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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues in vitro Verfahren für die Diagnose
und insbesondere Frühdiagnose
von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere von Demenzerkrankungen
wie der Alzheimer Krankheit und deren Vorstufen.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird dabei der Begriff "Diagnose" als Oberbegriff
für medizinische
Bestimmungen gebraucht, denen je nach dem klinischen Zustand des
Patienten, bei dem die Bestimmung durchgeführt wird, unterschiedliche
Fragestellungen zugrunde liegen können und die der Erkennung
und im vorliegenden Falle insbesondere auch der Früherkennung,
der Bestimmung des Schweregrads und der Verlaufsbeurteilung, auch
der therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung, und der Prognose des
zukünftigen Verlaufs
einer Erkrankung dienen. Dabei ist im vorliegenden Zusammenhang
von besonderer Bedeutung, dass eine Diagnose auch eine Negativdiagnose
sein kann, bei der z.B. aufgrund der Nichtfeststellbarkeit einer bestimmten
krankheitstypischen Biomarkerkonzentration in einer Blutprobe eines
Patienten das Vorliegen einer bestimmten Erkrankung unwahrscheinlich
gemacht wird.
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Für die Negativdiagnose
sind auch Biomarker von großem
Wert, für
die bei mehreren verschiedenen Krankheiten pathologisch veränderte Konzentrationen
festgestellt werden können
und die daher allein, für
sich genommen, noch keine positive Diagnose einer spezielle Krankheit
ermöglichen – obwohl
sie in der Regel bei Hinzuziehung weiterer klinischer oder biochemischer
Parameter auch für
die Positivdiagnose entscheidend sein können.
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Die
Erkrankungen, um deren Diagnose es bei der vorliegenden Erfindung
geht, sind sich eher langsam entwickelnde, chronische neurodegenerative
Erkrankungen von nichtinfektiöser Ätiologie,
insbesondere Demenz-Erkrankungen.
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Als
Demenz-Erkrankungen (Dementia) werden generell Krankheiten bezeichnet,
für die
ein gemeinsames Merkmal ist, dass erworbene intellektuelle Fähigkeiten,
v.a. das Gedächtnis,
und das normale Persönlichkeitsniveau
als Folge von Hirnschädigungen
beeinträchtigt
sind. Demenzerkrankungen sind in der Regel sich relativ langsam
entwickelnde Krankheiten von chronischem Charakter. Treten Demenzerscheinungen
vor dem hohen Alter im mittleren Lebensalter auf, werden sie als
präsenile
Demenz-Erkrankungen bezeichnet. Bei Demenz-Erkrankugnen unterscheidet
man auf der Basis der für
sie typischen Symptome und hirnpathologischen Veränderungen
insbesondere die folgenden Erkrankungen bzw. Gruppen von Erkrankungen:
Die
Alzheimer Demenz (AD) (Alzheimer Krankheit; Morbus Alzheimer) ist
die häufigste
neurodegenerative Demenz-Erkrankung, macht 2/3 aller Demenzfälle aus
und stellt auch das praktisch wichtigste Anwendungsgebiet für die vorliegende
Erfindung dar. AD zeichnet sich durch drei wichtige, allerdings
erst post mortem mit Sicherheit feststellbare pathologische Merkmale
aus: die Bildung von Amyloid-Plaques und neurofibrillären Bündeln sowie
den Verlust an Nervenzellen (Übersicht
s. (1); Literaturangaben in der Beschreibung in Form von Zahlen
beziehen sich auf die der Beschreibung folgende Literaturliste).
Amyloid-Plaques bestehen aus extraneuronalen Aggregaten des Amyloid-β-Proteins,
während
die Neurofibrillenbündel
hauptsächlich
Tau-Protein und Neurofilamente enthalten. Es wird vermutet, dass
die Plaque- und
Neurofibrillenbildung die Ursache für das Absterben von Nervenzellen
ist.
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Die
wichtigsten Symptome von AD sind zunehmende Merkfähigkeits-
und Denkstörungen
bei relativ lang anhaltender Gemütsansprechbarkeit,
wobei diese Symptome von weiteren weniger spezifischen Störungen begleitet
werden, die die Abgrenzung der AD von anderen Demenzformen erschweren.
