＡｎｇＩＩ　国際標準で校正された、検量用のＡ
ｎｇＩＩ　溶液、バッチ８６／５３８（メディカル・リ
サーチ・カウンシル社製）。 −　　ヨウ素１２５　でラベルされ、例２で規定した活
性を有するＡｎｇＩＩ　溶液。 −　　上記例１で調製され、かつ１試験あたり少なくと
も１０ｐｇのＡｎｇＩＩＩが捕獲されるように稀釈され
たウサギ抗ＡｎｇＩＩＩポリクローナル抗体の溶液。 −　　例５で調製された、１試験あたり少なくとも１０
ｐｇのペンタペプチドが捕獲されるようなウサギ抗ペン
タペプチド（ｐｅｐｔａｐｅｐｔｉｄｅ）　ポリクロー
ナル溶液。検定は　０．２％のＢＳＡ　を含有するイミ
ダゾール−ＨＣｌ緩衝液（１．０Ｍ；　ｐＨ７．４）中
で行う。最終的な反応容量は、２５０ｕｌ　である。こ
の検量線を、ＡｎｇＩＩＩ　４ｐｇ及びペンタペプチド
　４ｐｇの存在下で作成した。

【００６７】ウサギ抗ＡｎｇＩＩＩポリクローナル抗体
および抗ペンタペプチド抗体の溶液１００ｕｌを、Ａｎ
ｇＩＩＩおよびペンタペプチドの溶液５０ｕｌ（各ペプ
チド　４ｐｇに対応する）、ＡｎｇＩＩ　標準の溶液５
０ｕｌ及びヨウ素化ＡｎｇＩＩ　溶液５０ｕｌ（４００
０ｃｐｍ）　と共に、モノクローナル抗体　４Ｄ８で固
相化された試験管内で、１８時間、＋４℃でインキュベ
ートする。

【００６８】インキュベーション媒体を吸引し、イミダ
ゾール−ＨＣｌ　緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．４）１ｍ
ｌ　で洗浄した後、放射活性を、乾燥した試験管中で測
定する。この放射活性は、抗ＡｎｇＩＩ　抗体−ヨウ素
化ＡｎｇＩＩ　複合体のものである。

【００６９】検量系は、ＡｎｇＩＩ　の量を１試験あた
り０　〜４０ｐｇに変更して調製した。この放射活性の
測定は、その結果を各ＡｎｇＩＩ量（第１列）に対する
（ヨウ素化　ＡｎｇＩＩ）−抗ＡｎｇＩＩ　抗体複合体
の濃度比Ｂ／Ｂｏとして表すことができる。

【００７０】ＡｎｇＩＩＩ　　４ｐｇ及びペンタペプチ
ド４ｐｇを、検量線に対応する試験（第２列）ごとに添
加し、抗ＡｎｇＩＩ　抗体と存在するＡｎｇＩＩＩとの
交叉反応によるＢ／Ｂｏ比の低下を観察する。

【００７１】最後に、実験の第３の系（第３列）におい
ては、ＡｎｇＩＩＩ４ｐｇ、ペンタペプチド４ｐｇおよ
び抗ＡｎｇＩＩＩ抗体並びに抗ペンタペプチド抗体を、
検量線に対応する各試験ごとに添加する。この結果を、
以下の表４に記録する。

