KR20040015168A - 알츠하이머 치매의 차별적 진단 방법과 진단 장치 - Google Patents

알츠하이머 치매의 차별적 진단 방법과 진단 장치 Download PDF

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신 엑스 파마, 인코퍼레이티드
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Abstract

알츠하이머 치매(AD)를 진단하는 방법에 대해 설명한다. 상기 방법은 인체 특히 혈액 또는 혈액 산물과 같은 체액에 생화학적 마커인 글루타민 합성효소가 존재하는 지를 직접 감지하는 것으로 구성된다. 이런 감지 방법은 사람의 글루타민 합성효소에 특이적인 항체를 통합하는 면역분석으로 실시한다. 또한, AD 치매와 비-AD 치매를 구별하는 방법에 대해서 설명한다.

Description

알츠하이머 치매의 차별적 진단 방법과 진단 장치{PROCESS FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF ALZHEIMER'S DEMENTIA AND DEVICE THEREFOR}
알츠하이머 치매 또는 AD라고 하는 알츠하이머병은 기억 상실과 심각한 정치 지체를 초래하는 진행성 퇴행 질병이다. 진단전문의는 현재 AD 진단에 유일하게 가용한 수단인 뇌 조직의 조직학적 검사 이외에 치매 환자의 일생동안 AD를 분명하게 확인할 수 있는 수단을 오랫동안 추구해왔다. AD는 치매중 가장 흔한 형태로, 전체 치매의 절반 이상을 차지하고 4백만명의 미국인과 전세계적으로 거의 15백만명에게 영향을 주고 있다. 치매는 약간의 기억 상실과 혼란으로 시작하고, 시간이 지남에 따라 지적 능력과 사회적 능력의 심각한 손상으로 진행된다. 65세 노인에서 AD의 이환율은 1-2%이다. 75세 노인에서 이 수치는 7%로 상승하고, 85세에서는 18%이다. 65세 이상의 모든 개체에서 치매의 이환율은 8%이다. 수용시설에 거주하는 사람에서 이환율은 모든 연령에서 대략 50%이다.
알츠하이머 치매는 사회적 영향이 지대한데, 특히 이 질병의 후기에서 보호자에게 엄청난 부담을 준다. 상당한 경제적 비용이 보존적 치료(supportive care)와 수용시설 입원의 주요 원인이다. 사회에 노인 인구 비율이 급속하게 증가한다는 것은 AD에 걸리는 개체수가 급격하게 증가한다는 것을 의미하는데, 이런 이유로 AD의 조기 진단과 치료법의 발견은 전세계적으로 중요한 이슈가 되고 있다.
개체에서 AD가 의심되면, 권장되는 여러 검사가 실시된다:
(1) Mini Mental State Examination (MMSE) - 기능적 자율의 단계를 검사하는 Functional Assessment Questionnaire(FAQ) 형태의 진단실-기초한 정신측정 검사, (2) 실험실 검사 - 완전한 혈액 계산, 갑상선 자극 호르몬, 혈청 전해질, 혈청 칼슘, 혈청 글루코오스 수준의 측정, (3) 신경영상 - 혈관 치매(VaD), 종양, 정상뇌압 수두증 또는 경막하혈증과 같은 치매의 특정 원인을 검출하는데 일정한 역할을 하는 컴퓨터 단층촬영(CT)이 흔히 이용된다. 하지만, 신경영상은 정상적인 노화와 AD 또는 다른 피질성 치매를 구별하는데 다소 비효율적이다. 일차 진료 환경에서, 일부는 CT가 비정형 사례에만 국한될 수 있다고 제안하는 반면, 다른 사람들은 정기적인 스캐닝을 권고한다. 자기 공명 영상(MRI)은 대부분의 치매 사례에서 CT보다 나을 것이 없다.
알츠하이머는 치매의 가장 흔한 형태로, 치매 사례의 적어도 60%를 차지하고 있지만, 80여 가지의 치매 원인중 정확한 원인을 결정하는 진단 과정은 매우 난해하다. 게다가, 현재 실시되고 있는 검사는 AD와 다른 유형의 치매를 구별하는 데에는 부적합하다.
다른 질병 분야와 비교하여 치매 분야는 진단의 가치에 대한 회의가 제기되고 있는데, 그 이유는 현재 가용한 효과적인 치료법이 없기 때문이다. 모든 다른 의학 분야에서처럼 치매에서 진단의 정확성은 환자 관리에 중요하다. AD는 현재 단계에서는 치료될 수 없고 증상 치료만 가능한데, 현재 인식과 행동을 일시적으로 개선하는 첫 번째 약물(아세틸콜린스테라제 저해물질)이 미국 식품의약국(U.S. Food And Drug Administration)으로부터 승인을 받은 상태이다. 임상 시험중인 다른 약물은 다음과 같다: AD에서 퇴보를 예방하는 약물 - DESFERRIOXAMINE, ALCAR, 항-염증제, 항산화제, 에스트로겐; (2) 신경성 인자: NGF; (3) 백신: 최근 흥미로운 Schenk et al.(Nature 1999; 400:173-7) 보고서에서 AD 백신의 가능성을 제기하였다.
따라서, 다양한 치료법의 이런 한정성은 성공을 담보하기 위하여 AD에 높은 특이성을 갖는 정교한 진단 방법을 요구한다.
현재, AD의 진단을 보조하는 여러 검사법이 있다. 하지만, 유일하게 실질적인 진단법은 치매의 임상 병력과 함께 사후 뇌조직의 병리학적 검사이다. 이런 진단은 뇌 조직에 신경원성 병변(neurofibrillary tangle)과 초로성 반점(neutric plaque)의 존재에 기초하는데, 이들은 임상적 치매와 상관한다. 초로성 반점은 아밀로이드-베타라고 하는 정상적인 무해 단백질로 구성된다. 신경원이 죽기 시작하고 증상이 발생하기에 앞서, 병의 초기 단계동안 신경원 사이에 플라크 침착이 형성된다. 이들 신경원성 병변은 정상적인 나선 섬유와 손상된 나선 섬유로 구성된신경원간 응집체로, 여러 상이한 단백질로 구성되는 것으로 추정된다. 뇌 신경원에 대한 이런 내부 지지 구조는 tau라고 하는 단백질의 정상적인 기능에 좌우된다. 알츠하이머병에서, tau 단백질의 가닥은 변형되고 뒤틀리게 된다. 초로성 반점과 신경원성 병변의 신경조직병리학적 동정과 계산은 여러 뇌 절편의 염색과 현미경적 검사를 필요로 한다. 하지만, 이런 방법의 결과는 상당히 가변적이고 시간이 많이 소요되며 노동-집중적이다.
알츠하이머 치매를 예방하고 이의 발병이나 진행을 되돌리는 현재와 추후 약리학적 요법의 능력을 고려하면, AD의 조기 진단은 환자를 좀더 효과적으로 관리하는데 조력한다. 비-AD 치매가 AD 치매와 혼동될 수 있는 많은 사례가 있다. 이런 예에는 뇌로의 혈류를 일시적으로 교란시키는 작고 탐지되지 않는 뇌졸중이 있다. 임상적으로 약화된 환자 또는 파킨슨병 환자 역시 기억 상실을 경험할 수 있다. 많은 노인들이 부작용으로 인식 작업의 수행 능력을 단독으로 또는 복합적으로 손상시킬 수 있는 다양한 약물을 복용하고 있다.
따라서, AD를 조기에 구별하는 진단 기술이 제공된다면, 임상의는 이 질병의 병인에서 초기 단계에 적절한 치료 개입을 처방하는 능력을 향상시킬 수 있다.