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Beobachtungen
an AD-Patienten und Patienten, die im Laufe ihrer langjährigen klinischen
Beobachtung AD entwickelten, führten
zur Formulierung von Kriterien für
gegeneinander abgrenzbare Patientengruppen, die die ganze Breite
von
- (a) Personen ohne subjektive und objektive
kognitive Störungen
(die im Rahmen der vorliegenden Anmeldung die Kontrollgruppe repräsentieren), über
- (b) Patienten, die über
subjektiv empfundene kognitive Leistungseinbußen klagen, bei denen jedoch
keine kognitiven Defizite festgestellt werden können (im Rahmen der vorliegenden
Anmeldung ist das die Gruppe der "SKS"-Patienten,
wobei "SKS" für "subjektive kognitive
Störungen" steht), weiter über
- (c) Patienten, bei denen leichte kognitive Störungen feststellbar
sind und bei denen dann, wenn keine anderen demenzverursachenden
Erkrankungen vorliegen, die Diagnose "möglicherweise
AD" ("mgl AD") gestellt wird (im
Rahmen der vorliegenden Anmeldung ist das die Gruppe "LKS mgl AD", wobei "LKS" für "leichte kognitive
Störungen" steht) bis hin
- (d) zur Gruppe der Patienten mit dem typischen Bild erheblicher
kognitiver Störungen,
die schleichend begonnen haben und langsam progredieren, für die dann,
wenn andere Demenz-Ursachen ausgeschlossen werden können, die
Diagnose "wahrscheinlich
AD" gestellt wird
(im Rahmen der vorliegenden Anmeldung ist das die Gruppe "ws AD", wobei die Abkürzung für "wahrscheinlich Alzheimer" steht),
abdecken.
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Bezüglich der
Zuordnung von Patienten mit subjektiven und/oder objektiven kognitiven
Störungen
zu verschiedenen Gruppen wird ergänzend verwiesen auf (2), (3),
(4) und (5).
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Die
Demenz mit Lewy-Körperchen
(dementia with lewy-bodies: DLB) ist nach der Alzheimer Demenz die
zweithäufigste
Ursache für
eine demenzielle Erkrankung. Neuropathologisch ist die DLB durch
das Auftreten von sogenannten Lewy-Körperchen im Hirnstamm und im
Cortex charakterisiert. Diese Lewy-Körperchen bestehen überwiegend
aus Aggregaten des präsynaptischen
Proteins α-Synuclein
und Ubiquitin. Die Lewy-Body-Pathologie
kann in unterschiedlichem Ausmaß mit
Alzheimer und Parkinson-typischen neuropathologischen Veränderungen
assoziiert sein. So kommt es auch bei der DLB zur Bildung von beta-Amyloid
und senilen Plaques, jedoch nicht zu Neurofibrillenbündeln (Übersicht
s. (6)). Lewy-Körperchen
sind auch im Gehirn von Patienten mit Morbus Parkinson vorhanden,
wenn auch in einer unterschiedlichen Verteilung.
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Kernsymptome
von DLB sind eine progrediente kognitive Störung, Verwirrtheitsepisoden
mit fluktuierender Aufmerksamkeits- und Bewusstseinslage, Parkinsonismus,
häufige
Stürze
und Synkopen (anfallsartige, kurz dauernde Bewusstlosigkeit). Die
Sensitivität
und Spezifität
der diagnostischen Kriterien zeigen durchgehend eine hohe Spezifität, aber
zum Teil eine sehr niedrige Sensitivität. Das bedeutet, dass die DLB
im klinischen Alltag häufig
nicht diagnostiziert wird.
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Die
Frontotemporale Demenz (FTD) wird auch als Pick'sche Krankheit bezeichnet und macht
ca. 20% der präsenilen
Demenzerkrankungen aus. FTD ist teilweise genetisch bedingt und
zählt zu
den sogenannten Tauopathien, die sich durch eine Über- oder
Unterexpression eines Tauprotein-Subtyps bzw. durch die Expression
eines mutierten Tauproteins auszeichnen. Neuropathologisch kommt
es zu einer lokalen Atrophie des frontalen und/oder temporalen Cortex
sowie der Substantia Nigra und der Basalganglien. Dies hat unterschiedlich
ausgeprägte
Sprachstörungen,
eine Wesensänderung
sowie Verhaltensauffälligkeiten
zur Folge. Insgesamt ist die FTD mit einer Sensitivität von 93%
bei einer Spezifität
von nur 23% unterdiagnostiziert, wobei die AD die häufigste
Fehldiagnose darstellt.
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Unter
dem Begriff vaskuläre
Demenz (vascular dementia; VAD) werden Erkrankungen zusammengefasst,
bei denen eine Demenz durch Durchblutungsstörungen im Gehirn ausgelöst wird.
