JP4153873B2

JP4153873B2 - アルツハイマー危険因子の検出試薬および検出用キットならびにこれらを用いるアルツハイマー危険因子の検出方法

Info

Publication number: JP4153873B2
Application number: JP2003534903A
Authority: JP
Inventors: 成男太田; 雅弘前田
Original assignee: 株式会社免疫生物研究所
Priority date: 2001-10-04
Filing date: 2002-10-04
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2022-10-04
Also published as: WO2003031971A1; DE60225821D1; EP1434053A4; DE60225821T2; EP1434053B1; ATE390633T1; EP1434053A1; US20050266501A1; JPWO2003031971A1

Description

技術分野
本発明は、アルツハイマー危険因子を検出するための試薬、キットおよびこれらを用いるアルツハイマー危険因子の検出方法に関し、更に詳細には、アルツハイマー危険因子であるアポリポプロテインＥ４遺伝子型を簡便に精度良く検出可能とする抗体を用いるアルツハイマー危険因子の検出試薬、検出キットならびにこれらを用いる検出方法に関する。
背景技術
アルツハイマー病は１９０７年ドイツの神経病理学者Ａ．アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）によって最初に報告され、現在では老人痴呆の大きな原因の一つとなっている。日本においては６５歳以上の高齢者に占める痴呆患者の割合は約７％とされ、年々増加しているため高齢者医療費の高騰の一因であるばかりでなく、その介護のために国民の経済的負担が益々増加しようとしている。
このような現状から一般医も積極的に痴呆患者を早期に診断し治療すべき時代となってきている。
アルツハイマー病は、発症後急速に荒廃する経過をとり、顕著で多発性の高次脳皮質機能障害を示し、比較的早期から失語、失認、失行が認められる。病理学的には、脳が著しく萎縮し、末期には９００グラム以下までになる。組織学的には、神経細胞の消失、神経原線維変化、老人斑といった特徴ある病変が出現する。
現在までに下記表１に示すように４個の遺伝性アルツハイマー病原因遺伝子が報告されている。タンパク質は遺伝子をもとに生合成される。これを遺伝子によって「コードされるタンパク質」と呼ぶ。

このうち、アポリポプロテインＥ遺伝子（ＡＤ２）は、ヒトの血液中のリポプロテイン（脂質とタンパク質の複合体）の構成成分の一つであるアポリポプロテイン（以下、「Ａｐｏ」と省略することもある）Ｅをコードする遺伝子である。この遺伝子はアルツハイマー痴呆感受性遺伝子またはアルツハイマー危険因子と推定されている。
ＡｐｏＥは、２９９個のアミノ酸から構成され、Ｎ末端から１１２番目と１５８番目がシステインのものがＡｐｏＥ２、１１２番目がシステイン、１５８番目がアルギニンのものがＡｐｏＥ３、両方ともアルギニンのものがＡｐｏＥ４と呼ばれている。これらのＡｐｏＥをコードする遺伝子の遺伝子型は、ホモ接合体、ヘテロ接合体の各組合せとして、（ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２）、（ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３）、（ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４）、（ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３）、（ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４）および（ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４）となり、全てのヒトはこれらのいずれかに分類される。
長寿に伴う孤発性のアルツハイマー病患者の遺伝型を調べると、アルツハイマー病は（ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４）および（ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４）型に多く発症している。逆にＡｐｏＥ２を含む（ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２）、（ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３）および（ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４）では少なくなっている。さらに、抗酸化作用はＡｐｏＥ２＞ＡｐｏＥ３＞ＡｐｏＥ４の順になっており、ＡｐｏＥ４がアミロイドβタンパク質の線維化を促進するとの推測もなされている。
ＡｐｏＥの形成する二量体構造のうちＡｐｏＥ４を１つ有すると、つまりヘテロ接合（ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４あるいはＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４）であると発症年齢が１０年近く早くなるといわれている。ホモ接合（ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４）であると２０年近く発症年齢が早くなる。日本人ではＡｐｏＥ４の遺伝子頻度は１０％程度であるが、アルツハイマー病症例群ではこれが３０％程度となる。
このように、ＡＤ遺伝子上にＡｐｏＥ４が発現されていると、アルツハイマー病になりやすいこと、すなわち、ＡｐｏＥ４がアルツハイマー病の危険因子であるため、この因子の有無を早期に検出し、アルツハイマー病の発症を遅らせたり、アルツハイマー型痴呆の認知機能改善薬等を投与し、病状を緩和することが求められている。
ところで、これら遺伝子型を検査する方法として、現在、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法を代表とする遺伝子増幅検査がおこなわれている。この方法は、遺伝子型を確認する特異性という点では最も信頼性の高い方法である。しかしながら、この方法では遺伝子を持つ細胞（白血球など）が必須であり、また、遺伝子を感度良く検出するための特別な遺伝子増幅装置を必要とし、更に、測定にかかる時間も半日を要し、かかるコストが高いという問題があり、これにかわる簡便で安価な測定方法が望まれている。
