JP2007127472A - グリシル化ガストリン（ｇｌｙｃｉｎｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｄｇａｓｔｒｉｎ）の分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生体試料中のグリシル化ガストリンに関連する類縁物質（例えば、ガストリン、グリシル化ＣＣＫ−８、又はＣＣＫ−８）の量に影響を受けることなく、簡便かつ正確に測定することができるグリシル化ガストリンの免疫学的分析方法を提供する。
【解決手段】（１）ガストリンとは反応しないが、グリシル化ガストリンとは反応する第１のモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、（２）前記第１モノクローナル抗体とは別の領域を認識してグリシル化ガストリンと反応する第２のモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを使用する。
【選択図】なし

Description

本発明は、グリシル化ガストリン（glycine-extended gastrin）の分析方法に関する。より具体的には、モノクローナル抗体を用いてグリシル化ガストリンを特異的かつ高感度に測定する免疫学的分析方法に関する。なお、本明細書において、用語「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。

ヒト・グリシル化ガストリンは、配列番号１で表される１８個のアミノ酸残基からなるペプチドで、ヒト・ガストリン（配列番号２）のＣ末端側にグリシンが付加したペプチドである。ガストリンは、主として胃幽門前庭部に存在する内分泌細胞（Ｇ細胞）から１０１個のアミノ酸残基からなるプレプロガストリンとして生合成され、プロテアーゼによるプロセッシングとαアミデーションとを受け、グリシル化ガストリンを経て、１７個のアミノ酸残基からなるガストリンとなる。すなわち、グリシル化ガストリンは、最終的にＣ末端がアミド化されるガストリンの最終中間体として生成される［非特許文献１］。

グリシル化ガストリンは２個の３価鉄イオンと結合することにより、生物活性を示すことが知られており［非特許文献２］、ガストリンの受容体ではない別の受容体を介して［非特許文献３］、ガストリンにはない種々の生物活性を示すことが知られている。従って、グリシル化ガストリンはガストリンの単なる中間体ではなく、それ自身が別のペプチドホルモンであるとも言える。

グリシル化ガストリンの生物活性としては、例えば、インビトロで膵臓がん細胞の増殖を促進すること［非特許文献４］、マウスにおいて過剰発現させると肺癌細胞の増殖が促進されること［非特許文献５］、同じくマウスにおいて過剰発現させると大腸の増殖が促進されること［非特許文献６］、インビトロでヒト大腸癌細胞の浸潤を促進すること［非特許文献７］、インビトロでヒト大腸癌細胞のメタロプロテイナーゼ（metalloproteinase）１及び３の発現を促進すること［非特許文献８］、インビトロでヒト肝臓癌細胞の増殖を促進すること［非特許文献９］などの報告があり、ガストリンにはこれらの生物活性はない。

上記のようなインビトロの生物活性から、インビボ、すなわち、ヒトの生体においてのグリシル化ガストリンの機能を調べることは、種々の病態、特に癌の増殖や転移との関連において重要であると思われるが、簡便かつ特異的な測定法がないため、充分な解明がされていない。

正確に生体試料中のグリシル化ガストリンのみを測定するには、血液中に多量に存在するガストリンや存在する可能性が高いグリシル化ＣＣＫ−８（コレシストキニン）との交叉反応のない測定系が必要である。しかしながら、ガストリンは、グリシル化ガストリンとＣ末端アミノ酸が１つ違うだけであり、グリシル化ＣＣＫ−８は、グリシル化ガストリンとＣ末端アミノ酸配列（６アミノ酸残基）が全く同じであり、そのような測定系の作製は容易ではない。なお、ＣＣＫは、十二指腸粘膜のＩ細胞より分泌される消化管ホルモンで、ガストリンと同様に、プロペプチドとして生合成され、プロセッシングとαアミデーションを受け、Ｃ−末端がアミド化された３３個のアミノ酸残基からなるペプチド（ＣＣＫ−３３）であり、Ｃ−末端側の８個のペプチド（ＣＣＫ−８）として中枢神経系などに広く分布する。ＣＣＫ−８のアミノ酸配列は、ＤＹＭＧＷＭＤＦ（配列番号５）である。