Es gibt unterschiedliche Typen der VAD, von denen die Multi-Infarkt-Demenz (MID)
und die subcorticale VAD (auch als Binswanger'sche Erkrankung bezeichnet) die häufigsten
Formen darstellen.
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Bei
der Binswanger'schen
Erkrankung handelt es sich um eine langsam progrediente demenzielle
Entwicklung, die pathologisch durch cerebrovasculäre Läsionen in
der weißen
Hirnsubstanz charakterisiert ist. Klinisch resultiert dies in Verhaltensauffälligkeiten
wie Agitation, Reizbarkeit, Depression und Euphorie sowie einer
leichten Gedächtnisstörung.
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Die
Multi-Infarkt-Demenz entsteht allmählich als Folge von mehreren
kleinen Schlaganfällen,
auch als transiente ischämische
Attacken (TIA) bezeichnet, die zum Untergang von Hirngewebe im Cortex
und/oder subcortikalen Arealen führten.
Die Schlaganfälle
können
auch gänzlich
unbemerkt geblieben sein, die Demenz ist in diesem Falle die erste
spürbare Folge.
Bei Vorliegen einer MID kommt es zur stufenweisen Abnahme kognitiver
Fähigkeiten,
verbunden mit schweren Depressionen, Stimmungsschwankungen und Epilepsie.
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Eine
Diagnose von Demenz-Erkrankungen erfolgt heutzutage überwiegend
auf der Basis neuropsychologischer Untersuchungen und der Beobachtung
der Krankheitsentwicklung und ihres Verlaufs, unter Heranziehung
von Ausschlusskriterien für
bestimmte Demenzformen. Diese Untersuchungen liefern in sehr vielen Fällen mehrdeutige
Ergebnisse, die die o.g. Zahlen für die unterdiagnostizierten
Demenzformen oder unrichtig diagnostizierten Fälle erklären. Die krankheitstypischen
Gehirnveränderungen
können
an lebenden Patienten naturgemäß nicht
direkt festgestellt werden, und apparatemedizinische Untersuchungen
der Gehirnfunktionen mittels z.B. Computer- oder Magnetresonanz-Tomographie sind
aufwändig
und teuer.
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Es
wäre daher
wünschenswert,
die Erkennung und insbesondere Früherkennung von Demenzerkrankungen
durch die Messung von aussagekräftigen
Biomarkern, die mit Hilfe eines relativ einfachen Testverfahrens
z.B. in einer Blutprobe (Serumprobe, Plasmaprobe) eines Patienten
bestimmt werden können,
ergänzen und
dadurch erheblich verbessern zu können.
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Für die Alzheimer-Diagnostik
veröffentlichten
das Ronald und Nancy Reagan Institut der Alzheimer Association und
die NIA-Working Group Richtlinien für die Kriterien, die an einen
idealen Biomarker zur Detektion der AD gestellt werden (7). Folgende
Kriterien sollen im Idealfall durch den Biomarker erfüllt werden:
- 1. Er sollte hirnspezifisch sein und ein fundamentales
Merkmal der Neuropathologie dieser Erkrankungen detektieren.
- 2. Die diagnostische Sensitivität und die Spezifität von mindestens
80% sollte gegeben sein.
- 3. Die krankheitsspezifische Veränderung des Biomarkers sollte
sich in einem möglichst
frühen
Stadium der Erkrankung manifestieren, um mit geeigneten Therapiemaßnahmen
beginnen zu können
(8).
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Bis
jetzt gibt es jedoch keinen in der Zirkulation (d.h. im Blut bzw.
in Blutpräparaten
wie Serum oder Plasma) eines Patienten nachweisbaren Biomarker,
der im klinischen Alltag zur Verbesserung der Früh- und Differentialdiagnose
von AD herangezogen werden könnte
und alle o.g. Kriterien erfüllt.
Aktuell werden verschiedene potentielle Markerkandidaten untersucht,
darunter Inflammationsmarker wie IL-6 und TNF α, Marker für oxidativen Stress wie 3-Nitrotyrosin,
sowie Marker, die mit charakteristischen pathologischen Veränderungen
der AD assoziiert sind, wie Amyloid β, das einen Hauptbestandteil
der Amyloid-Plaques darstellt, und das Tau-Protein, das einen wesentlichen
Bestandteil der Neurofibrillenbündel
darstellt (vgl. die Übersicht
in (7); (9)).
