ES2581178T3 - Nuevas herramientas de diagnóstico para enfermedad de Alzheimer - Google Patents

Abstract

Un método para detectar la presencia de riesgo de enfermedad de Alzheimer (AD) en un mamífero vivo, o para ayudar en el diagnóstico y subclasificación de AD, método que comprende determinar la cantidad (relativa) o la presencia, ausencia o alteración de un conjunto de biomarcadores diana en una muestra de fluido biológico de dicho mamífero y comparar el nivel medido del biomarcador(es) con un valor de referencia, en donde una desviación de dicho valor de referencia es indicativo de la presencia, riesgo, progresión o gravedad de AD, y en donde dicho conjunto de biomarcadores comprende una proteína o ácido ribonucleico (ARN) codificado por cada uno de los siguientes genes: APBA1, ATG7, BECN1, CD44, CDH2, COL18A1, ERBB4, F3, FLNA, FYN, GRIN2B, IL20, ITPR1, LRP8, MTOR, NPPC, NRP1, PDGFC, ROBO1, SEMA3E, TGFB1, THBS1, VEGFR1 y WWOX.

Description

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DESCRIPCION

IMuevas herramientas de diagnostico para enfermedad de Alzheimer Campo de la invencion

La presente descripcion se refiere a desarrollo, validacion y aplicacion de nuevos conjuntos de biomarcadores para el diagnostico de la enfermedad de Alzheimer (AD) y trastornos relacionados, incluyendo el diagnostico precoz del MCI y prodromo precoz de la AD, identificacion de subtipos de la enfermedad, prediccibn de su respuesta a los procedimientos de gestion de la enfermedad, farmacos y sus combinaciones y para contra la respuesta a estos tratamientos, incluyendo validacion de biomarcadores para ensayos clinicos. En particular, la presente descripcion se refiere al campo de la deteccion y del control del tratamiento de trastornos neurodegenerativos, que incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad prodromica de la enfermedad de Alzheimer o deterioro cognitivo leve (MCI). De forma mas especifica, la presente descripcion se refiere a biomarcadores proteicos, lipidicos, glucidicos y metabolitos que se pueden medir en fluidos biologicos, que se pueden usar para ayudar en la deteccion, subclasificacion, prediccidn del tratamiento farmacologico y seguimiento de este tratamiento de trastornos neurodegenerativos , que incluyen la enfermedad de Alzheimer, su prodromo y deterioro cognitivo leve. La invencion proporciona un metodo para detectar la presencia o riesgo de AD, y el uso de un kit.

Antecedentes de la invencion

En la actualidad, la AD es la causa mas comun de demencia. Se caracteriza cllnicamente por una disminucion global de la funcion cognitiva que evoluciona lentamente y deja a los pacientes en fase terminal condenados a la cama, con incontinencia y dependientes de atencion de custodia. La muerte se produce, como promedio, 9 arios despues del diagnostico (Citron ef al., 2004). La tasa de incidencia de la AD aumenta de forma radical con la edad. Las predicciones de poblacion de las Naciones Unidas calculan que el numero de personas mayores de 80 arios se aproximaran a los 370 millones en el ario 2050. En la actualidad, se calcula que un 50 % de las personas mayores de 85 arios estan afectados con AD. Por lo tanto, mas de 100 millones de personas en todo el mundo padeceran demencia en 50 arios. El gran numero de personas que requieren cuidados constantes y otros servicios afectara gravemente a los recursos medicos, economicas y humanos (Suh y Checler, 2002).

En la actualidad, el diagnostico clinico de la AD se basa en entrevistas estructuradas (historias de pacientes), y examenes neuropsicologicos acoplados con formacibn de imagenes o exploraciones neurofisiologicas (exploraciones con CT, MRI, PET ylo SPECT y EEG) para descartar otras explicaciones de la perdida de memoria, incluyendo condiciones temporal (depresion o deficiencia de vitamina B12) o condiciones permanentes (apoplejia) y se basa en criterios del grupo de trabajo NINCDS-ADRDA (McKhann et al., 1984) y el Manual de Diagnostico y Estadistico de la Asociacion Americana de Psiquiatria de Trastornos Mentales (4a Ed. Washington D.C., Am Psychiatric Assoc, 1997).

Desafortunadamente, los metodos de diagnostico clinico no son infalibles. La revision basada en las evidencias de la bibliografia actual muestra una precision del diagnostico clinico de un 65 a 90 %. Las tasas de precision mas elevadas estan asociadas por lo general con centros especializados (clinicas de trastornos de memoria) que se centran en trastornos de memoria mientras que las tasas mas bajas estan asociadas probablemente con los medicos de atencion primaria. Ademas, la precision del diagnostico clinico probablemente es menor durante las etapas iniciales de la enfermedad cuando los sintomas son dificiles de diferenciar de los del deterioro cognitivo asociado a la edad normal. Mas recientemente, algunos estudios sugieren que una afeccion denominada deterioro cognitivo leve (MCI) representa a la AD prodromica y si se diagnostica en un estadio temprano representa la mejor oportunidad para intervencion farmaceutica. Los criterios clinicos usados para el diagnostico de MCI son los de Petersen et al (1999) e incluyen: 1) problemas de memoria corroborados por un informante, 2) deterioro de la memoria objetiva para edad y educacion, 3) funcion normal cognitiva general, 4) actividades de la vida diaria intactas, y 5) el sujeto no satisface los criterios de demencia.

Una complicacion adicional del diagnostico y el tratamiento de la AD es la falta de un biomarcador fiable que identifique de forma especifica a sujetos con AD, en particular en la fase inicial del estadio prodromico de la enfermedad (MCI). En vista de la magnitud del problema de salud publica que plantea la AD, se han realizado esfuerzos de investigacion considerables para elucidar la etiologla de la AD, asi como para identificar biomarcadores, proteinas caracteristicas o metabolitos medidos de forma objetiva como un indicador de procesos patogenicos, que se puede usar para diagnosticar y/o predecir si es probable que una persona desarrolle la AD.

La mayoria de los estudios de biomarcadores de la AD se han centrado en la medicion en el fluido cerebroespinal (CSF). Debido a su contacto intimo con el cerebro, los cambios patogenicos en el cerebro que dan como resultado alteraciones en proteinas/peptidos se reflejarian probablemente en el CSF.

Una serie de patentes de Estados Unidos y solicitudes publicadas que se refieren a metodos para diagnosticar la AD, incluyen las Pat. de Estados Unidos n.05 4.728.605, 5.874.312, 6.027.896, 6.114.133, 6.130.048, 6.210.895, 6.358.681, 6.451.547, 6.461.831, 6.465.195, 6.475.161, 6.495.335, 2005/0244890, y 2005/0221348. Ademas, un numero de informes en la bibliografia cientifica se refieren a ciertos marcadores bioquimicos y su correlacibn/asociacion con la AD, que incluyen a Fahnestock et al., 2002; Masliah et al., 1995; Power et al., 2001; y

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Burbach et al., 2004. Ademas, Li et al. (2002) y Sanna el al. (2003) han investigado la Leptina en relacion con la memoria y la esclerosis multiple, respectivamente. El documento de patente JP 2000/321274 tambien describe biomarcadores de AD.

Tres biomarcadores diferentes en CSF se han documentado particularmente bien: proteina de la cadena neuronal, tau (total, T-tau y diversas formas fosforiladas; P-tau) y derivados de la proteina precursora de amiloide (APP) que incluye a Ap« y se describe que la proteina de la cadena neuronal Ap42 se sobreexpresa en las neuronas del cerebro en pacientes con AD. Se ha desarrollado un ensayo cuantitativo para medir los niveles de un tipo especifico de proteina de la cadena neuronal (AD7c-NTP) en CSF y orina. Un buen numero de estudios han evaluado CSF-tau como un marcador ante mortem para la AD usando principalmente ensayos de inmunoabsorcion ligados a enzimas (ELISA) como el ensayo de medicion. En estudios anteriores, se midio la tau total (T-tau) aunque hay un creciente cuerpo de bibliografia que tambien describe el analisis de variantes fosforiladas (P-tau) de la misma proteina que participan en la formacion de ovillos neurofibrilares. Tambien se han desarrollado ELISA que pueden distinguir entre la principal forma de Ap que termina en el aminoacido 40 (A0^a) y las especies formadoras de placas seniles que terminan en la posicion 42 (AP42) y se han evaluado extensamente para el analisis del CSF. Estos tres ensayos, o bien usados de forma individual, o en el caso de tau en AP42, en combinacion, no han demostrado los valores de sensibilidad y especificidad requeridos para el uso clinico de rutina, en particular para el diagnostico precoz y discriminacion entre AD y otras demencias que no son AD. Ademas, los intentos para medir tau y AP42en sangre se han cumplido con exito limitado, lo que restringe aun mas su adopcion generalizada en la practica clfnica.

Se ha informado de un amplio espectro de otras anomalias, distintas de NTP, Tau y Ap, en CSF de pacientes con AD. Se ha mostrado que muchos de los marcadores de CSF identificados (secuencia de proteinas confirmada) informados en la presente memoria aumentan 0 disminuyen en pacientes con AD en comparacion con individuos normales. Por ejemplo, se sabe que la proteina Ubiquitina forma complejos con Tau hiperfosforilada durante la maduracion de los NFT en los cerebros de pacientes de AD (Iqbal et al., 1998). Se ha mostrado que los niveles de ubiquitina en CSF de AD y los grupos de control neurologicos son significativamente mas elevados que los de los controles de edad no neurologica (Wang etal., 1991; Kudo et al., 1994).

La proteina de fase aguda/inflamatoria, alfa(1)-antiquimotripsina (ACT) se produce en exceso en el cerebro con AD. La ACT tambien puede estimular la formacion de, y esta asociado con, depositos amiloides neurotoxicos (Potter et al., 2001). Los niveles de ACT tanto en suero como en el de CSF son significativamente mas elevados y, de forma significativa y especifica mas elevados en pacientes con demencia de tipo Alzheimer que en los sujetos de control (Matsubara et al., 1990). Hay una asociacion particularmente estrecha de los aumentos en CSF-ACT con la aparicion tardia (Harigaya et al., 1995).

La cromogranina A (CrA) es la principal proteina de grandes vesiculas sinapticas de niicleo denso y puede ser valiosa como un marcador bioquimico para la funcion sinaptica en AD. Un informe describio que no habia ninguna diferencia entre grupos de control de AD, demencia vascular, y grupos emparejados por edades, excepto cuando se compara con un subtipo familiar (AD de Tipo I) con controles en los que habia un aumento estadisticamente significativo de CrA de CSF en los individuos enfermos (Blennowetal., 1995).

La beta-2-microglobulina (P2M) es un iniciador de respuestas inflamatorias modulado por interferones y ciertas citoquinas (Hoekman et al., 1985). Un analisis del proteoma de CSF por electroforesis en dos dimensiones (gel de 2D) ha mostrado un aumento significativo de (32M en pacientes con AD (Davidsson et al., 2002), y mas recientemente estos resultados se confirmaron mediante analisis SELDI (Carrette et al., 2003).

Se ha demostrado que la transtiretina (TTR) interactua con Ap, evitando posiblemente la formacion de amiloide en fluidos biologicos y en el cerebro. (Tsuzuki et at., 2000). Se demostrb que una isoforma de TTR identificada aumenta en AD-CSF usando analisis con gel 2D de un pequerio numero de pacientes con AD y de control (Davidsson, mencionado anteriormente.) Sin embargo, este resultado entra en conflicto con otros informes que muestran una clara disminucion de TTR en CSF de pacientes con AD en comparacion con los controles (Serot et al., 1997.; Riisoen et al., 1998). Esta disminucion tambien se correlaciona de forma negativa con la abundancia de placas seniles (SP) (Merched et al., 1998).

La cistatina C, un inhibidor de cisteina proteasa, se ha implicado en los procesos neurodegenerativos y de reparacion del sistema nervioso, y la deposicion de la misma proteina junto con el peptido beta amiloide se encontro en forma de angiopatia amiloide cerebral (CAA) en diferentes tipos de demencias (Levy et al., 2001). La cistatina C de longitud completa se encontro como un marcador de CSF para AD en un estudio anterior de formacion de perfiles de SELDI (Carrette, mencionado anteriormente.). Una disfuncion relativa de la barrera hematoencefalica (BBB) esta asociada con AD entre las personas de edad muy avanzada. La proporcion de CSF/albumina de suero se puede usar como una medida de la funcion de la BBB. Se ha informado que la proporcion media de CSF/albumina de suero es mas elevada en todas las demencias estudiadas, incluida la AD, que en individuos sin demencia (Skoog et al., 1998).

La transferrina (TF) desemperie un papel en la defensa antioxidante en suero y tambien se produce en el cerebro en el que su papel en el estres oxidativo no es claro. Un estudio en pacientes con sindrome de Down que padecen demencia progresiva mostro disminucion de los niveles de TF cuando se comparaban con controles emparejados

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por edad sin enfermedad neurologica (Elovaara, 1984).

La prostaglandina-D-Sintasa (PDS) funciona para convertir la prostaglandina H2 en prostaglandina D2 y se ha identificado en varios estudios de CSF (Harrington et at., 1993; Hiraoka et at., 1998); Hiraoka et at., 2001; Kawashima et at., 2001; Mase et at., 1999 ; Mase et at., 2003; Melegos et at., 1997. Ademas, la PDS muestra isoformas alteradas en trastomos neurologicos que incluyen a la AD y la enfermedad de Parkinson.

Debido al aumento de la importancia de la AD en nuestras sociedades, existe una necesidad de nuevas herramientas de diagnostico y biomarcadores de AD eficaces.

Compendio de la invencion

La finalidad de la presente descripcion es proporcionar nuevos metodos de diagnostico o control de la AD y trastomos relacionados, asi como predecir y/o evaluar la capacidad de respuesta de los sujetos o la eficacia de los tratamientos en sujetos que padecen AD o un trastorno relacionado.

Los inventores han identificado una ruta molecular que esta implicada en la genesis de la AD y ofrece nuevas dianas para desarrollo de biomarcadores de AD.

Como se indica en la presente memoria, un ejemplo de la presente descripcion proporciona un metodo para el diagnostico de diagnosis of MCI, prddromo de AD, AD o metodos para ayudar en el diagnostico y subclasificacidn de trastomos neurologicos, que incluyen AD, mediante cuantificacidn de la cantidad de un biomarcador basado en proteina, ARN, metabolito, lipido, glucido en una muestra de fluido biologico del sujeto, tal como una muestra de fluido cerebroespinal, suero, saliva, orina, etc., y comparar la cantidad medida con un valor de referenda para el biomarcador. La informacion obtenida de este modo se puede usar para ayudar en el diagnostico, o para diagnosticar la enfermedad, respuesta potencial al farmaco o indicaciones tempranas de respuesta favorable al farmaco en el individuo. Los biomarcadores estan presentes de forma diferencial en sujetos que tienen una enfermedad neurologica, que incluye la AD, con respecto a los sujetos libres de la enfermedad, o sujetos que tienen una forma diferente de demencia.

