-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Alzheimer-Demenz (AD). Die Erfindung
betrifft speziell ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der
Anwesenheit mindestens eines biochemischen Markers, der mit Alzheimer-Demenz assoziiert
ist. Spezieller betrifft die Erfindung einen Immunassay zum Zeitpunkt
der Behandlung, welcher einzigartige Antikörper verwendet, um die Differentialdiagnose
von Alzheimer- gegenüber
Nicht-Alzheimer-Formen der Demenz zu ermöglichen.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Alzheimer-Krankheit,
auch als Alzheimer-Demenz oder AD bezeichnet, ist eine fortschreitende
neurodegenerative Störung,
die einen Gedächtnisverlust
und einen schweren geistigen Verfall verursacht. Diagnostiker haben
lange ein Mittel gesucht, um AD während der Lebenszeit von dementen Patienten
definitiv zu identifizieren, im Gegensatz zu der histopathologischen Überprüfung von
Gehirngewebe, welche das einzige derzeitige verfügbare Mittel ist, um eine letztendliche
Diagnose von AD zu liefern. AD ist die häufigste Form von Demenz, die
mehr als die Hälfte
aller Demenzen ausmacht und so viele wie 4 Millionen Amerikaner
und nahezu 15 Millionen Menschen weltweit betrifft. Demenz kann
mit einem leichten Gedächtnisverlust
und einer leichten Verwirrung beginnen, aber schreitet im Lauf der
Zeit fort, wobei sie eine schwere Beeinträchtigung der intellektuellen
und sozialen Fähigkeiten
erreicht. Im Alter von 65 liegt die gesellschaftliche Prävalenz von
AD zwischen 1 bis 2 %. Bis zum Alter von 75 steigt diese Zahl auf
7 % an, und im Alter von 85 beträgt
sie 18 %. Die Prävalenz
von Demenz bei allen Personen im Alter von mehr als 65 Jahren beträgt 8 %.
Bei denjenigen, die in Heimen oder Anstalten untergebracht sind,
beträgt
die Prävalenz
etwa 50 % in jedem Alter.
-
Die
soziale Auswirkung dieser Krankheit ist enorm, was durch die Bürde, die
Betreuern insbesondere in den späteren
Stadien der Krankheit auferlegt wird, verursacht wird. Die beträchtlichen
wirtschaftlichen Kosten stehen zum großen Teil mit der unterstützenden
Betreuung und der Aufnahme in Heime oder Anstalten in Beziehung.
Der rasch zunehmende Anteil von älteren
Menschen in der Gesellschaft bedeutet, dass die Zahl der Personen,
die an AD leiden, dramatisch wachsen wird, deshalb wird das Auffinden
einer frühen
genauen Diagnose und einer Heilung für AD weltweit zu einem Problem
von großer Bedeutung.
-
Wenn
bei einer Person ein Verdacht auf AD vorliegt, werden mehrere empfohlene
Tests durchgeführt:
(1) Mini-Geisteszustands-Überprüfung [Mini Mental
State Examination] (MMSE) – ein
psychometrischer Test in einem Büroraum
in Form eines Fragebogens für
die funktionelle Beurteilung [Functional Assessment Questionnaire]
(FAQ), um die Skala für die
funktionelle Selbstständigkeit
zu überprüfen, (2) Labortests – vollständiges Blutbild,
Messung des Thyrotropin-, Serum-Elektrolyten-, Serum-Calcium- und
Serum-Glucosespiegels,
(3) Nervenabbildung – am
häufigsten
wird Computertomographie (CT) verwendet, die eine Rolle beim Nachweis
gewisser Ursachen von Demenz, wie vaskulärer Demenz (VaD), Tumor, Normaldruck-Hydrozephalus
und subduralen Hämatoms,
spielt. Jedoch ist eine Nervenabbildung bei der Unterscheidung von
AD oder anderen kortikalen Demenzen von normaler Alterung weniger
effektiv. Einige schlagen vor, dass bei den Grund-Behandlungsschemata
CT auf atypische Fälle
beschränkt werden
sollte, aber andere empfehlen eine Routine-Durchmusterung. Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)
bietet in den meisten Fällen
von Demenz derzeit keinen Vorteil gegenüber CT.
-
Obwohl
Alzheimer die häufigste
Form von Demenz ist, die mindestens 60 der Fälle ausmacht, sind die diagnostischen
Verfahren zur Bestimmung der genauen Ursache von Demenz unter mehr
als 80 verschiedenen Arten im besten Fall schwierig. Weiter sind
die derzeit durchgeführten
Tests bei der Unterscheidung von AD von anderen Arten von Demenz unzulänglich.
-
Im
Vergleich zu anderen Krankheitsgebieten lässt das Gebiet der Demenz Fragen
bezüglich
des Werts der Diagnose entstehen, da derzeit keine Heilung oder
wirksame Therapie verfügbar
ist. Bei Demenzen weist wie in allen anderen Zweigen der Medizin
die Gewissheit einer Diagnose eine bedeutende Auswirkung auf die
Behandlung des Patienten auf. Obwohl AD zur Zeit nicht geheilt werden
kann, gibt es eine verfügbare
symptomatische Behandlung, und die ersten Arzneistoffe (Acetylcholinesterase-Hemmer)
für die
temporäre
Verbesserung der Kognition und des Verhaltens sind nun von der U.S.
Food and Drug Administration zugelassen. Andere Arzneistoffe befinden
sich in verschiedenen Stadien der klinischen Versuche: (1) Arzneistoffe,
um die Verschlechterung von AD zu verhüten – DESFERRIOXAMIN, ALCAR, entzündungshemmende
Arzneistoffe, Antioxidantien, Östrogen,
(2) Neurotrophe Faktoren: NGF, (3) Impfstoff: der kürzliche,
sehr aufregende Bericht von Schenk et al. (Nature 1999; 400: 173–7) lässt die Hoffnung
auf einen Impfstoff gegen AD entstehen.
-
Die
Spezifität
der verschiedenen Therapien erfordert demgemäß fortschrittliche diagnostische Methoden
mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit für AD, um deren Erfolg sicherzustellen.
-
Derzeit
gibt es eine Vielheit von verfügbaren Tests,
welche die Diagnose von AD unterstützen. Jedoch wird die einzige
echte existierende Diagnose durch die pathologische Überprüfung von
Leichen-Gehirngewebe in Verbindung mit einer klinischen Geschichte
von Demenz vorgenommen. Diese Diagnose beruht auf der Anwesenheit
von neurofibrillären
Knäueln
und von neuritischen (senilen) Plaques, die mit klinischer Demenz
korreliert worden sind. Neuritische Plaques bestehen aus einem normalerweise
harmlosen Protein, das als Amyloid-beta bezeichnet wird. Bevor Neuronen
anfangen abzusterben und sich die Symptome entwickeln, bilden sich
Plaque-Ablagerungen zwischen Neuronen früh im Krankheitsprozess. Die
neurofibrillären
Knäuel sind
interneuronale Aggregate, die aus normalen und gepaarten helixförmigen Filamenten
zusammengesetzt sind und vermutlich aus mehreren verschiedenen Proteinen
bestehen. Die innere Trägerstruktur von
Gehirnneuronen hängt
vom normalen Funktionieren eines Proteins ab, das als Tau bezeichnet wird.
Bei der Alzheimer-Krankheit gehen Fäden von Tau-Protein Umbildungen
ein, welche sie veranlassen, verdrillt zu werden. Die neurohistopathologische Identifikation
und die Zählung
von neuritischen Plaques und neurofibrillären Knäueln erfordert ein Färben und
die mikroskopische Überprüfung von mehreren
Gehirnabschnitten. Jedoch können
die Ergebnisse dieser Methode in großem Umfang variieren, und sie
ist zeitaufwändig
und arbeitsintensiv.