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Es
besteht ein aktueller Bedarf nach ergänzenden, valide Laborbefunde
liefernden Untersuchungsmethoden, die auf einer Bestimmung von als
Biomarker für
Demenzerkrankungen, insbesondere für die Alzheimer Demenz (AD),
geeigneten Substanzen in Blut- bzw. Plasmaproben beruhen und bei
Patienten, bei denen der Verdacht auf Vorliegen einer Demenzerkrankung,
insbesondere von AD, besteht, unterstützend für eine frühe Positivdiagnose und/oder
für eine
negative Ausschlussdiagnose geeignet sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine solche Untersuchungsmethode in
Form eines in vitro Verfahrens zur Erkennung und Früherkennung,
zur Bestimmung des Schweregrads und zur Verlaufsbeurteilung und
Prognose von neurodegenerativen Erkrankungen bereit, bei dem man
in einer Serum- oder Plasmaprobe eines Patienten, der an subjektiven
oder objektiv nachweisbaren kognitiven Störungen leidet, mit Hilfe eines
immundiagnostischen Bestimmungsverfahrens die Apo C-I-Immunreaktivität bestimmt,
und bei dem man auf der Basis der dafür gemessenen Konzentration
Schlüsse
hinsichtlich des Vorliegens einer neurodegenerativen Erkrankung
oder einer für
diese typischen Frühform
davon oder hinsichtlich des Verlaufs der Erkrankung und/oder des
Erfolgs der Bemühungen
zu ihrer Abmilderung oder Verhinderung zieht.
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Vorteilhafte
bzw. bevorzugte Ausgestaltungen eines Verfahrens gemäß Anspruch
1 sind in den Unteransprüchen
2 bis 8 wiedergegeben.
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Grundlage
der vorliegenden Erfindung ist der experimentelle Befund, dass im
Blut (Serum, Plasma) von Patienten mit kognitiven Störungen bis
hin zur Diagnose "möglicherweise
Alzheimer" oder "wahrscheinlich Alzheimer" im Vergleich mit
Kontrollpersonen auf charakteristische Weise verminderte Konzentrationen
des immunreaktiven Apo C-I gemessen werden.
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Wenn
im Rahmen der vorliegenden Anmeldung von "immunreaktivem Apo C-I" oder "immundiagnostisch
bestimmbarem Apo C-I" gesprochen
wird, wird damit ein Analyt definiert, wie er mit Hilfe eines Immunoassays,
insbesondere eine Immunoassays, wie er im experimentellen Teil der
vorliegenden Anmeldung bzw. in der deutschen Patentanmeldung
DE 103 43 815 A1 der
Anmelderin näher
beschrieben wird, bestimmbar ist.
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Wie
in der genannten
DE
103 43 815 A1 – auf
deren gesamten Inhalt, soweit dieser die Assaydurchführung und
die Diskussion zu den damit bestimmbaren Apo C-I Molekülen bzw.
Apo C-I-Abkömmlingen
betrifft, zur Ergänzung
der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung ausdrücklich Bezug genommen wird – erläutert wird,
werden mit einem Immunoassay der genannten Art in Blut von gesunden
Kontrollpersonen solche Apo C-I-Anteile
bestimmt, die eine Bindefähigkeit
gegenüber
hydrophoben Molekülstrukturen
bzw. hydrophoben Oberflächen
aufweisen und die durch Umsetzung mit einem geeigneten Material
für die
hydrophobe Ausschlusschromatographie (z.B. Octylsepharose) aus der
Probe entfernbar sind.
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Das
auf die beschriebene Weise bestimmbare Apo C-I bzw. der entsprechende
Apo C-I-Abkömmling wird
dabei auch als "freies
Apolipoprotein C-I" bezeichnet.
Es weist die Eigenschaften auf, aus einer Serum- oder Plasma-Probe
(in PBS Verdünnung)
heraus an hydrophobe Molekülstrukturen,
z.B. die Octylreste eines hydrophoben Octylsepharose-Chromatographie-Materials,
gebunden zu werden, von dem es unter typischen Bedingungen für die Elution
von Proteinen, insbesondere mit verdünnter Essigsäure, eluiert
werden kann. Die Verwendung des Begriffs "freies Apolipoprotein C-I" bedeutet jedoch
nicht notwendigerweise, daß das
durch hydrophobe Interaktionschromatographie abtrennbare Material
in den Ursprungsproben völlig
frei vorliegen muss. Assoziate bzw. Aggregate, auch mit Lipiden,
die unter den Versuchsbedingungen beim Kontakt mit Octylsepharose
unter Bindung des Apolipoproteins C-I an das Chromatographiermaterial
aufgebrochen werden, sind ebenfalls als "freies Apolipoprotein C-I" im Sinne der Verwendung
dieses Begriffs anzusehen.