Se proporciona un metodo para diagnosticar o evaluar la probabilidad de que un paciente este afectado con una enfermedad neurologica, que incluye la AD, metodo que comprende medir un nivel de un biomarcador de complejo de proteina de la presente descripcion.

Tambien se proporciona un metodo que comprende controlar la evolucion de una enfermedad neurodegenerativa, que incluye la AD, que comprende medir un nivel de conjuntos de biomarcadores de la presente invencion.

Otro ejemplo comprende controlar la eficacia de un metodo de tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, que incluye la AD, que comprende medir un nivel de un biomarcador de complejo de proteina de la presente descripcion.

Otro ejemplo comprende calificar y subclasificar una enfermedad neurodegenerativa, que incluye la AD, en un sujeto, que comprende medir un conjunto de biomarcadores complejos de la presente invencion.

Por lo general, los biomarcadores se seleccionan entre SNP asociado con enfermedad, proteinas, ARN, metabolitos, llpidos o glucidos implicados en biologfa de sinapsis, angiogenesis o respuesta al estres celular.

En una realizacion, el conjunto de biomarcadores de la invencion comprende el conjunto de proteinas o ARN codificados por los genes seleccionados del grupo que consiste en: APBA1, ATG7, BECN1, CD44, CDH2, COL18A1, ERBB4, F3. FLNA, FYN, GRIN2B, IL20, ITPR1 LRP8, MTOR, NPPC, NRP1, PDGFC, ROB01, SEMA3E, TGFB1, THBS1, VEGFR1 y WWOX.

En otro ejemplo, el conjunto de biomarcadores comprende adicionalmente al menos un biomarcador adicional seleccionado de SNP asociados con enfermedad, proteinas, ARN, metabolitos, lipidos o glucidos, que se detallan a continuacion.

En los ejemplos mencionados anteriormente y en otros ejemplos, el nivel medido del biomarcador se correlaciona con la enfermedad neurologica. En algunas realizaciones con esto se puede conseguir por comparacion de la cantidad metida con un valor de referenda para el biomarcador. El valor de referenda se puede obtener midiendo una cantidad del biomarcador en sujetos de control emparejados por edades que no se ven afectados por la enfermedad, o que estan libres de la enfermedad.

Otro ejemplo comprende controlar la eficacia de un metodo de tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, que incluye la AD, que comprende medir un nivel de conjunto de biomarcadorescomplejo. La eficacia del tratamiento se mide controlando los niveles del biomarcador en el sujeto en comparacion con una referenda, y/o comparados con otros ensayos previos del sujeto o con un estadio inicial del tratamiento/enfermedad en el sujeto.

En otros aspectos, el metodo mencionado anteriormente comprende adicionalmente la etapa de gestionar el tratamiento del individuo basandose en el estado. Por ejemplo, si la medicion del conjunto de biomarcadores se

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correlaciona con la presencia de enfermedad de subtipo de Alzheimer, entonces la gestion del tratamiento comprende administrar un farmaco o combinacibn de farmacos emparejados para ralentizar o revestir la progresion de la enfermedad. Algunas mediciones adicionales se pueden comparar con las mediciones previas, o el patron para controlar la progresion de la enfermedad.

En un aspecto mas, el metodo comprende adicionalmente medir el biomarcador despues de que haya comenzado el tratamiento, para controlar la progresion de la enfermedad.

Ademas con el otro aspecto, la presente descripcion proporciona un kit que comprende un soporte solido que comprende al menos un agente de captura unido al mismo, en donde el agente de captura une un componente del complejo de proteina biomarcadora de la presente descripcion.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona nuevos metodos de diagnostico y herramientas para AD y trastornos relacionados.

La expresion "trastorno relacionado con la AD" se refere a enfermedad de Alzheimer (AD), demencia senil de tipo AD (SDAT), enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewis, demencia vascular, deterioro cognitivo leve (MCI), afeccion prodromica de AD, AD en el estadio precllnico, alteracion de memoria asociada con la edad (AAMI) y problemas asociados con el envejecimiento, Parkinson post-encefalitico, ALS y sindrome de Down.

El descubrimiento racional de biomarcadores potenciales para la enfermedad de Alzheimer (AD) es una demanda urgente, sin satisfacer de la medicina experimental modema centrada en el desarrollo de farmacos relevantes para la AD.

Algunos biomarcadores de AD valiosos, que permiten un control detallado del inicio y la progresion de la enfermedad, ayudan a calcular de manera objetiva los efectos funcionales de los farmacos sometidos a ensayo, para asegurar un diagnostico precoz de la AD y aumenta la eficacia de la llnea de desarrollo de farmacos, especialmente el desarrollo de farmacos diseriados como una terapia preventiva. La principal dificultad, la disminucion satisfactoria de las tasas en la descripcion de biomarcadores relevantes para la AD, consiste en la enorme complejidad de esta enfermedad neurodegenerativa, que afecta a numerosos procesos celulares en diferentes tejidos y provoca un profundo declive en multitud de parametros fisiologicos.

Muy recientemente, la solicitud de patente de Estados Unidos 2010/0124756 (basada en Ray et al., 2007) describio el uso de un conjunto de 16 biomarcadores proteicos para ayudar en el diagnostico de la AD. Este conjunto se identified a partir de analisis estadistico de niveles de protelnas de serializacion (citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento) obtenido con chips de proteinas disponibles en el mercado que se dedican a estudiar el nivel de citoquinas en circulacion.

La presente invencion se basa en un estudio de busqueda y procesamiento de datos y se ha realizado centrandose en el analisis de rutas que los inventores identificaron como estrechamente implicadas en asociaciones geneticas que estudian la AD y siguiendo experimentos de formacion de perfiles de expresion pangenomicos. Los resultados son utiles para identificarnos solamente proteinas, sino tambien metabolitos o acidos nucleicos (ARN o SNP) que se podrian usarcomo biomarcadores.

Los inventores proponen usar un enfoque combinatorio de busqueda y procesamiento de datos a la seleccion de biomarcadores de AD potenciales y su priorizacion para estudios de validaciones, basandose en busqueda y procesamiento de rutas de datos experimentales disponibles que cubren resultados de estudios funcionales de biologla celular, experimentos de formacion de perfiles de expresion pangenomicos y estudios de asociacion genetica (Herz y Beffert, 2000; Mattson, 2004; Ballatore ef al., 2007; Li et al., 2008). Este enfoque incluye una serie de etapas consecutivas:

- en primer lugar, los genes asociados de manera funcional o genetica con AD, se agrupan en unidades funcionales descritas anteriormente, relevantemente pequerias, que representan modulos minimos de transduccion de la serializacion,

- estos modulos de transduccion de la senalizacibn se combinan adicionalmente y se extienden de forma maxima, basandose en el analisis de estudios funcionales disponibles al publico, para construir rutas relevantes para la AD,

- se definen grandes redes funcionales de interaccion de rutas de serializacion relevantes para AD, y

- se da prioridad a biomarcadores individuales o combinaciones racionales de biomarcadores que representan diferentes redes funcionales para anotacion funcional.

Por lo tanto, se selecciona un biomarcador potencial, - ya sea una proteina por si misma o un producto de cualquier reaccion bioquimica catalizada por esta proteina, - y se le da prioridad para estudios de validacion, si se ajusta a los siguientes criterios:

- participacion en la ruta de serializacion asociada con el inicio y desarrollo de la AD,

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- participacion en la red funcional representa de manera convincente por rutas asociadas con la AD,

- facilidad de deteccibn en muestras de paclente.

Seleccion de biomarcadores relevantes para la AD

La ruta del analisis de busqueda y procesamlento de datos revelo que 3 grandes grupos funcionales de genes, que representan varias rutas de senalizacion que interaction estrechamente, estan asociados con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer:

- el grupo de genes implicados en biologia de slnapsls que incluye genes que partlcipan en la organizacion de la zona de densidad post-sinaptica (PSD), lo que asegura la liberacion del neurotransmisor y el control del crecimiento y guia del axon,

- el segundo grupo combina genes implicados en el control de la angiogenesis y comparte algunos receptores de senalizacion y sus ligandos con rutas que controlan el crecimiento y guia del axon,

- el tercer grupo esta formado por los genes que subyacen a la respuesta al estres celular.

A continuacion, los inventores describen brevemente algunas redes funcionales a modo de ejemplo que regulan el crecimiento y angiogenesis del axon, descrito por el estudio de los inventores.

Red funcional oue controla el crecimiento v quia del axon

Las proteinas que participan en la regulacion del crecimiento y guia del axon permiten que las celulas precursors neuronales y axones miren hacia destinos adecuados para asegurar una ubicacion y conectividad correctas y estan implicadas en el desarrollo de la maduracion de sinapsis recien establecidas y por lo tanto, en la ejecucion de funciones cognitivas.

Las etapas consecutivas del crecimiento y guia del axon estan estrechamente controladas por acciones combinadas de una familia bastante limitada de ligandos de Netrinas, Semaforinas, Efrinas, y Slits y sus receptores funcionales similares extracelulares o unidos a la membrana. Los resultados funcionales de la activacion de la mayoria de receptores del crecimiento de axones estan estrechamente conectados con su capacidad para modular de manera diferencial de la actividad de GTPasas RhoA, Racl y Cdc42 pequehas, con la GTPasa RhoA siendo principalmente responsible de la retraccion de las neuritas y con laso de los conos en crecimiento en la mayoria, aunque no en todos, los entornos celulares (Leeuwen et al., 1997).

Es necesario destacar que la mayoria de estos ligandos y receptores tienen un papel igualmente importante fuera del establecimiento de la conectividad neuronal - en particular, en la angiogenesis mediante la via del crecimiento de vasos sanguineos recien generados.

Los ligandos de netrinas son proteinas secretadas que se descubrieron como reguladores de la extension axonal y la migracion celular durante el desarrollo neuronal. Son proteinas bifuncionales y son capaces de actuar como atrayentes para algunos tipos de celulas y como repelentes para otras; los efectos opuestos de los ligandos de netrinas en la guia del axon estan mediados por dos clases de receptores - DCC y UNC5C, ambos de los cuales se identificaron mediante analisis de busqueda y procesamiento de datos. El receptor de netrina que guia el DCC puede estar implicado tanto en la atraccion como en la repulsion de neuronas y del mismo modo, ya que, como se describio recientemente, participa en la regulacion de la angiogenesis mediante la activacion del modulo de senalizacion deERKI1/2-eNOS (Nguyen y Cal, 2006). El receptor de netrina, UNC5C, mas bien posee actividad de reposicion de neuronas (Guan y Rao, 2003).

A continuacion, los inventores tambien identificaron dos ligandos de semaforina, SEMA3E y SEMA3C, y neuropilinas correceptoras de semaforina, NRP1 y NRP2 y la plexina A2 (PLXNA2), que forman complejos de receptores heteromericos funcionales en la membrana celular. De forma analoga a las netrinas, se reconocen ligandos de semaforina de clase 3 no solamente como moduladores (inhibidores) del crecimiento del axon, sino tambien como potentes modificadores de la formacion de patrones vasculares y, en el caso de SEMA3E, interfieren de forma selectiva con la angiogenesis inducida por VEGF; otras semaforinas de clase 3 pueden controlar la morfogenesis vascular mas bien a traves de la inhibicion de la senalizacion de intergrina (Moriya el al., 2007; Acevedo et al., 2008).

Ademas, los inventores tambien detectaron varios miembros de las vlas senalizacion de efrina, - por ejemplo, el receptor de efrina, EPHA3, y proteinas auxiliares implicadas en la senalizacion de efrina, quinasa KALJRJN de NGEF y RhoGEF, - que median el colapso de los conos en crecimiento y la repulsion en el sistema nervioso durante el desarrollo y desemperian un papel importante en la plasticidad sinaptica en el SNC adulto (Winning et al., 2002; Noren y Pasquale, 2004).

Ademas, los inventores identificaron un modulo funcional compacto que representa la ruta de senalizacion de Slit/Robo, que participa de forma simultanea en la repulsion de los axones y la ramificacion del receptor de guia del axon ROB02 de circunvalacion, su ligando SLIT1 y su diana cadena abajo de la proteina 3 de activacion de SlityRobo Rho GTPasa (Brose y Tessier-Lavigne, 2000).

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La regulation del crecimiento y guia del axon por netrinas, slits, semaforinas y proteinas efrinas se ejecuta a traves de interacciones combinatorias, complejas de sus receptores afines que integran la information de diferentes familias de las senales de orientation, Por ejemplo, los ligandos de Slit inducen la union directa de los receptores Robo a DCC, y por lo tanto silencian la respuesta de la orientation de DCC a netrinas (Stein y Tessier-Lavigne, 2001). Se demostro que el ensamblaje combinatorio de los receptores de semaforina modifica su especificidad y afinidad a ligandos disponibles. Por otra parte, la action combinatoria de los receptores de guia de los axones en complejos de serialization puede incluso cambiar la polaridad de una respuesta de guia de atraccion a repulsion, tal como se demostro en el caso de la serialization de netrina, en la que la dimerization del receptor de DCC con el receptor UNC5C convierte en repulsion la atraccion del cono de crecimiento inducido por netrina mediada por DCC (Hong et al., 1999).

Estos ejemplos demuestran claramente que las rutas de serialization reveladas por la busqueda y enfoque de procesamiento de datos de los inventores no estan simplemente combinadas de forma mecam'stica en el mismo grupo funcional, sino que en realidad forman una red funcional integrada, en la que los modulos de serialization dirigen de manera cooperativa el crecimiento y la guia del proceso del axon.

Red funcional que controla la angiogenesis

La angiogenesis desemperia un papel fundamental asegurando la homeostasis tisular y en respuestas de adaptation al entomo y estimulaciones fisiologicas tales como hipoxia o curacion de heridas; su disfuncion contribuye a la patogenesis de patologias numerosas y heterogeneas que varian de complicaciones cardiovasculares a crecimiento y metastasis tumoral.

Aunque tradicionalmente la enfermedad de Alzheimer se considera como una afeccion neurodegenerativa acompariada de patologia vascular colateral, los datos de los inventores permiten volver a evaluar el impacto patogenico rede la desregulacion vascular y atribuir un papel importante, probablemente causal para las rutas angiogenicas en la etiologia de la enfermedad de Alzheimer, comparable con el papel desemperiado por la disfuncion de la serialization neuronal. Los inventores encontraron que algunos genes que regulan la angiogenesis estan extremadamente enriquecidos en redes de serialization implicadas en la enfermedad de Alzheimer: esta conclusion exige no solamente una revision de los enfoques tradicionales para prevention y curacion de la enfermedad de Alzheimer, sino que tambien proporciona nuevas directrices para selection de biomarcadores relevantes para el control detallado del initio y la progresion de este trastorno neurodegenerativo complejo.