-
Im
Hinblick auf die Fähigkeit
sowohl derzeitiger als auch zukünftiger
pharmakologischer Therapien, der Alzheimer-Krankheit vorzubeugen
und/oder den Beginn und/oder das Fortschreiten umzukehren, trägt eine
frühe Diagnose
von AD dazu bei, die Betreuung von Patienten besser handzuhaben.
Es kann viele Fälle
geben, in denen Nicht-AD-Demenz mit AD-Demenz verwechselt werden
könnte.
Solche Beispiele schließen
kleine, unentdeckte Schlaganfälle ein,
die vorübergehend
den Blutstrom zum Gehirn unterbrechen. Klinisch deprimierte Patienten
oder diejenigen mit Parkinson-Krankheit können ebenfalls Lücken im
Gedächtnis
erfahren. Viele ältere
Menschen stehen unter einer Vielfalt von Medikationen, die als Nebenwirkung
allein oder in Verbindung ihre Fähigkeit
beeinträchtigen
können,
kognitive Aufgaben durchzuführen.
-
Demgemäß würden Ärzte, falls
diagnostische Techniken für
die frühe
Differenzierung von AD zur Verfügung
gestellt werden könnten,
eine verbesserte Möglichkeit
erhalten, eine geeignete therapeutische Intervention in einem frühen Zustand
in der Pathogenese dieser Krankheit zu verordnen.
-
Es
sind verschiedene biochemische Marker für AD bekannt, und analytische
Techniken für
die Bestimmung derartiger Marker sind in der Technik beschrieben
worden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Marker", „biochemischer
Marker" oder „Marker-Protein" auf jedes Enzym,
Protein, Polypeptid, Peptid, jede isomere Form desselben, alle immunologisch
nachweisbare Fragmente desselben oder auf jedes andere Molekül, das im
Verlauf der AD-Pathogenese aus dem Gehirn freigesetzt wird. Derartige
Marker umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, alle einzigartigen
Proteine oder Isoformen derselben, die speziell mit dem Gehirn assoziiert
sind.
-
Glutamin-Synthetase
(GS) ist als ein Astrozyten-spezifisches Enzym anerkannt, das an
der Regulierung des Ammoniak- und Glutamat-Metabolismus beteiligt
ist und nach einer Gehirnverletzung überexprimiert wird (Norenberg
und Martinex-Hernandez, Brain Res. 1979; 161: 303). Einige wenige Studien über die
klinische Rolle von Glutamin-Synthetase sind mitgeteilt worden:
Gunnersen und Haley (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 11949)
fanden monomeres GS-Protein
in 38 von 39 AD-Liquor- (CSF-) Proben, Tumani et al. (Arch. Neurol.
1999; 56(10): 1241) beschreiben, dass die Konzentration von GS in
Lumbal-CSF von Patienten mit AD signifikant, aber nichtspezifisch
erhöht
ist (d.h. auch bei VaD, Schizophrenie und ALS erhöht ist).
Auf S. 1244, linke Spalte, führt
Tumani an, dass GS nicht in Serum gefunden wurde.
-
Neuronen-spezifisches
gamma-Enolase- (NSEγγ-) und S100B-Protein,
die im Gehirn gehäuft vorliegen,
sind ebenfalls nützliche
Marker für
die Beurteilung des Ausmaßes
eines Gehirnschadens: NSEγγ für einen
neuronalen Schaden und S100B für einen
Astrozyten-Schaden. Die Konzentrationen des NSE- und S100B-Proteins aus zerebrokortikalen
Bereichen sind mittels Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) überprüft worden.
Es wurde gefunden, dass die Konzentrationen dieser Proteine im frontalen
Kortex von AD-Patienten signifikant erhöht sind (Kato et al., J. Mol.
Neurosci., 1991; 3(2): 95). Aktivierte Astrozyten, die S100B überexprimieren, sind
innig mit den neuritischen β-Amyloid-Plaques von
AD assoziiert (Sheng et al., J. Neurosci. Res., 1994; 39: 398, Mrak
et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1996; 55: 273).
-
Es
gibt eine Anzahl von verschiedenen potentiellen Verwendungen von
Biomarkern bei der AD-Bewertung, und an jeder Verwendung könnte ein anderer
Marker oder ein anderer Satz von Markern beteiligt sein. Derartige
Verwendungen können,
ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein, die Verwendung eines Markers, um AD von anderen Ursachen
von Demenz zu unterscheiden; um Demenzen von den nicht-pathologischen
Auswirkungen des Alterns zu unterscheiden; um das Fortschreiten
der Krankheit zu überwachen,
nachdem die klinischen Symptome offensichtlich geworden sind; die
Verwendung eines Surrogats, um die Wirksamkeit der bevorstehenden Therapien
für AD
zu überwachen;
und die Isolierung von Markern, die eine Nützlichkeit als Risikoeinschätzungsfaktoren
für AD
aufweisen; und die Identifikation sowohl der frühesten biologischen Veränderungen,
die im Gehirn auftreten, als auch anderer Änderungen einschließen, die
auftreten, wenn die Krankheit fortschreitet. Idealerweise wäre es zu
bevorzugen, einen einzigen Marker zu isolieren, der alle Anforderungen
mit einem hohen Grad der Empfindlichkeit und Spezifität erfüllt, jedoch
kann dies ein unerreichbares Ziel sein. Jeder einzelne Marker muss
bezüglich
der Empfindlichkeit, Spezifität,
Zuverlässigkeit
und Validität
für die
Art von klinischer Situation, bei welcher er angewandt werden soll,
beurteilt werden. Ein Marker, der AD schlecht von anderen Ursachen
von Demenz unterscheiden kann, könnte nichtsdestoweniger
ein ausgezeichneter Marker für die Überwachung
des Fortschreitens des Krankheitsprozesses oder der Reaktion auf
eine Therapie sein.
-
Mit
Bezug auf diagnostische Vorrichtungen sind die klinische Bewertung
und die Verwendung von Tests zum Zeitpunkt der Behandlung, die biologische
Marker verwenden, wertvolle Werkzeuge zur Bewertung des Risikos,
der Überwachung
des Krankheitsfortschrittes und zur Lenkung therapeutischer Interventionen.
Die Vorteile, die aus der Verwendung von biologischen Markern als
diagnostischen Werkzeugen hervorgehen, schließen eine Stärkung der Gewissheit der klinischen
Diagnose, die Unterscheidung von AD von anderen Ursachen von Demenz
und die Quantifizierung der Schwere der Krankheit und der Geschwindigkeit
des Fortschreitens ein. Zusätzlich
sollten Tests, die biologische Marker verwenden, schnell, nicht-invasiv,
einfach durchzuführen
und preiswert sein.
-
Was
in der Technik fehlt, ist ein relativ nicht-invasives Verfahren
und eine Vorrichtung dafür, die
für die
definitive Diagnose von Alzheimer-Demenz bei lebenden Patienten
brauchbar ist. Zusätzlich
wird in großem
Maß ein
definitives Verfahren zur Beurteilung des Risikos der Entwicklung
von AD benötigt.
-
BESCHREIBUNG
DES STANDES DER TECHNIK
-
Das
U.S. Patent Nr. 5,445,937 an Haley lehrt ein Verfahren zur Diagnose
von Alzheimer-Krankheit sowie ein Mittel zur Diagnose und Differenzierung von anderen
Krankheiten. Dies erfolgt durch die Verwendung eines Krankheitsspezifischen
biochemischen Markers, Glutamin-Synthetase (GS), und ihres zugehörigen Photoaffinitäts-markierten
oder markierten Antikörpers,
der für
GS an der Bindungsstelle von GS spezifisch ist. Das '937-Patent konzentriert
sich auf die Überprüfung von
Liquor (CSF), um die Anwesenheit eines Photoaffinitätsmarkierten
oder markierten Nucleotid-bindenden Antikörper-Proteins nachzuweisen,
und korreliert die folgende Konzentration mit der Anwesenheit von
AD. Haley lehrt eine Vielfalt von Immunassay-Techniken, um ein derartiges
Verfahren zu bewerkstelligen. Obwohl Haley mit Bezug auf die prophetische
Nützlichkeit
von diagnostischen Verfahren, die Blut als Probe verwenden, Hypothesen
aufstellt und weiter vorschlägt,
dass ein monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörper-Immunassay entwickelt
werden könnte,
offenbart er aber nicht den einen und/oder den anderen in einer
praktischen Ausführung.