AD에 대한 다양한 생화학적 마커가 확인되었고, 이런 마커의 결정을 위한 분석 기술이 당분야에 기술되었다. 본원에서 "마커", "생화학적 마커"또는 "마커 단백질"은 AD 병인 과정동안 임의의 효소, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 이들의 이질성체, 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편, 또는 뇌로부터 방출되는 다른 분자를 의미한다. 이런 마커에는 뇌와 연관하는 특이 단백질 또는 이의 동종효소가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
글루타민 합성효소(GS)는 뇌 손상이후에 과다-발현되는 암모니아와 글루타메이트 대사의 조절에 관여하는 성상세포-특이 효소로 간주된다(Norenberg and Martinex-Hernandez, Brain Res 1979;161:303). 글루타민 합성효소의 임상적 연구에 관한 몇몇 연구가 보고되었다: Gunnersen and Haley(Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:11949)에서는 39개 AD 뇌척수액(CSF) 시료중 38개에서 단량성 GS 단백질을 발견하였고, Tumani et al.(Arch Neurol 1999;56(10):1241)에서는 AD 환자의 요신경 CSF에서 GS의 농도가 현저하지만 비특이적으로 증가한다고 기술하였다(즉, VaD, 정신분열증, ALS에서도 증가한다). 1244 페이지, 좌측 칼럼에서 Tumani는 GS가 혈청에 존재하지 않는다고 기술하였다.
뇌에 풍부하게 존재하는 신경원-특이적 감마-에놀라제(NSEγγ)와 S100B 단백질 역시 뇌 손상 정도를 평가하는 유용한 마커이다: 신경원 손상의 경우 NSEγγ, 성상세포 손상의 경우 S100B. 대뇌피질 부위에서 NSE와 S100B 단백질의 농도는 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA)으로 조사되었다. AD 환자의 전두피질에서 이들 단백질의 수준은 현저하게 상승하는 것으로 밝혀졌다(Kato et al. J Mol Neurosci, 1991;3(2):95). S100B를 과다발현하는 활성화된 성상세포는 AD의 β-아밀로이드 신경반과 밀접하게 연관하였다(Sheng et al. J Neurosci Res, 1994;39:398, Mrak et al. J Neuropathol Exp Neurol 1996;55:273).
AD 평가에서 생물 마커의 잠재적 용도는 다양하고, 각 용도에는 상이한 마커 또는 일단의 마커가 참여할 수 있다. 이런 용도에는 치매의 다른 원인과 AD를 구별하는 용도; 노화의 비-병원성 효과와 AD를 구별하는 용도; 임상적 증상이 분명하게 나타난 이후 AD의 진행을 모니터하는 용도; AD에 대한 장래 요법의 효능을 모니터하는 대용물로서 용도; AD에 대한 위험 평가 인자로 활용되는 마커를 분리하는 용도; 뇌에서 진행되는 초기의 생물학적 변화 및 병이 진행되면서 나타나는 다른 변화를 동정하는 용도가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이상적으로, 높은 감수성과 특이성으로 모든 요구사항을 충족시키는 단일 마커를 분리하는 것이 바람직하지만, 이는 실현불가능한 목표이다. 개별 마커는 적용되는 임상적 상황의 유형에 따라 감수성, 특이성, 신뢰성, 유효성으로 평가한다. AD와 치매의 다른 원인을 구별하는 데에는 불량한 마커임에도 불구하고, 질병 과정의 진행 또는 치료 반응을 모니터하는 데에는 우수한 마커일 수 있다.
진단 장치와 관련하여, 임상적 평가 및 생물학적 마커를 활용한 현장 검사는 위험을 평가하고 질병 진행을 모니터하며 치료 개입을 선도하는데 귀중한 도구이다. 진단 도구로서 생물학적 마커의 이용에 따른 장점은 임상적 진단의 확실성 강화, AD와 다른 치매 원인의 구별, 질병의 심각도와 진행 속도의 정량 등이다. 이에 더하여, 생물학적 마커를 이용한 검사는 신속하고 비-침입성이며 간단하게 실시가능하고 저렴해야한다.
이런 이유로, 당분야에 여전히 요구되는 사항은 살아있는 환자에서 알츠하이머병을 분명하게 진단하는데 효과적인 상대적으로 비-침입성의 방법과 장치이다. 이에 더하여, AD 발병 위험을 확실하게 평가하는 방법이 요구된다.
선행 기술의 설명
U.S. Patent No. 5,445,937(Haley)에서는 알츠하이머병의 진단 방법, 진단 수단 및 다른 질병과의 구별방법을 교시한다. 이는 질병-특이적 생화학적 마커, 글루타민 합성효소(GS) 및 GS의 결합 부위에서 GS에 특이적인 이의 개별적인 광친화성 라벨된 항체의 이용으로 실시된다. '937 특허에서는 광친화성 라벨된 항체, 뉴클레오티드 결합 단백질의 존재를 검출하는데 뇌척수액(CSF)에 집중하고 후속 수준과 AD의 존재를 상관시킨다. Haley는 이런 방법을 달성하기 위한 여러 면역분석 기술을 교시한다. Haley는 혈액을 시료로 이용하는 진단 방법의 예언적 유용성을 가정하고 단클론 및/또는 다클론 항체 면역분석이 실시될 수 있다고 제안하였지만, 실질적인 결과를 얻는 데는 실패하였다. 따라서, '937 특허는 뇌척수액을 이용한 진단 방법을 교시하는 데에만 유용하다. 뇌척수액의 시료를 얻기 위해서는 환자에게 상당히 불편한 침입성 기술이 필요로 하고 달성하는데 긴 시간이 요구된다. 이에 더하여, Haley에 의해 제안된 다클론 및/또는 단클론 항체는 여기에 개시된 바와 같이 GS의 사람 재조합 형태가 아닌 양의 뇌 GS에 특이성을 갖는다.
U.S. Pat. No. 5,508,167, Roses et al.에서는 아포리포단백 E type 4(ApoE4) 동종효소 또는 ApoE4를 인코드하는 DNA를 검출하여 AD를 진단하는 방법을 기술한다. 상기 방법은 혈액 시료를 이용할 수 있고 면역화학적 분석법으로 분석된다. 혈액 시료는 환원제와 선택적으로 결합시켜 시스테인 잔기에서 이황화 결합을 상응하는 반응성 설프하이드릴 기로 환원시킨다. 이 검사는 3가지 주요 ApoE 동종효소의 아미노산 서열 차이에 기초한다. 상기 검사는 사람 GS에 특이적이지도 않고 AD vs. 비-AD 치매를 차별적으로 진단하지도 못한다.
Tumani et al.(Arch. Neurol., (1999)56,pp1241-1246)은 GS가 AD의 진단에서 유용한 생화학적 마커인 지를 확인하기 위하여 CSF와 혈청에서 GS을 검사한다. 분석은 양의 뇌 GS에 특이적인 비오틴-라벨된 단클론 항체를 이용한 ELISA로 실시한다. GS 농도의 정상 범위는 사람 CSF에서 4pg/㎖, 사람 혈청에서 36pg/㎖인 것으로 보고되고 있다. GS의 평균 수준은 AD 환자의 CSF 시료에서 20±12pg/㎖, ALS 환자에서는 13±13pg/㎖, 혈관 치매(VaD) 환자에서는 13±7pg/㎖로 상승한다. 혈관 치매와 ALS 환자는 약간 낮은 상승을 보인다. AD 환자의 혈청에서는 111±53pg/㎖의 평균 수준이 측정된다. 하지만, 근위축성 측상 경화증(ALS)과 혈관 치매 환자의 혈청에서는 각각 116±62pg/㎖과 72±59/㎖의 상승된 평균 수준이 나타난다. 따라서, AD 치매와 관련된 분명한 진단 또는 AD vs. 비-AD 치매간 차별적 진단은 이들 분석으로부터 실현될 수 없었다.