通常、低分子ペプチドの免疫学的測定のためには、ポリクローナル抗体を作製することが多い。しかし、低分子ペプチドの場合、ポリクローナル抗体同士でペプチド抗原を挟み込む（いわゆるサンドイッチ）測定系を作製することは、立体障害の点で難しく、ペプチド自身をラジオアイソトープ標識し、被検試料中の抗原と競合させ測定するラジオイムノアッセイが多い。グリシル化ガストリンについても、実際そのような系が報告されている［非特許文献１０及び非特許文献１１］。しかしながら、被検試料に存在する可能性のある関連物質との交叉反応を否定することができるものではなく、また、ラジオアイソトープを使うため、設備も含め簡易な測定系ではない。グリシル化ガストリンに対するポリクローナル抗体の場合、どうしてもガストリン又はＣＣＫ−８等との共通部分を認識する抗体もできてしまうので、グリシル化ガストリンに比べて血中濃度が充分に高いと考えられるガストリンなどの類縁物質が存在する場合は特に問題となる。

一方、モノクローナル抗体を用いる場合、ガストリンに反応せず、グリシル化ガストリンに特異的なモノクローナル抗体を作製すると、両者の違いであるＣ末端のグリシン又はそれを含むアミノ酸配列を認識する抗体をスクリーニングすることになるため、結果として、Ｃ末端アミノ酸配列が全く同じグリシル化ＣＣＫ−８と反応してしまう抗体を選択してしまうということになる。従って、これまでにグリシル化ガストリンに特異的なモノクローナル抗体は作製されていない。
前記のような理由により、グリシル化ガストリンは生体内で重要な機能を持つと推測されるにも拘わらず、特異的な測定系は作製されていない。

「レギュレイトリー・ペプタイド（Regulatory Peptide ）」（オランダ），1991年，36巻，p. 323-343 「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」，（米国），2002年，277巻，p. 48602-48609 「ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Journal of Endocrinology）」，（英国），2004年，181巻，p. 315-325 「インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（International Journal of Cancer）」，（米国），1996年，66巻，p. 653-658 「キャンサー・リサーチ（Cancer Research）」，（米国），2004年，64巻，p. 196-201 「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal of Clinical Investigation）」，（米国），1999年，103巻，p. 1119-1126 「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochemical and Biophysical Research Communiction）」，（米国），2001年，285巻，p. 136-141 「インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（International Journal of Cancer）」，（米国），2004年，111巻，p. 23-31 「ダイジェスティブ・ディジーズ・アンド・サイエンス（Digestive Diseases and Science）」，（独国），2001年，46巻，p. 1356-1366 「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」，（米国），1985年，260巻，p. 11724-11729 「アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）」，（米国），1986年，152巻，p. 119-126

本発明の課題は、生体試料中のグリシル化ガストリンに関連する類縁物質（例えば、ガストリン、グリシル化ＣＣＫ−８、又はＣＣＫ−８）の量に影響を受けることなく、簡便かつ正確に測定することができるグリシル化ガストリンの免疫学的分析方法を提供することにある。

低分子ペプチドを測定する免疫学的測定には、通常、ポリクローナル抗体が用いられることが多く、前述のように、ラジオイムノアッセイが多い。低分子ペプチド測定のためのサンドイッチ測定系では、通常、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組み合わせは用いられるが、立体障害の点でポリクローナル抗体同士の組合せは用いられない。また、モノクロ−ナル抗体同士の組合せも、以下の理由により、通常、用いられない。すなわち、モノクローナル抗体同士によるサンドイッチ測定系は、１８アミノ酸残基のような低分子ペプチドについては、抗体の認識部位が近いため、いわゆるサンドイッチすることができないと考えるのが通例であり、実際、グリシル化ガストリンのような低分子ペプチドでそのような測定系の報告はない。