Demgemäß ist das'937-Patent nur hinsichtlich
der Lehr eines diagnostischen Tests nützlich, der Liquor verwendet.
Der Erhalt einer Liquor-Probe bringt für einen Patienten ziemlich
unbequeme invasive Techniken mit sich und erfordert eine längere Zeitspanne
zur Durchführung.
Zusätzlich sind
die einzigen polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörper, die
von Haley vorgeschlagen werden, diejenigen mit einer Spezifität für Schafshirn-GS,
im Gegensatz zu einer humanen rekombinanten Form von GS, wie gleich
hierin offenbart.
-
Im
U.S. Patent Nr. 5,508,167 beschreiben Roses et al. Verfahren zur
Diagnose von AD, welche den Nachweis einer Apolipoprotein E Typ
4- (ApoE4-) Isoform oder von ApoE4 kodierender DNA beinhalten. Das
Verfahren kann Blutproben verwenden, und diese werden durch einen
immunchemischen Assay analysiert. Die Blutprobe wird gegebenenfalls
mit einem Reduktionsmittel vereinigt, um die Disulfid-Bindung in
Cystein-Resten zu den entsprechenden reaktiven Sulfhydryl-Gruppen
zu reduzieren. Roses et al. beschreiben weiter ein Kit zum Nachweis
der ApoE4-Isoform. Der Test beruht auf den Unterschieden der Aminosäuresequenzen
der drei Haupt-ApoE-Isoformen. Der Test ist für humane GS nicht spezifisch,
noch weist er eine Empfindlichkeit bei der Differentialdiagnose
von AD gegenüber Nicht-AD-Demenzen
auf.
-
Tumani
et al. (Arch. Neurol., (1999) 56, S. 1241–1246) überprüfen die GS-Konzentrationen in CSF und überprüfen Serum,
um zu bestimmen, ob GS ein nützlicher
biochemischer Marker bei der Diagnose von AD ist. Die Analyse geschieht
durch einen ELISA, der einen Biotin-markierten monoklonalen Antikörper verwendet,
der gegen Schafhirn-GS gerichtet ist. Normale Bereiche der GS-Konzentration werden
als 4 pg/ml in menschlichem CSF und 36 pg/ml in menschlichem Serum
mitgeteilt. Die CSF-Proben bei AD-Patienten sind erhöht, mit
einem mittleren Niveau der GS-Konzentration von 20 ± 12 pg/ml,
bei ALS-Patienten
bei 13 ± 13
pg/ml, und bei Patienten mit vaskulärer Demenz (VaD) bei einer mittleren
erhöhten
Konzentration von 13 ± 7
pg/ml. Patienten mit vaskulärer
Demenz und ALS zeigen eine etwas geringere Erhöhung. Bei Patienten mit AD werden
mittlere Spiegel von 111 ± 53
pg/ml in Serum gemessen. Jedoch zeigen Patienten mit amyotropher
Lateralsklerose (ALS) und vaskulärer
Demenz ebenfalls mittlere erhöhte
Spiegel bei 116 ± 62
pg/ml bzw. 72 ± 59
pg/ml in Serum. So konnte aus diesen Assays keine definitive Diagnose
bezüglich
AD-Demenz oder Differentialdiagnose zwischen AD und Nicht-AD-Demenz
abgeleitet werden.
-
Gunnersen
und Haley (Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89, S. 11949–11953)
liefern einen Nachweis, dass GS in CSF von Patienten mit AD, aber
nicht in dem von gesunden Kontrollpersonen oder Kontrollen mit anderen
Krankheiten nachgewiesen wird. Die anderen untersuchten Krankheiten
sind Epilepsie, ALS und Parkinson. Patienten mit ALS oder Pick-Krankheit
zusätzlich
zu AD zeigen positive Ergebnisse, während ALS-Patienten keine positiven
Ergebnisse zeigen, was anzeigt, dass GS spezifisch für AD ist. Wie
bei anderen Veröffentlichungen
werden Antikörper,
die gegen nicht-humane GS gezüchtet
wurden, für
den Nachweis von GS verwendet.
-
Im
Allgemeinen tendieren die meisten wissenschaftlichen Veröffentlichungen
dazu, sich auf das Peptid β-Amyloid
zu konzentrieren, da postuliert wird, dass es eine Hauptdeterminante
von AD ist. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass gewisse Formen von
familiären
AD-Mutationen die Überproduktion
von β-Amyloid, insbesondere
der längeren
Form (1 – 42)
zur Folge haben, die leichter als die kürzere Form aggregiert. Hensley
et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., (1994), 91, S. 3270 – 3274) überprüfen die
Neurotoxizität
auf der Grundlage der Radikalerzeugung durch das Peptid β-Amyloid
in seinem Aggregatzustand. Mehrere synthetische Fragmente des Peptids
werden bezüglich
einer resultierenden Neurotoxizität getestet. Auf der Grundlage
der Tatsache, dass Sauerstoff ein Erfordernis für die Radikalerzeugung zu sein
scheint, und das Glutamat-Synthetase-
und das Kreatinkinase-Enzym oxidationsempfindliche Biomarker sind,
wird die Inaktivierung dieser Enzyme als Indikatoren für einen
aktiven Angriff auf biologische Moleküle durch diese fragmentierten β-Amyloid-Aggregate
verwendet.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Alzheimer-Demenz (AD), insbesondere
ein Verfahren zur Diagnose und Unterscheidung von Alzheimer-Demenz
von anderen Formen von Demenz durch Testen der Anwesenheit von spezifischen
biochemischen Markern für
die Alzheimer-Krankheit in Körperflüssigkeiten,
insbesondere in Blut, Blutprodukten, Urin, Speichel und dergleichen.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Quantifizierung
der Anwesenheit mindestens eines biochemischen Markers, der mit
Alzheimer-Demenz assoziiert
ist. Spezieller betrifft die Erfindung einen Immunassay zum Zeitpunkt
der Behandlung, welcher einzigartige Antikörper verwendet, um die Differentialdiagnose
von Alzheimer- gegenüber
Nicht-Alzheimer-Formen von Demenz zu ermöglichen.
-
Gemäß der Erfindung
wird ein neuer diagnostischer Testsatz für die Diagnose und Überwachung
des Fortschreitens von Alzheimer-Demenz bereitgestellt, welcher
umfasst:
mindestens einen monoklonalen Antikörper, der
für monomere
Gehirn-assoziierte humane Glutamin-Synthetase mit einem Gewicht
von etwa 44 kDa spezifisch ist, wobei der Antikörper aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus dem Antikörper,
der von dem Klon produziert wird, der bei der ATCC als Hinterlegungsnummer
PTA-3339 hinterlegt ist, und dem Antikörper, der von dem Klon produziert
wird, der bei der ATCC als Hinterlegungsnummer PTA-3340 hinterlegt ist,
besteht.