Por ejemplo, los inventores identificaron el gen CD44 que codifica un receptor para el acido hialuronico (HA), cuyos productos de degradation estimulan la angiogenesis (West ef al., 1985). Este receptor estaba implicado en la organization y/o estabilizacion de la formation de endotelios o vasos recien formados (Cao et al., 2006). El receptor de CD44 tambien se une y regula la actividad de proteinas tales como osteopontina, colagenos, y metaloproteinasas de la matriz (MMP) implicadas en la dinamica de la matriz extracelular, que por ultimo acomparia a la formation de nuevos vasos sanguineos (Sottile, 2004).

Otros receptores de membrana, implicados en el control del angiogenesis e identificados mediante enfoque de busqueda y procesamiento de datos, incluyen IL20Ra, receptor LEPTR de leptina, receptor EDNRA de endotelina y receptor de VEGFR1/FLT1, asi como un ligando funcional para el receptor Tie-2 (proteina ANGPT2) que influye en la remodelacibn vascular (Fiedler et at., 2003). El gen IL20Ra codifica un receptor para IL20, una citoquina pleiotropica implicada en la formation de tubos vasculares (Hsieh et at., 2006). La leptina, una hormona endocrina y ligando para LEPTR, estimula la angiogenesis de manera sinergicas con el factor de crecimiento de fibroblastos, FGF-2, y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), los dos factores angiogenicos mas potentes y expresados en todas partes. Ademas, esta implicado en el aumento de la permeabilidad vascular (Cao et al., 2001). La endotelina-1. un ligando para el receptor EDNRA, desemperie un papel principal en la proliferation y la angiogenesis tumoral de diversos tipos de cancer. NRP1 y NRP2 son correceptores transmembrana no solamente para las semaforinas, sino tambien para factores de crecimiento de VEGF y modulan la activation de la serialization de VEGFR-2, que asegura el desarrollo del angiogenesis (Ferrara et al., 2003). La angiopoyetina-1 (ANGPTA) y la angiopoyetina-2 (ANGPT2) se han identificado como reguladores maestros con diferentes funciones efectuadas en el ensamblaje vascular. Se sabe que todas estas rutas de serialization estan estrechamente integradas en la red funcional global que regula diferentes aspectos de la biologia de celulas endoteliales.

Ademas, los inventores tambien seleccionaron un grupo of genes (THBS2, LAMA1, COL4A2, ADAMTS12 y ADAM10) implicados en la organization y la remodelacion de la matriz extracelular, una etapa obligatoria en la remodelacibn de la formation de patrones vasculares, o en el procesamiento funcional (TLL2) de moduladores anqioqenicos bien conocidos tales como prolactina, hormona de crecimiento, y lactogeno placentario (Sottile, 2004; Ge et al., 2007).

Por ultimo, los inventores tambien identificaron un gran numero de genes, implicados en el metabolismo de LPA/S1P o modulados por la serialization de LPA/S1P (MTR, MAT2B, CUBN, ATP10A, THEM2, PITPNC1, ENPPG, SGPP2, AGPAT, DGKH, DGKB, MGST2, PLD2, y DRD2). El acido fosfatidico (PA), acido lisofosfatidico (LPA), y esfingosina 1-fosfato (SIP) son fosfolfpidos naturales que poseen propiedades de serialization potentes. En particular, estos factores de crecimiento de fosfollpido presentan efectos divergentes en el potential angiogenico de las celulas

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endoteliales y podria - de manera combinada, complementaria - inducir de forma eficaz la neovascularizacion. Por ejemplo, la SIP esta implicada principalmente en el ascenso de la migracion quimiotactica de celulas endoteliales, aunque el LPA esta mas implicado en la estabilizacion de la funcion de la barrera monocapa endotelial en estadios tardios de la angiogenesis (English et al., 1999). El LPA podria influir en la angiogenesis ya sea mediante la modulacion de la actividad de la RhoA GTPasa o mediante el aumento de la expresion de varios factores angiogenicos - VEGF, PDGFB e IL-8 (Park et al., 2007). Ademas de esta estrecha implicacion en la angiogenesis, el LPA tambien se reconoce como un lipido extracelular de senalizacion que provoca el colapso del cono de crecimiento de neuritas e influye en la migracion de neuronas postmitdticas tempranas durante el desarrollo (Fukushima et al., 2002).

Una vez mas, al igual que en el caso de la senalizacion del crecimiento/gula de axones, estos factores individuales pro- o anti-angiogenicos, revelados por la ruta de busqueda y procesamiento de datos, se integran en una unica red de rutas funcionales que gobierna de forma cooperativa el desarrollo del sistema vascular.

Clases biomarcadores de AD relevantes

Los ejemplos dados demuestran claramente que la descripcibn de las redes funcionales, asociadas con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, proporciona claras directrices para una seleccion racional y priorizacion de biomarcadores individuales o sus combinaciones para estudios de validacion experimentales. Por ejemplo, como se pone en evidencia con los datos de los inventores, algunos receptores del crecimiento de axon o algunos receptores que controlan diferentes estadios de la angiogenesis, o sus ligandos, o que albergan dominios extracelulares de estos receptores generados por metaloproteinasas o a traves de proteolisis intramembranosa regulada, o metabolitos de rutas bioquimicas de LPA/S1P representan biomarcadores funcionarios relevantes que permiten un control preciso y objetivo de estadios consecutivos del inicio y desarrollo de la AD.

Los inventores presentan 3 listados de biomarcadores relevantes para AD preferentes. La 1a clase de biomarcadores comprende genes, organizados en rutas titulares que estan asociados con el inicio o la progresion de la enfermedad de Alzheimer. Las parejas funcionales de estos genes se revelaron mediante la busqueda manual de datos experimentales disponibles y mediante formacion de perfiles de expresion pangenomica o estudios de interaccion de proteinas y constituyen la 2s clase de biomarcadores. Por ultimo, la 3a clase de marcadores relevantes para AD contiene parejas de genes potenciales de la 1a clase, descritos formacion de perfiles de expresion pangenomica o estudios de interaccion de proteinas y seleccionados adicionalmente por su capacidad para ser detectados en celulas sanguineas y otros biofluidos.

Clase 1 - Genes asociados con el inicio o la progresion de AD (tabla 11:

ABAT (EG: 18), ABCA1 (EG:19), ABCC4 (EG:10257), ABCC9 (EG:10060), ACADSB (EG:36), ACC2 / ACACB (EG:32), ACCN1 (EG:40), ACCN2 (EG:41), ACOT11 (EG:26027), ACOT7 (EG:11332), ACOXL (EG:55289), ACVP2 (EG:98), ADAM12 (EG:8038), ADAMTS12 (EG:81792), ADARB2 (EG:105), ADCV2 (EG:108), ADH5 (EG:128), ADRA1A (EG:148), AG PAT5 (EG:55326), AGPAT7 (EG:254531), AKAP11 (EG:11215), AKAP13 (EG:11214), AKAP2 (EG: 11217), ALCAM (EG:214), ALK (EG:238), ALX4 (EG:60529), ANG2 I ANGPT2 (EG:285), ANK1 (EG:286), ANKS1A <EG:23294), ANXA1 (EG:301), ANXA3 (EG:306), APBA1 (EG:320), APBA2BP / NECAB3 (EG:63941), APBA3 (EG:9546), APBB1 <EG:322), APPBP2 (EG:10513), ARHGAP10 (EG:79658), ARHGAP17 (EG:55U4), ARHGAP18 (EG:93663), ARHGAP22 (EG:58504), ARHGAP26 (EG:23092), ARNT2 (EG:9915), ASAH1 (EG:427), ATF3 (EG:467), ATF7 (EG:11016), ATG10 (EG.83734), ATG5 (EG:9474), ATG7 (EG:10533), ATIC (EG:471), ATP10A (EG:57194), ATP10B (EG:23120), ATP10D (EG:57205), ATP2A3 (EG:489), ATP2B1 (EG:490), ATP2B2 -EG:491), ATP6V1C1 (EG:528), ATP7B (EG:540), ATR (EG:545), ATXN1 (EG:6310), AUH (EG:549), B3GNTL1 (EG:146712), BAB (EG.577), BAP1 (EG:8314), BCL2 (EG:596), BCL2L14 (EG:79370), BCL3 (EG:602), BDH2 (EG:56898), BDNF (EG:627), BIN1 (EG:274), BMP3A. (EG:651), BRE (EG:9577), BR13BP (EG:140707), BR1P1 (EG:83990), CA10 (EG:56934), CACNA1C (EG:775), CACNA1 D (EG:776), CACNA1E (EG:777), CACNA2D1 (EG:781), CACNA2D3 (EG:55799), CACNA2D4 (EG:93589), CACNB2 (EG:783), CADPS2 (EG:93664), CALCB (EG:797), CALCR (EG:799), CALN1 (EG:83698), CAMK1D (EG:57118), CAMK2D (EG:817), CAMK4 (EG:814), CAMKK2 (EG:10645), CAST1 (EG:26059), CD44 (EG:960), CDC42EP3 (EG:10602), CDH10 (EG:1008), CDH12 (EG: 1010), CDH13 (EG:1012), CDH18 (EG:1016), CDH22 (EG:64405), CDH4 (EG:1002), CDH5 (EG:1003), CDH8 (EG:1006), CDH9 (EG:1007), CDK5RAP2 (EG:55755), CDK6 (EG:1021), CDKAL1 (EG:54901), CDON (EG:50937), CHL1 (EG:10752), CHMP5 (EG:51510), CHRM2 (EG:1129), CITRON (EG:11113), CLTC (EG:1213), CNGB3 (EG:54714), CNTFR (EG:1271), CNTN4 (EG:152330), COL3A1 (EG:1281), COL4A2 (EG:1284), COL4A3BP (EG:10087), COLEC12 (EG:81035), COMMD1 (EG:150684), COMMD10 (EG:51397), COPS7A (EG:50813), COPS7B (EG:64708), CS (EG:1431), CSH1 (EG:1442), CSMD1 (EG:64478), CST5 (EG:1473), CTNNA2 (EG:1496), CTNND2 (EG:1501), CUBN (EG:8029), CUGBP2 (EG:10659), CYP11A1 (EG:1583), CYP19A1 (EG:1588), CYP1B1 (EG:1545), CYP7B1 (EG:9420), DAAM1 (EG:23002), DAB1 (EG:1600), DAPK1 (EG:1612), DAPK2 (EG:23604), DBC1 (EG:1620), DBT (EG:1629), DCC (EG:1630), DEPDC2 (EG:80243), DGKB (EG:1607), DGKE (EG:8526), DGKG (EG:1608), DGKH (EG:160851), DHCR7 (EG:1717), DISC1 (EG:27185), DLD (EG:1738), DLG2 (EG:1740), DLGAP1 (EG:9229), DNAJB11 (EG:51726), DNER (EG:92737), DNM3 (EG:26052), DOCK2 (EG:1794), DOCK4 (EG:9732), DOCK9 (EG:23348), DPP6 (EG:1804), DRD2 (EG:1813), EDNRA (EG:1909), EFNA5 (EG:1946), EGFR (EG:1956), EHHADH (EG:1962), ELAVL2 (EG:1993), EML1 (EG:2009), ENAH (EG:55740), ENPP2/ autotaxina (EG:5168), ENPP6 (EG:133121), ENPP7 (EG:339221), EPB41L2 (EG:2037), EPHA10 (EG:284656), EPHA3