従って本発明は、現在遺伝子検査に用いられているＰＣＲ法と比べて安価で感度良くＡｐｏＥ４遺伝子型を検出する測定方法を見出し、これを利用したアルツハイマー危険因子の検出方法を提供することをその課題とするものである。
発明の開示
本発明者は、極めて構造的に類似しているＡｐｏＥ２、Ｅ３ないしＥ４から、ＡｐｏＥ４のみを検出しうる方法について研究を行った。そして、その結果、特定のペプチドに対する抗体は、ＡｐｏＥ４に特異的に反応するものであり、当該抗体を利用すれば、アルツハイマーの危険因子の存在を明確にしうることを見出した。
また、ＡｐｏＥ２、Ｅ３ないしＥ４の全てに対する抗体と、上記ＡｐｏＥ４に対する特異的な抗体を組み合わせて用いれば、ＡｐｏＥ４をより精度高く検出可能であり、更に、多量検体の測定が可能なこと、１検体当たりの測定コストが遺伝子検査に比べきわめて安価であること、従来より病院などの検査室で汎用されている自動比色装置が使用可能であり、新たに特別な装置を必要としないこと等を見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、アポリポプロテインＥ４に特異的な抗体を有効成分として含有するアルツハイマー危険因子の検出試薬を提供するものである。
また、本発明は、次の成分（ａ）および（ｂ）を含有するアルツハイマー危険因子の検出キットを提供するものである。
（ａ）アポリポプロテインＥ４に特異的な抗体を含む試薬
（ｂ）アポリポプロテインＥ２、アポリポプロテインＥ３およびアポリポプロテインＥ４の全てに対する抗体を含む試薬
更に、本発明は、上記検出試薬または検出キットを利用するアルツハイマー危険因子の検出方法を提供するものである。
発明を実施するために最良の形態
本発明において使用される、アポリポプロテインＥ４（ＡｐｏＥ４）に特異的な抗体とは、ＡｐｏＥ４のみを認識できる抗体であり、ペプチドとして構造の類似するＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３は認識しない抗体をいう。このような抗体は、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３とＡｐｏＥ４遺伝子がコードするタンパクを対比し（ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４のアミノ酸配列はＮＣＢＩのデータベースに、それぞれアクセッション番号２３０１１８、ＡＡＨ０３５５７およびＡＡＢ５９３９７として登録されている）、ＡｐｏＥ４のみに特異的な配列を中心とする適当な長さのオリゴペプチドを合成し、それに対する抗体を常法により作製すればよい。
上記のＡｐｏＥ４のみに特異的な配列を中心とする適当な長さのオリゴペプチドの具体例としては、ＡｐｏＥ４のアミノ酸配列の１０６番から１１６番であるＡＤＭＥＤＶＲＧＲＬＶ（配列番号１）のＮ末端側にシステイン（Ｃ）を結合したＣＡＤＭＥＤＶＲＧＲＬＶ（配列番号２）のアミノ酸配列を持つ合成ペプチド（以下、「ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド」という）を抗体作製のために使用することができる。
上記のＡｐｏＥ４フラグメントペプチドは、特に限定されることなく種々の方法で得られることができる。例えば、当業界で公知の方法により合成することができる。
このＡｐｏＥ４フラグメントペプチドは、次に生体高分子化合物と結合させ、これを抗原としてＡｐｏＥ４に特異的な抗体を作製することができる。
この生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」と言う）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブミン（以下「ＲＳＡ」と言う）、サイログロブリン等が挙げられ。このうちＫＬＨおよびサイログロブリンがより好ましい。
上記ＡｐｏＥ４フラグメントペプチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒ．Ｉａｎｇｅｒｅｔａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４１０９０−１０９４（１９５４））、または活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵｅｔａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．４２３０１−３０９（１９９４））等の公知の方法によって行うことができる。
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、ＡｐｏＥ４フラグメントペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするペプチド−生体高分子化合物結合体が作製される。混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物を使用することができ、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。
また、上記反応は、通常、−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から２時間である。
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的には、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、合成ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するペプチドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミドのモル比は好ましくは１：１０〜１０：１、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０〜５０℃、好ましくは２２−２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、より好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜１６時間、より好ましくは１〜２時間である。