-
Es
wird auch ein Verfahren zur Diagnose oder Überwachung des Fortschreitens
von Alzheimer-Demenz bereitgestellt, welches umfasst:
Kontaktieren
einer Blutprobe, eines Blutprodukts oder von Liquor eines Patienten,
von dem vermutet wird, dass er an Alzheimer-Demenz leidet, mit einem monoklonalen
Antikörper,
wobei der Antikörper
für monomere
Gehirn-assoziierte humane Glutamin-Synthetase mit einem Gewicht
von etwa 44 kDa spezifisch ist und aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus dem Antikörper,
der von dem Klon produziert wird, welcher bei der ATCC als Hinterlegungsnummer
PTA-3339 hinterlegt ist, und dem Antikörper, der von dem Klon produziert
wird, welcher bei der ATCC als Hinterlegungsnummer PTA-3340 hinterlegt
ist, besteht;
Nachweis von spezifischer Bindung des Antikörpers an
die Probe;
wobei der Nachweis einer erhöhten Konzentration der Glutamin-Synthetase
in der Probe des Patienten im Vergleich zu Kontrollproben eine Diagnose
von Alzheimer-Demenz anzeigt oder wobei das Ausmaß der Erhöhung der
Glutamin-Synthetase
in der Probe des Patienten im Vergleich zu Kontrollproben mit dem
Fortschreiten der Alzheimer-Demenz bei dem Patienten korreliert.
-
Es
werden auch ein isolierter monoklonaler Antikörper, der von dem Klon produziert
wird, der bei der ATCC als Hinterlegungsnummer PTA-3339 hinterlegt
ist, und ein isolierter monoklonaler Antikörper, der von dem Klon produziert
wird, der bei der ATCC als Hinterlegungsnummer PTA-3340 hinterlegt
ist, und die Klone selbst bereitgestellt.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und ein ELISA-System zur
Diagnose, Subtypisierung und Überwachung
der Alzheimer-Krankheit. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung,
dass GS-Protein aus dem Gehirn freigesetzt wird und in Körperflüssigkeiten
außerhalb
des Gehirns nachgewiesen werden kann.
-
Es
werden die Erzeugung und Reinigung von rekombinanter humaner GS
beschrieben. Diese GS-Proteine können
verwendet werden, um monoklonale und polyklonale Antikörper zu
erzeugen, die wiederum in Immunassays verwendet werden können, wobei
sie eine Immunreaktion eingehen, die überwacht und/oder quantifiziert
werden kann, um zirkulierendes GS-Protein bei verdächtigen Personen
nachzuweisen. Alternativ kann das GS-Protein selbst in Immunassays
verwendet werden, um zirkulierende Antikörper bei solchen Personen nachzuweisen.
Das Vorhandensein von Alzheimer-Demenz ist durch die Erkennung von
Konzentrationen eines speziellen biochemischen Markers in Körperflüssigkeit
gekennzeichnet, wobei die Konzentrationen mit der Manifestation
von Alzheimer-Demenz-Symptomen
korrelieren, wie durch den MMSE-Test quantifiziert. Als Risiko-Abschätzungstest
erhöht
die Erkenntnis von Konzentrationen derartiger Marker, welche die
Entwicklung von Alzheimer-Demenz anzeigen, weiter die diagnostische
Möglichkeit,
die dem Praktiker zur Verfügung
gestellt wird.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein relativ nicht-invasives und hoch
empfindliches Verfahren für die
definitive Diagnose von Alzheimer-Krankheit bereit.
-
Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, welches die Analyse
mindestens einer Körperflüssigkeit
eines Patienten einschließt,
um die Anwesenheit mindestens eines Markers zu bestimmen, der eine
Anzeige für
AD gegenüber
Nicht-AD-Demenz ist.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper bereit, die für mit Neuronen
in Beziehung stehende Proteine spezifisch sind, wie durch das Verfahren
der vorliegenden Erfindung identifiziert.
-
Der
Immunassay ist für
die Erkennung der neuronalen spezifischen Proteine in einer oder
mehreren menschlichen Körperflüssigkeiten
wirksam. Die vorliegende Erfindung verwendet einen gereinigten monoklonalen
Antikörper,
der für
humane Glutamin-Synthetase spezifisch ist. Der Testsatz für die Diagnose
von AD ist als nicht-invasiver Test zum Zeitpunkt der Behandlung
geeignet, welcher unter Verwendung einer Probe durchgeführt werden
kann, die Blut oder irgendein Blutprodukt umfasst.
-
Andere
Ziele und Vorteile dieser Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung
ersichtlicher, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Figuren
genommen wird, in denen mittels Veranschaulichung und Beispiel gewisse
Aus führungsformen dieser
Erfindung angegeben sind. Die Figuren stellen einen Teil dieser
Beschreibung dar und schließen beispielhafte
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ein und erläutern verschiedene Ziele und Merkmale
derselben.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
1 ist
ein Vergleich von statistisch signifikanten Werten für GS, NSE
und S100 im Blut einer Kohorte von Patienten, die klinisch als unter
einer Form von Alzheimer-Demenz leidend eingestuft wurden;
-
2 ist
ein Vergleich von statistisch signifikanten Werten für GS, NSE
und S100 im Blut einer Kohorte von Patienten, die klinisch als unter
einer Form von Nicht-Alzheimer-Demenz leidend eingestuft wurden;
-
3 stellt
Kasten-Whisker-Grafiken von GS relativ zum Alter bei gesunden Personen
dar.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Der
Marker, der gemäß dem Verfahren
der Erfindung analysiert wird, wird in den Kreislauf freigesetzt
und kann im Blut oder in irgendeinem Blutprodukt, z.B. Plasma, Serum,
zytolysiertem Blut, z.B. durch Behandlung mit einem hypotonen Puffer
oder mit Detergentien, und Verdünnungen
und Präparaten derselben
und in anderen Körperflüssigkeiten,
z.B. CSF, Speichel, Urin, Lymphe und dergleichen, vorhanden sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Konzentration
der Marker in CSF gemessen werden.
-
Die
Ausdrücke „über normal" und „über dem Grenzwert" werden verwendet,
um eine Konzentration eines Markers zu bezeichnen, die größer ist
als die Konzentration des Markers, die in normalen Personen beobachtet
wird, welche keinem zerebralen Ereignis, d.h. einer Gehirndegeneration
oder -atrophie, unterliegen. Bei einigen Markern können normalerweise
sehr niedrige Konzentrationen des Markers im Blut einer Person vorliegen.
Bei anderen Markern, die gemäß der Erfindung
analysiert werden, können
normalerweise nachweisbare Konzentra tionen im Blut vorliegen. Deshalb
zeigen diese Ausdrücke
eine Konzentration an, die signifikant über der normalen Konzentration
liegt, welche bei gesunden Personen gefunden wird. Der Ausdruck „signifikant" oder „statistisch
signifikant" bezeichnet
eine statistische Signifikanz und bedeutet im Allgemeinen eine zwei
Standardabweichungen (SA) über
normaler oder höhere
Konzentration des Markers. Das Assay-Verfahren, durch welches die
Analyse des Marker-Proteins durchgeführt wird, muss empfindlich sein,
um die Konzentration des Markers nachweisen zu können, die über den interessierenden Konzentrationsbereich
vorliegt, und muss auch hoch spezifisch sein.
-
Der
Marker und zwei andere Markern, die verglichen worden sind, um ihren
Wert als diagnostisches Werkzeug zu bewerten, sind Proteine, die
von spezifischen Zellen im Gehirn freigesetzt werden, wenn diese
Zellen bei einem zerebralen Ereignis geschädigt werden. Diese Marker,
z.B. Proteine, können
entweder in ihrer nativen Form vorliegen oder sie können immunologisch
nachweisbare Fragmente der Proteine sein, die beispielsweise das
Ergebnis eines proteolytischen Abbaus sind. Mit „immunologisch nachweisbar" ist gemeint, dass
die Markerfragmente einen Epitop enthalten, das spezifisch von in
dem Assay verwendeten Antikörper-Reagenzien
erkannt wird.
-
Die
Marker sind für
den Zell-Typ spezifisch. Das Enzym Enolase katalysiert die Umwandlung
von 2-Phosphoglycerat und Phosphoenolpyruvat im glycolytischen Stoffwechsel.