Gunnersen와 Haley(Proc. Natl. Acad. Sci.(1992)89, pp11949-11953)는 AD 환자의 CSF에서 검출되지만 건강한 대조 피험자 또는 다른 질환 대조군의 CSF에는 검출되지 않는 GS의 증거를 제시한다. 고려되는 다른 질환은 간질, ALS, 파킨슨병이다. AD 이외에 ALS 또는 피크씨병(Pick' disease)는 양성 결과를 보이는 반면, ALS 환자는 음성 결과를 보이는데, 이는 GS가 AD에 특이적임을 시사한다. 다른 간행물에서처럼 비-사람 GS에 대한 항체가 GS의 검출에 사용된다.
일반적으로, 대부분의 과학 논문에서는 AD의 주요 결정인자로 추정되는 펩티드, β-아미로이드에 집중하는 경향이 있다. 이는 특정 형태의 가족성 AD 돌연변이가 β-아밀로이드, 특히 짧은 형태보다 좀더 쉽게 응집하는 길어진 형태(1-42)의β-아밀로이드의 과다 생산을 유발한다는 관찰에 의해 뒷받침된다. Hensley et al.(Proc. Natl. Acad. Sci.(1994), 91, pp3270-3274)에서는 응집 상태의 펩티드 β-아미로이드에 의한 유리 라디칼 발생에 기초한 신경독성을 조사하였다. 산소가 라디칼 생성의 필수요소이고 글루타메이트 합성효소와 크레아틴 키나아제 효소가 산화-감수성 생물 마커라는 사실에 기초하여, 이들 효소의 불활화는 이들 단편화된 β-아밀로이드 응집체의 생물 분자에 대한 활성 공격의 지표로 활용된다.
본원 발명의 요약
본원 발명은 알츠하이머 치매(AD)의 진단 방법, 특히 체액, 예를 들면 혈액, 혈액 산물, 소변, 타액 등에서 알츠하이머병의 특이적인 생화학적 마커의 존재를 검사하여 알츠하이머 치매와 다른 유형의 치매를 차별적으로 진단하는 방법에 관한다. 또한, 본원 발명은 알츠하이머 치매와 연관된 적어도 한가지 생화학적 마커의 존재를 정량하는 방법에 관한다. 좀더 구체적으로, 본원 발명은 알츠하이머 치매 vs. 비-알츠하이머 치매의 차별적 진단이 가능한 특이 항체를 이용한 현장(point-of-care) 면역 분석법에 관한다.
본원 발명은 알츠하이머병을 진단하고 서브타입하며 모니터하는 방법과 ELISA 시스템에 관한다. 본원 발명은 S100B, NESγγ, GS 단백질이 뇌로부터 방출되고 뇌 외부의 체액에서 검출될 수 있다는 발견에 기초한다.
재조합 사람 GS의 발생과 정제를 기술한다. 이들 GS 단백질은 단클론 또는 다클론 항체를 만드는데 사용되고, 이들 항체들은 면역분석에 사용될 수 있는데, 여기서 이들 항체는 면역반응에 참여하고, 이런 면역반응을 모니터하고 정량하여의심 개체에서 순환 GS를 검출할 수 있다. 대안으로, GS 단백질 자체가 이런 개체에서 순환 자가 항체를 검출하는 면역분석에 사용될 수도 있다. 알츠하이머 치매의 발병은 체액에서 특정 생화학적 마커 수준의 인지로 특성화되는데, 상기 수준은 MMSE 검사법으로 정량된 알츠하이머 치매 증상의 태위(presentation)에 상관한다. 위험 평가 검사로서, 알츠하이머 발병의 지표인 이런 마커 수준의 인지는 숙련된 임상의의 진단 능력을 더욱 증대시킨다.
따라서, 본원 발명의 목적은 알츠하이머병의 명확한 진단을 위한 비-침입성의 매우 민감한 방법을 제공하는 것이다.
본원 발명의 다른 목적은 AD vs 비-AD 치매를 지표하는 적어도 한가지 마커의 존재를 확인하기 위하여 환자의 적어도 한가지 체액을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본원 발명의 또 다른 목적은 본원 발명의 방법으로 동정된 신경원 관련된 단백질에 특이적인 항체를 제공하는 것이다.
본원 발명의 또 다른 목적은 한가지이상 사람 체액에서 신경원 특이적 단백질의 인지에 효과적인 면역분석법을 제공하는 것이다.
본원 발명의 또 다른 목적은 사람 글루타민 합성효소에 특이적인 정제된 단클론 항체를 제공하는 것이다.
본원 발명의 또 다른 목적은 혈액이나 임의의 혈액 산물을 포함하는 시료를 이용하여 실시될 수 있는 비-침입성 현장 검사로 구성되는 AD의 진단을 위한 검사 키트를 제공하는 것이다.
본원 발명의 다른 목적과 장점은 첨부된 도면과 함께, 본원 발명의 특정 구체예를 설명한 하기의 상세한 설명으로부터 자명하다. 이들 도면은 본원 명세서의 일부를 구성하고 본원 발명의 전형적인 구체예를 포함하며 다양한 목적과 이의 특징을 설명한다.
본원 발명은 알츠하이머 치매(AD)의 진단 방법에 관한다. 특히, 본원 발명은 알츠하이머 치매와 연관된 적어도 한가지 생화학적 마커의 존재를 정량하는 방법에 관한다. 좀더 구체적으로, 본원 발명은 알츠하이머 치매 vs. 비-알츠하이머 치매의 차별적 진단이 가능한 특이 항체를 이용한 현장(point-of-care) 면역 분석법에 관한다.
도 1은 알츠하이머 치매를 앓고 있는 것으로 임상적으로 평가된 환자 코호트(cohort)의 혈액에서 GS, NSE, S100에 대한 통계학적으로 유의한 수치의 비교이다.
도 2는 비-알츠하이머 치매를 앓고 있는 것으로 임상적으로 평가된 환자 코호트(cohort)의 혈액에서 GS, NSE, S100에 대한 통계학적으로 유의한 수치의 비교이다.
도 3은 건강한 개체에서 연령에 상대적인 GS의 상자 그림(box whisker plot)을 도시한다.
본원 발명에 따라 분석되는 마커는 순환계로 방출되고 혈액 또는 임의의 혈액 산물, 예를 들면 혈장, 혈청, 예로써 저장 완충액(hypotonic byuffer)이나 세정제로 처리와 희석으로 세포용해된 혈액과 이의 제형, 다른 체액, 예를 들면 CSF, 타액, 소변, 림프 등에 존재할 수 있다. 다른 적절한 구체예에서, CSF에서 마커의 농도를 측정할 수 있다.
"정상 이상"과 "컷-오프 이상"은 뇌 사건, 다시 말하면 뇌 퇴행이나 위축을경험하지 않는 정상 개체에서 관찰되는 마커의 수준보다 높은 마커의 수준을 의미한다. 일부 마커의 경우, 정상 개체의 혈액에서 매우 낮은 수준으로 존재할 수 있다. 본원 발명에 따라 분석된 다른 마커의 경우, 정상 개체의 혈액에서 감지가능한 수준으로 존재할 수 있다. 이런 이유로, 이들 용어는 건강한 개체에서 발견되는 정상 수준보다 현저하게 높은 수준을 표시한다. "현저하게" 또는 "통계학적으로 유의하게"는 통계학적 유의성을 나타내고, 일반적으로 마커의 정상 이상의 농도에서 2개의 표준 편차(SD)를 의미한다. 마커 단백질에 대한 분석을 실시하는 이런 분석 방법은 관심있는 농도 범위에 존재하는 마커의 수준을 검출할 수 있을 만큼 민감하고 특이적이어야 한다.
진단 도구로서 수치를 서로 비교 평가하는 3가지 마커는 뇌 사건동안 손상된 특정 뇌 세포에 의해 방출되는 단백질이다. 이들 마커, 예를 들면 단백질은 고유 형태이거나 또는 단백분해 파괴로 생성된 단백질의 면역학적으로 감지가능한 단편일 수 있다. "면역학적으로 감지가능한"은 마커 단편이 상기 분석에 사용되는 항체 반응물에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 보유한다는 것을 의미한다.