上記何れかの方法により得られた反応物を透析、脱塩カラム等によって精製して、ＡｐｏＥ４フラグメントペプチドと高分子化合物との結合体（以下、単に「結合物」ということがある」）を得ることができる。
次に、上記の様にして得られた結合物を抗原とし、これを用いる抗体の作製方法および当該抗体を用いる免疫化学測定法について説明する。なお、抗体の調製にあたっては公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。
上記結合体を使用して、本発明のＡｐｏＥ４に特異的な抗体を作製するには、当該結合体で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取すればよい。
すなわち、まず例えば、ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド−サイログロブリン結合体等の結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と結合したものを、免疫原として哺乳動物を免疫する。
免疫される動物としては当該分野で常用されたものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行うことができる。
次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取し、そこから分離した血清を用い、ＡｐｏＥ４フラグメントペプチドに対する抗体を得ることができる。
また、常法に従い、前記結合体で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってもＡｐｏＥ４フラグメントペプチドに対する抗体を得ることができる。
かくして得られた抗体は、必要により標識することができる。この標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、^３２Ｐ、^１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。
また逆に、上記と同様に、ＡｐｏＥ４フラグメントペプチドに上記標識物質を結合させたものを、免疫化学的測定法において使用することができる。
本発明のアルツハイマー危険因子の検出試薬（以下、「本発明試薬」という）は、上記抗体と担体とを組み合わせることにより調製される。このような担体としては、例えば、ガラスチューブ、ポリスチレンビーズ、マイクロタイタープレート、メンブレン等が挙げられる。なお、本発明試薬は、液状であっても、また用時に水を加えて液状物となし得る凍結乾燥物であっても良い。
一方、本発明試薬によりアルツハイマー危険因子を検出すべき検体としては、種々の体液、例えば、全血液、血清、血漿等が挙げられる。この検体は、必要により適宜希釈してから使用することができ、この希釈にはリン酸、炭酸、トリス等を含有する緩衝液や、生理食塩水等を使用することができる。検体希釈の具体例としては、全血液の場合、５１倍希釈（全血液１０μｌに対し、希釈用緩衝液を５００μｌ加える）、血清または血漿の場合１０１倍希釈（血清または血漿１０μｌに対し、希釈用緩衝液を１０００μｌ加える）が挙げられる。
本願発明によるアルツハイマー危険因子の検出方法（以下、「本発明方法」という）は、本発明試薬を検体中に加え、本発明試薬中の抗体の抗原抗体反応を検出することにより行われる。本発明方法における抗原抗体反応の検出方法としては、例えば、ＲＩＡ法（放射性同位元素免疫測定方法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ，７０，４１９−４４３９（１９８０））、免疫比濁法、蛍光抗体法、プラーク法、スポート法、凝集法、オクタロニー等、一般に使用する方法（「ハイブリドーマとモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）を利用することができる。
本発明方法をより有利に実施するための方法としては、２種の抗体により、検出すべきＡｐｏＥ４を挟み込む、いわゆるサンドイッチ法を挙げることができる。この方法において使用する一方の抗体としては、上で説明したＡｐｏＥ４に特異的な抗体が利用され、他方の抗体としては、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の全てに対する抗体が挙げられる。
本発明において使用されるＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の全てに対する抗体とは、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の何れをも特異的に認識できる抗体であれば特に限定されないが、上述したＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の遺伝子配列より、これらの全てに共通する配列に対応するタンパク質を合成し、それに対する抗体を作製すればよい。例えば、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の共通アミノ酸配列の２８１番から２９９番であるＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ（配列番号３）のＮ末端側にシステイン（Ｃ）を結合したＣＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ（配列番号４）のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドを人工合成し、上述したＡｐｏＥ４に対する抗体と同様に作製すればよい。
ＡｐｏＥ４の検出について、サンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。すなわち、まず（ａ）ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の全てに対する抗体を、担体に固相化し、次いで（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばＢＳＡにより、ブロッキングする。更に、（ｃ）これにＡｐｏＥを含む検体を希釈した試料を加え、ＡｐｏＥ−抗体複合体を生成させた後、（ｄ）標識酵素を結合したＡｐｏＥ４に特異的な抗体を加え、ＡｐｏＥ−固相化抗体複合体と結合させ、最後に（ｅ）標識酵素の発色量等を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のＡｐｏＥ４の量を決定することができる。
