JP2014520825A - モノクローナル抗体に対して特異的なβ−アミロイドx−37およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
材料と方法
モノクローナル抗体の作成
2匹のBalb/cマウスを完全フロイントアジュバント中のH2N−CAIIGLMVG−COOH(配列番号01)で初回刺激した。製造会社の使用説明書に従って、PierceのImject Maleimide Activated mc KLH/BSAキット(Pierce、Rockford、IL)などの市販されるキットを使用して、COOH−末端システイン(cystein)残基を介して、ペプチドをマレイミド活性化mc(鍵穴カサガイ(Megathura crenulata))KLHに、またはマレイミド活性化ウシ血清アルブミンにカップリングして、免疫化のために準備した。マウスを、最初に完全フロイントアジュバント中の、引き続いて不完全フロイントアジュバント中の100μgまたは200μgのKLH共役ペプチドで、2週毎に追加免疫した。
抗Assx−37抗体の検出のために使用されたスクリーニングELISAは、50μl/ウェルの被覆緩衝液(10mMトリス、10mMのNaCl、および10mMのNaN3、pH8.5)中で、NUNC Maxisorp(Life Technologies)平底高結合型96ウェルマイクロタイタープレート内に4℃で一晩被覆させた、0.5μg/ml遊離ヒトAss1−37ペプチドによる、直接ELISAであった。翌日、プレートを75μl/ウェルのPBS中0.1%カゼインによって、室温で60分間被覆して、非特異的結合を低下させた。次に50μlのハイブリドーマ上清を添加して、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、50μl/ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヒツジ抗マウスIgGによって、37℃、1時間で結合モノクローナル抗体を検出した(Amersham−Pharmacia Biotech)。双方の試薬を0.1%カゼイン/PBS中で希釈した。プレートを洗浄して、50μlの100mMクエン酸および100mMリン酸水素二ナトリウム中の0.42mMの3,5,3’,5’−テトラメチル−ベンジジンおよび0.003%(vol/vol)のH2O2溶液(pH4.3)を基質として添加した。プレート振盪機上で反応を室温で最大15分間進行させ、その後、50μl/ウェルの2NH2SO4で発色を停止させて、450nmのマイクロタイタープレートリーダー(Thermomax,Molecular Devices)上でプレートを読み取った。選択されたモノクローナル抗体と全長ヒト遊離Ass1−38およびAss1−39ペプチドとの交差反応性を、スクリーニングアッセイと同一の直接ELISAで試験した。
ヒトAβ1−37、Aβ1−38、Aβ1−39、Aβ1−40、およびAβ1−42標準物質を0.1mg/mLでジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、−80℃で保存した。ELISAで使用するために、ペプチドをPBS中の0.1%カゼインで1pg/mLにさらに希釈した。被覆緩衝液中の濃度1.5μg/mLのモノクローナル抗体で、96ウェルプレート(ハーフエリア黒色プレート、Costar)を4℃で一晩被覆した。JRD/Aβ37/3をAβ1−37の捕捉抗体として使用した。翌日、プレートをPBS中の0.1%カゼインで、室温で1〜4時間洗浄してブロックした。HRPO標識二次抗体JRF/Aβ/N25(全長ヒトAβペプチドのN末端を特異的に認識する抗体(Mercken,M.et al.,Neurobiol Aging 21,S41(2000))と共に、標準物質および未希釈サンプルを4℃で一晩培養した。一晩のインキュベーション後プレートを洗浄し、製造会社の推奨事項に従って、Quantablu基質(Pierce)でAβ1−37アッセイを発色させた。
5μgの各合成ペプチド(Aβ1−37、Aβ1−38、Aβ1−39、Aβ1−40、Aβ1−42)をNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)ビス−トリス12%ゲル上に装填し、製造会社の使用説明書に従って、iBlotシステム(Invitrogen)の使用によって、ニトロセルロース膜上にブロットした。脱脂粉乳(NFDM)(5%w/v;Biorad)を含有する、トリス緩衝食塩水Tween−20(TBS−T;1Mトリス、150mM NaCl、および0.05%Tween−20、pH8.5)で膜を1時間ブロックし、TBS−T中で3回洗浄した。NFDM(5%w/v)含有TBS−Tで希釈された一次抗体(5μg/ml)と共に、4℃で一晩インキュベーションした。West Dura(登録商標)増強化学発光(Pierce,Thermoscientific)によって、HRPO(TBS−T中の1:20000、Amersham Biosciences)共役ヒツジ抗マウスIgを使用して、一次抗体を検出した。Lumi−imaging system(Roche Diagnostic)によって、シグナルを捕捉した。