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(EG:2042), EPHA6 (EG:285220). ERBB4 (EG:2066), ETFA (EG:2108). EYA2 (EG:2139), F13A1 (EG:2162), FABP5 (EG:2171), FBLN2 (EG:2199), FBXW8 (EG:26259), FER1L3 (EG:26509), FGF12 (EG:2257), FGF14 (EG:2259), FGF5 (EG:2250), FHIT (EG:2272), FLNB (EG:2317), FMN1 (EG:342184), F0X03A (EG:2309), FREQ (EG:23413), FRS2 (EG:10818), FSTL5 (EG:56884), FTO (EG:79068), FZD3 (EG:7976), GAB2 (EG:9846), GABBR2 (EG:9568), GABRA2 (EG:2555), GABRB2 (EG:2561), GABRB3 (EG:2562), GABRG3 (EG:2567), GATA3 <EG:2625), GDF10 (EG:2662), GDF2 (EG:2658), G1PC2 (EG:54810), GL12 (EG:2736), GLRA1 (EG:2741), GLRX (EG:2745), GLUD1 (EG:2746), GNG12 (EG:55970), GNPTAB (EG:79158), GPC5 (EG:2262), GPC6 (EG:10082), GRIA4 (EG:2893), GRID1 (EG:2894), GRID2 (EG:2895), GRIK1 (EG:2897), GRIK2 (EG:2898), GRIK3 (EG:2899), GRIK4 (EG:2900), GRIN2B (EG:2904), GRM7 (EG:2917), GRM8 (EG:2918), GUCY1B2 (EG:2974), GULP1 (EG:51454), HAPLN1 (EG:1404), HAS2 (EG:3037), HBG2 (EG:3048), HCRTR2 (EG:3062), HECW1 (EG:23072), HEY2 (EG:23493), HIF1A (EG:3091), HIPK1 (EG:204851), HIPK2 (EG:28996), HIVEP2 (EG:3097), HK2 <EG:3099), HMBOX1 (EG:79618), HMOX1 (EG:3162), HPSE2 (EG:60495), HRG (EG:3273), HSD17B12 (EG:5U44), HTR1A (EG.3350), IDE (EG:3416), IGF1R (EG:3480), IGF2BP1 (EG:10642), IL18R1 (EG:8809), 1L20RA (EG:53832), IL20RB (EG:53833), INPP4A (EG:3631), 1INPP4B (EG:8821), INSR (EG:3643), IPPK (EG:64768), IQGAP2 (EG:10788), ITGA1 (EG:3672), ITGA11 (EG:22801), ITGA9 (EG:3680), ITPR1 (EG:3708), ITPR2 (EG:3709), JAK1 (EG:3716), JARID1B (EG:10765), KALIRIN / KALRN (EG:8997), KCND2 (EG:3751), KCNJ6 (EG:3763), KCNMA1 (EG:3778), KREMEN1 (EG:83999), KTN1 <EG:3895), KYNU (EG:8942), LAMA1 (EG:284217), LAMA3 (EG:3909), LEPR (EG:3953), LETMD1 (EG:25875), LIPL3/ LIPM (EG:340654), LPHN2 (EG:23266), LRP1 (EG:4035), LTBP1 (EG:4052), LTBP2 (EG:4053), MAD1L1 <EG:8379), MAML3 (EG:55534), MAP2 (EG:4133), MAT2B (EG:27430), MBNL2 (EG:10150), MCC1 (EG:4163), MCPH1 (EG:79648), MDM1 (EG:56890), ME1 (EG:4199), ME2 (EG:4200), MGLL {EG:11343), MGST2 (EG:4258), MMP10 (EG:4319), MMP7 (EG:4316), MSR1 (EG:4481), MTOR (EG:2475), MTR (EG:4548), MTRR (EG:4552), MYO10 (EG:4651), NAALAD2 (EG:10003), NAV1 (EG:89796), NBEA (EG:26960), NCK1 (EG:4690), NCK2 (EG:8440), NCOA1 (EG:8648), NEDD4 (EG:4734), NEDD9 (EG:4739), NFATC2 (EG:4773), NFKB1 (EG:4790), NFYB (EG:4801), NGEF <EG:25791), NISCH (EG:11188), NLGN1 (EG:22871), NOG (EG:9241), NOS1AP (EG:9722), NOX3 (EG:50508), NPPC (EG:4880), NR3C2 (EG:4306), NRCAM (EG:4897), NRG1 (EG:3084), NRG3 (EG:10718), NRG4 (EG:145957), NRIP1 (EG:8204), NRP1 (EG:8829), NRP2 (EG:8828), NRXN1 (EG:9378), NRXN3 (EG:9369), NUDT1 (EG:4521), NUDT13 (EG:25961), NUDT3 (EG:11165), ODZ2 (EG:57451), OGDH (EG:4967), OPCML (EG:4978), OPRM1 (EG:4988), OSBPL10 (EG:114884), OSBPL3 (EG:26031), OSTN (EG:344901), P2RX4 (EG:5025), P2RY12 (EG:64805), PAFAH2 <EG:5051), PAK6 (EG:56924), PAK7 (EG:57144), PALLD (EG:23022), PARK2 (EG:5071), PARVA (EG:55742), PC (EG:5091), PCDH9 (EG:5101), PCLO (EG:27445), PCSK5 (EG:5125), PDE11A (EG:50940), PDE1A (EG:5136), PDE3A (EG:5139), PDE4D (EG:5144), PDE6D (EG:5147), PDGFC (EG:56034), PFKP (EG:5214), PICALM (EG:830]), PIK3C2G (EG:5288), PIK3C3 (EG:5289), PIP5K2A (EG:5305), PISD (EG:23761), PITPNC1 (EG:26207), PLA2R1 (EG:22925), PLCB1 (EG:23236), PLCL1 (EG:5334), PLD2 (EG:5338), PLEKHA6 (EG:22874), PLXDC2 (EG:84898), PLXNA2 (EG:5362), PML (EG:5371), PPF1A2 (EG:8499), PPFIBP1 (EG:8496), PPFIBP2 (EG:8495), PPM1D (EG:8493), PPM1E (EG:22843), PPP1R12A <EG:4659), PRIMA1 (EG:145270), PRKD3 (EG:23683), PRKG1 (EG:5592), PRLR (EG:5618), PRNP (EG:5621), PSAP (EG:5660), PSD3 (EG:23362), PTK2 (EG:5747), PTN (EG:5764), PTPRG (EG:5793), PTPRM (EG:5797), PVRL1 (EG:58]8), RAB3B (EG:5865), RALA (EG:5898), RALBP1 (EG:10928), RASGRF2 (EG:5924), RBBP8 (EG:5932), RGS8 (EG:85397), RIMS1 (EG:22999), RIMS2 (EG:9699), ROB01 (EG:6091), ROB02 (EG:6092), ROR1 (EG:49]9), ROR2 (EG:4920), RPH3AL (EG:9501), RPS6KA2 (EG:6196), RPS6KA5 (EG:9252), RPS6KB1 (EG:6198), RPSA (EG:3921), RTN1 (EG:6252), RUNX2 (EG:860), RYR2 (EG:6262), SCAP2 (EG:8935), SCARF2 (EG:91179), SCGB1A1 (EG:7356), SCHIP1 (EG:29970), SCN11A (EG:11280), SCN9A (EG:6335), SDHA (EG:6389), SDK1 (EG:221935), SEC24D (EG:9871), SEMA3A (EG:10371), SEMA3C (EG:10512), SEMA3E (EG:9723), SEMA5A (EG:9037), SEMA7A (EG:8482), SERPINA6 (EG:866), SERPINC1 (EG:462), SFRP4 (EG:6424), SGMS1 (EG:259230), SGPP2 (EG:130367), SH3BP5 (EG:9467), SHMT1 (EG:6470), SIL1 (EG:64374), SLC12A6 (EG:9990), SLC1A1 (EG:6505), SLC1A2 (EG:6506), SLC1A3 (EG:6507), SLC1A4 (EG:6509), SLC22A4 (EG:6583), SLC24A3 (EG:57419), SLC25A21 (EG:89874), SLC6A1 (EG:6529), SLC6A18 (EG:348932), SLC6A20 (EG:54716), SLC6A7 (EG:6534), SLC8A1 (EG:6546), SLIT 1 (EG:6585), SMAD4 (EG:4089), SMYD3 (EG:64754), SNCA (EG:6622), SNCAIP (EG:9627), SND1 (EG:27044), SNPH (EG:9751), SNX9 (EG:51429), SOCS1 (EG:8651), SORBS1 (EG;10580), SORBS2 (EG:8470), SORCS1 (EG:114815), SORCS2 (EG:57537), SOX5 (EG:6660), SOX9 (EG:6662), SPOCK1 (EG:6695), SPOCK3 (EG:50859), SQSTM1 (EG:8878), SRD5A1 (EG:6715), SRGAP3 (EG:9901), ST14 (EG:6768), STAB2 (EG:55576), STAT3 (EG:6774), STX2 (EG:2054), STXBP6 (EG:29091), SV2B (EG:9899), SV2C (EG:22987), SYN3 (EG:8224), SYT12 (EG:91683), SYT2 (EG:127833), TBXAS1 (EG:6916), TFCP2 (EG:7024), TGFBRAP1 (EG:9392), THBS2 (EG:7058), THEM2 (EG:55856), TLL2 (EG:7093), TNFAIP3 (EG:7128), TNFRSF11B (EG:4982), TRIO (EG:7204), TRKB / NTRK2 (EG:4915), TRPM3 (EG:80036), TRPS1 (EG:7227), UBE3A (EG:7337), ULK4 (EG:54986), UNC13C (EG:440279), UNC5C (EG:8633), VAMP5 (EG:10791), VANGL2 (EG:57216), VAV3 (EG:10451), VDAC2 (EG:7417), VEGFR1 / FLT1 (EG:2321), VEGFR2 (EG:3791), VIL2 (EG:7430), VPS13B (EG:157680), WASPIP / WIPF1 (EG:7456), WIF1 (EG:11197), WWOX (EG:51741), YES1 (EG:7525), ZFHX1B (EG:9839).

Clase 2 - Genes funcionales asociados (tabla 21:

ABL1 (EG:25), A2M (EG:2), AB11 (EG:10006), ACAT1 (EG:38), ACHE (EG:43), ACTN1 (EG:87), ACTN2 (EG:88), ACTN3 (EG:89), ACTN4 (EG:81), ADAM10 (EG:102), ADAM 17 (EG:6868), ADAM9 (EG:8754), AD1POQ (EG:9370), ADIPOR1 (EG:51094), ADIPOR2 (EG:79602), ADORA2B (EG:136). ADRB2 (EG:154), ADRBK1 (EG:156), AKR1C2 (EG:1646), AKT1 (EG:207), ALDH2 (EG:217), ALOX12 (EG:239), ANKRA2 (EG:57763), APH1A {EG:51107), APH1B

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(EG:83464), APOA1 (EG:335), APOE (EG:348), APP (EG:351), ARHGEF11 (EG:9826), ARHGEF12 (EG:23365), ATG12 (EG:9140), ATM (EG:472), ATP1A1 (EG:476), BACE1 (EG:23621), BACE2 (EG:25825), BAD (EG:572), BAK (EG:578), BAX (EG:581), BCAR1 (EG:9564), BECN1 (EG:8678), BGLAP (EG:632), BMP2 (EG:650), BRCA1 (EG:672), BSN (EG:8927), CALM1 (EG:801), CASK (EG:8573), CASP3 (EG:836), CASP8 (EG:841), CASR (EG:846), CBL (EG:867), CCNE1 (EG:898), CD36 (EG:948), CDC2 (EG:983), CDC42 (EG:998), CDC42BPB (EG:9578), CDH1 (EG:999), CDH2 (EG:1000), CDK5 <EG:1020), CDKN1A (EG:1026), CHAT (EG:1103), CHEK1 (EG: 1111), CHRM1 (EG:1128), CHRM3 (EG:1131), CHRM4 (EG:1132), CHRM5 (EG:1133), CLTA (EG:12U), CLTB (EG:1212), COL18A1 (EG:80781), CPT1A (EG:1374), CPT1B (EG:1375), CREB1 (EG:1385), CRMP1 (EG:1400), CSF1 (EG: 1435), CSNK1A1 (EG:1452), CTNN (EG:20I7), CTNNB1 (EG:1499), CTTN (EG:2017), CUL1 (EG:8454), CYSLTR1 (EG: 10800), CYSLTR2 (EG:57105), DGKZ (EG:8525), DHFR (EG:1719), DLG3 (EG:1741), DLG4 (EG: 1742), DLGAP2 (EG:9228), DLGAP3 (EG:58512), DLGAP4 (EG:22839), DNAJB9 (EG:4189), DNM1 (EG:1759), DOCK3 (EG:1795), DRD5 (EG:1816), DVL1 (EG:1855), EDG1 (EG:1901), EDG2 (EG:1902), EDG3 (EG:1903), EDG4 (EG:9170), EDG5 (EG:9294), EDG6 (EG:8698), EDG7 (EG:23566), EDG8 (EG:53637), EDN1 (EG:1906), EDNRB (EG:1910), EFNA1 (EG:1942), EFNA2 (EG:1943), EFNA3 (EG:1944), EFNA4 (EG:1945), EFNB1 (EG:1947), EFNB2 (EG:1948), EFNB3 (EG:1949), EGF (EG:1950), EIF4E (EG:1977), EIF4EBP1 (EG:1978), EPHA1 (EG:2041), EPHA2 (EG:1969), EPHA4 (EG:2043), EPHA5 (EG:2044), EPHA7 (EG:2045), EPHA8 (EG:2046), EPHB1 (EG:2047), EPHB2 (EG:2048), EPHB3 (EG:2049), EPHB4 (EG:2050), EPHB6 (EG:2051), ERC1 (EG:23085), ERC2 (EG:26059), ESRRG (EG:2104), EZR (EG:7430), F2 (EG:2147), F2R (EG:2149), F3 (EG:2152), FAS (EG:355), FDPS (EG:2224), FES <EG:2242), FGF2 (EG:2247), FGF4 (EG:2249), FGFR1 (EG:2260), FKBP1A (EG:2280), FKBP1B <EG:2281), FLNA (EG:2316), FOXOI (EG:2308), FRAP1 (EG:2475), fusion de IL16 (EG:3603) con dominio PDZ, FYN (EG:2534), FZD2 (EG:2535), GADD45A (EG:1647), GADD45B (EG:4616), GADD45G (EG:10912), GDNF (EG:2668), GFRA1 (EG:2674), GFRA2 (EG:2675), GFRA3 (EG:2676), GFRA4 (EG:64096), GH1 (EG:2688), GNA12 (EG:2768), GNA13 (EG:10672), GNA11 (EG:2770), GNA12 (EG:2771), GNA13 (EG:2773), GNB2L1 (EG:10399), GOPC (EG:57120), GPR37 (EG:2861), GRIA2 (EG:2891), GRIA3 (EG:2892), GR1N3A (EG:116443), GRIP1 (EG:23426), GRIP2 (EG:80852), GRK4 (EG:2868), GRK5 (EG:2869), GRM3 (EG:2913), GRM5 (EG:2915), GRM6 (EG:2916), GSK3B (EG:2932), GUCY2C (EG:2984), GUCY2D (EG:3000), GUCY2E (EG:390226), GUCY2F (EG:2986), GUCY2G (EG:390003), HGF (EG:3082), HOMER1 (EG:9456), HOXD13 (EG:3239), HSD11B1 (EG:3290), HSP90B1 (EG:7184), HSPA4L (EG:22824), HSPA5 (EG:3309), HTR1B (EG:3351), HTR1D (EG:3352), HYAL1 (EG:3373), HYAL2 (EG:8692), HYAL3 (EG:8372), HYAL4 (EG:23553), HYOU1 (EG:10525), IGF2 (EG:3481), IL16 (EG:3603), IL20 (EG:50604), IL6ST (EG:3572), IL8 (EG:3576), IMPDH1 (EG:3614), IMPDH2 (EG:3615), INS (EG:3630), IQGAP1 (EG:8826), IQUB (EG:154865), IRF1 (EG:3659), ITCH (EG:83737), ITGA6 (EG:3655), ITGB1 (EG:3688), KCNA2 (EG:3737), KCNIP1 (EG:30820), KCNIP2 (EG:30819), KCNJ11 (EG:3767), KCNJ12 (EG:3768), KCNJ8 (EG:3764), KCNMB1 (EG:3779), LDLR (EG:3949), LEP (EG:3952), LIFR (EG:3977), LIN7A (EG:8825), LIN7B (EG:64130), LIN7C (EG:55327), LPIN1 (EG:23175), LPIN2 (EG:9663), LPIN3 (EG:64900), LRP2 (EG:4036), LRP6 (EG:4040), LRP8 (EG:7804), LYN (EG:4067), MAOA (EG:4128), MAOB (EG:4129), MAPK1 (EG:5594), MAPK12 (EG:6300), MAPK3 (EG:5595), MAPK8 (EG:5599), MAPT (EG:4137), MET (EG:4233), MLH1 (EG:4292), MLLT4 (EG:4301), MME (EG:4311), MMP2 (EG:4313), MMP3 (EG:4314), MMP9 (EG:4318), MSN (EG:4478), MUC1 (EG:4582), MYCBP2 (EG:23077), MYL1 (EG:4632), NCAM1 (EG:4684), NCF2 (EG:4688), NCSTN (EG:23385), NF2 (EG:4771), NGF (EG:4803), NGFR (EG 4804), NOS1 (EG:4842), NOS3 (EG:4846), NOTCH1 (EG:4851), NOTCH2 (EG:4853), NOTCH3 (EG:4854), NOVA1 (EG:4857), NOX1 (EG:27035), NOX4 (EG:50507), NPPA (EG.4878), NPPB (EG:4879), NR1I2 (EG:8856), NR3C1 (EG:2908), NRAS (EG:4893), NTF3 (EG:4908), NTN1 (EG:9423), NTN2L (EG:4917), NTN3 (EG:4917), OPRK1 (EG:4986), OPRS1 (EG:10280), P2RY1 (EG:5028), PAK1 (EG:5058), PCAF (EG:8850), PCTP (EG:58488), PDE5A (EG:8654), PDGFA (EG:5154), PDGFB (EG:5155), PDGFRA (EG:5156), PDGFRB (EG:5159), PIAS1 (EG:8554 ), PICK1 (EG:9463), PIK3CA (EG:5290), PIK3CB (EG.5291), PIK3R1 (EG:5295), PIK3R4 (EG:30849), PIP5K1A (EG:8394), PIP5K1B (EG:8395), PLA2G1B (EG:5319), PLA2G2A (EG:5320), PLA2G4A (EG:5321), PLA2G5 (EG:5322), PLA2G6 (EG:8398), PLAT (EG:5327), PLAU (EG:5328), PLD1 (EG:5337), PLG (EG:5340); PLN (EG:5350), PPAP2A (EG:8611), PPAP2B <EG:8613), PPAP2C (EG:8612), PPARA (EG:5465), PPARG (EG:5468), PPARGC1B (EG:133522), PPP1CA (EG:5499), PPP3CA (EG:5530), PPP3CB (EG:5532), PPP3CC (EG:5533), PRKAA1 (EG:5562), PRKAA2 (EG:5563), PRKAB1 (EG:5564), PRKAB2 (EG:5565), PRKACA (EG:5566), PRKACB (EG:5567), PRKAG1 (EG:5571), PRKCA (EG:5578), PRKCD (EG:5580), PRL (EG:5617), PSEN1 (EG:5663), PSEN2 (EG:5664), PSENEN (EG:55851), PTGS2 (EG:5743), PTK2B (EG:2185), PTPN11 (EG:5781), PTPRF (EG:5792), PXN (EG:5829), RAC1 (EG:5879), RAP1A (EG:5906), RAP1B (EG:5908), RBPJ (EG:3516), RDX (EG:5962), RELN (EG:5649), RET (EG:5979), RGNEF (EG:64283), RHEB (EG:6009), RHOA (EG:387), RHOG (EG:391), ROCK1 (EG:6093), ROCK2 (EG:9475), RPH3A (EG:22895), RPS6KA1 (EG:6195), RPS6KB2 (EG:6199), RPTOR (EG:57521), RYR3 (EG:6263), SCARB1 (EG:949), SCN1A (EG:6323), SCN1B (EG:6324), SEMA3F (EG:6405), SEMA4A (EG:64218), SEMA4B (EG:10509), SEMA4C (EG:54910), SEMA5B (EG:54437), SEMA6B (EG:10501), SEMA6C (EG:10500), SERPINA5 (EG:5104), SERPINB2 (EG:5055), SERPIND1 (EG:3053), SERPINE1 (EG:5054), SERPINE2 (EG:5270), SH3GL2 (EG:6456), SHH <EG:6469), S1AH1 (EG:6477), SLC8A2 (EG:6543), SLC9A1 (EG:6548), SLC9A3R1 (EG:9368), SLC9A3R2 (EG:9351), SLN (EG:6588), SMAD3 (EG:4088), SMAD5 (EG:4090). SNAP25 (EG:6616), SOX6 (EG:55553), SPP1 (EG:6696), SRC (EG:6714), SREBF1 (EG:6720), SREBF2 (EG:6721), STAR (EG:6770 ), STAT5A (EG:6776), STAT5B (EG:6777), STK11 (EG:6794), STX1A (EG:6804), STXBP1 (EG:6812), SUM01 (EG:7341), SYNJ1 (EG:8867), SYNJ2 (EG:8871), SYTL4 (EG:94121), TBR1 (EG:10716), TGFB1 (EG:7040), TGFBR1 (EG:7046), TGFBR2 (EG:7048), TGFBR3 (EG:7049), THBS1 (EG:7057), THRA (EG:7067), THRB (EG:7068), TIAM1 (EG:7074), TIMP2 (EG:7077), TNF (EG:7124), TNFRSF11A (EG:8792), TNFRSF21 (EG:27242), TNFSF11 (EG:8600), TP53 (EG:7157), TP63 (EG:8626), TRAF6 (EG.7189), TRPC3 (EG:7222), TRPC4 (EG:7223), TRPC5 (EG:7224), TSC1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(EG:7248), TSC2 (EG:7249), TSPO (EG:706), UBE2A <EG:7319), UNC13B (EG:10497), VAMP2 (EG:6844), VCL (EG:7414), VDR (EG:7421), VEGFA (EG:7422), VEGFB (EG:7423), VEGFC (EG:7424), VEZF1 (EG:7716), WASF1 (EG:8936), WNT1 (EG:7471), WNT5A (EG:7474), XDH (EG:7498), VAP1 (EG:10413).