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Wie
der genannten
DE 103
43 815 A1 zu entnehmen ist, erkennt der genannte Immunoassay
im Blut von Krebspatienten auch eine Apo C-I-Fraktion, die nicht
an Octylsepharose bindet und deren Auftreten für Tumorerkrankungen charakteristisch
zu sein scheint. Ggf. wäre
daher im Rahmen der Gesamtdiagnose auf eine Demenzerkrankung bzw.
auf deren Vorstufen unter Verwendung der bei der Bestimmung des
immunreaktiven Apo C-I gewonnenen Messwerte auszuschließen, dass
die Messwerte bei dem jeweiligen Patienten durch eine Krebserkrankung
verfälscht
werden. Das kann beispielsweise auf die in der
DE 103 43 815 A1 beschriebene
Weise erfolgen, indem man prüft,
ob sich die gemessenen Konzentrationswerte durch einen Kontakt der
Probe mit z.B. Octylsepharose verändern.
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Das
gemäß der vorliegenden
Erfindung zu bestimmende immunreaktive Apo C-I umfasst neben Analyten,
die das vollständige
Peptid Apo C-I darstellen oder enthalten, auch "Apo C-I Abkömmlinge". Darunter sind insbesondere immunreaktive
Apo C-I-Fragmente und Aggregate zu verstehen, insbesondere solche,
die sich in dem genannten Sandwich-Immunoassay wie das freie Protein
Apolipoprotein C-I verhalten. Die "Abkömmlinge" können z.B.
um einzelne Aminosäuren
oder Aminosäuresequenzen
verkürzte
Apolipoprotein C-I-Moleküle
sein, oder auch – z.B.
durch Aggregation – sterisch
oder konformationell veränderte
vollständige Apolipoprotein
C-I-Moleküle.
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Dass
auch die Bestimmung solcher Apo C-I-Abkömmlinge von der Erfindung umfasst
sein soll, trägt den
bekannten Tatsachen Rechnung, dass Immunoassays normalerweise nicht
zwischen unterschiedlichen Analyten unterscheiden können, wenn
die Unterschiede außerhalb
der für
die Antikörperbindung
genutzten Molekülabschnitte
liegen, d.h. im Falle eines Sandwich-Immunoassays in Endbereichen des erfassten
Moleküls
außerhalb
der von den beiden Bindungsstellen für die Antikörper begrenzten Aminosäuresequenz.
Ferner soll der weiteren bekannten Tatsache Rechnung getragen werden,
dass dann, wenn peptidische Analyten in der Zirkulation auftreten,
stets auch mit dem Auftreten ihrer Abbauprodukte in Form von Peptidfragmenten
zu rechnen ist. Die Konzentrationen derartiger Fragmente sind in
der Regel in etwa proportional zu der Konzentration des Ausgangspeptids,
wobei die Konzentrationsunterschiede Stabilitätsunterschiede bzw. unterschiedliche
Geschwindigkeiten des "Clearings" der Peptide bzw.
Fragment durch weiteren proteolytischen Abbau oder durch Ausschleusung
aus dem Kreislauf z.B. über
die Nieren widerspiegeln.
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Soweit
in der Literatur eine Diskussion von Apo C-I im Zusammenhang mit
der Alzheimer Krankheit gefunden werden kann, handelt es sich ausschließlich um
Untersuchungen zur Apolipoprotein C-I Expression in Extrakten von
Gehirngewebe Verstorbener, jedoch nicht in der Zirkulation lebender
Patienten (vgl. 10). Angesichts der Existenz der Blut-Hirn-Schranke (blond-brain
barrier, BBB), die einen Schrankeneffekt für den Übergang von z.B. proteinischen
Substanzen zwischen dem Gehirn und der Zirkulation ausübt, können aus Untersuchungen
mit Gehirngewebeextrakten keine Schlüsse bezüglich des Auftretens bzw. der
Konzentration von proteinischen Substanzen in der Zirkulation gezogen
werden.