12匹のビーグル犬に、流動食と共にメトセル懸濁液中の2つのGSM化合物(国際公開第2011/006903パンフレットからのGSMA:化合物97およびGSMB:化合物157)の1つを経口投与した。処置に先だって、および投薬の4、8、24、および48時間後に、脳脊髄液(CSF)を採取した。流動食は、120mlの濃縮流動食(Convalescence support(登録商標)、1袋を112.5mlの温水に溶解した)であり、投薬は給餌直前に実施した。
大槽(cistern magna)カテーテルが外科的に埋め込まれた、7匹の幼若カニクイザル(Macaca fascicularis)をGSM E−2012の単回経口投与で処置した。処理に先だって(0時間)および投与後の複数の時点(0.5、1、2、4、6、8、12、16、24、48時間)で、脳脊髄液(CSF)および血液を採取した。動物を臨床徴候について毎日観察し、投薬に先だって体重を記録した。
MSD Sector装置SI6000およびMSDプロトタイプ4−plexプレートを使用して、Aβ37、Aβ38、Aβ40、およびAβ42について、9人の健常対照、6人の神経学的対照、および9人のアルツハイマー病患者からのCFSサンプルをスクリーニングした。このアッセイでは、Abeta37(JRD/Aβ37/3)、Abeta38(J&JPRD/Aβ38/5)、Abeta40(JRF/cAβ40/28)、およびAbeta42(JRF/cAβ42/26)に対して特異的な精製モノクローナル抗体で、MSD4−plexプレートを被覆して、スルホタグ標識JRF/AβN/25抗体を検出抗体として使用した。MSDの電気化学発光検出技術を使用して、Abeta37、Abeta38、Abeta40、およびAbeta42の同時の特異的検出を実施した。スルホタグは、4−plexプレートの電極表面で開始される電気化学刺激時に、発光する。
Claims (12)
- Aβx−37ペプチドを特異的に認識する、モノクローナル抗体。
- 前記Aβx−37ペプチドが、Aβ−ペプチド断片Ass1−37、Ass3−37、Ass3p−37、Ass11−37、およびAss11p−37からなる群から選択される、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 検出可能に標識される、請求項1または2に記載の抗体。
- 前記検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、ルミネセンス標識、または蛍光標識である、請求項3に記載の抗体。
- 担体上に固定化される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体。
- 2011年2月1日にそれぞれ受入番号LMBP 8062CBおよびLMBP 8063CBの下にBelgian coordinated collection of microorganismsに寄託された、ハイブリドーマ細胞JRD/Ab37/3 scl1またはJRD/Ab37/4 scl1のいずれか、または2011年3月30日に受入番号LMBP 8064CBの下にBelgian Coordinated Collections of Microorganismsに寄託されたハイブリドーマJRD/Ab37/10 scl1による、請求項1から5のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 前記サンプルを請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体に接触させて、前記抗体と前記Aβx−37ペプチドとの間に免疫複合体が形成されかどうかを測定するステップを含んでなる、サンプル中のAβx−37ペプチドを測定または検出するための免疫測定法。
- 前記サンプルが、哺乳類からの組織サンプルおよび体液サンプルからなる群から選択される、請求項7に記載のAβx−37ペプチドの存在を測定または検出する方法。
- β−アミロイド関連疾患を診断するための請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- 治療を受ける患者の生物学的サンプル中のAβx−37ペプチド量およびAβ42ペプチド量を一定時間毎に測定するステップと、
前記Aβx−37ペプチド量および前記Aβ42ペプチド量の相対変化を経時的に測定するステップとを含んでなる、β−アミロイド関連疾患の治療をモニタリングする方法。 - 前記Aβx−37ペプチド量を測定するステップが、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体を使用して実施される、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体と、前記抗体運搬手段とを含んでなる、β−アミロイド関連疾患の診断、進行モニタリングまたは治療モニタリングのための免疫測定法キット。
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