まず、（ａ）工程において、抗体を固相化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０．０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．１−２０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で、好ましくは２０−１５０μｌ／ウェルが適している。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩のインキュベーションが適している。
また、（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する試料中のＡｐｏＥが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液のほかに、ブロックエース（大日本製薬社製：コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することができる。具体的なブロッキング方法としては、抗原を固相化した部分に１％ＢＳＡ溶液を適量加え、４℃で一晩インキュベートした後、緩衝液で洗浄する方法が挙げられる。この方法で用いられる緩衝液としては、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０および０．０５％ＮａＮ_３を含む５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）が好ましい。
次いで（ｃ）工程において、ＡｐｏＥを含む試料を固相化抗体と接触させ、固相化抗体でＡｐｏＥを補足し、ＡｐｏＥ−固相化抗体複合体を生成させる。反応は限定されるわけではないが、３７℃程度で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の蛋白質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．２）が好ましい。
更に（ｄ）工程において、固相化抗体に補足されたＡｐｏＥに、標識物質で標識したＡｐｏＥ４に特異的な抗体を加え、固相化抗体−ＡｐｏＥ−標識物質で標識したＡｐｏＥ４に特異的な抗体の複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。また、標識物質で標識したＡｐｏＥ４に特異的な抗体は、担体に結合した固相化抗体に対して約５０００−１００００倍、好ましくは最終吸光度が１．０−１．５となるように希釈して反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いることができる。以上の反応により、標識物質で標識したＡｐｏＥ４に特異的な抗体が、固相化抗体に補足されたＡｐｏＥのうちのＡｐｏＥ４のみに結合することができる。この複合体の標識物質を検出することによりＡｐｏＥ４を検出することができる。
上記（ｄ）工程において使用される標識物質としてはＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、^３２Ｐ、^１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、過酸化水素と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン（以下、「ＴＭＢ」という）又はｏ−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」という）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた後、２Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。ＯＰＤを使用する場合には４９２ｎｍの吸光度を測定し、ＴＭＢを使用する場合には４５０ｎｍの吸光度を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
既知の濃度のＡｐｏＥ４を添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のＡｐｏＥ４の濃度を算出できる。
また、本発明によれば、上記検出方法においてＡｐｏＥ４ホモ遺伝子型とＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液１（以下、単に「標準液１」という）と、ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とＡｐｏＥ４以外の遺伝子型とを判別しうる標準液２（以下、単に「標準液２」という）を用いることにより、試料中のＡｐｏＥの遺伝子型を判別することができる。
この標準液１の濃度は、種々の体液、例えば、全血液、血清、血漿等の検体中に含まれるＡｐｏＥ４の濃度から決められるものであり、検体中に含まれるＡｐｏＥがすべてＡｐｏＥ４である（ＡｐｏＥ４／Ｅ４のホモ遺伝子型を有する）被検者のＡｐｏＥ４の最小濃度と、ＡｐｏＥ４とＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４とＡｐｏＥ２である（ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型を有する）被検者のＡｐｏＥ４の最高濃度との間のＡｐｏＥ４の濃度である。
一方、標準液２の濃度も検体中に含まれるＡｐｏＥ４の濃度から決められるものであり、検体中に含まれるＡｐｏＥが、ＡｐｏＥ４とＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ４である（ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型を有する）被検者のＡｐｏＥ４の最小濃度と、すべてＡｐｏＥ３、すべてＡｐｏＥ２またＡｐｏＥ３とＡｐｏＥ２である（ＡｐｏＥ４以外の遺伝子型を有する）被検者のＡｐｏＥ４の最高濃度との間のＡｐｏＥ４の濃度である。
具体的に検体として全血液を用いる場合には、標準液１および標準液２はＡｐｏＥ４の濃度がそれぞれ１．２μｇ／ｍｌおよび０．２４μｇ／ｍｌである溶液を測定の際に用いる全血液と同様の希釈倍率に希釈したものとなる。
より具体的にＡｐｏＥの遺伝子型は、標準液１の吸光度をＡとし、標準液２の吸光度をＢとし、試料中のＡｐｏＥ４の吸光度をＣとすると、以下のように判別することができる。