Clase 3 - Parejas potenciales de genes de la clase 1 (tabla 3):

A4GALT (EG:53947), ABCB1 (EG:5243), ACACA (EG:31), ACADM (EG:34), ACAT2 (EG:39), ACTB (EG:60), ACTG1 (EG:71), ADAM15 (EG:8751), ADCY1 (EG:107), ADCY5 (EG:111), ADORA1 (EG:134), ADORA2A (EG:135), AGA (EG: 175), AHCY (EG:191), AHSG (EG:197), AK2 (EG:204), AKAP3 (EG:10566), AKR1B1 (EG:231), ALB (EG:213), ALDOA (EG:226), ALDOC (EG:230), AMBP (EG:259), AMPD3 (EG:272), AMPH (EG:273), ANGPT1 (EG:284), ANTXR2 (EG:118429), ANXA2 (EG:302), AP1B1 (EG:162), AP1MI (EG:8907), AP2A1 (EG:160), APC (EG:324), APEH (EG:327), APEX1 (EG:328), APLP2 (EG:334), APOA2 (EG:336), APOA4 (EG.337), APOC1 (EG:341), APOC2 (EG:344), APOC3 (EG:345), APOD (EG:347), APRT (EG:353), AQP3 (EG:360), AR (EG:367), ARF1 (EG:375), ARF2 (EG:376), ARF3 (EG:377), ARHGEF1 (EG:9138), ARL3 (EG:403), ARRB1 (EG:408), ARRB2 (EG:409), ARSA (EG:410), ASCC3L1 (EG:23020), ATF4 (EG:468), ATP2A2 (EG:488), ATP2B4 (EG:493), ATP5B (EG:506), ATP5D (EG:513), ATP6V1E1 (EG:529), BAG2 (EG:9532), BAT1 (EG:7919), BBC3 (EG:27113), BCAR3 (EG:8412), BCL2L1 (EG:598), BGN (EG:633), BLMH (EG:642), BTK (EG:695), BTRC (EG:8945), C1QBP (EG:708), C4A (EG:720), CACNA1H (EG:8912), CALM2 (EG:805), CALM3 (EG:808), CAMK1 (EG:8536), CAPZA1 (EG:829), CAPZB (EG:832), CASP7 (EG:840), CASP9 (EG:842), CAV1 (EG:857), CBLB (EG:868), CBR1 (EG:873), CCDC59 (EG:29080), CCNA1 (EG:8900), CCNB1 (EG:891), CCS (EG:9973), CD200 (EG:4345), CD22 (EG:933), CD2AP (EG:23607), CD3E (EG:916), CD4 (EG:920), CD46 (EG:4179), CD47 (EG:961), CD48 (EG:962), CD5 (EG:921), CD59 (EG:966), CD74 (EG:972), CD9 (EG:928), CD93 (EG:22918), CDH11 (EG:1009), CDH15 (EG:1013), CDH3 (EG:1001), CDH6 (EG:1004), CDK4 (EG:1019), CDKN2A (EG:1029), CEBPB (EG:1051), CFB (EG:629), CFD (EG: 1675), CFH (EG:3075), CFTR <EG:1080), CHRNA7 (EG:1139), CHUK (EG:1147), CITED1 (EG:4435), CKB (EG:1152), CLIC1 (EG:1192), CL1C4 (EG:25932), CL1C6 (EG:54102), CLU (EG:1191), CNTNAP3 (EG:79937), CNTNAP4 (EG:85445), COL1A1 (EG:1277), COL1A2 (EG:1278), COL4A1 (EG:1282), COMT (EG:1312), COPA (EG:1314), COPB2 (EG:9276), COPE (EG:11316), COPG (EG:22820), CREBBP (EG:1387), CRK (EG:1398), CRKL (EG:1399), CRYZ (EG:1429), CSE1L (EG:1434), CSF1R (EG:1436), CSK (EG:1445), CSNK1D (EG:1453), CSNK1E (EG:1454), CST3 (EG:1471), CTAGE5 (EG:4253), CTGF (EG:1490), CTNNA1 (EG:1495), CUTA (EG:51596), CYCS (EG:54205), DAB2 (EG:1601), DAG1 (EG:1605), DAXX (EG:1616), DCD (EG:117159), DCTN1 (EG:1639), DCUN1D1 (EG:54165), DDEF1 (EG:50807), DDEF2 (EG:8853), DDOST (EG:1650), DDR1 (EG:780), DDX21 (EG:9188), DFFA (EG:1676), DGKD (EG:8527), DLG1 (EG:1739), DMD (EG:1756), DMP1 (EG:1758), DNAJA1 (EG:3301), DNAJA3 (EG:9093), DNAJB2 (EG:3300), DNM2 (EG:1785), DOCK1 (EG.1793), DOK1 (EG:1796), DPYSL2 (EG:1808), DSP (EG:1832), DUSP3 (EG:1845), DYNLL1 (EG:8655), E2F1 (EG:1869), EEF1A2 (EG:1917), EEF1D (EG: 1936), EEF1G (EG:1937), EIF2A (EG:83939), EIF4G1 (EG:1981), ELF1 (EG:1997), ELF3 (EG:1999), EP300 (EG:2033), EPB41 (EG:2035), EPRS (EG:2058), EPS8 (EG:2059), ERBB2 (EG:2064), ERBB21P (EG:55914), ERP29 (EG:10961), ESD (EG:2098), ESR1 (EG:2099), ETS1 (EG:2113), F7 (EG.2155), FADD (EG:8772), FGA (EG:2243), FHL1 (EG:2273), FHL2 (EG:2274), FHOD1 (EG:29109), FLNC (EG:2318), FLOT1 (EG:10211), FLOT2 (EG:2319), FN1 (EG:2335), FOS (EG:2353), FOXM1 (EG:2305), FPR1 (EG:2357), FUBP1 (EG:8880), GAB1 (EG:2549), GABARAPL2 (EG:11345), GANAB (EG:23193), GAPDH (EG:2597), GATA1 (EG:2623), GC (EG:2638), GCLM (EG:2730), GCN1L1 (EG:10985), GD12 (EG:2665), GFI1B (EG:8328), GJB1 (EG:2705), GM2A (EG:2760), GNA11 (EG:2767), GNAQ (EG:2776), GNAS (EG:2778), GNAZ (EG:2781), GNB1 (EG:2782), GNPDA1 (EG:10007), GOLGA4 (EG:2803), GP6 (EG:51206), GPC1 (EG:2817), GPRASP1 (EG:9737), GRAP2 (EG:9402), GRB2 (EG:2885), GRIN1 (EG:2902), GRIN2A (EG:2903), GRM1 (EG:2911), GSN (EG:2934), GSTM3 (EG:2947), GTF21 (EG:2969), HABP2 (EG:3026), HBEGF (EG:1839), HCK (EG:3055), HCLS1 (EG:3059), HDAC1 (EG:3065), HDAC2 (EG:3066), HIST1H1E (EG:3008), HLA-A (EG:3105), HMGA1 (EG:3159), HMGB1 (EG:3146), HMMR (EG:3161), HMOX2 (EG:3163), HNF4A (EG:3172), HNRPF (EG:3185), HNRPH1 (EG:3187), HTSRPM (EG:4670), HPRT1 (EG:3251), HPX (EG:3263), HRAS (EG:3265), HSP90AA1 (EG:3320), HSP90AB1 (EG:3326), HSPA1A (EG:3303), HSPA1L (EG:3305), HSPA6 (EG:3310), HSPA8 (EG:3312), HSPB1 (EG:3315), HSPD1 (EG:3329), HSPE1 (EG:3336), HSPG2 (EG:3339), HTR2C (EG:3358), ID2 (EG:3398), IFIH1 (EG:64135), IFNG (EG:3458), IGF1 (EG:3479), IGFBP3 (EG:3486), IGHG1 (EG:3500), IKBKB (EG:3551), IKBKE (EG:9641), 1KBKG (EG:8517), 1L2RA (EG:3559), ILK (EG:3611), INADL (EG:10207), IRF2 (EG:3660), IRS1 (EG:3667), ITGA2 (EG:3673), ITGA3 (EG:3675), ITGA4 (EG:3676), ITGAV (EG:3685), ITGB3 (EG:3690), IT1H1 (EG:3697), ITPR3 (EG:3710), JAK2 (EG:3717), JUP (EG:3728), KCNJ2 (EG:3759), KCTDJ2 (EG:115207), KIAA0152 (EG:9761), KIAA1217 (EG:56243), KIF13B (EG:23303), KIF17 (EG:57576), KIF5C (EG:3800), KLF3 (EG:51274), KPNA1 (EG:3836), KPNA2 (EG:3838), KPNA3 (EG:3839), KPNA4 (EG:3840), KPNB1 (EG:3837), KRTI (EG:3848), KRT10 (EG:3858), KRT13 (EG:3860), KRT16 (EG:3868), KRT17 (EG:3872), KRT18 (EG:3875), KRT5 (EG:3852), KRT6A (EG:3853), KRT6B (EG:3854), KRT8 (EG:3856), KRT9 (EG:3857), LICAM (EG:3897), LAMA5 (EG:3911), LAT (EG:27040), LCK (EG:3932), LETM1 (EG:3954), LGALS8 (EG:3964), LIMS1 (EG:3987), LOC643751 (EG:643751), LRRFIP2 (EG:9209), LTA4H (EG:4048), LYL1 (EG:4066), LYZ (EG:4069), MADCAM1 (EG:8174), MAML1 (EG:9794), MAP1A (EG:4130), MAP2K2 (EG:5605), MAP3K1 (EG:4214), MAP3K14 (EG:9020), MAP3K3 (EG:4215), MAP3K71P2 (EG:23118), MAP3K8 (EG:1326), MAP4K3 (EG:8491), MAPK10 (EG:5602), MAPK9 (EG:5601), MAPRE1 (EG:22919), MARK2 (EG:2011), MATR3 (EG:9782), MAX (EG:4149), MCF2 (EG:4168), MCM4 (EG:4173), MCM6 (EG:4175), MCM7 (EG:4176), MDH2 (EG:4191), MDM2 (EG:4193), MEP1A (EG:4224), M1CAL1 (EG:64780), MIF (EG:4282), MMP14 (EG:4323), MPG (EG:4350), MRCL3 (EG:10627), MSH2 (EG:4436), MSH6 (EG:2956), MTHFD1 (EG:4522), MTPN (EG:136319), MUC2 (EG:4583), MYB (EG:4602), MYH10 (EG.4628), MYH4 (EG:4622),