Das Enzym liegt als drei Isoproteine vor, die jeweils das Produkt
eines getrennten Gens sind. Die Genloci werden als ENO1, ENO2 und
ENO3 bezeichnet. Das Genprodukt von ENO1 ist die nicht-neuronale
Enolase (NNE oder α), die
in verschiedenen Säugergeweben
umfangreich verteilt ist. Das Genprodukt von ENO2 ist die Muskel-spezifische
Enolase (MSE oder β),
die hauptsächlich
in der Herz- und quergestreiften unwillkürlichen Muskulatur vorliegt,
während
das Produkt des ENO3-Gens die Neuronen-spezifische Enolase (NSE
oder γ)
ist, die zum größten Teil
in den Neuronen und neuroendokrinen Zellen gefunden wird. Die nativen
Enzyme werden als homo- oder heterodimere Isoformen gefunden, die
aus drei immunologisch verschiedenen Untereinheiten, α, β und γ, zusammengesetzt
sind. Jede Untereinheit (α, β und γ) weist ein
Molekulargewicht von 16 kDa, 44 kDa bzw. 46 kDa auf.
-
Die αγ- und γγ-Enolase-Isoformen,
die als Neuronen-spezifische Enolase gekennzeichnet worden sind,
weisen jeweils ein Molekulargewicht von etwa 80 000 Dalton auf.
Es wurde gezeigt, dass die NSE-Konzentration in CSF und Blut nach
einer Gehirnverletzung (z.B. Schlaganfall, Kopftrauma) zunimmt,
und die Freisetzung von NSE aus geschädigtem zerebralem Gewebe in
den CSF und den Blutkreislauf spiegelt das Ausmaß des Schadens des zerebralen
Gewebes wieder. NSE weist eine biologische Halbwertszeit von etwa
48 Stunden auf.
-
Das
S100-Protein ist ein zytoplasmatisches saures Calcium-bindendes
Protein, das hauptsächlich
in der grauen Substanz des Gehirns, hauptsächlich in Astrozyten und Schwann-Zellen,
gefunden wird. Das Protein liegt in mehreren homodimeren oder heterodimeren
Isoformen vor, die aus zwei immunologisch unterschiedlichen Untereinheiten,
A1 (MG 10 400 Dalton) und B (MG 10 500 Dalton), bestehen. Im zentralen
Nervensystem (ZNS) machen das Homodimer S100 B-B (21 000 Dalton)
und das Heterodimer S100 A1-B (20 900 Dalton) mehr als 95 % des
Gesamt-S100 aus (Isobe et al., Biochem. Int. 1983; 6:419, Zimmer
et al., Brain Res. Bull. 1995; 37:417). Da ein hoher Prozentsatz
von S100B im Gehirn gefunden wird, haben eine Anzahl von Studien dieses
Protein als Marker für
eine zerebrale Verletzung untersucht. Die biologische Halbwertszeit
von S100B beträgt
113 Minuten (Usui et al., Clin. Chem. 1989; 35:1942). Wiederholte
Messungen von S100B-Serumspiegeln sind nützlich, um den Verlauf eines
neurologischen Schadens zu überwachen.
-
Glutamin-Synthetase
(GS) ist ein allgegenwärtiges
Enzym, das unter Verwendung von Ammoniak als Stickstoff-Quelle die
ATP-abhängige
Umwandlung von Glutamat in Glutamin katalysiert. GS ist in hohen
Konzentrationen in der Leber, der Muskulatur, den Nieren und dem
Gehirn anwesend (De Groot et al., Biochim. Biophys. Acta 1987; 908:231). GS
im menschlichen Gehirn ist ein Astrozyten-spezifisches Enzym, das
am Schutz von Neuronen über die Umwandlung
des potentiell neurotoxischen Glutamats und Ammoniaks in Glutamin
beteiligt ist.
-
Die
zweiwertige Kationen-Stelle von GS macht es für eine Oxidation außerordentlich
empfindlich.
-
An
senilen Plaques reiche Bereiche des Gehirns von Patienten mit AD
stellen Umgebungen erhöhten
oxidativen Stresses dar, und dieses Protein ist im Gehirn von Patienten
mit AD mehr oxidiert als dasjenige von Kontrollen. Reaktive Mesoglia-Zellen, die
umfangreich in Bereichen mit senilen Plaques anwesend sind, sind
als Quelle für
sauerstoffhaltige Radikale vorgeschlagen worden.
-
Drei
unterschiedliche Arten von GS sind bekannt: GSI, GSII und GSIII.
Gene für
GSI und GSIII sind in Bakterien gefunden worden. Das humane GS-Gen
gehört
zum GSII-Typ. (Brown et al., J. Mol. Evol. 1994; 38:566). Es wird
angenommen, dass GS im Gehirn als oktamere Struktur mit einem Molekulargewicht
von 360 000 bis 400 000 Dalton vorliegt (Tumani et al., J. Immunol.
Meth. 1995; 188:155). Jedoch nimmt man an, dass das Protein im Blutkreislauf
in der monomeren Form mit MG 44 ± 1 kDa vorliegt (Boksha et
al., J. Neurochem. 2000; 75:2574). Hohe Konzentrationen von GS wurden
in Lumbal-CSF von
AD-Patienten mitgeteilt (Gunnersen und Haley, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1992; 89:11949, Tumani et al., Arch. Neurol. 1999; 56:1241).
-
Der
genaue Mechanismus, der zu erhöhten GS-Konzentrationen
in CSF führt,
bleibt unbekannt. Die Überexpression
von GS in reaktiven Astrozyten und die anschließende Freisetzung in den extrazellulären Raum
wurde vorgeschlagen (Tumani et al., Arch. Neurol. 1999; 56:1241).
-
In
einer weiteren in Betracht gezogenen Ausführungsform der Erfindung können Körperflüssigkeits-Proben
Patienten zu einem Zeitpunkt oder zu verschiedenen Zeitpunkten für eine fortlaufende
Analyse entnommen werden. Typisch wird einem Patienten bei der Krankenvorstellung
mit möglichen
Symptomen von AD eine erste Probe entnommen und gemäß der Erfindung
analysiert. Anschließend wird nach
einem gewissen Zeitraum nach der Krankenvorstellung, z.B. etwa 3 – 6 Monate
nach der ersten Krankenvorstellung, eine zweite Probe entnommen und
gemäß der Erfindung
analysiert. Die Daten können
verwendet werden, um AD zu diagnostizieren, AD auszuschließen, zwischen
AD- und Nicht-AD-Demenz zu unterscheiden.
-
Die
Konzentration irgendeines oder aller der drei spezifischen interessierenden
Marker, die in der Körperflüssigkeit
des Patienten gefunden wurden, wurden aus einer einzigen Probe gemessen,
obwohl einer oder mehrere einzelne Marker in einer Probe gemessen
werden können.
Mit „Probe" ist eine Körperflüssigkeit
wie Blut oder CSF gemeint. Alle Marker können mit einer Assay-Vorrichtung oder
unter Verwendung einer getrennten Assay-Vorrichtung für jeden
Marker gemessen werden, in welchem Fall Aliquoten der Blutprobe
verwendet werden können.
Es wird bevorzugt, jeden von bis zu 3 Markern in derselben einzigen
Probe zu messen, unabhängig
davon, ob die Analysen in einer einzigen analytischen Vorrichtung
oder in getrennten Vorrichtungen durchgeführt werden, so dass die Konzentration
von jedem der Marker, die gleichzeitig in einer einzigen Probe vorhanden
sind, verwendet werden kann, um sinnvolle Daten bereitzustellen.