本発明者は、グリシル化ガストリンに対する種々のモノクローナル抗体を作製し、グリシル化ガストリンが低分子のペプチドであるにもかかわらず、そのＣ末端を認識するモノクローナル抗体とＮ末端を認識するモノクローナル抗体とを組み合わせることにより、意外にもサンドイッチすることができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、（１）ガストリンとは反応しないが、グリシル化ガストリンとは反応する第１のモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、（２）前記第１モノクローナル抗体とは別の領域を認識してグリシル化ガストリンと反応する第２のモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを使用することを特徴とする、グリシル化ガストリンの免疫学的分析方法に関する。

本発明の免疫学的分析方法の好ましい態様によれば、前記免疫学的分析方法がサンドイッチ法又は凝集法である。

また、本発明の免疫学的分析方法の別の好ましい態様によれば、（１）（ａ）請求項１に記載の第１モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、又は請求項１に記載の第２モノクローナル抗体若しくはそのフラグメントのいずれか一方のモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントを固定化した不溶性担体、（ｂ）残る一方のモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントに標識を付した標識抗体、及び（ｃ）グリシル化ガストリンを含む可能性のある被検試料を接触させる工程、並びに（２）前記不溶性担体上に形成される、固定化抗体とグリシル化ガストリンと標識抗体との複合体の前記標識からの信号を分析する工程を含む。

また、本発明は、（１）ガストリンとは反応しないが、グリシル化ガストリンとは反応する第１のモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、（２）前記第１モノクローナル抗体とは別の領域を認識してグリシル化ガストリンと反応する第２のモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを含むことを特徴とする、グリシル化ガストリンの免疫学的分析用キットに関する。

本発明の免疫学的分析方法によれば、生体試料中のグリシル化ガストリンに関連する類縁物質（例えば、ガストリン、グリシル化ＣＣＫ−８、又はＣＣＫ−８）の量に影響を受けることなく、グリシル化ガストリンを簡便かつ正確に測定することができる。

本発明では、２種類のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを使用する。第１のモノクローナル抗体は、ガストリンとは反応しないが、グリシル化ガストリンと反応する。また、第２のモノクローナル抗体は、前記第１モノクローナル抗体とは別の領域を認識してグリシル化ガストリンと反応する。

本発明で用いる第１モノクローナル抗体は、グリシル化ガストリンのＣ末端のグリシン又はそれを含むＣ末端のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体である。ヒト・グリシル化ガストリンのアミノ酸配列（配列番号１；１８アミノ酸）と、ヒト・ガストリンのアミノ酸配列（配列番号２；１７アミノ酸）とは、グリシル化ガストリンのＣ末端にグリシンが付加されていることを除いて、一致する。また、ヒト・グリシル化ガストリンのアミノ酸配列と、グリシル化ＣＣＫ−８のアミノ酸配列とは、Ｃ末端アミノ酸配列（６アミノ酸残基）が一致する。従って、前記第１モノクローナル抗体は、グリシル化ガストリン及びグリシル化ＣＣＫ−８と反応するが、ガストリン及びＣＣＫ−８とは反応しない。

前記第１モノクローナル抗体は、常法［例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法］に従って調製することができる。例えば、グリシル化ガストリンの全長ペプチド、あるいは、そのＣ末端の部分ペプチド（例えば、Ｃ末端のグリシン残基を含む５〜１２個のアミノ酸残基からなるペプチド）を免疫原として使用し、グリシル化ガストリンの全長ペプチド及び／又はＣ末端部分ペプチド（例えば、前記免疫原）、並びに、ガストリンの全長ペプチド及び／又はそのＮ末端部分ペプチドを用いてスクリーニングを実施することによって、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製することができ、そのハイブリドーマから前記第１モノクローナル抗体を調製することができる。