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MYH9 (EG:4627), MYL4 (EG:4635), MYL6 (EG:4637), NARG1 <EG:80155), NBPF3 (EG:84224), NCF1 (EG.4687), NCKIPSD (EG:51517), NCOA3 (EG:8202), NCORI <EG:9611), NCOR2 (EG:9612), NEDD8 (EG:4738), NFKB2 (EG:4791), NFKB1A (EG:4792), NFKBIB (EG:4793), NFKBIE (EG:4794), NIDI (EG:4811), NKX3-1 (EG.4824), NOTCH4 (EG:4855), NP (EG:4860), NPEPPS (EG:9520), NPR1 (EG:4881), NSF (EG:4905), NTRK3 (EG:4916), NUDC (EG:10726), NUDT5 (EG:11164), OSM (EG:5008), P4HB (EG:5034), PACSIN3 (EG:29763), PAFAH1B1 (EG:5048), PAFAH1B2 (EG:5049), PAICS (EG:10606), PAK2 (EG:5062), PAM (EG:5066), PARD3 (EG:56288), PARD6A (EG:50855), PARP1 (EG:142), PAWR (EG:5074), PCBD1 (EG:5092), PCDH1 (EG:5097), PCMT1 (EG:5110), PCNA (EG:5111), PDCD10 (EG:11235), PDCD5 (EG:9141), PDCD6IP (EG:10015), PDLIM7 (EG:9260), PEA15 (EG:8682), PECAM1 (EG:5175), PEX19 (EG:5824), PF4V1 (EG:5197), PFAS (EG:5198), PFDN2 (EG:5202), PFKM (EG:5213), PGF (EG:5228), PGRMC1 (EG:10857), PHC3 (EG:80012), P1GR (EG:5284), PIK3CD (EG:5293), PIK3CG (EG:5294), PIK3R2 (EG:5296), PIN1 (EG:5300), PKD1 (EG:5310), PKN1 (EG:5585), PKN2 (EG:5586), PLCG1 (EG:5335), PLCG2 (EG:5336), PLTP. (EG:5360), PP1B (EG:5479), PPM1B (EG:5495), PPP1R12C (EG:54776), PPP2CB (EG.5516), PPP2R1A (EG:5518), PPP4C (EG:5531), PRKAR2A (EG:5576), PRKAR2B (EG:5577), PRKCB1 (EG:5579), PRKCE (EG:5581), PRKDC (EG:5591), PRSS1 <EG:5644), PRSS3 (EG:5646), PSMA1 (EG:5682), PSMA2 (EG:5683), PSMA3 (EG:5684), PSMA6 (EG:5687), PSMA7 (EG:5688), PSMB3 (EG:5691), PSMD13 (EG:5719), PSMD14 (EG:10213), PSMD2 (EG:5708), PSMD8 (EG:5714), PTGES3 (EG:10728), PTPN1 (EG:5770), PTPN12 (EG:5782), PTPN3 (EG:5774), PTPRA (EG:5786), PTPRC (EG:5788), PTPRD (EG:5789), PTPRS (EG:5802), PUS7 (EG:54517), RAB10 (EG:10890), RABI3 (EG:5872), RAB1B (EG:81876), RAB37 (EG:326624), RAB3A (EG:5864), RAB3C (EG:115827), RAB3D (EG 9545), RAB8A (EG:42]8), RAD23A (EG:5886), RAF1 (EG:5894), RANBP2 (EG:5903), RANBP9 (EG:10048), RAP2B (EG:5912), RAPGEF1 (EG:2889), RARG (EG:5916), RASA1 (EG:5921), RASA2 (EG:5922), RASAL2 (EG:9462), RBBP4 (EG:5928), RELA (EG:5970), RELB (EG:5971), REX02 (EG:25996), RGS12 (EG:6002), RGS16 (EG:6004), RGS2 (EG:5997), RGS4 (EG:5999), RHAG (EG:6005), RHOB (EG:388), RHOC (EG:389), RHOQ (EG:23433), RHPN2 (EG:85415), RIN2 (EG:54453), RP4691N24.1 (EG:22981), RPGR (EG:6103), RPL35 (EG:11224), RPS14 (EG:6208), RPS27A (EG:6233), RPS3A (EG:6189), RRM1 (EG:6240), RUNX1 (EG:861), RUNX3 (EG:864), RUVBL1 (EG:8607), RUVBL2 (EG:10856), RXRA (EG:6256), SAA1 (EG:6288), SACS (EG:26278), SCN5A (EG:6331), SCYE1 (EG:9255), SDC1 (EG:6382), SDCBP (EG:6386), SDHB (EG:6390), SEC23B (EG:10483), SEC63 (EG:11231), SELE (EG:6401), SELL (EG:6402), SEPT2 (EG:4735), SEPT5 (EG:5413), SF3B14 (EG:51639), SFN (EG:2810), SFPQ (EG:6421), SGOL2 (EG:151246), SH2D1A (EG:4068), SH3BGRL2 (EG:83699), SH3GL3 (EG:6457), SH3GLB1 (EG:51100), SHC1 (EG:6464), SHC2 (EG:25759), SHC3 (EG:53358), S1N3B (EG:23309), SLA2 (EG:84174), SLC1A5 (EG:6510), SLC3A2 (EG:6520), SLC4A1 (EG.6521), SMAD1 (EG:4086), SMAD2 (EG:4087), SMARCA4 (EG:6597), SMARCB1 (EG:6598), SMARCC1 (EG.6599), SMARCD2 (EG:6603), SNAP23 (EG:8773), SNX2 (EG:6643), SNX3 (EG:8724), SNX4 (EG:8723), SOCS3 <EG:9021), SORBS3 (EG:10174), SORL1 (EG:6653), SOS1 (EG:6654), SP1 (EG:6667), SP3 (EG:6670), SPAG9 (EG:9043), SPAST (EG:6683), SP11 (EG:6688), SPTAN1 (EG:6709), SPTBN1 (EG:6711), SRI (EG:6717), SSTR5 (EG:6755), ST13 (EG:6767), STARD13 (EG:90627), STAT6 (EG:6778), STK24 (EG:8428), STOML2 (EG:30968), STX12 (EG:23673), STX18 (EG:53407), SVIL (EG:6840), SYK (EG:6850), SYMPK (EG:8189), TACSTD1 (EG:4072), TAGLN2 (EG:8407), TARS (EG.6897), TAT (EG:6898), TBCA (EG:6902), TBXA2R (EG:6915), TCF3 (EG:6929), TEC (EG:7006), TEK (EG:7010). TFRC (EG:7037), TGFBI (EG:7045), TGM2 (EG:7052), THBS3 (EG:7059), TIMP1 (EG:7076), TJAP1 (EG:93643), TJP1 (EG:7082), TKT (EG:7086), TLN2 (EG:83660), TMED2 (EG:10959), TMOD3 (EG:29766), TN1P2 (EG:79155), TNK2 (EG:10188), TP73 (EG:7161), TPM2 (EG:7169), TPP2 (EG:7174), TPR (EG:7175), TRADD (EG:8717), TRAF2 (EG:7186), TRIM29 (EG:23650), TRIP4 (EG:9325), TRIP6 (EG:7205), TSC22D1 (EG:8848), TSC22D3 (EG:1831), TSHR (EG:7253), TSN (EG:7247), TTN (EG:7273), TTR (EG:7276), TUBA8 (EG:51807), TUBB (EG:203068), TUBB6 (EG:84617), TUFM (EG:7284), TXN (EG:7295), TXNDC4 (EG:23071), TYR03 (EG:7301), UBA2 (EG:10054), UBB (EG:7314), UBE2G2 (EG:7327), UBE21 (EG:7329), UBE2L3 (EG:7332), UBE2L6 (EG:9246), UCHL1 (EG:7345), UGCGL1 (EG:56886), UMPS (EG:7372), UNC119 (EG:9094), UNC5CL (EG:222643), UTRN (EG:7402), VASP (EG:7408), VAV2 (EG:7410), VCP (EG:7415), VDAC1 (EG:7416), VIM (EG:7431), VLDLR (EG:7436), WAS (EG:7454), YWHAB (EG:7529), YWHAE (EG:7531), YWHAG (EG:7532), YWHAH <EG:7533), YWHAQ (EG:1097.1), YWHA2 (EG:7534), ZAP70 (EG:7535), ZYX (EG:7791).

Los grupos de genes mencionados anteriormente (o los correspondientes ARN, proteinas, ligandos, SNP asociados o metabolitos asociados con la actividad de proteinas codificadas por estos genes) representan biomarcadores valiosos que se pueden usar, solos o en diversas combinaciones, para diagnosticar AD o trastomos relacionados.

Un conjunto de biomarcadores comprende al menos dos biomarcadores. En otros ejemplos, el conjunto de biomarcadores comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7 o mas biomarcadores.

En una realizacion, el conjunto de biomarcadores segun la invention comprende proteinas o ARN codificados por cada uno de los genes seleccionados del grupo que consiste en: APBA1, ATG7, BECN1, CD44, CDH2, COL18A1, ERBB4, F3, FLNA, FYN, GRIN2B, IL20, ITPR1, LRP8, MTOR, NPPC, NRP1, PDGFC, ROB01, SEMA3E, TGFB1, THBS1, VEGFR1 y WWOX.

Un conjunto de biomarcadores diana tambien puede comprender uno o mas biomarcadores como se ha enumerado anteriormente en combinacion con al menos un biomarcador adicional. Por lo general, tales biomarcadores adicionales se seleccionan de SNP asociados a enfermedad, proteinas, ARN, metabolitos, lipidos o glucidos.

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En una realizacion preferida, uno o mas biomarcadores adicionales se seleccionan entre proteinas o ARN codificados por los genes seleccionados entre: A2M, ACHE, ALDH2, ANXA1, APOA1, ATP2A3, CASK, CASP8, CDH1, CDH5, CDKN1A, CHAT, CTNND2, DOCK3, EDN1, F13A1, FGF2, FLNB, GABRB2, ITGA1, LAMA1, LAMA3, LEPR, LRP1, MAP2, MMP9, NFATC2, NOS3, NOTCH3, NPPB, PDGFA, PDGFB, PIK3CB, PLAU, PLXDC2, PLXNA2, PRKG1, PRNP, PTK2, RVR2, SEMA5A, SERPINA6, SERPINB2, SERPIND1, STAT3, THBS2, TNF, TP53, TRPC4, TSC1 y VEGFA.

En otra realizacion preferida, uno o mas biomarcadores adicionales se seleccionan entre proteinas o ARN codificados por los genes seleccionados entre: ABCC4, ACC2, ACTN1, ADAM12, ADRA1A, AKAP13, ALCAM, ANXA3, ARHGEF11, ARHGEF12, ATF3, ATM, ATP6V1C1, ATR, BAP1, BGLAP, BIN1, BRIP1, BSN, CACNA1D, CALCB, CDC42BPB, CDH12, CDH13, CHEK1, CHL1, CLTC, COL3A1, COPS7B, CSF1, CSH1, CSNK1A1, CTNNA2, CUL1, CYP11A1, DAAM1, DGKZ, DLG3, DOCK2, EGF, EGFR, EPB41L2, ERC1, F2, FAS, FER1L3, FES, FKBP1A, FSTL5, GFRA3, GFRA4, GHI, GRIP1, GUCY2D, HGF, HIPK1, HMBOX1, HRG, HSP90B1, HSPA5, HYOU1, 1GF2, IL16, IL6ST, IL8, INS, IPPK, IQGAP1, IQGAP2, ITGA9, JAK1, LEP, LETMD1, L1FR, LRP2, LRP6, LTBP1, MAD1L1, MAML3, MMP2, MMP3, MSR1, MUC1, MYO10, NCAM1, NCK1, NGF, NISCH, NOS1, NOTCH2, NPPA, NRIP1, NTF3, OPRM1, PCAF, PCLO, PDE3A, PDE5A, PFKP, PIK3CA, PLA2G2A, PLAT, PLG, PRL, PRLR, PSAP, PSD3, PTGS2, PTK2B, PTPRF, PTPRG, PTPRM, RELN, RET, RIMS2, ROCK1, RPS6KA1, RPS6KA2, RPS6KB1, SCN9A, SERPINA5, SERPINC1, SERPINE1, SERPINE2, SNAP25, SPP1, SREBF2, STAT5B, SV2B, T1MP2, TNFSF11, TRIO, TSC2, UBE3A, VCL, V1L2, WASP1P, XDH y ZFHX1B.

En un ejemplo, el biomarcadorjs) adicional se selecciona/n entre metabolitos de:

- ruta metabdlica del colesterol, que incluye preferiblemente colesterol, ester de colesterol, pregnenolona, alopregnanolona, colest-5-eno-3p,26-diol, deshidroepiandrosterona y sulfato de deshidroepiandrosterona, o combinacion de los mismos; y/o

- ruta metabolica del folato, que incluye preferiblemente 5-metiltetrahidrofolato, acido folico, s-adenosil metionina, homocisteina y tetrahidrofolato, o combinacion de los; y/o

- ruta metabdlica del acido fosfatidico, que incluye preferiblemente acido fosfatidico, acido lisofosfatidico, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilglicerofosfato, o combinacion de los mismos, y/o

- ruta metabdlica de la esfingosina, que incluye preferiblemente esfingosina-1-fosfato, esfingosina y C2-ceramida, o combinacion de los mismos; y/o

- ruta metabdlica de terpenoides, que incluye preferiblemente mevalonato, difosfato de geranilo, difosfato de geranilgeranilo y difosfato de farnesilo.