Ａ＜Ｃの場合：ＡｐｏＥ４／Ｅ４のホモ遺伝子型を有する。
Ｂ＜Ｃ＜Ａの場合：ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型を有する（ＡｐｏＥ４／Ｅ３
またはＡｐｏＥ４／Ｅ２遺伝子型）。
Ｃ＜Ｂの場合：ＡｐｏＥ４以外の遺伝子型を有する（ＡｐｏＥ３／Ｅ３、
ＡｐｏＥ３／Ｅ２またはＡｐｏＥ２／Ｅ２遺伝子型）。
なお、当然のことながら、これらの測定の際には試薬ブランクによる測定が行われ、吸光度の補正が行われてもよい。
なお、本発明方法を容易に実施するために、アルツハイマー危険因子の検出キットを利用することができる。この検出キットは例えば次の組み合わせよりなるものである。
次の試薬（ａ）および（ｂ）の組み合わせ
（ａ）ＡｐｏＥ４に対する抗体を含む試薬
（ｂ）ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏ４の全てに対する抗体を含む試薬次の試薬（ｃ）および（ｄ）の組み合わせ
（ｃ）標識された、ＡｐｏＥ４に対する抗体を含む試薬
（ｄ）固相化された、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の全てに対する抗体を含む試薬
更に、上記検出キットに次の試薬（ｅ）および（ｆ）の組合わせ
（ｅ）ＡｐｏＥ４ホモ遺伝子型とＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液１
（ｆ）ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とＡｐｏＥ４以外の遺伝子型とを判別しうる標準液２
本発明検出試薬、本発明方法および本発明キットによれば、検体中のＡｐｏＥ４を正確に、かつ簡易に検出することが可能となる。そして、検体中のＡｐｏＥ４の存在およびその量は、生体がＡｐｏＥ４遺伝子を保有することを示し、ひいてはアルツハイマー症になる可能性が高いこと、すなわちアルツハイマーの危険因子を保有することを示すことになるものである。
実施例
以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、何らこれらに制約を受けるものではない。
実施例１
ＡｐｏＥ４を特異的に認識する抗体の調製：
ＡｐｏＥ４を特異的に認識する抗体は、ＡｐｏＥ４のアミノ酸配列の１０６番から１１６番のＮ末端側にシステイン（Ｃ）を結合したＣＡＤＭＥＤＶＲＧＲＬＶ（配列番号２）のアミノ酸配列を持つ合成ペプチド（以下、「ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド」という）を用い、次のようにして調製した。
（１）免疫用抗原の作製
免疫原となるＡｐｏＥ４フラグメントペプチド（Ｓｙｎｐｅｐ社製）とサイログロブリンとの結合体はＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）法で作製した。結合体を作製するにあたり、サイログロブリンとＡｐｏＥ４フラグメントペプチドとＥＭＣＳのモル比をそれぞれ１：３００：４００とした。まず、サイログロブリン５ｍｇを０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに溶解し、これにジメチルホルムアミドで溶解したＥＭＣＳ８０μｇ／μｌを上述モル相当量加え、サイログロブリン−ＥＭＣＳ複合体を作製した。この複合体を含む溶液に、ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド４ｍｇを約１ｍｌの蒸留水に溶解した溶液を上述モル相当量加えることにより、ＥＭＣＳで架橋されたＡｐｏＥ４フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体を作製した。次いでこれをＰＢＳを用いて透析し、１．０μｇ／μｌになるように濃度を調整して、免疫用抗原とした。
（２）免疫感作
上記（１）で得られた免疫用抗原についてウサギおよびマウスに免疫を行った。ウサギは１週間、または２週間おきに１００μｌ（１００μｇ）免疫した。マウスは１週間おきに５０μｌ（５０μｇ）免疫した。抗原はウサギおよびマウスとも初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、２回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。ウサギは８回免疫後、マウスは４回免疫後採血を行い、血清を分離しこれを抗血清とした。
（３）スクリーニング用抗原の作製
ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド（Ｓｙｎｐｅｐ社製）を蒸留水で溶解したものをスクリーニング用ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗原とした。また、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４（和光純薬工業社製）を蒸留水で溶解したものをスクリーニング用ＡｐｏＥ抗原とした。さらに、ＡｐｏＥ４（和光純薬工業社製）は実施例３においても標準液として使用した。
（４）抗血清のＡｐｏＥ４フラグメントペプチドに対する反応性
上記（３）で調製したスクリーニング用ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗原を用いてＥＬＩＳＡ法により、上記（２）で調製した抗血清の反応性を調べた。まず、上記（３）で調製したスクリーニング用ＡｐｏＥ４フラグメントペプチドを１．０μｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に希釈し、５０μｌずつ９６ウエルプレートに固相した。ＰＢＳにて洗浄し、次いで、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％ＮａＮ_３溶液でブロッキングした後、抗血清の１００倍希釈液を順次２倍倍希釈し、５０μｌウエルに入れ、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて４回洗浄後、ウサギ抗血清にはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ＩＢＬ社製）を、マウス抗血清にはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（ＩＢＬ社製）を５０μずつ各ウエルに添加し、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、０．４ｍｇ／ｍｌになるようにオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を０．０３％過酸化水素水を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、各１００μｌずつ各ウエルに入れ、室温で１５分間遮光状態で放置し、発色させた。発色後、１Ｎ硫酸１００μｌを各ウエルに添加し、反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定して、抗血清のＡｐｏＥ４フラグメントペプチドに対する反応性を確認した。