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Soweit
im Rahmen der in der
DE
103 43 815 A1 beschriebenen chromatographischen Untersuchungen
auch Fraktionen aus Seren von zwei Alzheimer-Patienten vermessen
wurden, wurden keine statistisch signifikanten Ergebisse erhalten,
die einen Schluss bezüglich
eines Zusammenhangs zwischen der Konzentration des immunreaktiven
Apo C-I und verschiedenen Stufen von Demenzerkrankungen bzw. der
Alzheimer-Krankheit erlauben würden.
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Die
nachfolgend im experimentellen Teil beschriebenen Messergebnisse
in EDTA-Plasmaproben von 60 augenscheinlich gesunden Normalpersonen
(symptomfreien Kontrollen) und 196 Patienten mit leichten bis schweren
kognitiven Störungen
gemäß den eingangs
beschrieben Gruppen (b) bis (d) ergab erstmals eine klare, diagnostisch
signifikante Korrelation zwischen den für immunreaktives Apo C-I gefundenen
Konzentrationen und der Schwere der Demenzsymptome in Form kognitiver
Störungen,
wobei die gemessenen Konzentrationen in signifikanter Weise mit
der Schwere von AD-Vorstufen korrelierten und damit die klinische
Unterscheidung der verschiedenen Patientengruppen widerspiegelten.
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Die
erfindungsgemäße Bestimmung
von immunreaktivem Apo C-I im Rahmen der Diagnostik von neurodegenerativen
Erkrankungen wird insbesondere als Messung vorgeschlagen, die die
parallele Bestimmung physiologischer bzw. klinischer und neuropsychologischer
Parameter und anderer Biomarker ergänzt und für differentialdiagnostische
Zwecke verfeinert.
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Das
Verfahren wird daher bevorzugt im Rahmen einer Multiparameter-Bestimmung
durchgeführt,
bei der gleichzeitig mindestens ein weiterer für das jeweilige Krankheitsbild
aus sagekräftiger
biochemischer oder physiologischer Parameter bestimmt wird und bei
der ein Messergebnis in Form eines Satzes von mindestens zwei Messgrößen gewonnen
wird, der zur Feindiagnostik der neurodegenerativen Erkrankung ausgewertet wird.
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Neben
der Bestimmung des immunreaktiven Apo C-I kann z.B. wenigstens ein
weiterer biochemischer Parameter bestimmt werden, der aus den Gruppen
der natriuretischen Peptide, Entzündungsmediatoren, Komplementkomponenten,
Cytokine, Chemokine, der Blutkoagulanzien und fibrinolytischen Faktoren,
Akutphasenproteine und radikalischen Verbindungen ausgewählt ist.
Als Co-Parameter sind insbesondere auch zu nennen diejenigen Parameter,
die in den älteren
deutschen Patentanmeldungen der Anmelderin mit den Aktenzeichen
10 2005 034 174.8 (midregionales
Proadrenomedullin),
10 2005
036 094.7 (liquordiagnostische Bestimmung von Procalcitonin),
10 2006 027 818.6 und
10 2006 023 175.9 diskutiert
werden sowie der Parameter CPS-1 (Carbamoylphosphat Synthetase 1),
zu dem sich relevante Diskussionen im Hinblick auf neurodegenerative
Erkrankungen in den Anmeldungen
EP
05023420.2 und
DE
10 2006 021 406.4 finden.
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Es
ist dabei vorgesehen, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch als Simultanbestimmung
mittels einer Chiptechnologie-Messvorrichtung
oder einer immunchromatographischen Messvorrichtung erfolgen kann
und die Auswertung der dabei ggf. erhaltenen komplexen Messergebnisse
mit Hilfe eines geeigneten Computerprogramms erfolgen kann.
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Obwohl
die Untersuchungen bisher auf Plasmaproben von Patienten beschränkt waren,
die Anzeichen von Vorstufen von AD zeigten bzw. für die die
Diagnose "wahrscheinlich
Alzheimer" gestellt
worden war, gehen die Erfinder davon aus, dass – möglicherweise mit unterschiedlichen
typischen Konzentrationsbereichen – auch bei anderen neurodegenerativen
Erkrankungen, insbesondere bei vaskulärer Demenz (VAD) und Demenz
mit Lewy-Körperchen
(DLB), charakteristische Veränderungen
der Konzentrationen des immunreaktiven Apo C-I in Patientenplasmen
feststellbar sein könnten.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Messergebnissen und einer Figur noch
näher erläutert.