本発明で用いる第２モノクローナル抗体は、前記第１モノクローナル抗体とは別の領域（好ましくは、グリシル化ガストリンのＮ末端領域）を認識してグリシル化ガストリンと反応する。前記第２モノクローナル抗体が認識するグリシル化ガストリンのＮ末端領域は、前記第１モノクローナル抗体と一緒に用いることにより、グリシル化ガストリン特異的な免疫学的分析系（特にはサンドイッチ測定系）を構築可能な領域である限り、特に限定されるものではないが、例えば、Ｎ末端から数えて１番〜１２番（好ましくは１番〜８番、より好ましくは１番〜６番）のアミノ酸残基からなるＮ末端アミノ酸配列、あるいは、その部分配列であって、アミノ酸残基５〜１１個（好ましくは６〜８個）からなる部分アミノ酸配列を挙げることができる。前記第２モノクローナル抗体は、グリシル化ガストリン及びガストリンと反応するが、グリシル化ＣＣＫ−８及びＣＣＫ−８とは反応しない。

前記第２モノクローナル抗体は、常法に従って調製することができる。例えば、免疫原として、グリシル化ガストリンの全長ペプチド、あるいは、そのＮ末端の部分ペプチド（例えば、Ｎ末端のグルタミン酸残基を含む５〜１２個のアミノ酸残基からなるペプチド）を使用し、スクリーニング用抗原として、グリシル化ガストリンの全長ペプチド及び／又はＮ末端部分ペプチド（例えば、前記免疫原）、並びに、ガストリンの全長ペプチド及び／又はそのＮ末端部分ペプチドを用いること以外は、通常のモノクローナル抗体調製法に従って、調製することができる。

本発明の免疫学的分析方法では、前記の第１モノクローナル抗体又はそのフラグメント及び前記の第２モノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いて免疫分析系を構築することができる。前記フラグメントは、その元となるモノクローナル抗体の反応特異性を有する抗体フラグメントである限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、元となるモノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。

本発明の免疫学的分析方法には、種々の免疫学的分析方法、例えば、サンドイッチ法、凝集法などが含まれる。また、前記の第１モノクローナル抗体又はそのフラグメント及び前記の第２モノクローナル抗体又はそのフラグメントは、前記の各種免疫学的分析方法に用いることのできる、本発明の免疫学的分析用キットの構成試薬としても有用である。

本発明の免疫学的分析方法に用いる被検試料は、グリシル化ガストリンを含む可能性のある試料であれば特に限定されるものでないが、例えば、生体試料［例えば、血液、血漿、血清、尿、細胞、組織（正常組織又は癌組織）、又は器官］又はその処理物（例えば、破砕物、懸濁液、溶解液）を用いることができる。

サンドイッチ法を利用する本発明の免疫学的分析方法は、例えば、
（１）（ａ）前記の第１モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、又は前記の第２モノクローナル抗体若しくはそのフラグメントのいずれか一方のモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントを固定化した不溶性担体、（ｂ）残る一方のモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントに標識を付した標識抗体、及び（ｃ）グリシル化ガストリンを含む可能性のある被検試料を接触させる工程、並びに
（２）前記不溶性担体上に形成される、固定化抗体とグリシル化ガストリンと標識抗体との複合体の前記標識からの信号を分析する工程
を含む。

更に具体的には、サンドイッチ法を利用する本発明の免疫学的分析方法は、例えば、前記の第１モノクローナル抗体又はそのフラグメントを不溶性担体に固定化し、この抗体固定化不溶性担体とグリシル化ガストリンを含む可能性のある被検試料とを接触させ、続いて、前記の第２モノクローナル抗体又はそのフラグメントに標識を付した抗体と接触させ、不溶性担体上に、固定化第１抗体とグリシル化ガストリンと標識第２抗体とからなるサンドイッチ状複合体を形成させ、第２抗体の標識の信号を検出するか、あるいは、前記の第２モノクローナル抗体又はそのフラグメントを不溶性担体に固定化した後、グリシル化ガストリンを含む可能性のある被検試料と接触させ、続いて、前記の第１モノクローナル抗体又はそのフラグメントに標識を付した抗体と接触させ、不溶性担体上に、固定化第２抗体とグリシル化ガストリンと標識第１抗体とからなるサンドイッチ状複合体を形成させ、第１抗体の標識からの信号を検出することができる。

本発明のサンドイッチ法による免疫学的分析方法に使用することのできる不溶性担体は特に限定されるものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース及びこれらの組み合わせ等を例示することができる。