（５）抗血清のＡｐｏＥに対する反応性
上記（３）で調製したスクリーニング用ＡｐｏＥ抗原を用いてウエスタンブロット法にて抗血清の反応性を調べた。まず上記抗原を１２％アクリルアミドゲルにアプライし、２０ｍＡにて電気泳動を行った。このゲルをメンブレンにブロット後、３％スキムミルク／１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％ＮａＮ_３でブロッキングを３７℃で２時間行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて洗浄後、各抗血清を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２００倍に希釈し、４℃で一晩反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて洗浄後、ウサギ抗血清にはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧを、マウス抗血清にはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを添加し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて洗浄し、ＥＣＬ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）にて発光させ、Ｘ線フィルムに感光させた。これにより、抗血清とＡｐｏＥ４との反応性を確認した。
（６）ハイブリドーマ細胞の作製
上記（５）で抗血清の力価、ＡｐｏＥ４との反応性を確認したマウスについてモノクローナル抗体の作製を行った。まず、血清中の抗ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗体の活性が高くなったマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８）とをＰＥＧ法にて細胞融合を行った。細胞増殖が認められた培養上清液について以下の方法でＡｐｏＥ４フラグメントペプチドに対する抗体活性を調べた。上記（３）で調製したスクリーニング用ＡｐｏＥ抗原を用いてＥＬＩＳＡ法により、培養上清液の反応性を調べた。まず、上記（３）で調製したスクリーニング用ＡｐｏＥ抗原を１．０μｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に希釈し、５０μｌ／ウエルにて９６プレートに固相した。ＰＢＳにて洗浄、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％ＮａＮ_３溶液でブロッキングした後、培養液を５０μｌ／ウエルに入れ、４℃で一晩反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて４回洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを５０μｌずつ各ウエルに添加し、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、０．４ｍｇ／ｍｌになるようにＯＰＤを０．０３％過酸化水素水を含む０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、１００μｌずつ各ウエルに入れ、室温で１５分間遮光状態で放置し、発色させた。発色後、１Ｎ硫酸１００μｌを各ウエルに加え、反応を停止させ４９０ｎｍの吸光度を測定した。この中で、特異性のある抗体活性が認められたウエルを選抜した。次に選抜されたウエルの細胞について限界希釈法を用いた細胞クローニングを行った。その結果ＡｐｏＥ４に特異的に反応する抗ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をクローン化した。
（７）抗ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの結合体作製
抗ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの結合体の作製は以下の手順に従った。上記のようにして産生された抗ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗体２０ｍｇをペプシン消化し、ゲル濾過することにより抗ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗体のＦ（ａｂ’）_２フラグメントを精製し、２−メルカプトエタノールを用いることによりＦ（ａｂ’）_２フラグメントをＦａｂ’フラグメントに還元した。ＨＲＰとＥＭＣＳとを３７℃で６０分反応させ、ゲル濾過することによりＨＲＰ−ＥＭＣＳ結合体を作製し、この結合体とＦａｂ’フラグメントとを４℃で一晩反応させ、ゲル濾過することによりＥＭＣＳ架橋による抗ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの結合体を作製した。
実施例２
ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の全てに対する抗体の調製：
ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の全てに対する抗体は、これらの共通アミノ酸配列である２８１番から２９９番のＮ末端側にシステイン（Ｃ）を結合したＣＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ（配列番号４）のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドを用い、実施例１と同様に作製した。