En un ejemplo de particular, el biomarcador(es) es/son un SNP o una combinacion de SNP para los genes enumerados anteriormente, o para otros genes implicados:

- en biologia de sinapsis, por ejemplo: ADARB2, AKAP11, ATG5, BDNF, CAMK2D, CDH18, CDH22, CDH8, CDH9, CITRON, CNGB3, DLG2, DLGAP1, OOCK4, DOCK9, DPP6, EML1, FMN1, GRIA4, GRID1, GRID2, GRIK1, GRIK2, GRIK3, GRIK4, GRM7, GRM8, KCND2, LPHN2, MMP7, NAALAD2, NLGN1, NRCAM, NRG1, NRG3, NRG4, NRXN1, NRXN3, NTRK2, OPCML, P2RX4, PARK2, PVRL1, RASGRF2, SCAP2, SLC1A4, SLC6A20, SLC6A7, SNCA, SORBS2, YES1, ABL1, ADAM17, AKT1, CALM1, CBL, CDC42, CREB1, CTNNB1, DLG4, DLGAP2, DLGAP3, DLGAP4, GOPC, GRIA2, GRIA3, GRIN3A, GRIP2, GRM3, GRM5, GRM6, HOMER1, KCNIP1, KCNIP2, LYN, MAPK1, MAPK3, NGFR, NRAS, PIAS1, PICK1, PIK3R1, PIK3R4, PPP1CA, PPP3CA, PPP3CB, PPP3CC, PRKACA, PRKACB, PRKCA, RAP1 A, RAP1B, RHOA, ROCK2, SRC, SUM01, TBR1, UBE2A, YAP1, ABAT, APBA3, APBB1, B3GNTL1, CACNA1C, CACNA1E, CACNA2D1, CACNA2D3, CACNA2D4, CACNB2, CADPS2, CALN1, CAMK4, CAST1, CDKAL1, CNTN4, CSMD1, CUGBP2, DAPKI, DAPK2, DBC1, DISCI, DNER, DRD2, FGF12, FREQ, GABBR2, GABRA2, GABRB3, GABRG3, GLRA1, GLUD1, GUCYIB2, KCNJ6, KCNMA1, KYNU, NFKB1, NOS1AP, ODZ2, PDEUA, PDE4D, PICALM, PRKD3, RAB3B, RGS8, PJMSI, RPH3AL, SCN11A, SEC24D, SLC12A6, SLC1A1, SLC1A2, SLC1A3, SLC6A1, SLC6AJ8, SNPH, SNX9, STX2, STXBP6, SV2C, SYN3, SYT12, SYT2, UNC13C, VAMP5, ANKRA2, BACE1, CDC2, CDK5, CHRM1, CHRM3, CHRM4, CHRM5, CTNN, DNM1, ERC2, GUCY2C, GUCY2E, GUCY2F, GUCY2G, KCNMB1, LIN7A, LIN7B, LIN7C, NOVA1, PRKAA1, PRKAA2, PRKAB1, PRKAB2, PRKAG1, RPH3A, SCN1A, SCN1B, SH3GL2, SLC9A1, STX1A, STXBP1, SYNJ1, SYNJ2, SYTL4, UNC13B, VAMP2, WASF1, ALK, ANKS1A, ARHGAP18, ARHGAP26, CDC42EP3, CDH10, CDH4, DAB1, DCC, DEPDC2, DNM3, EFNA5, EPHA10, EPHA3, EPHA6, EPHB6, G1PC2, HEY2, KALRN, KTN1, NAV1, NBEA, NCK2, NGEF, NRP2, PAK6, PAK7, PCDH9, PLD2, PPFIA2, PPFIBP1, PPFIBP2, PPP1R12A, PTN, ROB02, ROR1, ROR2, SDK1, SEMA3A, SEMA3C, SEMA7A, SLIT 1, SORBS1, SRGAP3, ULK4, UNC5C, AB11, ADORA2B, CASR, CRMP1, GDNF, GFRA1, GFRA2, GNA12, HTR1B, HTR1D, IQUB, MYL1, NOTCH1, NTN1, NTN3, PIP5K1A, PIP5K1B, RAC1, RBPJ, RGNEF, RHOG, SEMA4C, SIAM; y/o

- en angiogenesis, por ejemplo: ADAMTS12, ADIPOQ, ANGPT2, ANK1, ARHGAP10, ARHGAP17, ARHGAP22, ARNT2, BAB, BMP3A, CA10, CALGR, COL4A2, COL4A3BP, COMMD1, COMMD10, DBT, DRD2, EDNRA, EFNA5, EPHA3, FABP5, FBLN2, FOX03A, G1PC2, GPC6, GULP1, HAPLN1, HAS2, HIF1A, HPSE2, IL18R1, IL20RA, IL20RB, ITGA11, LTBP2, MMP10, MMP7, NCK2, NEDD4, NEOD9, NFKB1, NR3C2, NRG1, NRP2, P2RY12, PAK6, PALLD, PARVA, PCSK5, PDE11A, PDE1A, PDE4D, PDGFRA, PPMIE, PTN, RPSA, SCHIP1, SEMA3A, SEMA3C, SEMA7A, SMAD4, SMYD3, SND1, SORBS2, SPOCK1, SPOCK3, STAB2, TGFBRAP1, TLL2, VAV3, VEGFR2, YES1, BCAR1, CD36, COC42, CTNH F2R, FOXOI, GUCY2C, GUCY2E, GUCY2F, GUCY2G, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, ITCH, ITGA6, ITGB1, MAPK1, MAPK3, MET, MME, NF2, P2RY1, PAK1, PDGFRB, PIK3R1,

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PIK3R4, PPARA, PXN, RAC1, RDX, RHOA, SMAD3, STAT5A, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TIAM1, VEGFB, VEGFC, VEZF1, ABCA1, ACADSB, ACOT11, ACOT7, ACOXL, AKAP2, ATP7B, AUH, BDH2, CAMK1D, CAMKK2, CNTFR, COLEC12, CS, CUBN, CYP19A1, CYPIB1, CYP7B1, DHCR7, DLD, EHHADH, ETFA, FTO, GABBR2, GLRX, HCRTR2, HSD17B12, LIPL3, ME1, ME2, MGLL, NCOA1, NFYB, OGDH, OSBPL10, OSBPL3, PC, RPS6KA5, SCARF2, SDHA, SLC22A4, SLC25A21, SOCS1, SRD5A1, TBXAS1, ACAT1, ADIPOR1, ADIPOR2, ADRB2, AKR1C2, CPT1A, CPTIB, EIF4E, EIF4EBP1, ESRRG, FDPS, HSD11B1, LDLR, NR112, NRAS, OPRS1, PPARG, PPARGC1B, PRKAA1, PRKAA2, PRKAB1, PRKAB2, PRKACA, PRKACB, PRKAG1, PTPN11, RHEB, RPS6KB2, RPTOR, SCARB1, SREBF1, STAR, STK11, THRA, THRB, TSPO, ADCY2, ADH5, AGPAT5, AGPAT7, ASAH1, ATIC, ATP10A, ATP 10B, ATP10D, CDH8, CDH9, DGKB, DGKE, DGKG, DGKH, ENPP2, ENPP6, ENPP7, GATA3, GDF2, GNG12, MAT2B, MGST2, MTR, MTRR, PAFAH2, PIP5K2A, PISD, PITPNC1, PLA2R1, PLCB1, PLCL1, PLD2, PRIMA1, RALA, RALBP1, SCGB1A1, SGMS1, SGPP2, SHMTI, SNGA, ST14, THEM2, TRPS1, ADRBK1, CYSLTR1, CYSLTR2, DHFR, DRD5, EDG1, EDG2, EDG3, EDG4, EDG5, EDG6, EDG7, EDG8, GNA12, GNA13, GNAI1, GNAI2, GNAI3, GRK5, GRM5, LPIN1, LPIN2, LPIN3, MYCBP2, PCTP, PLA2G1B, PLA2G4A, PLA2G5, PLA2G6, PLD1, PPAP2A, PPAP2B, PPAP2C, PRKCD, ALX4, CDON, GST5, GDF10, HIVEP2, NOG, OSTN, ROR2, RUNX2, SOX5, SOX9, TNFRSFHB, BMP2, FGF4, FZD2, HOXD13, MAPK8, SHH, SMAD5, SOX6, TNFRSF11 A, VDR , WNT5A; y/o

- en respuesta al estres celular, por ejemplo: ACYP2, ATP2B1, ATP2B2, ATXN1, DGKB, DGKE, DGKG, DGKFI, ITPR2, PDE11A, PDE4D, PLCB1, PLEKHA6, SIL1, SLC8A1, TRPM3, ATP1A1, CHRM1, CHRM3, CHRM4, CHRM5, DNAJB9, FKBP1B, GUCY2C, GUCY2E, GUCY2F, GUCY2G, IMPDH1, IMPDH2, IRF1, MSN, PLN, PPP3CA, PPP3CB, PPP3CC, PRKCA, RDX, RYR3, SCN1A, SCN1B, SLC8A2, SLC9A3R1, SLC9A3R2, SLN, TRPC3, TRPC5, AKAP11, APBA2BP, APBB1, APPBP2, BCL2, CDK5RAP2, CDKAL1, CHMP5, CHRM2, DAB1, DNAJB11, DRD2, ELAVL2, ENAH, FGF14, FGF5, FMN1, FRS2, FZD3, GAB2, GL12, GPC5, INSR, HAS2, HECW1, HTR1A, IDE, IGFIR, IGF2BP1, INPP4A, INPP4B, KREMEN1, NEDD4, NOG, NOS1AP, PARK2, PDE6D, PIK3C2G, PVRL1, ROR2, SFRP4, SNCA, SNCAIP, SORCS1, SORCS2, TFCP2, VANGL2, VPS13B, WIF1, ADRB2, ADRBK1, AKT1, BACE1, BAX, GCNE1, CDK5, CTNNB1, DVL1, FGFR1, FZD2, GNB2L1, GPR37, GRK5, GSK3B, ITGBI, MAOA, MAOB, MAPK1, MAPK3, MAPK8, MLLT4, MME, PRKAA1, PRKAA2, PRKAB1, PRKAB2, PRKACA, PRKACB, PRKAG1, RAC1, SRC, WNT1, WNT5A, ABCC9, ACCN1, ACCN2, ATF7, ATG10, ATG5, BCL2L14, BCL3, BRE, BR13BP, CDK6, COMMD1, COMMD10, COPS7A, DAPK1, DAPK2, DCC, EYA2, FBXW8, FH1T, FOX03A, GNPTAB, HBG2, HIPK2, HK2, HMOX1, JAR1D1B, MBNL2, MCC1, MCPH1, MDM1, NEDD9, NFKB1, NOX3, NRP2, NUDTI, NUDT13, NUDT3, PIK3C3, PML, PPM1D, RBBP8, RTN1, SEMA3C, SH3BP5, SLC24A3, SORBS2, SQSTM1, TNFAIP3, UNC5C, VDAC2, YES1, ALOX12, ATG12, BAD, BAK1, BCARI, CD36, GADD45A, GADD45B, GADD45G, HSPA4L, KCNJ11, KCNJ8, MAPK12, MLH1, NCF2, NOX1, NOX4, NTN1, PAK1, PIK3R4, SEMA4C, TNFRSFJ1A, TP63, TRAF6, CASP3.

Un objeto de la presente invencion es un metodo para detectar la presencia de riesgo de AD o un trastorno relacionado en un mamlfero, o para ayudar en el diagnostico y subclasificacion de AD y trastomos relacionados, metodo que comprende la determinacion de la cantidad (relativa) con la presencia, ausencia o alteracion de un biomarcador diana en una muestra del sujeto, en donde dicha cantidad o alteracion es indicativo de la presencia, riesgo, progresion o gravedad de dicha enfermedad, y en donde dicho biomarcador se selecciona entre una proteina, ARN, metabolito, lipido o glucido implicado en biologia de sinapsis, angiogenesis o respuesta al estres celular.

Por lo tanto, un objeto de la invencion reside en un metodo para detectar (in vitro o ex vivo) la presencia o riesgo de desarrollo de AD o un trastorno relacionado en un mamifero, que comprende la determinacion de la presencia, en una muestra biologica del mamifero de una alteracion en cada uno de los genes como se reivindica, o un ARN o proteina correspondientes, siendo la presencia de una alteracion de este tipo indicativa de la presencia o riesgo de desarrollar AD en dicho mamifero.

Otro objeto de la presente invencion es un metodo para predecir y/o evaluar la capacidad de respuesta de un sujeto a un tratamiento frente a la AD y trastomos relacionados con la eficacia de un tratamiento de este tipo en un sujeto, metodo que comprende detemninar la cantidad (relativa) o la presencia, ausencia o alteracion de cada uno de los biomarcadores diana en una muestra del sujeto, en donde dicha cantidad o alteracion es indicativa de la capacidad de respuesta de dicho sujeto o de la eficacia del tratamiento, y en donde dicho biomarcador se selecciona entre una proteina o ARN reivindicados implicados en biologia de sinapsis, angiogenesis o respuesta al estres celular.

Otro objeto se refiere a un metodo para evaluar o seguir la respuesta a un tratamiento para AD en un sujeto, metodo que comprende una etapa de medir la expresion de uno o mas genes como se enumera en uno de los grupos 1-3 mencionados anteriormente, o un ARN o proteina correspondientes, antes y/o durante el tratamiento, y una comparacion de la expresion medida de este modo con la medida en un primer estadio del tratamiento o antes del tratamiento.

Otro objeto se refiere a una mejora de los aumentos para el tratamiento de AD o trastomos relacionados, mejora que consiste en medir la expresion de uno o, preferiblemente, varios genes como se enumera en uno de los grupos 1-3 mencionados anteriormente, o un ARN o proteina correspondientes, antes y/o durante el tratamiento. La medicidn de la expresion hace posible adaptar el tratamiento de acuerdo con la evolucion de la patologia y/o eficacia del tratamiento.

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El metodo comprende la determinacion de la presencia (o de la ausencia o de la cantidad (relativa)), en una muestra biolbgica del mamifero, de al menos 5 moleculas diana distintas selecclonadas entre las mencionadas anteriormente, preferiblemente de al menos 10.

Una alteracion en un gen o ARN o proteina indica, dentro del significado de la invencion, cualquier alteracion o desregulacion de la expresion de dicho gen, ARN o proteina, al nivel de la transcripcion y/o traduccion, asi como cualquier alteracion en la estructura de la proteina(s) codificada (aparicion o desaparicion de variantes tales como variantes truncadas, mutadas o de code y empalme).

La deteccion de la alteracion en una expresion o estructura genetica o de ARN se puede realizar usando una diversidad de tbcnicas conocidas per se en la tbcnica. Estas incluyen, pero no se limitan a, transferencia de Northern, hibridacion selectiva usando por ejemplo, matrices de acido nucleico, amplificacibn de acido nucleico usando por ejemplo, RT-PCR, o PCR cuantitativa, Amplificacidn Mediada por la Transcripcion (TMA), Amplificacibn por desplazamiento de hebra (SDA), Amplificacion usando Oligonucleotido especifico de Alelo (ASO), transferencia de Southern, analisis conformacional SSCA, hibridacion in situ (por ejemplo, FISH), etc. Si fuera apropiado, la cantidad/naturaleza de acido nucleico detectada se puede comparar con un valor de referenda, por ejemplo un valor medio o promedio observado entre pacientes de control (por ejemplo, no afectados con la AD), o con un valor medido en paralelo en una muestra de control.

El metodo comprende la deteccion de la presencia o ausencia o cantidad (relativa) de una secuencia de acido nucleico de un gen de un grupo de genes como se ha enumerado anteriormente mediante hibridacion selectiva o amplificacibn selectiva.