【００７２】

【表４】

【００７３】抗ＡｎｇＩＩＩ抗体および抗ペンタペプチ
ド抗体の存在により、反応媒体中でＡｎｇＩＩＩおよび
ペンタペプチドが特異的に捕獲される結果、検量線の値
を回復できることが確認される。さらに、例２と同様に
、用いられた濃度で抗ＡｎｇＩＩＩ抗体および抗ペンタ
ペプチド抗体を添加することは、ＡｎｇＩＩ　の検量線
に影響しないことが証明された。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　アンギオテンシンＩＩの特異的検定の
ためのキットであって、抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体、標識
　Ａｎｇ　ＩＩ　溶液、既知であり、かつ増加する濃度
の　Ａｎｇ　ＩＩ　標準を含有する溶液、必要な洗浄溶
液、１０％未満、好ましくは　５％未満の　Ａｎｇ　Ｉ
Ｉ　との交叉反応を示す抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体の
溶液、および、適当であれば、各々の抗体が１０％未満
、好ましくは　５％未満の　Ａｎｇ　ＩＩ　と交叉反応
を示す、抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体溶液および／または抗
−　ヘキサペプチド抗体溶液および／または抗−　ペン
タペプチド抗体溶液、を具備するキット。
【請求項２】　　Ａｎｇ　ＩＩが酵素で標識されている
ことを特徴とする請求項１記載のキット。
【請求項３】　　Ａｎｇ　ＩＩを標識する酵素の基質を
含有する溶液および、適当であれば、酵素活性を可視化
するための１種以上の試薬および酵素反応を停止させる
ための溶液をさらに具備することを特徴とする請求項１
または２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４】　　Ａｎｇ　ＩＩが蛍光化合物、または発
光化合物、または放射性元素のいずれかで標識されてい
ることを特徴とする請求項１記載のキット。
【請求項５】　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体がモノクロ−
ン性またはポリクロ−ン性である請求項１ないし４のい
ずれか１項に記載のキット。
【請求項６】　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体が溶液の形態
にあることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１
項に記載のキット。
【請求項７】　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体が固体支持体
に結合していることを特徴とする請求項１ないし６に記
載のキット。
【請求項８】　　前記固体支持体が、チュ−ブ、マイク
ロタイタ−プレ−ト、または磁性もしくは他の粒子であ
ることを特徴とする請求項７記載のキット。
【請求項９】　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体、抗−　
Ａｎｇ　Ｉ　抗体、抗−　ペンタペプチド抗体、および
抗−　ヘキサペプチド抗体がモノクロ−ナル抗体または
ポリクロ−ナル抗体であることを特徴とする請求項１ま
たは２に記載のキット。
【請求項１０】　　各抗体がポリクロ−ン性であり、か
つウサギ抗血清由来であることを特徴とする請求項９記
載のキット。
【請求項１１】　　下記式で表わされ、担体タンパク質
に結合しているペプチド誘導体を用いて動物を免疫する
ことにより得られる抗体。Ｈ−　Ｘ１　−Ｔｙｒ−Ｉｌ
ｅ−Ｈｉｓ−　Ｒ１　−　Ｒ２　−Ｃｙｓ−　ＮＨ２（
ここで、Ｒ１　は直接的な結合、または１つもしくは２
つの天然アミノ酸を有する鎖状結合を示し、Ｒ２　は式
　−ＮＨ−（ＣＨ２　）ｎ　−ＣＯ−で表わされる基で
あって、ｎは１ないし９であり、Ｘ１　は、調製される
抗血清の特異性により、直接的な結合、Ａｒｇ　または
　Ａｒｇ−Ｖａｌを表わす）
【請求項１２】　　アンギオテンシンＩＩＩ　に特異的
であり、かつ１０％未満、好ましくは　５％未満のアン
ギオテンシンＩＩとの交叉反応を示す請求項１１記載の
抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体。
【請求項１３】　　前記ペプチド誘導体が、　　　　　
　　　Ｈ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−
Ｒ１　−　Ｒ２　−Ｃｙｓ−　ＮＨ２　　　　　　　（
ＶＩ）（ここで、Ｒ１　は直接的な結合または１つもし
くは２つの天然アミノ酸を含む鎖状結合を示し、Ｒ２　
は式　−ＮＨ−（ＣＨ２　）ｎ　−ＣＯ−で表わされる
基であって、ｎは１ないし９である）であり、かつ担体
タンパク質に結合していることを特徴とする請求項１２
記載の抗−Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体。
【請求項１４】　　前記ペプチド誘導体が式Ｈ−Ａｒｇ
−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｒ’１　−Ａｈｘ