実施例１および実施例２で作製した抗体の特異性を図１に示す。図１から明らかなように実施例１で作製した抗体はＡｐｏＥ４のみと反応性を示し、実施例２で作製した抗体はＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４の全てと反応性を示した。
実施例３
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築とＡｐｏＥ４の測定：
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築は以下のように作製した。１０μｇ／ｍｌの実施例２で作製したＡｐｏＥ２、Ｅ３およびＥ４の全てに対し特異的に反応する抗体を１００μｌずつ９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。４℃で一晩反応させた後、１．０％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ_３溶液にてブロッキングを行い、これをサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。実施例１の（７）で作製した、抗ＡｐｏＥ４フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの結合体を標識抗体とした。ＡｐｏＥ４との反応性の測定は以下のように行った。サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートに実施例１の（３）で調製した標準液を１００μｌ加え、３７℃で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで４回洗浄、標識抗体を１００μｌ加え、３７℃で３０分反応させた。反応後、００５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢ溶液を１００μｌ加え、室温、遮光下で３０分放置した。１Ｎ硫酸で反応を止め、４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＡｐｏＥ４を特異的に測定でき、検量線を作成することができた。
実施例４
酵素免疫測定試験：
（１）検体
ボランティアの全血液の３５検体を対象とした。全血液１０μｌに対し、１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝溶液を５００μｌ加えて５１倍希釈したものを検体とした。
（２）免疫反応
実施例３で作製したサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエル中に、上記（１）で作製した検体を１００μｌ加え、プレートカバーをして３７℃で１時間反応させた。
１時間経過後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝溶液からなる洗浄液で、７回洗浄した。推奨する洗浄方法は、プレートの各ウェルを洗浄ビンに入れた洗浄液を用いて勢い良く洗い流しその後、洗浄液をウェルに満たし１５〜３０秒間静置しプレートを逆さまにして振り払い洗浄液を完全に除去する方法である。この洗浄操作を規定回数以上行い、ペーパータオル等の上でたたいてウェルの水分を完全に除去する。プレートウォッシャーによる洗浄は、機種により洗浄が不十分な場合があるので洗浄後、さらに上記洗浄方法による洗浄を３回程度おこなう。
次いで、実施例１で得られた、ＨＲＰで標識されたＡｐｏＥ４を特異的に認識する抗体を１００μｌ添加し、プレートカバーをして３７℃にて３０分間反応させた。３０分間経過後、前述したのと同様の方法で洗浄を９回行った。
さらに、精製水５ｍｌと０．０１％の過酸化水素を含有する緩衝溶液５ｍｌとを混合して得られる基質用緩衝液に、１ｍｇのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンタブレット；シグマ社製）タブレットの２錠を溶解したものをＴＭＢ基質液とし、そのＴＭＢ基質液をウエルに１００μｌ添加し、遮光をして室温で３０分間反応させた。ＴＭＢ基質液添加後、反応液は徐々に青色に変わる。更に１Ｎ硫酸からなる停止液をウエルに１００μｌ添加し、プレートの側面を軽くたたいて均一になるように混和する。停止液添加後、反応液は青色から黄色に変化する。
前記と同様の操作を検体のかわりにＡｐｏＥ４ホモ遺伝子型とＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液１（ＡｐｏＥ４（和光純薬工業製）を１．２μｇ／ｍｌに濃度調整したものを精製水で５１倍希釈したもの：以下、「標準液１」という）、ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とＡｐｏＥ４以外の遺伝子型とを判別しうる標準液２（ＡｐｏＥ４（和光純薬工業製）を０．２４μｇ／ｍｌに調整したものを精製水で５１倍希釈したもの：以下、「標準液２」という）および試薬ブランクに変えたものについて、１つの検体用プレートで同時に行った。また、検体用プレートと同様の操作を検体ブランク用プレートについても行った。
（３）吸光度測定
（２）の抗体反応を行った後、プレート底面のよごれや水滴を拭き取り液面に気泡がないことを確認して、３０分以内に試薬ブランクを対照として検体、標準液１および標準液２の波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。同様に検体ブランク用プレートについても測定を行う。
測定した吸光度を以下のように定義する。
検体用プレート
検体の吸光度＝Ａとする。
標準液１の吸光度＝Ｂとする。
標準液２の吸光度＝Ｃとする。
検体ブランク用プレート
検体ブランクの吸光度＝Ｄとする。
標準液１の吸光度＝Ｅとする。
標準液２の吸光度＝Ｆとする。
（４）吸光度の補正方法
検体用プレートの吸光度から検体ブランク用プレートで得られた吸光度を各々引いた値を補正後の吸光度とする。
（Ａ）検体の吸光度＝Ａ−Ｄ＝Ｓとする
（Ｂ）標準液１の吸光度＝Ｂ−Ｅ＝Ｃ１とする
（Ｃ）標準液２の吸光度＝Ｃ−Ｆ＝Ｃ２とする
（５）吸光度の判定方法
上記のように補正された吸光度を表２に示す判定基準により遺伝子型を判定した。

（６）結果
上記のようにして得られた吸光度とＰＣＲ法による遺伝子型の判定結果との関係を図２に、吸光度より判定した遺伝子型の結果とＰＣＲ法による遺伝子型の判定結果を表３に示す。