본원 발명에 따라 분석되는 마커는 세포형 특이적이다. 효소 에놀라제는 당분해 경로에서 2-포스포글리세리트와 포스포에놀피루베이트의 상호전환(interconversion)을 촉매한다. 상기 효소는 개별 유전자의 각 산물인 3가지 이소단백질(isoprotein)로 존재한다. 유전자 좌위는 ENO1, ENO2, ENO3이다. EN01의 유전자 산물은 비-신경원 에놀라제(NNE 또는 α)로, 다양한 포유동물 조직에 광범위하게 분포한다. ENO2의 유전자 산물은 근육 특이적 에놀라제(MSE 또는β)로, 심장과 횡문근에 주로 존재하고, ENO3 유전자의 산물은 신경원 특이적 에놀라제(NSE 또는 γ)로, 주로 신경원과 신경내분비 세포에서 발견된다. 이들 고유 효소는 3가지의 면역학적으로 상이한 소단위 α,β, γ로 구성된 동종- 또는 이종이량체 동종효소로 발견된다. 각 소단위(α,β, γ)는 각각 16kDa, 44kDa, 46kDa의 분자량을 갖는다.
신경원 특이적 에놀라제로 명명된 αγ과 γγ 에놀라제 동종효소는 ~80,000 달톤의 분자량을 갖는다. 뇌 손상이후 CSF와 혈액에서 NSE 농도가 증가하고, 손상된 뇌 조직으로부터 CSF와 혈액 순환계로 NSE의 방출이 뇌 조직의 손상 정도를 반영하는 것으로 밝혀졌다. NSE는 ~48시간의 생물학적 반감기를 갖는다.
S100 단백질은 뇌의 회색질, 특히 대교세포와 슈반세포에서 주로 발견되는 세포질 산성 칼슘-결합 단백질이다. 이 단백질은 2개의 면역학적으로 상이한 소단위, A1(MW 10,400 달톤)과 B(MW 10,500 달톤)로 구성되는 여러 동종이량체 또는 이종이량체 동종효소로 존재한다. 중추신경계(CNS)에서, 동종이량체 S100 B-B(21,000 달톤)와 이종이량체 S100 A1-B(20,900 달톤)는 전체 S100의 95% 이상을 구성한다(Isobe et al. Biochem Int 1983;6:419, Zimmer et al. Brian Res Bull 1995;37:419). 높은 비율의 S100B가 뇌에서 발견되기 때문에, 다수의 연구에서 이 단백질을 뇌 손상의 마커로 조사하였다. S100B의 생물학적 반감기는 113분이다(Usui et al. Clin Chem 1989;35:1942). 신경학적 손상 과정을 모니터하는 데에는 S100B 혈청 수준의 반복 측정이 효과적이다.
글루타민 합성효소(GS)는 암모니아를 질소원으로 하여 글루타메이트의 글루타민으로의 ATP-의존성 전환을 촉매하는 편재성 효소이다. GS는 간, 근육, 신장, 뇌에 높은 농도로 존재한다(De Groot et al. Biochem Biophys Acta 1987;908:231). 사람 뇌에서 GS는 잠재적인 신경독성 글루타메이트와 암모니아의 글루타민으로의 전환을 통하여 신경원의 보호에 관여하는 성상세포-특이적 효소이다.
GS는 이가 양이온 부위로 인하여 산화에 극히 민감하다.
AD 환자의 뇌에서 노인반-밀집 영역은 상승된 산화 스트레스 환경을 대변하고, AD 환자의 뇌에서 상기 단백질은 대조에서보다 더욱 산화된다. 노인반 영역에 폭넓게 존재하는 반응성 미세교세포는 뇌에서 산화라디칼(oxyradical)의 근원으로 제안되었다.
3가지 상이한 유형의 GS가 알려져 있다: GSI, GSⅡ, GSⅢ. GSI과 GSⅢ에 대한 유전자는 박테리아에서 발견되었다. 사람 GS 유전자는 GSⅡ형에 속한다(Brown et al. J Mol Evol 1994;38:566). 뇌에서 GS는 360,000-400,000 달톤의 분자량을 보유하는 옥타머 구조로 존재하는 것으로 생각된다(Tumani et al. Immunol Meth 1995;188:155). 하지만, 혈액 순환계에서 상기 단백질은 MW 44±1kDa의 단량체로 존재하는 것으로 생각된다(Boksha et al. j Neurochem 2000;75:2574). 높은 농도의 GS가 AD 환자의 요신경 CSF에서 보고되었다(Gunnersen and Haley, Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:11949, Tumani et al. Arch Neurol 1999;56:1241).
CSF에서 상승된 GS 농도를 유발하는 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 반응성 성상세포에서 GS의 과다 발현과 세포외 공간으로 후속적인 방출이 제안되었다(Tumani et al, Arch Neurol 1999;56:1241).
본원 발명의 다른 구체예에서, 체액 시료는 분석이 진행되는 동안 때를 맞춰 한 시점에서 또는 여러 시점에서 취할 수 있다. 전형적으로, 첫 번째 시료는 AD의 가능 증상의 태위직후에 환자로부터 취하고 본원 발명에 따라 분석한다. 후속으로, 태위에서 일정 기간후, 예를 들면 첫 태위에서 대략 3-6개월후, 2번째 시료를 취하고 본원 발명에 따라 분석한다. 이들 데이터를 이용하여 AD를 진단하고 AD를 배제하며 AD와 비-AD 치매를 구별할 수 있다.
환자의 체액에서 발견된 3가지 특정 마커중 임의 하나 또는 전부의 수준은 1개의 단일 시료에서 측정하지만, 한 시료에서 1개 이상의 개별 마커를 측정할 수도 있다. "시료"는 혈액이나 CSF와 같은 체액을 의미한다. 모든 마커는 한가지 분석 장치로 측정하거나, 또는 각 마커에 개별적인 분석 장치로 측정할 수 있는데, 이런 경우에 동일 시료의 분량이 사용될 수 있다. 단일 시료에 동시에 존재하는 각 마커의 수준으로부터 의미있는 데이터를 얻기 위해서는 분석이 단일 분석 장치 또는 개별 장치에서 실시되는 지에 상관없이, 동일한 단일 시료에서 최대 3가지 마커를 각각 측정하는 것이 바람직하다.
각 마커의 존재는 각 마커에 특이적인 항체를 이용하고 개별 마커에 대한 각 항체의 특이적 결합을 감지하여 측정한다. 본원 발명에 따라 측정된 특정 마커 각각의 수준을 측정하는데 상용되는 분석 방법을 비롯하여 임의의 적합한 직접적인 또는 간접적인 분석 방법이 이용될 수 있다. 이런 분석은 경쟁 분석, 샌드위치 분석일 수 있고, 라벨은 공지된 라벨, 예를 들면 방사성면역분석, 형광이나 화학발광형광 면역분석, 또는 면역PCR 기술에서 선택될 수 있다. 면역분석 기술은 당업자에게 이미 공지되어 있기 때문에 본원에서 논하지 않는다. S100B의 분석은 Takahashi et al.(Clin Chem 1999;45(8):1307을 참고한다.
본원의 실시예에 이용되는 면역분석 방법은 시료에서 마커 단백질의 수준을 측정하는 이중 항체 또는 샌드위치 ELISA로 구성된다. 상기 방법에 따라, 항체중 하나는 고체상에 고정되는"캡처"항체이고, 다른 항체는 예로써 효소로 라벨된 "탐침" 항체이다. 탐침 항체는 캡처 항체에 결합된 마커 단백질에 결합하여 샌드위치 구조를 형성한다. 3가지 마커의 각 분석에서, 마커 단백질 표준은 흡수도 vs 마커 단백질 농도의 표준 곡선이나 보정 곡선을 작성하는데 이용된다. 상기 방법은 적절한 구체예의 이점 이외에, 추가된 마커 NSE와 S100B가 각각 신경의 파괴를 표시하고 뇌에서 급성 사건을 모니터하는데 조력한다는 점에서 중요하다.