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1 zeigt
die Ergebnisse der Messung der Konzentrationen des immunreaktiven
Apo C-I, wie sie mit dem im experimentellen Teil beschriebenen Sandwich-Immunoassay
bestimmbar sind, und zwar in EDTA-Plasmen von 60 gesunden Kontrollpersonen,
und von 196 Patienten mit kognitiven Störungen verschiedener Schwere,
die den o.g. Gruppen (b), (c) und (d), d.h. den Gruppen "SKS" (50 Patienten), "LKS mgl AD" (46 Patienten) und "ws AD" (100 Patienten)
entsprachen.
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Experimenteller Teil
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1. Apolipoprotein C-I-Immunoassay
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Die
direkte Messung von immundiagnostisch bestimmbarem Apo C-I in Plasma
erfolgte mit dem gleichen Sandwich-Immunoassay, wie er bereits in
der deutschen Patentanmeldung
DE 103 43 815 A1 der Anmelderin beschrieben
wird. Im einzelnen ist dieser Assay wie folgt aufgebaut:
Für die direkte
immundiagnostische Bestimmung von Apolipoprotein C-I im Serum wurde
aus den nachfolgend beschriebenen Bestandteilen ein Immunoassay
vom Sandwich-Typ aufgebaut:
- a) Coated Tubes:
Polystyrolröhrchen
(Greiner) wurden mit einem kommerziell erhältlichen polyklonalen affinitätsgereinigten
Antikörper
gegen Apolipoprotein C-I (Bezugsquelle: Acris Antibody, Bad Neuheim, Deutschland)
beschichtet. Der Antikörper
war nach Herstellerangaben durch Immunisierung von Kaninchen mit
humanen Apo C-I erhalten und über
eine Sepharose-Affinitätssäule mit
humanem Apolipoprotein C-I aufgereinigt worden. Zur Beschichtung
wurden 0,2 μg
Antikörper
in 300 μl
PBS an Polystyrolröhrchen (Greiner,
Deutschland) gebunden, die mit Schaf-Anti-Kaninchen IgG-Antikörper (Sigma)
beschichtet waren. Die Bindung wurde nach 18 Stunden bei Raumtemperatur
beendet. Anschließend
wurden die Röhrchen
2 mal mit je 3 ml 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS gewaschen.
Nach ihrer Trocknung in Vakuum wurden die Röhrchen als Festphase für den Apolipoprotein
C-I-Immunoassay verwendet.
- b) Akridiniumester-markierter Antikörper: 100 μg eines anderen Antikörpers gegen
humanes Apolipoprotein C-I (aus Kaninchen; Bezugsquelle: Academie
Bio-Medical Company, Texas, USA) in 100 μl PBS wurden mit 10 μg Akridinium-NHS-Ester (in 10 μl Acetonitril)
umgesetzt. Nach einer 10-minütigen
Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte die Reinigung des markierten
Antikörpers
unter Abtrennung unumgesetzter Bestandteile der Reaktionsmischung
durch HPLC an SW 300 (Waters). Für
seine Verwendung im Immunoassey wurde der markierte Antikörper in
PBS mit 0,5% BSA und 1 mg/ml Kaninchen IgG zur Absättigung
der Röhrchenwände auf
ca. 1 Mio. RLU/300 μl
(RLU = relative Lichteinheiten) eingestellt.
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2. Durchführung der immundiagnostischen
Bestimmung von Apolipoprotein C-I in Serum- bzw. Plasma-Proben
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Serum-
bzw. Plasmaproben wurden 1:10 000 mit PBS, 0,5% BSA verdünnt. Davon
wurden jeweils 300 μl
in die mit dem immobilisierten Antikörper beschichteten o.g. Röhrchen pipettiert
und anschließend
für 4 Stunden
bei Raumtemperatur unter Schütteln
(300 U/min auf einem Heidolph-Kreisschüttler) inkubiert. Der Röhrcheninhalt
wurde anschließend
mit PBS ausgewaschen (4-maliges Befüllen und Dekantieren mit jeweils 1
ml PBS), und an die Röhrchenwand
gebundenes Apolipoprotein C-I wurde innerhalb von 20 Stunden bei Raumtemperatur
und 300 U/min mit 300 μl
je Röhrchen
des akridiniumestermarkierten Anti-Apolipoprotein C-I-Antikörpers umgesetzt.
Danach wurde ungebundener markierter Antikörper durch 5-maliges Waschen
mit je 1 ml PBS entfernt, und die verbleibende Chemilumineszenz
wurde auf bekannte Weise in einem Berthold Luminometer 952 T gemessen.