なお、ＰＣＲ法による遺伝子型の判定は、ヒクソンらの方法（ＨｉｘｓｏｎＪＥａｎｄＶｅｒｎｉｅｒＤＴ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．１９９０，Ｍａｒ，３１（３）：５４５−８）に準じて行われた。

また、本発明の検出方法とＰＣＲ法との一致率（ｎ＝３５）を下記表４に示した。

図２、表４および表５から明らかなように本発明方法によれば、ＰＣＲ法による遺伝子型の判定結果と全く同一の判定結果が得られた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、従来より病院などの検査室で汎用されている自動比色装置がそのまま使用可能であり、特別な装置を必要としないので、従来のＰＣＲ法に比べきわめて安価にアルツハイマー危険因子を検出することができる。
また遺伝子検査では遺伝子を持つ細胞（白血球など）が必須であるが、本発明では試料としての検体は、全血液または血清および血漿が使用可能であるので血清・血漿など適応範囲が広がるものである。
従って本発明は、現行において確定検査とされるＡｐｏＥ遺伝子検査の前に大量の検体を測定するスクリーニングの検査として、きわめて有効なものである。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１および実施例２で作製された抗体の特異性を示す図である。
第２図は、実施例４で得られた吸光度とＰＣＲ法による遺伝子型の判定結果の関係を示す図である。

Claims

次の試薬（ａ）、（ｅ）および（ｆ）を含有するアルツハイマー危険因子の検出キット
（ａ）アポリポプロテインＥ４に特異的な抗体を含む試薬
（ｅ）ＡｐｏＥ４ホモ遺伝子型とＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液１
（ｆ）ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とＡｐｏＥ４以外の遺伝子型とを判別しうる標準液２
次の試薬（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）を含有するアルツハイマー危険因子の検出キット。
（ａ）アポリポプロテインＥ４に特異的な抗体を含む試薬
（ｂ）アポリポプロテインＥ２、アポリポプロテインＥ３およびアポリポプロテインＥ４の全てに対する抗体を含む試薬
（ｅ）ＡｐｏＥ４ホモ遺伝子型とＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液１
（ｆ）ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とＡｐｏＥ４以外の遺伝子型とを判別しうる標準液２
次の試薬（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を含有するアルツハイマー危険因子の検出キット。
（ｃ）標識された、アポリポプロテインＥ４に特異的な抗体を含む試薬
（ｄ）固相化された、アポリポプロテインＥ２、アポリポプロテインＥ３およびアポリポプロテインＥ４の全てに対する抗体を含む試薬
（ｅ）ＡｐｏＥ４ホモ遺伝子型とＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液１
（ｆ）ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とＡｐｏＥ４以外の遺伝子型とを判別しうる標準液２
アポリポプロテインＥ４に特異的な抗体が、ＡＤＭＥＤＶＲＧＲＬＶ（配列番号１）で表されるペプチド配列を有するポリペプチドを認識する抗体である請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載のアルツハイマー危険因子の検出キット。
アポリポプロテインＥ２、アポリポプロテインＥ３およびアポリポプロテインＥ４の全てに対する抗体が、ＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ（配列番号３）で表されるペプチド配列を有するポリペプチドを認識する抗体である請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載のアルツハイマー危険因子の検出キット。
検体とアポリポプロテインＥ４に特異的な抗体を反応させたものの吸光度を測定し、ＡｐｏＥ４ホモ遺伝子型とＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液１の吸光度と、ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とＡｐｏＥ４以外の遺伝子型とを判別しうる標準液２の吸光度を指標に、検体中のアポリポプロテインＥ４の遺伝子型を検出することを特徴とするアルツハイマー危険因子の検出方法。
検体とアポリポプロテインＥ２、アポリポプロテインＥ３およびアポリポプロテインＥ４の全てに対する抗体とを反応させ、次いで得られた複合体にアポリポプロテインＥ４に特異的な抗体を反応させたものの吸光度を測定し、ＡｐｏＥ４ホモ遺伝子型とＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液１の吸光度と、ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とＡｐｏＥ４以外の遺伝子型とを判別しうる標準液２の吸光度を指標に、検体中のアポリポプロテインＥ４の遺伝子型を検出することを特徴とするアルツハイマー危険因子の検出方法。
検体が全血液、血清または血漿である請求項第６項または第７項記載のアルツハイマー危険因子の検出方法。
アポリポプロテインＥ２、アポリポプロテインＥ３およびアポリポプロテインＥ４の全てに対する抗体が固相化されたものであり、アポリポプロテインＥ４に特異的な抗体が標識されたものである請求項第７項または第８項記載のアルツハイマー危険因子の検出方法。
請求項第１項ないし第５項の何れかの項記載のアルツハイマー危険因子の検出キットを用いて、検体中のアポリポプロテインＥ４の遺伝子型を検出することを特徴とするアルツハイマー危険因子の検出方法。
検体とアポリポプロテインＥ４に特異的な抗体を反応させたものの吸光度を測定し、ＡｐｏＥ４ホモ遺伝子型とＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とを判別しうる標準液１の吸光度と、ＡｐｏＥ４ヘテロ遺伝子型とＡｐｏＥ４以外の遺伝子型とを判別しうる標準液２の吸光度を指標に、検体中のアポリポプロテインＥの遺伝子型を判別することを特徴とするアポリポプロテインＥの遺伝子型判別方法。