標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。

凝集反応を利用する本発明の免疫学的分析方法は、例えば、不溶性担体に固定化された前記の第１モノクローナル抗体又はそのフラグメントと、不溶性担体に固定化された前記の第２モノクローナル抗体又はそのフラグメントとを、被検試料存在下に接触させ、凝集反応を観察する。スライド板を用いる場合には目視的に、又は反応セルを用いる場合には特定の波長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中のグリシル化ガストリン濃度を定量することができる。

凝集反応を利用する本発明の免疫学的分析方法において、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げることができる。モノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができる。こうして、モノクローナル抗体と不溶性担体との複合体（抗体／担体複合体）を形成し、これを本発明の免疫学的分析方法に用いることができる。

本発明の免疫学的測定方法（凝集法）においては、例えば、第１モノクローナル抗体（又はそのフラグメント）及び第２モノクローナル抗体（又はそのフラグメント）を、それぞれ別々に、不溶性担体に担持させることもできるし、あるいは、第１モノクローナル抗体（又はそのフラグメント）及び第２モノクローナル抗体（又はそのフラグメント）を混合物として不溶性担体に担持させることもできる。前者の場合は、第１モノクローナル抗体（又はそのフラグメント）担持不溶性担体と、第２モノクローナル抗体（又はそのフラグメント）担持不溶性担体とを組み合わせて使用し、後者の場合は、第１モノクローナル抗体（又はそのフラグメント）及び第２モノクローナル抗体（又はそのフラグメント）担持不溶性担体を使用する。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：合成ペプチドの作製》
ペプチド自動合成装置（アプライド・バイオシステム社製）を用いて固相法により、配列番号１で表されるグリシル化ガストリン（１８アミノ酸）のＮ末にシステイン（Ｃｙｓ）を付加した１９アミノ酸からなる合成ペプチド（ＣＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−Ｇｌｙ；配列番号３）を作製した。ポリマー性の固相支持体へ、前記ペプチドのＣ末端側から、そのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を、順次ペプチド結合によって結合した。そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸を用いて固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。合成ペプチドの精製純度は約９５％で、そのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサー（アプライド・バイオシステム社製）により確認した。

《実施例２：合成ペプチドとキャリアータンパク質との架橋》
合成ペプチドは、ハプテンとして、キャリアータンパク質との架橋物にして免疫抗原とした。キャリアータンパク質として、キーホールリンペットヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin；以下、ＫＬＨと略称する）を使用した。その架橋方法は、合成ペプチドのＮ末端側にあるＣｙｓ残基を利用した。スルホ（ｓｕｌｆｏ）−ＳＭＣＣ（succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate）を用いて、ＫＬＨにＳＨ基反応性のマレイミド基を導入し、活性化し、次に、その活性化されたマレイミド基とＣｙｓ−ＳＨ基を反応させ、架橋した。

《実施例３：合成ペプチドに対する抗体の作製》
実施例２で作製した免疫原である合成ペプチド５０μｇをＰＢＳ（リン酸緩衝液，ｐＨ７．４）２５０μＬに溶解し、フロイントの完全アジュバンド２５０μＬと充分混合してエマルジョンとした。このエマルジョンをＢａｌｂ／Ｃマウス（雌）の四肢皮下及び腹腔内に投与した。
更に、２週間後、新たに前記の半量の合成ペプチド（２５μｇ）をフロイントの不完全アジュバンドと充分混合してエマルジョンとし、皮下及び腹腔内に投与した（２回目投与）。
更に、２週間後、新たに前記２回目投与と同量の合成ペプチド（２５μｇ）をフロイントの完全アジュバンドと充分混合してエマルジョンとし、マウス腹腔内に投与した（３回目投与）。
最終免疫４日後に、眼底静脈より採血を行い、免疫抗原ペプチドに対する力価を測定しながら、同量（２５μｇ）を同間隔（２週間）で免疫を実施した。