-
Die
Anwesenheit jedes Markers wird bestimmt, indem man Antikörper verwendet,
die für
jeden der Marker spezifisch sind, und die spezifische Bindung jedes
Antikörpers
an seinen betreffenden Marker nachweist. Jede geeignete direkte
oder indirekte Assay-Methode kann verwendet werden, einschließlich derjenigen,
die im Handel erhältlich
sind, um die Konzentration von jedem der spezifischen Marker, die
gemäß der Erfindung
gemessen wird, zu bestimmen. Bei den Assays kann es sich um kompetitive
Assays, Sandwich-Assays handeln, und die Markierung kann aus der
Gruppe von wohlbekannten Markierungen ausgewählt sein, wie Radioimmunassay,
Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Immunassay oder Immuno-PCR-Technologie.
Eine umfangreiche Erörterung
der bekannten Immunassay-Techniken ist hier nicht erforderlich,
da diese dem Fachmann bekannt sind. Siehe Takahashi et al. (Clin.
Chem. 1999; 45(8):1307) bezüglich
eines S100B-Aassays.
-
Obwohl
nicht darauf beschränkt,
umfasst das Immunassay-Verfahren, das in den vorliegenden Beispielen
verwendet wurde, einen doppelten Antikörper- oder Sandwich-ELISA zum
Messen der Konzentration der Marker-Proteine in der Gruppe. Gemäß diesem
Verfahren ist einer der Antikörper
ein „Einfang"-Antikörper, der auf einer festen
Phase immobilisiert wird, und der andere ist ein „Nachweis"-Antikörper, der
beispielsweise mit einem Enzym markiert ist. Der Nachweis-Antikörper bindet sich
an das Marker-Protein, das an den Einfang-Antikörper gebunden ist, so dass
eine Sandwich-Struktur gebildet wird. Bei jedem Assay der drei Marker werden
Marker-Protein-Standards verwendet, um einen Standard oder eine
Kalibrierungskurve der Extinktion gegen die Marker-Protein-Konzentration herzustellen.
Dieses Verfahren ist von Bedeutung, da zusätzlich zu dem Vorteil der bevorzugten
Ausführungsform
die zugesetzten Marker NSE und S100B dazu beitragen, eine anhaltende
Zerstörung
von Neuronen anzuzeigen bzw. akute Ereignisse im Gehirn zu überwachen.
-
Die
Assay-Verfahren, die verwendet werden, um die Marker-Proteine zu
messen, sollten eine ausreichende Empfindlichkeit zeigen, damit
jedes Protein über
einen Konzentrationsbereich von normalen Werten, die bei gesunden
Personen gefunden werden, bis zur erhöhten Konzentration bei kranken Menschen,
d.h. 2 SA über
normal (= Grenzwert) und höher,
gemessen werden kann. Beim GS-Protein ist der Grenzwert = 0,022
ng/ml, NSE = 8,34 ng/ml und S100B = 0,02 ng/ml.
-
Der
Assay kann in verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich eines
Mikrotiterplatten-Formats, das zur Durchführung der Assays im Chargenmodus
bevorzugt wird. Die Assays können
auch in automatisierten Analysevorrichtungen durchgeführt werden,
die in der Technik wohlbekannt sind. Ein weiteres Assay-Format,
das gemäß der Erfindung
verwendet werden kann, ist ein schneller manueller Test, der zum
Zeitpunkt der Behandlung an jedem Ort vorgenommen werden kann. Typisch
liefern derartige Vorrichtungen ein Ergebnis, das über oder unter
einem Grenzwert ist, d.h. ein halbquantitatives Ergebnis.
-
Expression von rhGS und
Isolierung von monoklonalem Antikörper:
-
Um
einen Antikörper
mit spezifischen Bindungseigenschaften für human Glutamin-Synthetase (humane
rekombinante GS oder rhGS) zu isolieren, wurde cDNA der rhGS von
ATCC erworben. Die volle Länge
des offenen Leserasters (ORF) des rhGS wurde mittels PCR und Subklonierung
in pET28a (Ndel/Shol) erhalten. Das Konstrukt schloss ein Polyhistidin-Etikett
am N-Terminus des rhGS-ORF
und keine zusätzliche
Sequenz am C-Terminus ein. Das Protein wurde in Escherichia coli
BL21 (DE3) exprimiert, indem man Techniken folgte, die von Listrom
et al. (Biochem. J. 1997; 328:159) beschrieben wurden. Die Herstellung
von rohem Zellextrakt sowie die Löslichmachung von unlöslichen
Expressionsprodukten, die aus einer Harnstoff/Alkali-Behandlung
bestand, wurden gemäß dem Verfahren
von Moreno et al. (J. Comp. Neurol. 1994; 350:260) erzielt. Eine
Affinitätsreinigung
wurde mittels Ni-NTA-Chromatographie durchgeführt, indem man den Empfehlungen
des Lieferanten folgte.
-
Herstellung von monoklonalem
Antikörper:
-
Der
monoklonale Antikörper
der vorliegenden Erfindung wurde durch das Polyethylenglycol- (PEG-)
vermittelte Zellfusionsverfahren produziert.
-
Herstellung von Immunozyten:
-
Balb/c-Mäuse, ein
Stamm mit dem H-2d-Haplotyp von Charles
River Canada, St. Constant, Quebec, Kanada, weiblich, 7 – 9 Wochen
alt, wurden mit der rhGS, die bei der ersten Injektion in einem
gleichen Volumen von komplettem Freund-Adjuvans (FCA) emulgiert
war, und dann bei den darauf folgenden Injektionen in 2- bis 4-wöchigen Zeitabständen mit
25 – 100 μg GS in inkomplettem
Freund-Adjuvans (FIA) immunisiert. Die immunisierten Mäuse wurden 3 – 4 Tage
nach der Endimmunisierung, die entweder intravenös und/oder intraperitoneal
in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, verabreicht wurde,
geopfert.
-
Herstellung von Hybridoma:
-
Milzzellen
von Mäusen,
die mit dem GS-Protein immunisiert worden waren, und Sp2/0-Zellen wurden
in Anwesenheit von 42%- igem
PEG gemäß dem Verfahren
fusioniert, das von Fuller, S.A., Takahashi, M. und Hurrell, J.G.R.
(Preparation of Monoclonal Antibodies: in: Susubel F., Brent B.,
Kingston R. et al., Hsg. Current Protocols in Molecular Biology. New
York: Greene Publishing Associates, 1987: Unit 11) beschrieben wurde.
Die resultierenden fusionierten Zellen wurden in HAT-Selektionsmedium
suspendiert und auf vier Platten mit 96 Vertiefungen plattiert, die
mit Futterzellen, peritonealen Exsudat-Zellen (PEZ), besät waren,
wie von Fuller et al. beschrieben (siehe obige Literaturstelle).
-
Durchmusterung der den
GS-spezifischen Antikörper sekretierenden
Hybridoma:
-
Das
Durchmustern von Hybridom-Kulturen wurde anhand von zwei Verfahren
durchgeführt.