마커 단백질을 측정하는데 시용되는 분석 방법은 건강한 개체에서 발견되는 정상 수치에서 병든 개체에서 발견되는 상승된 수준, 즉 2SD 정상(=컷-오프) 이상까지의 농도 범위에서 각 단백질을 측정할 수 있을 만큼 충분한 민감성을 보여 한다. GS 단백질에서, 컷-오프 = 0.022ng/㎖, NSE = 8.34ng/㎖, S100B = 0.02ng/㎖.
이들 분석은 배치(batch) 양식에서 분석을 실시하는데 선호되는 마이크로역가 평판 형식을 비롯한 다양한 형식으로 실시될 수 있다. 이들 분석은 당분야에 공지된 자동화 분석기로 실시될 수도 있다. 본원 발명에 이용될 수 있는 다른 분석 양식은 임의의 현장에서 실시될 수 있는 신속 매뉴얼 검사이다. 전형적으로, 이런 장치는 컷-오프 이상이나 이하의 결과, 즉 반-정량적 결과를 제공한다.
rhGS의 발현 및 단클론 항체의 분리
사람 글루타민 합성효소(사람 재조합 GS 또는 rhGS)에 특이적인 결합 특성을 갖는 항체를 분리하기 위하여, rhGS의 cDNA는 ATCC로부터 구매하였다. rhGS 개방 해독틀(ORF)의 전장은 PCR 및 pET28a(NdeI/ShoI)에 서브-클로닝으로 수득하였다. 이런 구조체는 rhGS ORF의 N-단부에서 폴리-히스티딘 태그를 보유하고 C-말단에서는 추가 서열을 보유하지 않았다. 단백질은 Listrom et al.(Biochem J 1997;328:159)의 기술에 따라 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)에서 발현시켰다. 정제되지 않은 세포 추출물의 준비 및 요소/알칼리 처리에 존재하는 불용성 발현 산물의 용해는 Moreno et al.(J Comp Neurol 1994;350:260)의 방법에 따라 달성하였다. 친화성 정제는 공급원자의 권고에 따라 Ni-NTA 크로마토그래피로 실시하였다.
단클론 항체의 준비:
본원 발명의 단클론 항체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개된 세포 융합 방법으로 만들었다.
면역세포의 준비:
Charles River Canada, St. Constant, Quebec, Canada로부터 구한 H-2d일배체형체를 가진 Balb/c 생쥐(암컷, 7-9주)는 첫 번째 주사를 위한 등부피의 프레운드 완전 어쥬번트(FCA)에, 이후 2-4주 간격으로 후속 주사를 위한 25-100㎍ GS-함유 프레운드 불완전 어쥬번트(FIA)에 유화된 rhGS로 면역하였다. 면역된 생쥐는인산염 완충액(PBS, pH 7.4)에 담긴 최종 면역주사를 정맥내 및/또는 복강내 제공하고 3-4일후에 죽였다.
하이브리도마의 준비:
GS 단백질과 Sp2/0 세포로 면역된 생쥐에서 얻은 비장 세포는 Fuller, SA, Takahashi, M and Hurrell, JGR(Preparation of Monoclonal Antibodies: In Susubel F, Brent B Kingston R. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology. New York: Greene Publishing Associates, 1987: Unit 11)에서 밝힌 방법에 따라 42% PEG의 존재하에 융합시켰다. 생성된 융합 세포는 Fuller et al.이 밝힌 바와 같이 HAT 선택 배지에 현탁시키고 피더 세포(feeder cell)인 복막 삼출물 세포(PEC)로 사전-접종된 4개의 96-웰 평판에 도말하였다.
GS-특이적 항체-분비 하이브리도마의 스크리닝:
하이브리도마 배양액의 스크리닝은 2가지 방법으로 실시하였다. (1) 고체상 ELISA - 스크리닝 ELISA-1: 유합 하이브리도마 배양 상층액은 10mM 탄산염 완충액(pH 9.6)에 담긴 2㎍/㎖ rhGS로 코팅된 96-웰 마이크로역가 평판(NUNC MaxiSorp, GIBCO BRL)에 첨가하였다. 과량의 결합 부위는 PSB(pH 7.4)에 담긴 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하였다. 0.05% Tween 20(WB)을 함유하는 PBS로 평판을 세척한 이후, 단클론 항체를 함유하는 100㎕ 배양 상층액은 고정된 항원과 함께 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 세척후, 과산화효소 공액된 염소 항-생쥐 IgG(Jackson ImmunoResearch Lab, Inc., West Grove, Pa.)를 첨가하고 전기 진탕기(orbital shaker)에서 실온(RT)에 30분동안 배양하였다. 세척후, TMB 기질용액(Sigma)을 첨가하였다. 암실에서 RT에 5분간 배양한 이후, 반응은 1MH2SO4로 중단시키고, 광학 밀도는 450mm에서 판독하였다. 선별된 양성 배양액은 Fuller et al.이 밝힌 바와 같이 제한 희석 방법으로 클로닝하였다. ELISA 스크리닝과 클로닝 과정은 배양 안정성과 클론성이 달성될 때까지 반복하였다. (2) 스크리닝 ELISA-2: 두 번째 방법에서, 하이브리도마 배양 상층액에서 단클론 항체는 ELISA 평판의 고체상에 고정된 염소 항-생쥐 IgGfc(Jackson ImmunoResearch)를 통하여 포획되었다. 37℃에서 1시간 배양후, 평판은 방법-1에서와 같이 세척하였다. 이후, 0.5% BSA를 함유하는 PBS에서 1/2000 희석된 비오틴화된 GS(제조업자의 권고에 따라 Boehringer Mannheim의 Biotin Labeling Kit를 이용하여 제조)를 각 웰에 첨가하였다. 교반기에서 RT에 30분 배양후, 평판은 세척하고 1/10,000의 HRP-공액된 스트렙타비딘(Boehringer Mannheim)을 첨가하고 RT에 30분동안 배양하였다. 세척후, TMB 기질 용액을 첨가하고, 반응은 방법-1에서와 같이 판독하였다.
ELISA 분석을 실시하기 위하여, 1G3과 5G4로 명명된 2개의 클론이 선별되었다. 이들 클론은 Budapest Treaty에 따라 각각 수탁 번호 PTA-3339와 PAT-3340하에 2001. 4. 25에 American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209에 기탁되었다. 37 CFR 1.808에 따라, 기탁자는 기탁된 물질에 대한 공공의 이용성에 어떤 제한도 특허의 허여 직후에 소멸될 것임을 보증한다.
GS-특이적 단클론 항체는 복수(ascite)를 이용하여 만들었다. 복수는 0.25-0.5㎖ PBS(pH 7.4)에 담긴 1-5x106하이브리도마 세포를 복강내 주사하여, 0.25㎖ 프리스탄(pristane)으로 사전처리된 Balb/c 생쥐에서 만들었다. 10 내지 14일후, 복수를 수거하였다. 복수에서 얻은 단클론 항체는 공지된 과정에 따라 친화성 칼럼(Protein G, AVIDAL)에서 정제하였다. 정제된 단클론 항체는 면역화학적 연구에 사용하였다.
다클론 항체 생산과 정제:
염소는 프레운드 어쥬번트에 유화된 정제된 rhGS 250-500㎍을 근육내 및/또는 피하 주사로 격주로 면역하였다. 역가는 절반-샌드위치 ELISA로 혈청을 스크리닝하여 정기적으로 모니터하였다. GS에 특이적인 다클론 항체(PAb)는 재조합 GS에 결합된 브롬화시아노겐 활성화된 세파로즈-4B(Pharmacia)를 이용한 친화성 정제로 염소 혈청으로부터 후속 정제하였다. 정제된 다클론 항체는 10mM PBS(pH 7.4)에 투석하고 한외여과로 농축하며 -20℃에 저장하였다.