《実施例４：抗血清力価評価》
採血した血清中に含有された抗体と、免疫原として使用した合成ペプチドとの抗原抗体の反応を、次に示すＥＬＩＳＡ法（エンザイム・イムノソーベント・アッセイ）で検討した。
まず、９６ウエル平底ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに、合成ペプチド溶液（１μｇ／ｍＬ炭酸緩衝液，ｐＨ９．６）を５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置した。この処置により合成ペプチドは、各ウエルの接触面に非特異的に吸着する。

次に、それらの各ウエルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のホウ酸緩衝液，ｐＨ８．３）で洗浄した後、１．０％ウシ血清アルブミン溶液（０．０５％ＮａＮ_３含有のＰＢＳ，ｐＨ７．２）を各ウエルに５０μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。これらの各ウエルを同洗浄液で洗浄し、５０倍〜１００，０００倍に希釈（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ，ｐＨ７．２）した抗血清を、各ウエルに５０μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。次に、前記の各ウエルを同洗浄液で洗浄し、マウス免疫グロブリンに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体液を、各ウエルに５０μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。そして、これらの各ウエルを同洗浄液で洗浄後、ｏ−フェニレンジアミン溶液［ｏ−フェニレンヂアミン２０ｍｇ及び３５％Ｈ_２Ｏ_２１０μＬを０．０５ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍＬに溶解］を５０μＬずつ分注し、室温で１５分間反応後、２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ_２ＳＯ_４を５０μＬずつ分注して西洋ワサビペルオキシダーゼの反応を停止し、このＥＬＩＳＡプレートの各ウエルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。対照の陰性血清と比較し、１００，０００倍希釈抗血清にて抗原ペプチドとの反応を確認することができたマウスについて、以下の細胞融合を実施した。

《実施例５：細胞融合》
１００，０００倍希釈にて抗原ペプチドとの反応性がＥＬＩＳＡ法で確認することができたマウスについて、最終免疫より２週間後に、免疫抗原（２５μｇ）を更に腹腔内に免疫した。４日後、脾臓を摘出してほぐした後、ＲＰＭＩ１６４０培地でよく洗浄した。この洗浄した脾細胞（１０^８個）と、同様によく洗浄したマウスミエローマＰ３−Ｘ−６３−Ａｒｇ−Ｕ１（１０^７個）とを混ぜ、５０（Ｗ／Ｖ）％ＰＥＧ４０００を徐々に滴下し、細胞融合させた。ＲＰＭＩ１６４０を徐々に加えることによりＰＥＧを希釈し、反応を停止した。これを１１００回転にて５分間遠心して細胞を集め、ＨＡＴ培地［１０^−４ｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、４×１０^−７ｍｏｌ／Ｌアミノプテリン、及び１．６×１０^−５ｍｏｌ／Ｌチミジンを含む１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）−ＲＰＭＩ１６４０培地］に懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエルに０．１ｍＬずつ分注し、５％ＣＯ_２存在下にて３７℃でインキュベートした。融合後、４日目及び８日目にＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）０．２ｍＬで置換した。

《実施例６：融合細胞の選別とクローン化》
実施例４に記載した抗血清力価測定と同様の方法（抗原ペプチド固相ＥＬＩＳＡ法）にて、９６穴マイクロプレート各ウエルの培養上清の抗原ペプチドに対する反応性を評価した。まず、９６ウエル平底ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに合成ペプチド溶液（１μｇ／ｍＬ炭酸緩衝液，ｐＨ９．６）を５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置した。この処置により合成ペプチドは、各ウエルの接触面に非特異的に吸着する。次に、それらの各ウエルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有のホウ酸緩衝液，ｐＨ８．３）で洗浄した後、１．０％ウシ血清アルブミン溶液（０．０５％ＮａＮ_３含有のＰＢＳ，ｐＨ７．２）を各ウエルに５０μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。これらの各ウエルを同洗浄液で洗浄し、細胞融合実施後１２日目の培養中の９６穴マイクロプレートの各ウエル培養上清を、各ウエルに５０μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。次に、前記の各ウエルを同洗浄液で洗浄し、マウス免疫グロブリンに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体液を、各ウエルに５０μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。そして、これらの各ウエルを同洗浄液で洗浄後、ｏ−フェニレンジアミン溶液［ｏ−フェニレンヂアミン２０ｍｇ及び３５％Ｈ_２Ｏ_２１０μＬを０．０５ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍＬに溶解］を５０μＬずつ分注し、室温で１５分間反応後、２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ_２ＳＯ_４を５０μＬずつ分注して西洋ワサビペルオキシダーゼの反応を停止し、このＥＬＩＳＡプレートの各ウエルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。対照（ＨＴ培地）をブランクとし、４９２ｎｍにおける吸光度が０．５以上のウエルを選び出し、限界希釈法によりクローニングを繰り返し行い、安定したモノクローナル抗体産生細胞を確立した。