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Zur
Kalibrierung des Assays wurde ein synthetisches Apolipoprotein C-I
verwendet. Eine typische Standardkurve, wie sie für den obigen
Assay erhalten wird, ist in
3 der
bereits genannten
DE
103 43 815 A1 gezeigt.
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3. Messung der Apo C-I-Immunreaktivität im Plasma
von gesunden Kontrollen und Patienten mit kognitiven Störungen verschiedenen
Schweregrads
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Zur
Ermittlung eines Bezugswerts für
die Konzentration des immundiagnostisch bestimmbaren "freien" Apo C-I wurde eine Messung
in EDTA-Plasmen von 60 symptomfreien Kontrollpersonen durchgeführt, die
weder Symptome kognitiver Störungen
zeigten noch an irgendeiner anderen erkennbaren Erkrankung (Tumorerkrankungen;
schwere Infektion oder Entzündung)
litten, für
die bekannt ist, dass sie die Apo C-I-Spiegel in der Zirkulation
beeinflussen. Für
die Kontrollgruppe wurde ein Mittelwert (Median) für die gemessene
Apo C-I-Konzentration von 332 μg/mi
ermittelt.
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Als
Patientenkollektiv dienten Patienten mit Demenzerscheinungen in
Form kognitiver Störungen
verschiedener Schwere, aufgrund derer eine Zuordnung der einzelnen
Patienten zu einer der o.g. Gruppen (b), (c) bzw (d) erfolgt war.
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Die
gemessenen Konzentrationen an immunreaktivem Apo C-I im Plasma von
gesunden Kontrollen und Patienten mit kognitiven Störungen sind
in 1 gezeigt.
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Die
ermittelten Zahlenwerte in Form der sog. Mediane für die verschiedenen
Patientengruppen waren wie folgt:
| | Median
Kontrollen (n = 60) | Median
SKS (n = 50) | Median
LKS mgl AD (n = 46) | Median
ws AD (n = 100) |
| Apo
C-I (Angaben in μg/ml) | 332,9 | 288,5 | 258,5 | 260,0 |
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Die
Konzentrationen des in Plasmen immundiagnostisch bestimmbaren Apo
C-I, erkennbar an den Werten für
die Mediane der verschiedenen Patientengruppen, sinken mit der Schwere
der Symptome in der Richtung: Kontrollen > SKS > LKS mgl AD ≈ ws ADklar
ab.
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Aus
der bereits erwähnten älteren
DE 103 43 815 A1 ist
es bekannt, dass die messbaren Konzentrationen von Apo C-I auch
bei anderen Krankheiten oder physiologischen Zuständen Abweichungen
von den bei Kontrollpersonen messbaren Werten zeigen; die meisten
einschlägigen
Erkrankungen wie z.B. Sepsis oder Tumoren sind jedoch klinisch in
der Regel einfach diagnostisch von Demenzerkrankungen abgrenzbar
und ihren evtl. Auswirkungen können
daher bei der Stellung einer Diagnose angemessen berücksichtigt
werden.
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Obwohl
Apo C-I somit daher kein gehirnspezifischer Parameter ist, eignet
sich die Messung der Apo C-I-Immunreaktivität in der Zirkulation (Plasma,
Serum) angesichts der o.g. Korrelationen sehr gut für Zwecke der
unterstützenden
AD-Frühdiagnostik.
-
Literatur
-
- 1. SELKOE D.J. (2001). Alzheimer's disease: genes,
Proteins, and therapy. Physiological Reviews 81:741–766
- 2. Boetsch T., Stübner
S. Auer S., Klinisches Bild, Verlauf und Prognose, Kapitel 5 in:
Hampel, Padberg, Möller (Hrsg.),
Alzheimer Demenz - Klinische Verläufe, diagnostische Möglichkeiten,
moderne Therapiestrategien; WVG mbH Stuttgart 2003
- 3. Boetsch T., Operationalisierte Demenzdiagnostik,
Kapitel 6.1 in: Hampel, Padberg, Möller (Hrsg.), Alzheimer Demenz – Klinische
Verläufe,
diagnostische Möglichkeiten,
moderne Therapiestrategien; WVG mbH Stuttgart 2003
- 4. Reisberg B., Ferris S.H., de Leon M.J., Crook T.,
1982, The global deterioration scale for assessment of primary degenerative
dementia, Am J Psychiatry 139:1136–1139
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