(1) Festphasen-ELISA – Durchmusterungs-ELISA-1: Überstände von
konfluenten Hybridoma-Kulturen wurden in Mikrotiterplatten mit 96
Vertiefungen (NUNC MaxiSorp, eingetragene Marke, GIBCO BRL) gegeben,
welche mit rhGS zu 2 μg/ml
in 100 mM Carbonat-Puffer, pH 9,6, beschichtet waren. Die überschüssigen Bindungsstellen
wurden durch Rinder-Serumalbumin (BSA) in PBS, pH 7,4, blockiert. Nach
Waschen der Platte mit PBS, die 0,05 % Tween 20 (eingetragene Marke)
(WB) enthielt, wurden 100 μl
Kulturüberstand,
der die monoklonalen Antikörper enthielt,
1 Stunde bei 37 °C
mit dem immobilisierten Antigen inkubiert. Nach Waschen wurde Peroxidase-konjugiertes
Ziegen-Antimaus-IgG
(Jackson ImmunoResearch Lab, Inc., West Grove, Pa.) dazugegeben
und auf einem Orbitalschüttler
30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach Waschen wurde
TMB-Substratlösung
(Sigma) dazugegeben. Nach fünfminütiger Inkubation
bei RT im Dunkeln wurde die Reaktion mit 1 M H2SO4 gestoppt, und die optische Dichte wurde
bei 450 nm abgelesen. Selektierte positive Kulturen wurden durch
das Grenzverdünnungsverfahren
einer Klonierung unterzogen, wie von Fuller et al. (siehe obige
Literaturstelle) beschrieben. Die ELISA-Durchmusterung und Klonierungsverfahren
wurden wiederholt, bis eine Kulturstabilität und Fähigkeit zur Klonierung erhalten
wurden. (2) Durchmusterungs-ELISA-2: In dem zweiten Verfahren wurden
monoklonale Antikörper
in dem Hybridomkultur-Überstand über Ziegen-Anti-Maus-IgGFc (Jackson ImmunoResearch) eingefangen,
das auf der Festphase der ELISA-Platte immobilisiert war. Nach einstündiger Inkubation
bei 37 °C
wurden die Platten wie bei Verfahren 1 gewaschen. Dann wurde biotinylierte
GS (hergestellt unter Verwendung des Biotin Labeling Kit von Boehringer
Mannheim nach den Empfehlungen des Herstellers), die als 1/2 000 Verdünnungen
in PBS mit 0,5 % BSA verdünnt
war, zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei RT auf
einem Schüttler
wurde die Platte gewaschen, und HRP-konjugiertes Streptavidin (Boehringer
Mannheim) bei 1/10 000 wurde dazugegeben und 30 Minuten bei RT inkubiert.
Nach Waschen wurde TMB-Substratlösung
dazugegeben, und die Reaktion wurde wie beim Verfahren 1 abgelesen.
-
Um
einen ELISA-Assay zu entwickeln, wurden zwei Klone selektiert, die
als 1G3 und 5G4 bezeichnet wurden. Die Klone wurden gemäß dem Budapester
Vertrag bei der American Type Culture Collection, 10801 University
Blvd., Manassas, VA 20110–2209
am 25. April 2001 unter den Hinterlegungsnummern PTA-3339 bzw. PTA-3340
hinterlegt. Gemäß 37 CFR
1.808 versichern die Hinterleger, dass alle Beschränkungen,
die der Verfügbarkeit
der hinterlegten Materialien für
die Öffentlichkeit
auferlegt wurden, unwiderruflich bei der Erteilung eines Patents
aufgehoben werden.
-
Produktion von monoklonalem
Antikörper:
-
Der
GS-spezifische monoklonale Antikörper wurde
unter Verwendung von Aszites produziert. Aszites wurde in Bulb/c-Mäusen, die
zuvor mit 0,25 ml Pristan behandelt worden waren, durch intraperitoneale
Injektion von 1 – 5 × 106 Hybridomzellen in 0,25 – 0,5 ml PBS, pH 7,4, produziert.
10 bis 14 Tage später wurde
der Aszites gesammelt. Der monoklonale Antikörper aus Aszites wurde auf
einer Affinitätssäule (Protein
G, AVIDAL, eingetragene Marke) unter Verwendung bekannter Verfahren
gereinigt. Der gereinigte monoklonale Antikörper wurde für immunchemische
Studien verwendet.
-
Produktion und Reinigung
von polyklonalem Antikörper:
-
Ziegen
wurden zweiwöchentlich
durch intramuskuläre
und/oder subkutane Injektionen von 250 – 500 μg gereinigter rhGS immunisiert,
die in Freund-Adjuvans
emulgiert war. Der Titer wurde routinemäßig durch Durchmusterung des
Serums anhand eines Halb-Sandwich-ELISA überwacht. Polyklonale Antikörper (PAb),
die für
GS spezifisch waren, wurden anschließend aus Ziegenserum durch Affinitätsreinigung
unter Verwendung von Bromcyan-aktivierter Sepharose-4B (eingetragene
Marke) (Pharmacia) gereinigt, die an rekombinante GS gekuppelt war.
Die gereinigten polyklonalen Antikörper wurden gegen 10 mM PBS,
pH 7,4, dialysiert, durch Ultrafiltration konzentriert und bei –20 °C aufbewahrt.
-
Diagnostischer Assay und
Nachweis von GS in biologischen Proben:
-
Ein
weiterer Zweck der Erfindung ist es, Reagenzien zur Verwendung in
diagnostischen Assays zum Nachweis von GS von Personen bereitzustellen, die
an Alzheimer-Krankheit leiden.
-
In
einer Ausführungsweise
dieser Ausführungsform
kann GS der vorliegenden Erfindung als Antigen in Immunassays für die Erfassung
derjenigen Personen verwendet werden, die an AD leiden. Das Protein
GS der vorliegenden Erfindung kann in irgendeinem Immunassay-System
verwendet werden, das in der Technik bekannt ist, einschließlich, ohne
darauf beschränkt
zu sein: Radioimmunassay, Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), "Sandwich"-Assays, Präzipitin-Reaktionen, Geldiffusions-Immunodiffusions-Assay,
Agglutinations-Assay, Fluoreszenz-Immunassays, Protein A- oder G-Immunassays
und Immunelektrophorese-Assays. Gemäß der Erfindung sind monoklonale
oder polyklonale Antikörper,
die gegen humane GS produziert wurden, in dem Immunassay von Blutproben
oder Blutprodukten, wie Serum, Plasma oder dergleichen, Rückenmarksflüssigkeit
oder einer anderen Körperflüssigkeit,
z.B. Speichel, Urin, Lymphe und dergleichen, nützlich, um Patienten mit AD
zu diagnostizieren. Alzheimer-Demenz kann bestimmt werden, in dem
man einen einzigen monoklonalen Antikörper oder eine Mehrzahl von
monoklonalen Antikörpern einzeln
oder in Kombination verwendet, welche für humane Glutamin-Synthetase spezifisch
sind.
-
Die
Antikörper
können
in jeder Art Immunassay verwendet werden. Dies schließt sowohl
den Zweistellen-Sandwich-Assay als auch den Einzelstellen-Immunassay des nicht-kompetitiven
Typs sowie herkömmliche
kompetitive Bindungsassays ein.
-
Wegen
der Leichtigkeit und Einfachheit des Nachweises und dessen quantitativer
Natur ist der Sandwich- oder doppelte Antikörper-Assay besonders bevorzugt,
der in einer Anzahl von Abwandlungen existiert, von denen alle von
der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden. Beispielsweise wird
in einem typischen Sandwich-Assay unmarkierter Antikörper auf
einer festen Phase, z.B. Mikrotiterplatte, immobilisiert, und die
zu testende Probe wird dazugegeben. Nach einer gewissen Inkubationszeitspanne,
um die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes zu ermöglichen,
wird ein zweiter Antikörper
dazugegeben, der mit einem Reportermolekül markiert ist, das ein nachweisbares
Signal induzieren kann, und die Inkubation wird fortgesetzt, um eine
ausreichende Zeit zur Bindung an das Antigen an einer verschiedenen
Stelle zu ermöglichen,
was die Bildung eines Komplexes aus Antikörper-Antigen-markiertem Antikörper zum
Ergebnis hat. Die Anwesenheit des Antigens wird durch Beobachtung eines
Signals bestimmt, das durch Vergleich mit Kontrollproben, die bekannte
Mengen an Antigen enthalten, quantifiziert werden kann.
-
Klinische Studien:
-
Eine
prospektive beobachtende Pilotstudie wurde an drei geriatrischen
Kliniken durchgeführt. Die
Studie bewertete 38 Patienten, die in die Klinik kamen, wobei die
Mini-Geisteszustands-Überprüfung- (MMSE-) Überprüfung und
andere Routinetests vorgenommen wurden. Aus diesen wurden 24 als
AD und 14 mit anderen Arten von Demenz außer AD diagnostiziert. Das
mittlere Alter der Patienten, die eine Alzheimer-Demenz zeigten,
betrug etwa 79 Jahre, mit einem Altersbereich von 54 bis 87 Jahren.