−Ｃｙｓ−　ＮＨ２（ここで、Ａｈｘ　は６−アミノヘ
キサノン酸残基を表わし、Ｒ’１　は　Ｐｒｏもしくは
他の天然アミノ酸に結合した　Ｐｒｏを表わす）に対応
し、かつ１０％未満、好ましくは　５％未満の　Ａｎｇ
　ＩＩ　との交叉反応を示すことを特徴とする請求項１
３記載の抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体。
【請求項１５】　　ウサギ抗血清であり、かつ　１％未
満の　Ａｎｇ　ＩＩとの交叉反応を示すことを特徴とす
る請求項１４記載の抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体。
【請求項１６】　　ペンタペプチド（Ｖ）に対して特異
的であり、かつ１０％未満のアンギオテンシンＩＩとの
交叉反応を示す請求項１１記載の抗−　ペンタペプチド
（Ｖ）抗体。
【請求項１７】　　前記ペプチド誘導体が、式　　　　
　　　　Ｈ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｒ１　−　Ｒ２
　−Ｃｙｓ−　ＮＨ２　　　　　　　　　　　　　　　
（ＩＸ）（ここで、Ｒ１　は直接的な結合または１つも
しくは２つの天然アミノ酸を含む鎖状結合を示し、Ｒ２
　は式　−ＮＨ−（ＣＨ２　）ｎ　−ＣＯ−で表わされ
る基であって、ｎは１ないし９である）であり、かつ担
体タンパク質に結合していることを特徴とする請求項１
６記載の抗−ペンタペプチド抗体。
【請求項１８】　　前記ペプチド誘導体が、式Ｈ−Ｔｙ
ｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｒ’１　−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−　Ｃ
Ｈ２（ここで、Ａｈｘ　は６−アミノヘキサノン酸残基
を表わし、Ｒ’１　は　Ｐｒｏもしくは他の天然アミノ
酸に結合した　Ｐｒｏを表わす）に対応し、かつ　１％
未満の　Ａｎｇ　ＩＩ　との交叉反応を示すことを特徴
とする請求項１７記載の抗−　ペンタペプチド（Ｖ）抗
体。
【請求項１９】　　ヘキサペプチド（ＩＶ）に対して特
異的であり、かつ１０％未満のアンギオテンシンＩＩと
の交叉反応を示す請求項１１記載の抗−　ヘキサペプチ
ド（ＩＶ）抗体。
【請求項２０】　　前記ペプチド誘導体が、式　　　　
　　　　Ｈ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｒ１　
−　Ｒ２　−Ｃｙｓ−　ＮＨ２　　　　　　　　　　　
（ＶＩＩＩ）（ここで、Ｒ１　は直接的な結合または１
つもしくは２つの天然アミノ酸を含む鎖状結合を示し、
Ｒ２　は式　−ＮＨ−（ＣＨ２　）ｎ　−ＣＯ−で表わ
される基であって、ｎは１ないし９である）であり、か
つ担体タンパク質に結合していることを特徴とする請求
項１９記載の抗−ヘキサペプチド（ＩＶ）抗体。
【請求項２１】　　前記ペプチド誘導体が、式Ｈ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｒ’１　−Ａｈｘ−Ｃｙ
ｓ−　ＮＨ２（ここで、Ａｈｘ　は６−アミノヘキサノ
ン酸残基を表わし、Ｒ’１　は　Ｐｒｏもしくは他の天
然アミノ酸に結合した　Ｐｒｏを表わす）に対応し、か
つ１０％未満、好ましくは　５％未満の　Ａｎｇ　ＩＩ
　との交叉反応を示すことを特徴とする請求項１１記載
の抗−　ヘキサペプチド（ＩＶ）抗体。
【請求項２２】　　Ａｎｇ　Ｉ　に対して特異的であり
、かつ１０％未満の　Ａｎｇ　ＩＩ　との交叉反応を示
す抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体。
【請求項２３】　　下記式で表わされ、担体タンパク質
に結合しているペプチド誘導体を用いて動物を免疫する
ことにより得られることを特徴とする請求項２２記載の
抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体。　　　　Ｈ−Ｃｙｓ−Ｒ２　−　Ｒ３　−Ａｒｇ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−ＯＨ　　　（ＶＩＩ）（ここで、Ｒ３　は直接的な結合、または１つもしくは
２つの天然アミノ酸を含む鎖状結合を示し、Ｒ２　は式
　−ＮＨ−（ＣＨ２　）ｎ　−ＣＯ−で表わされる基で
あって、ｎは１ないし３である）
【請求項２４】　　　　前記ペプチド誘導体が、式　　
　　　　　　Ｈ−Ｃｙｓ−Ａｈｘ−Ｒ’３　−Ａｒｇ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈ
ｉｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ここで、Ａｈｘ　は６−アミノヘキサノン酸残基を表
わし、Ｒ’３　は　Ａｓｐもしくは他の天然アミノ酸に
結合した　Ａｓｐを表わす）に対応し、かつ１０％未満
、好ましくは　５％未満の　Ａｎｇ　ＩＩ　との交叉反
応を示すことを特徴とする請求項２３記載の抗体。
【請求項２５】　　請求項１記載の検定キットを用いる
アンギオテンシンＩＩの検定方法であって、ａ）下記成
分を含有する反応媒体を調製する工程、−　　検定しよ
うとする生物学的液体の抽出物、−　　抗−　Ａｎｇ　