생물학적 시료에서 GS의 감지 및 진단 검사
본원 발명의 다른 목적은 알츠하이머병을 앓는 개체에서 GS를 감지하기 위한 진단 검사에 이용할 수 있는 시약을 제공하는 것이다.
본원 발명의 한 구체예에서, 본원 발명의 GS는 AD 개체를 감지하기 위한 면역분석에 항원으로 이용될 수 있다. 본원 발명의 단백질 GS는 방사능면역분석, 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA), "샌드위치"분석, 침강 반응, 겔 확산 면역확산 분석, 응집 분석, 형광 면역 분석, 단백질 A 또는 G 면역분석 및 면역 전기영동 분석을 포함하나 이에 국한되지 않는 임의 면역분석 시스템에 이용될 수 있다. 본원 발명에 따르면, 사람 GS에 대해 생성된 단클론 또는 다클론 항체는 AD 환자를 진단하기 위한 혈액이나 혈액 산물, 예를 들면 혈청, 혈장 등, 척수 또는 다른 체액, 예를 들면 타액, 소변, 림프 등의 시료에서 면역분석에 유용하다. 알츠하이머 치매는 사람의 GS에 특이적인 단일 단클론 항체 또는 복수의 단클론항체를 단독이나 복합적으로 이용하여 결정할 수 있다.
임의 유형의 면역분석에 이들 항체가 이용될 수 있다. 이런 면역분석에는 두 부위 샌드위치 분석과 비-경쟁 유형의 단일 부위 면역분석 및 통상적인 경쟁 결합 분석이 포함된다.
감지가 용이하고 단순하며 정량적 특성으로 인하여, 본원 발명에 의해 다양한 모든 변수가 고려된 샌드위치 또는 이중 항체 분석이 특히 바람직하다. 가령, 전형적인 샌드위치 분석에서, 라벨안된 항체를 마이크로역가 평판과 같은 고체상에 고정시키고, 검사 시료를 첨가한다. 항체-항원 복합체가 형성될 수 있도록 일정 시간 배양한 이후에, 감지가능한 신호를 유도할 수 있는 리포터 분자로 라벨된 제 2 항체를 첨가하고, 상이한 부위에서 항원과 결합할 수 있는 만큼 충분한 시간동안 배양을 지속하여 항체-항원-라벨된 항체의 복합체를 형성한다. 항원의 존재는 함량을 미리 알고 있는 항원을 함유하는 대조 시료와의 비교로 정량될 수 있는 신호의 관찰로 확인한다.
임상 연구
세 곳의 고령자 병원에서 전형적 관찰을 위한 시험 연구를 실행하였다. 이연구에서는 병원을 방문한 38명의 환자를 평가하고, Mini Mental State Examination(MMSE) 및 다른 경로 테스트를 실시하였다. 이들중, 24명은 AD 진단을 받았고, 14명은 AD가 아닌 다른 종류의 치매로 진단을 받았다. 알츠하이머 치매를 보이는 환자들의 평균 연령은 약 79세이고, 연령대는 54 내지 87세이었다. Mini Mental State Examination 수치(MMSE)를 기록하였다. 혈액 시료를 취하고, 응고후 시료를 원심분리하고, 혈청 소량을 냉동하고, S100, NSE, GS 분석을 할 때까지 -70℃에서 보관한다.
대조 개체에는 153명의 건강한 혈액 기증자(연령대 18-87세; 평균 연령 71.03±9.95)가 포함되었는데, 이들의 혈액 시료를 이용하여 S100, NSE 및 GS의 농도에 대한 기준 값을 결정하였다.
알츠하이머병은 기저 신피잘에서 시작되어, 해마로 확산되며, 종국에는 모든 피질 부분으로 침투하는 진행성 질환으로 인지되고 있다. 질병 과정동안 증세는 경감되지 않는다(Braak and Braak, Neurobiol Aging 1997;18(4):351). 이는 AD가 진행성 질환이며, 단순히 노화의 산물이 아니라는 것을 말한다. AD 병인은 신경원의 점진적인 진행성 파괴를 수반한다. NSE는 AD에 특이성은 없지만, 마커는 신경원의 진행성 파괴를 나타내는 지시물질로 이용된다. 사람 GS에 대한 단클론 항체를 이용하여, 비-CSF-체액에서 단백질을 분석할 때 AD에 섬세하고 민감하며 특이적인 분석이 가능하다. 이는 선행 기술 분석과 상이한데, 기존 분석에서 마커는 비-사람 GS에 특이적이고, 혈청이나 임의의 다른 비-CSF 체액으로부터 명확한 데이터가 유도될 수 없었다. S100은 민감성을 갖지 않지만 AD의 표적 집단인 노인들에서흔히 발생하는 뇌에서 급성 사건(TIA, 경색, 국소빈혈을 유도하는 저산소증 등)을 모니터하는데 유용하다.
모든 기준치는 평균+2SD로 나타낸다. 3가지 마커의 기준치는 다음과 같다;GS=0.022ng/㎖, NSE=8.34ng/㎖, S100=0.02ng/㎖.
S100 및 NSE 수준은 Syn-X Pharma Inc, Mississauga, Ont. CANADA의 SMART S100 및 SMART NSE를 각각 이용하여 분석하였다. GS 분석을 위해서, Syn-X Pharma에서 항체 시약 및 조정물질(즉, 재조합 사람 GS)을 생산하고, ELISA는 상기에서 설명한 것과 같이 실시하였다.
도 3의 상자 그림에서는 연령을 기초하여 분류된 건강한 개체에서 GS 단백질의 혈청 농도의 분석을 도시한다. 흥미롭게도, 60대 개체는 연령대가 좀더 젊은 사람들과 비교하여 혈액에서 현저하게 높은 수준의 GS를 나타낸다. 하지만, 70+이상의 개체의 혈액에서 평균 GS 수준은 20대와 40대에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 낮아졌다. 유사한 패턴이 S100에서도 관찰되었다. 한편, NSE 혈청 농도의 연령 분포는 다른 두 마커와 상이한데, 14 내지 40세의 연령군에서 상당히 높은 농도가 관찰되었다. 이들 3가지 단백질의 혈청 수준은 성별과 상관관계가 없었다. 임의 특정 이론에 구애됨 없이, GS(또는 S100) 수준이 상승된 60대는 이미 뇌 퇴행이 시작되고, 70대의 이런 개체는 "환자"로 분류되며, 나머지 "건강한"개체는 이들 단백질 마커를 낮은 수준으로 보인다. 따라서, 60대 연령군의 GS 수준에 초점을 맞추는 것이 위험 평가 연구를 위한 진단으로 특히 유익한 것으로 결론이 도출되었다.
24개의 MMSE-기초한 AD 혈청 시료중 20개는 경등도 AD 사례이었고, 4개는 중등도이었다(도 1참고). 3가지 마커, GS, NSE, S100B의 민감성은 각각 100%, 33%, 8%이었다. GS 수준은 AD 심각도, 즉 MMSE 스코어와 상관하지만, NSE에서는 유사한 상관관계가 관찰되지 않았다. S100의 민감성은 매우 낮지만, 이 마커가 상승되면 급성 현상으로 인한 뇌 성상세포의 파괴가 진행되고 있음을 암시할 수 있다.
14개의 비-AD 치매 시료중에서 1개 시료만 GS 및 S100 수준이 상승되었고, 7개 시료는 컷-오프 수준 이상의 MSE 농도를 보인다(도 2참고). 이는 GS 및 S100이 AD에 매우 특이적인 마커라는 것을 시사한다.