Die Mini-Geisteszustands-Überprüfungs- Punktezahl (MMSE)
wurde verzeichnet. Eine Blutprobe wurde erhalten, und nach der Gerinnung
wurden die Proben zentrifugiert, und Aliquoten von Serum wurden
eingefroren und bei –70 °C aufbewahrt,
bis die Analyse bezüglich
S100, NSE und GS durchgeführt
wurde.
-
Kontrollpersonen
schlossen 153 gesunde Blutspender ein (Altersbereich von 18 – 87 Jahren: mittleres
Alter 71,03 +/– 9,95
Jahre), deren Blutproben verwendet wurden, um Bezugswerte für Konzentrationen
von S100, NSE und GS zu bestimmen.
-
Die
Alzheimer-Krankheit ist als fortschreitender Krankheitsprozess anerkannt,
der im basalen Neokortex beginnt, sich zum Hippocampus ausbreitet
und schließlich
in alle kortikalen Bereiche eindringt. Es gibt keine Remission im
Krankheitsverlauf (Braak und Braak, Neurobiol. Aging 1997; 18(4):351).
Dies zeigt an, dass AD ein Krankheitsprozess und nicht einfach ein
Produkt des Alterns ist. Die AD-Pathogenese beinhaltet die ständige und
fortschreitende Zerstörung
von Neuronen. Obwohl NSE keine Spezifität für AD aufweist, liefert der
Marker einen Beitrag als Indikator einer fortlaufenden Zerstörung von
Neuronen. Unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers, der
vorliegend für
humane GS offenbart ist, wird ein eleganter, empfindlicher und spezifischer
Assay für
AD möglich
gemacht, wenn das Protein in Nicht-CSF-Körperflüssigkeiten analysiert wird.
Dies ist anders als in Assays des Standes der Technik, in denen
die Marker für
nicht-humane GS spezifisch waren und keine definitiven Daten aus Serum
oder irgendeiner anderen Nicht-CSF-Körperflüssigkeit abgeleitet werden
konnten. S100 weist nicht die Empfindlichkeit auf, aber es ist ein
nützlicher Marker,
um akute Ereignisse im Gehirn (z.B. TIA, Schlaganfall, Hypoxie,
die zu ischämischen
Ereignissen führt,
usw.) zu überwachen,
die bei älteren
Personen, welche die Zielpopulation von AD sind, häufige Ereignisse
sind.
-
Alle
Bezugswerte sind als Mittel + 2 SA mitgeteilt. Die Bezugswerte für die drei
Marker sind: GS = 0,022 ng/ml, NSE = 8,34 ng/ml und S100 = 0,02 ng/ml.
-
Die
Konzentrationen von S100 und NSE wurden unter Verwendung des SMART
S100- bzw. des SMART NSE-ELISA-Assaykits analysiert, welche von
Syn-X Pharma Inc., Mississauga, Ont., KANADA, erhältlich sind.
Bei dem GS-Assay
werden die Antikörper-Reagenzien
und der Kalibrator (d.h. rekombinante humane GS) bei Syn-X Pharma
produziert, und der ELISA-Assay wurde wie oben beschrieben entwickelt.
-
Die
Kasten-Whisker-Diagramme in 3 stellen
die Analyse von Serum-Konzentrationen
von GS-Protein bei gesunden Personen dar, die auf der Grundlage
des Alters in Kategorien eingeteilt wurden. Interessanterweise zeigte
die Personen in ihrem siebten Lebensjahrzehnt signifikant höhere Konzentrationen
an GS im Blut im Vergleich zu den anderen jüngeren Altersgruppen. Jedoch
sinkt die mittlere GS-Konzentration im Blut von Personen im achten Lebensjahrzehnt
und darüber
auf ähnliche
Werte wie diejenigen, die im dritten und fünften Lebensjahrzehnt beobachtet
werden. Ein ähnliches
Muster wird bei S100-Protein beobachtet. Andererseits ist die Altersverteilung
der NSE-Serumkonzentration von den anderen zwei Markern verschieden,
indem in der Altersgruppe von 14 bis 40 Jahren signifikant höhere Konzentrationen
beobachtet werden. Es gab keinen Zusammenhang der Serumkonzentrationen
dieser drei Proteine mit dem Geschlecht. Obwohl man nicht durch
irgendwelche speziellen Theorien gebunden sein will, wurde die Hypothese
aufgestellt, dass diejenigen in ihrem siebten Lebensjahrzehnt mit
erhöhter
GS (und/oder erhöhtem
S100) in der Tat bereits einen Gehirnverfall entwickeln und dass
derartige Personen in ihrem achten Lebensjahrzehnt als „Patienten" klassifiziert werden
und verbleibende sogenannte „gesunde" Personen in gesundheitlicher
Hinsicht in guter Verfassung sind und niedrige Konzentrationen dieser
Protein-Marker zeigen. So wurde geschlossen, dass die Richtung der
Aufmerksamkeit auf GS-Konzentrationen in der Gruppe im siebten Lebensjahrzehnt
als Diagnostikum für
Risiko-Beurteilungsstudien besonders wertvoll ist.
-
Von
den 24 Serumproben von AD auf MMSE-Basis waren 20 milde AD-Fälle, und 4 waren mäßige (siehe 1).
Die Empfindlichkeit der drei Marker, d.h. GS, NSE und S100B betrugen
100 %, 33 % bzw. 8 %. Die GS-Konzentration korreliert gut mit der Schwere
von AD, d.h. der MMSE-Einstufung, während eine ähnliche Korrelation bei NSE
nicht beobachtet wird. Die Empfindlichkeit von S100 ist sehr gering,
wenn dieser Marker jedoch erhöht
ist, kann dies ein Anzeichen einer stattfindenden Zerstörung von Astrozyten
im Gehirn aufgrund von akuten Ereignissen sein.
-
Von
den 14 Nicht-AD-Demenzproben zeigte nur eine Probe eine erhöhte Konzentration
sowohl an GS als auch S100, während
7 Proben eine Konzentration von NSE über dem Grenzwert zeigten (2). Dies
zeigt an, dass GS und S100 hochspezifische Marker für AD sind.
-
Alle
Patente und Veröffentlichungen,
die in dieser Beschreibung erwähnt
sind, zeigen das Niveau des Fachmanns an, an den sich diese Erfindung
wendet. Alle Patente und Veröffentlichungen werden
hierin durch Bezugnahme in dem gleichen Ausmaß aufgenommen, als ob von jeder
einzelnen Veröffentlichung
speziell und einzeln angezeigt worden wäre, dass sie durch Bezugnahme
aufgenommen wird.
-
Der
Fachmann wird ohne weiteres anerkennen, dass die vorliegende Erfindung
gut geeignet ist, die Gegenstände
durchzuführen
und die erwähnten Zwecke
und Vorteile sowie diejenigen, die ihnen eigen sind, zu erlangen.
Die hierin beschriebenen Oligonucleotide, Peptide, Polypeptide,
biologisch verwandte Verbindungen, Methoden, Verfahren und Techniken
sind derzeit für
die bevorzugten Ausführungsformen
repräsentativ
und sollen beispielhaft sein und sind nicht als Beschränkungen
des Bereichs gedacht. Änderungen
dabei und andere Verwendungen eröffnen
sich dem Fachmann, welche innerhalb des Geists der Erfindung eingeschlossen
sind und durch den Bereich der beigefügten Ansprüche definiert sind. Obwohl
die Erfindung in Verbindung mit speziellen bevorzugten Ausführungsformen
beschrieben worden ist, sollte verstanden werden, dass die Erfindung,
wie beansprucht, nicht durch derartige spezielle Ausführungsformen
unangemessen beschränkt
werden sollte.