《実施例７：免疫抗原合成ペプチド特異性の確認》
実施例４で使用したＥＬＩＳＡプレートを同様に使用した。一定の濃度に希釈した培養上清に５種類の合成ペプチド、すなわち、免疫抗原ペプチド、ガストリン、ＣＣＫ−８、グリシル化ＣＣＫ−８、又はガストリンのＮ末端ペプチド（ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡ；配列番号４）をそれぞれ０．１３μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ添加し、４℃で１晩静置した。ＥＬＩＳＡプレートをウシ血清アルブミン処理後、前記の希釈抗血清を各ウエルに５０μＬずつ分注した。以下、実施例４と同様の操作を行い、５種類のペプチドによる間接阻害ＥＬＩＳＡを行うことにより、特異性を確認した。

本発明で用いる第１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、クローン２Ｃ６、１Ｇ６、３Ｅ７、４Ｈ４、及び９Ｂ１１が得られ、本発明で用いる第２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、クローン３Ｄ２及び２Ｃ９が得られた。前記第１抗体は、グリシル化ガストリン又はグリシル化ＣＣＫ−８と反応したが、ガストリン又はＣＣＫ−８とは全く反応しなかった。前記第２抗体は、グリシル化ガストリン、ガストリン、又はガストリンのＮ末端ペプチドと反応したが、グリシル化ＣＣＫ−８又はＣＣＫ−８とは全く反応しなかった。

《実施例８：サンドイッチＥＬＩＳＡ測定における類縁物質との交叉反応性の確認》
第１の抗体として、ＩｇＧ（クローン番号：３Ｄ２）を５μｇ／ｍＬの濃度となるように１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）溶液で希釈し、９６ウエル平底ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに５０μＬ分注し、４℃で一晩静置した。この処置により、第１の抗体は、各ウエルの接触面に非特異的に吸着する。

第１の抗体溶液を吸引除去した後、ブロッキング剤［２２．５ｍｇ／ｍＬスキムミルク，２５％−Super Block Bloking Buffer in TBS（PIERCE社），１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ，及び５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）］を３００μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。ブロッキング剤を取り除いた後、各種類縁ペプチド溶液を５０μＬずつ分注し、室温で２時間静置した。類縁ペプチド溶液は、グリシル化ガストリンについては０〜５００ｐｇ／ｍＬとなるように、ガストリン、ＣＣＫ−８（PEPTIDE INSTITUTE. INC, Code 4087-V）及びグリシル化ＣＣＫ−８（キアゲン）については０〜１０μｇ／ｍＬとなるように、希釈液［１１．２５ｍｇ／ｍＬスキムミルク，１２．５％−Super Block Bloking Buffer in TBS，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ，及び５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）］で希釈調整した。

反応後、洗浄液［０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）］で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した第２の抗体（クローン番号：２Ｃ６）のＦ（ａｂ’）_２を５μｇ／ｍＬになるように希釈液で希釈し、５０μＬずつ分注し、室温で１時間静置した。洗浄液［０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）］で洗浄し、基質溶液［７５μｇ／ｍＬテトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）及び０．００６％Ｈ_２Ｏ_２含有０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）］１００μＬを分注し、室温で１０分間静置した。０．５ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ_２ＳＯ_４を１００μＬずつ分注し、西洋ワサビペルオキシダーゼの反応を停止し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。