본 명세서에 언급하고 있는 특허 및 간행물은 본원 발명이 속하는 기술 분야에 당업자 수준을 나타내는 것이다. 모든 특허와 간행물은 본원에 순전히 참고로 한다. 본원 발명에서 특정 실례를 기술하지만, 이런 실례는 본원 발명을 국한시키지 않는다. 본원 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 실시될 수 있으며, 본원 발명이 명세서 및 도면에서 나타내고 설명하는 것에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 본원 발명은 언급된 목적 및 장점을 실행할 수 있도록 적합된다. 본원 발명의 구체예에 있는 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 생물학적으로 관련된 화합물, 방법, 과정, 기술은 적절한 구체예를 대표하며, 본원 발명의 영역을 한정하지 않는다. 본원 발명에서 정의하는 범위에 포함되고 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 개변 및 다른 용도는 당업자에게 자명하다. 본원 발명은 특정 구체예로 설명하고 있지만, 청구된 본원 발명은 이런 특정 구체예에 의해 한정되지 않는다. 또한, 본원 발명을 실행함에 있어서 설명된 방식에 다양한 개변 또한 본원 발명의 범위에 속한다.

Claims (54)

  1. 포유류에서 알츠하이머 치매를 진단하고 구별하는 방법에 있어서,
    - 포유류의 체액 시료를 얻고;
    - 알츠하이머병의 생물학적 마커에 특이적으로 결합하는 적어도 한가지 항체와 시료를 접촉시키고;
    - 시료내에 생물학적 마커가 존재하는 지를 결정하고;
    - 알츠하이머 치매 발생과 생물학적 마커의 존재를 상관시키는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 임상적으로 치매를 나타내는 징후를 보이는 포유류에서 비-AD 치매로부터 알츠하이머 치매를 구별하는 방법에 있어서,
    - 포유류의 체액 시료를 얻고;
    - 알츠하이머병의 생물학적 마커에 특이적으로 결합하는 적어도 한가지 항체와 시료를 접촉시키고;
    - 시료내에 생물학적 마커의 수준을 측정하고;
    - 알츠하이머 치매와 비-알츠하이머 치매를 나타내는 통계학적으로 유의한 수준과 생물학적 마커의 측정된 수준을 상관시키고,
    - AD와 비-AD 치매를 구별하여 진단하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 생물학적 마커는 사람의 글루타민 합성효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 체액 시료는 혈액 또는 혈액 산물인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체는 사람 GS에 특이적인 적어도 한가지 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 시료를 측정하는 방법은 면역분석 기술에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 알츠하이머 치매를 나타내는 적어도 한가지 마커에 특이적인 적어도 한가지 항체, 이때 항체 또는 마커는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 마커에 결합하고;
    여기서, 마커, 이 마커에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석은 체액 시료에서 실시된다.
  8. 제 7 항에 있어서, 마커는 사람의 글루타민 합성효소이고, 이 항체는 합성 효소에 특이적인 적어도 한가지 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  9. 제 7 항에 있어서, 체액 시료는 혈액 또는 혈액 산물인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  10. 제 7 항에 있어서, 진단 및 모니터링은 체액의 단일 시료에서 실행되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  11. 제 7 항에 있어서, 진단 및 모니터링은 체액의 다중 시료에서 실행되고, 제 1 체액 시료에서는 적어도 한가지 분석이 실시되며, 제 2 체액 시료에서는 다른 분석이 실시되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
  12. 제 11 항에 있어서, 제 1과 제 2 체액 시료는 다른 시점에서 수득되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  13. American Type Culture Collection에 PTA-3339로 기탁된 하이브리도마 세포주 1G3.
  14. American Type Culture Collection에 PTA-3339로 기탁된 하이브리도마 세포주 1G3으로부터 생성된 단클론 항체.
  15. American Type Culture Collection에 PTA-3339로 기탁된 하이브리도마 세포주 1G3에서 생성되는 단클론 항체를 이용하여 사람 글루타민 합성효소를 감지하는 방법에 있어서,
    단클론 항체를 시료에 접촉시켜 시료내에 있는 글루타민 합성효소와 단클론 항체간에 면역반응을 일으키고,
    면역반응을 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. American Type Culture Collection에 PTA-3340으로 기탁된 하이브리도마 세포주 5G4.
  17. American Type Culture Collection에 PTA-3340으로 기탁된 하이브리도마 세포주 5G4로부터 생성되는 단클론 항체.
  18. American Type Culture Collection에 PTA-3340으로 기탁된 하이브리도마 세포주 5G4에서 생성되는 단클론 항체를 이용하여 사람 글루타민 합성효소를 감지하는 방법에 있어서,
    단클론 항체를 시료에 접촉시켜 시료내에 있는 글루타민 합성효소와 단클론항체간에 면역반응을 일으키고,
    면역반응을 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 적어도 한가지 동물 숙주에서 사람 글루타민 합성효소에 대항하여 생성된 다클론 항체.
  20. 사람 글루타민 합성효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 면역학적으로 감지가능한 단편.
  21. 제 20 항에 있어서, 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  22. 제 20 항에 있어서, 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  23. 제 20 항에 있어서, 항체 단편인 것을 특징으로 하는 항체.
  24. 제 20 항에 따른 항체로 구성되는 진단키트.
  25. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 알츠하이머 치매를 나타내는 적어도 한가지 뇌 연관된 마커에 특이적인 사람 글루타민 합성효소에 대해 생성된 적어도 한가지 항체, 이때 항체 또는 마커는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 마커에 결합하고;
    여기서, 마커, 이 마커에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 체액 시료에서 실시한다.
  26. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 알츠하이머 치매를 나타내는 적어도 한가지 뇌 연관된 마커에 특이적인 사람 글루타민 합성효소에 대해 생성된 적어도 한가지 항체, 이때 항체 또는 마커는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 마커에 결합하고;
    여기서, 마커, 이 마커에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 혈액 또는 임의의 혈액 산물의 시료에서 실시한다.
  27. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 알츠하이머 치매를 나타내는 적어도 한가지 뇌 연관된 마커에 특이적인 사람 글루타민 합성효소에 대해 생성된 적어도 한가지 단클론항체, 이때 항체 또는 마커는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 마커에 결합하고;
    여기서, 마커, 이 마커에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 체액 시료에서 실시한다.
  28. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 뇌 연관된 사람 글루타민 합성효소에 특이적인 사람 글루타민 합성효소에 대해 생성된 적어도 한가지 단클론항체, 이때 항체 또는 마커는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 마커에 결합하고;
    여기서, 마커, 이 마커에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 혈액 또는 임의의 혈액 산물의 시료에서 실시한다.
  29. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 뇌 연관된 사람 글루타민 합성효소에 특이적인 사람 글루타민 합성효소에대해 생성된 적어도 한가지 항체, 이때 항체 또는 뇌 연관된 사람 글루타민 합성효소는 고형 서포트에 고정되어 있고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 사람 글루타민 합성효소에 결합하고;
    여기서, 사람 글루타민 합성효소, 이에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 체액 시료에서 실시한다.
  30. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 뇌 연관된 사람 글루타민 합성효소에 특이적인 적어도 한가지 항체, 이때 항체 또는 뇌 연관된 사람 글루타민 합성효소는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 사람 글루타민 합성효소에 결합하고;
    여기서, 사람 글루타민 합성효소, 이에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 혈액 또는 임의의 혈액 산물의 시료에서 실시한다.
  31. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 분자량이 약 44kDa인 뇌 연관된 사람의 단량체 글루타민 합성효소에 특이적인 적어도 한가지 항체, 이때 항체 또는 뇌 연관된 사람 글루타민 합성효소는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 사람 글루타민 합성효소에 결합하고;
    여기서, 분자량이 약 44kDa인 뇌 관련된 사람의 단량체 글루타민 합성효소, 이에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 체액 시료에서 실시한다.