ＩＩ抗体、 −　　標識　Ａｎｇ　ＩＩ　、 −　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体、 −　　および、適当であれば、抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体
および／または抗−ペンタペプチド抗体および／または
抗−　ヘキサペプチド抗体ｂ）各々下記成分を含有する、検定に有用な反応媒体を
同時に調製する工程、 −　　Ａｎｇ　ＩＩ標準、 −　　抗　Ａｎｇ　ＩＩ　抗体、 −　　標識　Ａｎｇ　ＩＩ　、 −　　抗　Ａｎｇ　ＩＩＩ抗体、 −　　および、適当であれば、抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体
および／または抗−ペンタペプチド抗体および／または
抗−　ヘキサペプチド抗体ｃ）これらの媒体を　４℃ないし室温で１２ないし７２
時間インキュベ−トする工程、ｄ）抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体に結合した　Ａｎｇ　ＩＩ
　を遊離　Ａｎｇ　ＩＩ　から分離する工程、ｅ）最後に、適切な方法により結果の読取りを行なう工
程を具備する方法。
【請求項２６】　　検定しようとする生物学的液体の抽
出物または　Ａｎｇ　ＩＩ　標準の２５ないし　５００
μｌを、−　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体溶液　２５　な
いし　５００μｌ、−　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体
溶液　２５　ないし　５００μｌ、−　　適当であれば
、抗−　Ａｎｇ　Ｉ　抗体溶液　２５　ないし　５００
μｌおよび／または抗−　ペンタペプチド（Ｖ）抗体溶
液　２５　ないし　５００μｌおよび／または抗−　ヘ
キサペプチド（ＩＶ）抗体溶液　２５　ないし　５００
μｌ、および−　　標識　Ａｎｇ　ＩＩ　溶液　２５　
ないし　５００μｌ、を含有する媒体と混合することに
より工程ａ）およびｂ）を行なうことを特徴とする請求
項２５記載の方法。
【請求項２７】　　検定しようとする生物学的液体の抽
出物または　Ａｎｇ　ＩＩ　標準の２５ないし　５００
μｌを、−　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体溶液　２５　な
いし　５００μｌ、−　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体
溶液　２５　ないし　５００μｌ、および−　　標識　
Ａｎｇ　ＩＩ　溶液　２５　ないし　５００μｌ、を含
有する媒体と混合することにより工程ａ）およびｂ）を
行なうことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】　　工程ａ）およびｂ）を、抗−　Ａｎ
ｇ　ＩＩ抗体を固相化したチュ−ブを用いて、検定しよ
うとする生物学的液体の抽出物または　Ａｎｇ　ＩＩ　
標準の２５ないし　５００μｌを、 −　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩＩ　抗体溶液　２５　ないし
　５００μｌ、および−　　標識　Ａｎｇ　ＩＩ　溶液
　２５　ないし　５００μｌ、を含有する媒体と混合す
ることにより行ない、かつ工程ｄ）を、反応媒体からイ
ンキュベ−ション溶液を吸引し、次いで洗浄し、固体支
持体に結合した抗体と複合体を形成しない　Ａｎｇ　Ｉ
Ｉ　を除去するためにさらに吸引することにより行なう
ことを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２９】　　抗−　Ａｎｇ　ＩＩ抗体が、抗−　
Ａｎｇ　ＩＩ抗体が結合した、磁性もしくは他の粒子の
形態にあることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項３０】　　血漿抽出物に用いられることを特徴
とする請求項２５記載の方法。
【請求項３１】　　下記式で表わされるペプチド誘導体
。Ｈ−　Ｘ１　−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−　Ｒ１　−　
Ｒ２　−　ＮＨ２（ここで、Ｒ１　は直接的な結合、ま
たは１つもしくは２つの天然アミノ酸を有する鎖状結合
を示し、好ましくは、Ｒ１　は　−Ｐｒｏ−もしくは他
のアミノ酸に結合した−Ｐｒｏ−を表わし、Ｒ２　は式
　−ＮＨ−（ＣＨ２　）ｎ　−ＣＯ−で表わされる基を
表わし、ｎは１ないし９であって、好ましくはｎは５で
あり、Ｘ１　は直接的な結合、バリン残基またはジペプ
チド　Ａｒｇ−Ｖａｌ残基である）
【請求項３２】　　下記式で表わされるペプチド誘導体
。　　　　Ｈ−Ｃｙｓ−Ｒ２　−　Ｒ３　−Ａｒｇ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−ＯＨ　　　（ＶＩＩ）（ここで、Ｒ３　は直接的な結合または１つもしくは２
つの天然アミノ酸を含む鎖状結合であって、好ましくは
　Ａｓｐもしくは他の天然アミノ酸に結合した　Ａｓｐ
を表わし、Ｒ２　は式　−ＮＨ−（ＣＨ２　）ｎ　−Ｃ
Ｏ−で表わされる基であって、ｎは１ないし９、好まし
くは５である）