結果を図１に示す。この測定系では、グリシル化ガストリンにのみ特異的に反応し、類縁物質は全く反応性を示さなかった。

《実施例９：モノクローナル抗体結合ラテックスの調製と前記ラテックスによるグリシル化ガストリンの測定》
第１のモノクローナル抗体（クローン番号：３Ｄ２）ＩｇＧを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液２ｍＬと、ラテックス溶液（２％ポリスチレンラテックス、JSR社製、粒径０．３１０μｍ）２ｍＬとを混合し、マグネチックスターラーにて２時間攪拌し、抗体をラテックス粒子上に固定化した。遠心分離（２０，０００ｇ、２０分間）した後、沈殿を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５０ｍｍｏｌ/Ｌ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液に懸濁し、１時間攪拌した。遠心分離を繰り返すことにより、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液で沈殿を３回洗浄した後、沈殿を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液に懸濁させ、モノクローナル抗体３Ｄ２結合ラテックス含有液を得た。
第２のモノクローナル抗体（クローン番号：２Ｃ６）ＩｇＧも３Ｄ２と同様にしてモノクローナル抗体２Ｃ６結合ラテックスを得た。得られた２種のモノクローナル抗体結合ラテックス含有液を等量混合し、使用するまで４℃で保存した。

２種のモノクローナル抗体結合ラテックス含有液に、種々の濃度のグリシル化ガストリン又は類縁ペプチド溶液を加えて混合し、全自動免疫血清検査システムＬＰＩＡ−ＮＶ７（三菱化学ヤトロン社製）を用いて、凝集の反応速度を測定した。

結果を図２に示す。この測定系では、グリシル化ガストリンにのみ特異的なラテックス凝集が認められ、類縁物質では全く凝集は認められなかった。

本発明の免疫学的分析方法は、種々の病態、特に癌の増殖や転移との関連において重要である、グリシル化ガストリンの分析の用途に適用することができる。

配列表の配列番号４の配列で表されるアミノ酸配列は、合成ペプチド配列である。

本発明のサンドイッチ免疫測定法により、グリシル化ガストリン標準品（ＳＴＤ）、ガストリン（ガストリン１）、ＣＣＫ−８、及びグリシル化ＣＣＫ−８（Ｇ−ＣＣＫ−８）を測定した結果を示すグラフである。 本発明のラテックス凝集測定法により、グリシル化ガストリン標準品（ＳＴＤ）、ガストリン（ガストリン１）、ＣＣＫ−８、及びグリシル化ＣＣＫ−８（Ｇ−ＣＣＫ−８）を測定した結果を示すグラフである。

Claims (4)

1. （１）ガストリンとは反応しないが、グリシル化ガストリンとは反応する第１のモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、
   （２）前記第１モノクローナル抗体とは別の領域を認識してグリシル化ガストリンと反応する第２のモノクローナル抗体又はそのフラグメントと
   を使用することを特徴とする、グリシル化ガストリンの免疫学的分析方法。
2. 前記免疫学的分析方法がサンドイッチ法又は凝集法である、請求項１に記載の方法。
3. （１）（ａ）請求項１に記載の第１モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、又は請求項１に記載の第２モノクローナル抗体若しくはそのフラグメントのいずれか一方のモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントを固定化した不溶性担体、（ｂ）残る一方のモノクローナル抗体若しくはそのフラグメントに標識を付した標識抗体、及び（ｃ）グリシル化ガストリンを含む可能性のある被検試料を接触させる工程、並びに
   （２）前記不溶性担体上に形成される、固定化抗体とグリシル化ガストリンと標識抗体との複合体の前記標識からの信号を分析する工程
   を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. （１）ガストリンとは反応しないが、グリシル化ガストリンとは反応する第１のモノクローナル抗体又はそのフラグメントと、
   （２）前記第１モノクローナル抗体とは別の領域を認識してグリシル化ガストリンと反応する第２のモノクローナル抗体又はそのフラグメントと
   を含むことを特徴とする、グリシル化ガストリンの免疫学的分析用キット。

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