  32. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 분자량이 약 44kDa인 뇌 연관된 사람의 단량체 글루타민 합성효소에 특이적인 적어도 한가지 항체, 이때 항체 또는 뇌 연관된 사람 글루타민 합성효소는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 사람 글루타민 합성효소에 결합하고;
    여기서, 분자량이 약 44kDa인 뇌 관련된 사람의 단량체 글루타민 합성효소, 이에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 혈액 또는 임의의 혈액 산물의 시료에서 실시한다.
  33. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 분자량이 약 44kDa인 뇌 연관된 사람의 단량체 글루타민 합성효소에 특이적인 적어도 한가지 단클론항체, 이때 항체 또는 뇌 연관된 사람 글루타민 합성효소는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 사람 글루타민 합성효소에 결합하고;
    여기서, 분자량이 약 44kDa인 뇌 관련된 사람의 단량체 글루타민 합성효소, 이에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 체액 시료에서 실시한다.
  34. 알츠하이머 치매 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 분자량이 약 44kDa인 뇌 연관된 사람의 단량체 글루타민 합성효소에 특이적인 적어도 한가지 단클론항체, 이때 항체 또는 뇌 연관된 사람 글루타민 합성효소는 고형 서포트에 고정되고;
    - 적어도 한가지 종류의 라벨된 항체, 이 항체는 사람 글루타민 합성효소에 결합하고;
    여기서, 분자량이 약 44kDa인 뇌 관련된 사람의 단량체 글루타민 합성효소,이에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편이 존재하는 지를 결정하는 적어도 한가지 분석법은 혈액 또는 임의의 혈액 산물의 시료에서 실시한다.
  35. 알츠하이머 치매를 진단하고 구별하며 이의 진행을 모니터하는 방법에 있어서,
    - 포유류로부터 체액 시료를 얻고;
    - 시료와 적어도 한가지 항체 또는 항체 단편을 접촉시키고, 이때 항체 또는 항체 단편은 S-100 단백질 베타 동종효소, 신경원 특이적 에놀라제(NSE), 글루타민 합성효소(GS) 또는 이들의 면역학적 단편에서 선택된 적어도 한가지 생화학적 마커 단백질에 대해 특이적인 결합 성질을 갖는 항체에서 선택되고, 상기 항체는 고형 서포트에 결합할 수 있으며;
    - 시료와 적어도 한가지 라벨된 항체를 접촉시키고, 각 라벨된 항체는 선택된 생화학적 표석 단백질중 하나에 대해 친화력을 가지고;
    - 각 마커, 이에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편을 결정하고 측정하는 적어도 한가지 분석이 체액 시료에서 실행되며;
    - 시료에서 선별된 생화학적 마커 단백질이 존재하는 지를 결정하고;
    - 각 선별된 생화학적 마커 단백질 각각의 존재와 알츠하이머 치매 발생을 상관시키는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 임상적으로 치매를 나타내는 포유류에서 비-AD 치매와 알츠하이머 치매를 구별하는 방법에 있어서,
    - 포유류로부터 체액 시료를 얻고;
    - 시료와 적어도 한가지 항체 또는 항체 단편을 접촉시키고, 이때 항체 또는 항체 단편은 S-100 단백질 베타 동종효소, 신경원 특이적 에놀라제(NSE), 글루타민 합성효소(GS) 또는 이들의 면역학적 단편에서 선택된 적어도 한가지 생화학적 마커 단백질에 대해 특이적인 결합 성질을 갖는 항체에서 선택되고, 상기 항체는 고형 서포트에 결합할 수 있으며;
    - 시료에서 선별된 생화학 마커 단백질 수준을 측정하고;
    - 알츠하이머 치매와 비-알츠하이머 치매를 나타내는 통계학적 유의성 수준과 선별된 생화학 마커의 측정된 수준을 상관시키고;
    - AD와 비-AD 치매를 구별하여 진단하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 적어도 한가지 생화학적 마커 단백질은 사람 글루타민 합성효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 35 또는 제 36 항에 있어서, 체액 시료는 혈액 또는 임의의 혈액 산물인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 적어도 한가지 항체는 사람 GS에 특이적인 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 시료를 측정하는 방법은 면역분석 기술을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 알츠하이머 치매를 진단하고 이의 진행을 모니터하는 진단 키트에 있어서, 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트:
    - 3가지 상이한 마커 단백질 각각에 특이적인 1 내지 3가지 항체, 상기 항체들은 고형 서포트에 고정될 수 있고, 여기서
    a. 제 1 마커 단백질은 S100 단백질의 베타 동종효소이고, 제 1 항체 또는 항체 단편은 이에 특이적이고;
    b. 제 2 마커 단백질은 신경원 특이적인 에놀라제, 제 2 항체 또는 항체 단편은 이에 특이적이고;
    c. 제 3 마커 단백질은 글루타민 합성효소(GS)이고, 제 3 항체 또는 항체 단편은 이에 특이적이고;
    d. 1개 내지 3가지 라벨된 항체, 이들 각 라벨된 항체는 상기 마커 단백질중 하나에 결합하고;
    e. 3가지 마커 단백질 각각을 각 마커 단백질의 특정 경계값에 비교하여, 적어도 2개의 정상 수준 이상 표준 편차의 통계학적으로 유의성 있는 농도가 존재하는 지를 결정하는 수단;
    여기서, 적어도 한가지 마커, 이에 특이적인 항체 또는 이들의 면역학적으로 감지가능한 단편의 존재를 결정하는 적어도 한가지 분석은 체액 시료에서 실시하고,
    3가지 마커를 비교하는 단계로 알츠하이머 치매 발생을 확인한다.
  42. 제 41 항에 있어서, 제 3 마커 단백질은 사람 글루타민 합성효소이고, 항체 또는 항체 단편은 글루타민 합성효소에 특이적인 적어도 한가지 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  43. 제 41 항에 있어서, 체액 시료는 혈액 또는 임의의 혈액 산물인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  44. 제 41 항에 있어서, 진단 및 모니터링은 체액의 단일 시료에서 실행되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  45. 제 41 항에 있어서, 진단 및 모니터링은 체액의 다중 시료에서 실행하고, 적어도 한가지 분석은 제 1 체액 시료에서 실시되고, 적어도 한가지 다른 분석은 제 2 체액 시료에서 실시되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
  46. 제 45 항에 있어서, 제 1과 제 2 체액 시료는 상이한 시점에서 수득되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
  47. 제 35 항에 있어서, 글루타민 합성효소를 감지하는 항체는 American Type Culture Collection에 PTA-3340으로 기탁된 하이브리도마 세포주 5G4에서 생성되는 단클론 항체 또는 단클론 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 36 항에 있어서, 글루타민 합성효소를 감지하는 항체는 American Type Culture Collection에 PTA-3340으로 기탁된 하이브리도마 세포주 5G4에서 생성되는 단클론 항체 또는 단클론 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 41 항에 따라 알츠하이머 치매의 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 글루타민 합성효소를 감지하는 항체는 American Type Culture Collection에 PTA-3340으로 기탁된 하이브리도마 세포주 5G4에서 생성되는 단클론 항체 또는 단클론 항체 단편인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  50. 제 35 항에 있어서, 글루타민 합성효소를 감지하는 항체는 American Type Culture Collection에 PTA-3339로 기탁된 하이브리도마 세포주 1G3에서 생성되는 단클론 항체 또는 단클론 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 36 항에 있어서, 글루타민 합성효소를 감지하는 항체는 American Type Culture Collection에 PTA-3339로 기탁된 하이브리도마 세포주 1G3에서 생성되는 단클론 항체 또는 단클론 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 41 항에 따라 알츠하이머 치매의 진행을 진단하고 모니터하는 진단 키트에 있어서, 글루타민 합성효소를 감지하는 항체는 American Type Culture Collection에 PTA-3339로 기탁된 하이브리도마 세포주 1G3에서 생성되는 단클론 항체 또는 단클론 항체 단편인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  53. 제 35 항에 있어서, 포유류는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 36 항에 있어서, 포유류는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
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