Por lo general, la hibridacion selectiva se consigue usando sondas de acido nucleico, inmovilizadas preferiblemente en un soporte, tal como en forma de un soporte solido o semisolido que tenga al menos una superficie que permita la inmovilizacion de sondas de acidos nucleico. Por ejemplo, algunos soportes de este tipo son portaobjetos de vidrio, membranas, filtros, columnas, etc., que se pueden preparar con cualquier material compatible, como vidrio, silice, plastico, fibra, metal, polimero, etc. Algunas sondas de acidos nucleicos se pueden preparar con cualquier acido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, PNA, etc), preferiblemente de una sola hebra. Por lo general, las sondas comprenden de 5 a 400 bases, preferiblemente de 8 a 200, mas preferiblemente menos de 100. Las sondas son especificas para y complementarias con al menos una parte de una secuencia genetica o de ARN como se ha enumerado anteriormente, permitiendo de este modo una deteccion especifica de la misma a traves de hibridacion.

La hibridacion se puede realizar en condiciones convencionales de rigurosidad (por ejemplo, baja, media o elevada), conocidas por el experto en la tecnica, como se describe por ejemplo, en Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Near.

Por lo tanto, un objeto particular reside en un metodo para detectar la presencia o el riesgo de desarrollar AD o un trastomo relacionado en un mamifero, o para evaluar la capacidad de respuesta de un sujeto o la eficacia de un tratamiento frente a AD, metodo que comprende poner en contacto, en condiciones que permitan una hibridacion entre secuencias complementarias, acidos nucleicos de una muestra del mamifero y un conjunto de sondas especificas como se ha definido anteriormente, para obtener un perfil de inmigracion, perfil de hibridacion que es caracteristico de la presencia o el riesgo de desarrollar AD en este mamifero, o de la capacidad de respuesta o eficacia del tratamiento. El perfil de hibridacion se puede comparar con uno o mas perfiles de referenda, en particular un perfil de referencia caracteristico de sujetos sanos y/o sujetos afectados con AD, comparacion que permite determinar la probabilidad por el riesgo para que el paciente tenga o desarrolle AD.

La amplificacibn selectiva se realiza preferiblemente usando un cebador o un par de cebadores que permitan la amplificacibn de todo o parte de un gen o ARN como se ha descrito anteriormente en una muestra del sujeto. Por lo general, el cebador es especifico para y complementary con una parte de la secuencia de un gen o ARN diana como se ha definido anteriormente, y por lo general es un acido nucleico de una sola hebra con una longitud entre 5 y 50 bases, preferiblemente entre 5 y 30.

Por lo tanto, otro objeto en particular reside en un metodo para detectar la presencia o el riesgo de desarrollar AD en un mamifero, que comprende poner en contacto, en condiciones que permitan que se produzca la amplificacibn, acidos nucleicos a partir de una muestra del mamifero y un cebador o conjunto de cebadores como se ha definido anteriormente para obtener un perfil de amplificacibn, siendo dicho perfil caracteristico de la presencia o riesgo de desarrollar AD en dicho mamifero.

El metodo comprende la determinacion de la presencia o cantidad (relativa) de un polipeptido codificado por un gen o ARN como se ha definido anteriormente. Una determinacion de este tipo se puede realizar mediante diversas tbcnicas conocidas per se en la tecnica, tal como por medio de un ligando especifico, por ejemplo un anticuerpo o un fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, Fab, Fab1, CDR, ScFv, etc). Por lo general, el ligando se inmoviliza en un soporte, tal como se ha descrito anteriormente. Algunas tecnicas para detectar la formacibn de un complejo inmune incluyen ELISA, RIA, etc. Si fuera apropiado, la cantidad de polipeptido detectada se puede comparar con un valor de referencia, por ejemplo un valor medio o promedio observado entre pacientes de control, o con un valor medido en paralelo en una muestra de control.

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El metodo se puede aplicar a cualquier muestra biologica del mamlfero a someter a ensayo, en particular cualquier muestra que comprenda acidos nucleicos o polipeptidos. Algunos ejemplos de muestras de este tipo incluyen sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, saliva, orina, heces, extractos celulares, biopsia del tejido, etc. La muestra se puede tener con cualquier tecnica conocida per se en la tecnica, por ejemplo mediante recogidas usando por ejemplo, tecnicas ni masivas, o a partir de colecciones o bancos de muestras, etc. Ademas, la muestra se puede tratar previamente para facilitar la accesibilidad de las moleculas diana, por ejemplo mediante lisis (mecanica, qulmica, enzimatica, etc), purificacion, centrifugacion, separacion, etc.

La invencion se puede aplicar a cualquier mamifero, preferiblemente a seres humanos.

Metodos de identificacion de Nuevos Marcadores v Cuantificacion de biomarcadores

La presente invencion permite la deteccion de biomarcadores de lesion cerebral en fluidos biologicos. Los ensayos de deteccion se describiran a continuacion.

Esos ensayos incluiran sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan tecnicas tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sandwich", ensayos de inmunoprecipitacion, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, inmunoensayos de fluorescencia y similares. Los ensayos de este tipo son de rutina y se conocen bien en la tecnica (vease, por ejemplo, Ausubel et a I, eds, .1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., New York, que se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad). A continuacion se describen brevemente algunos inmunoensayos a modo de ejemplo (pero no se pretenden como modo de limitacion).

La inmuno precipitacion consiste en el lisado de celulas con tampon RIPA (Ensayo de RadioInmunoPrecipitacion) que proporciona un fondo bajo (Tris HCI 50 mM a pH 8, NaCI 150 mM, NP-40 al 1 %, SDS al 0,1 %). En cuanto se produce la lisis, comienza la proteolisis, desfosforilacion y desnaturalizacion. Estos sucesos se pueden ralentizar en gran medida si las muestras se mantienen en hielo o a 4 °C en todas las ocasiones y los inhibidores apropiados afiaden recien preparados al tampon de lisis. Dos de los inhibidores de proteasa usados mas habitualmente para IP son PMSF (50 ug/ml), y aprotinina (1 ug/ml). La muestra se incuba a continuacion con el anticuerpo durante 1 hora hasta toda una noche a 4 °C, preferiblemente con agitacion. Mientras tanto, se preparan las perlas de Sepharose Si se usa un anticuerpo monoclonal, se eligen perlas de Sepharose acopladas a proteina G, si se usa un anticuerpo policlonal, normalmente son adecuadas las perlas de Sepharose acopladas a proteina A. Se aiiaden 70-100 pi de las perlas a cada muestra, siempre manteniendo en hielo. La mezcla de lisado-perias se incuba a continuacion a 4 °C con agitacion giratoria durante 4 horas. Cuando el tiempo de incubacion se termina, los tubos se centrifugan, el sobrenadante se retira y las perlas se daban en tampon de lisis tres veces (centrifugando cada vez a 4 °C y retirando el sobrenadante). Por ultimo, el sobrenadante final se retira y se afiaden 25-50 pi de tampon de carga 2x. A continuacion, la mezcla se Neva a ebullicion a 95-100 °C durante 5 minutos para desnaturalizar la proteina y separarla de las perlas de protelna-A/G, se centrifugo y el sobrenadante contiene la proteina. Las muestras se pueden desarrollar en una Transferencia de Western para analisis adicional.

El analisis de Transferencia de Western consiste en determinar cantidades relativas de la proteina de interes presente en diferentes muestras. Las proteinas se separan mediante electroforesis en gel, normalmente en gel de SDS-poliacrilamida (tambibn conocido como SDS-PAGE). Los peptidos se transfieren a una lamina de papel de transferencia especial denominado papel de nitrocelulosa: Colocar una membrana de nitrocelulosa en el gel y, usando electroforesis, conducir las bandas de proteina (polipeptido) a las membranas de nitrocelulosa membrane. Esto proporciona una membrana de nitrocelulosa que esta marcada con las mismas bandas de proteina que el gel. Las proteinas recien en el mismo patron de separacion que tenian en el gel. La transferencia se incuba con una proteina generica (tal como proteinas de leche) para unirse a cualquier sitio de adherencia restante en la nitrocelulosa. A continuacion, se anade un anticuerpo a la solucion que es capaz de unirse a su proteina especifica. El anticuerpo primario se incuba con la membrana de nitrocelulosa, para formar un complejo de anticuerpo-proteina con la proteina de interes. El anticuerpo secundario se incuba a continuacion con la membrana de nitrocelulosa. Este anticuerpo es un conjugado de anticuerpo-enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante) dirigidos frente al anticuerpo primario. La ubicacion del anticuerpo se revela mediante su vinculacion con un sustrato incoloro que la enzima ahadida convierte en un producto coloreado que se puede observar y fotografiar.

Los ELISA (Ensayo de Inmunoabsorcion Ligado a Enzimas) consiste en medir la cantidad de antigeno entre dos capas de anticuerpos. Los antigenos a medir deben contener al menos dos sitios antigenicos, capaces de unirse a dos anticuerpos que actuan en el sandwich. Por lo tanto, los ensayos de sandwich se limitan a la cuantificacion de antigenos multivalentes tales como proteinas o polisacaridos. El principio de la tecnica de ELISA es la inmovilizacion del anticuerpo de captura, seguido de union del antigeno al anticuerpo inmovilizado, union del segundo anticuerpo, ligado a una enzima, al antigeno unido (formacion del complejo inmune) y por ultimo deteccion del complejo inmune usando sustrato enzimatico apropiado. Aunque para deteccion se han usado muchos tipos de enzimas diferentes, la peroxidasa de rabano picante (HRP) y la fosfatasa alcalina (ALP) son las dos enzimas mas ampliamente usadas en ensayos de ELISA. Es importante considerar el hecho de que algunos materiales biologicos tienen niveles elevados de actividad enzimatica endogena (tal como ALP elevada en celulas alveolares, peroxidasa elevada en globulos rojos) y esto puede dar como resultado una senal no especifica. Cuando sea necesario, se realiza un tratamiento del

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bloqueo adicional con levamisol (para ALP) o con solucion de PhC^al 0,3 % en metanol (para peroxidasa). Identifcacion v analisis cuantitativo de biomarcadores

Las muestras biologicas se toman de voluntarios sanos (controles), con edades, genera, condicion fisica similares con respecto a pacientes con lesion cerebral. Las comparaciones de estas muestras biologicas permiten identificar biomarcadores especificos de lesion cerebral (como se ha definido anteriormente).

Las muestras biologicas se tienen que procesar para analisis, tal como cromatografia (exclusion por tamano, intercambio ionico, afinidad por heparina, extraccion secuencial, electroforesis en gel). Hay muchas formas de reducir la complejidad de una muestra basandose en las propiedades de union de las proteinas en la muestra, o las caracteristicas de las proteinas en la muestra. La separation y clasificacion de las muestras entonces favorecera la deteccion adecuada de biomarcadores.

La cromatografia por exclusion se podria usar para dividir una muestra de acuerdo con el tamano de las proteinas. Para muestras biologicas pequenas, se usa preferiblemente una columna de centrifugacion de seleccion por tamano. En general, la primera fraccion que se eluye de la columna ("fraccion 1") tiene el porcentaje mas elevado de proteinas de alto peso molecular; la fraccion 2 tiene el menor porcentaje de proteinas de peso molecular elevado; la fraccion 3 tiene un porcentaje incluso menor de proteinas de alto peso molecular; la fraccion 4 tiene la cantidad menor de proteinas grandes, y asi sucesivamente. Cada fraccion se puede analizar a continuacion mediante inmunoensayos, espectrometria de iones en fase gaseosa, y similares, para la deteccion de marcadores.

Una muestra se puede dividir mediante cromatografia de intercambio ionico que permite la separacion de las proteinas de acuerdo con sus caracteristicas de carga. Por ejemplo, una muestra biologica se puede procesar en una resina de intercambio de aniones Q (por ejemplo, Q HyperD F, Biosepra) que producira de forma secuencial eluyentes en serie que tengan un pH diferente. La cromatografia de intercambio ionico permite la separacion de los biomarcadores cargados con mayor carga negativa: es probable que el eluyente que tenga un pH basico este cargado con carga debilmente negativa, mientras que una fraccion que tenga un pH bajo esta cargada con una carga fuertemente negativa.

Una muestra tambien se puede dividir mediante cromatografia con heparina sobre la base de interaccion por afinidad con heparina y caracteristicas de carga. La heparina, un mucopolisacarido sulfatado, unir a algunos marcadores con restos cargados con carga positiva. Por lo tanto, una muestra se puede incluir de forma secuencial, con cada eluyente teniendo diferentes pH o concentraciones de sal: es probable que el eluyente que tenga un pH acido este cargado con carga debilmente positiva mientras que una fraccion que tenga un pH elevado esta cargado con carga fuertemente positiva.

Una muestra se puede dividir mediante el aislamiento de proteinas que tengan una caracteristica especifica, por ejemplo, estan glicosiladas. Por ejemplo, una muestra de CSF se puede dividir pasando la muestra sobre una columna de cromatografia con lectina (que tiene una afinidad elevada hacia los azucares). Las proteinas glicosiladas se uniran a la columna con lectina y las proteinas no glicosiladas pasaran a traves del flujo continuo. A continuacion, las proteinas glicosiladas se eluyente la columna con lectina con un eluyente que contenga un azucar, por ejemplo, N-acetil-glucosamina y estan disponibles para analisis adicional.

Otra manera para determinar la composicion de la muestra biologica es eluirla a traves de columnas en serie que contengan adsorbentes dirigidos con respecto a las proteinas diana. Cualquier material y metodo adecuados se pueden usar para realizar una extraccion secuencial de una muestra. Por ejemplo, los inventores pueden usar una serie de columnas de centrifugacion que contiene diferentes adsorbentes, una placa de multiples pocillos revestida con diferentes adsorbentes, una sonda que contiene adsorbentes especificos adaptados para uso en un espectrometro de iones en fase gaseosa (la sonda se cambia entre las dos medidas). La ventaja de realizar extraccion secuencial en una sonda con espectrometro de iones en fase gaseosa es que los marcadores que se unen a diversos adsorbentes en cada etapa de la extraccion se pueden identificar y analizar directamente.

Los biomarcadores en una muestra tambien se pueden separar mediante electroforesis en gel de alta resolucion. Esta tecnica es particularmente potente cuando se comparan muestras relacionadas, tales como muestras de tejido sano con respecto a tejido enfermo (es decir, lesion cerebral). Por ejemplo, las proteinas que son mas abundantes en la muestra enferma podrian representar nuevas dianas o biomarcadores farmacologicos. La 2D-PAGE comparativa la que se puede usar para buscar proteinas cuya expresion varia del mismo modo en el mismo conjunto de condiciones (estas pueden tener funciones relacionadas) y para identificar proteinas producidas como respuesta a la terapia con farmacos (estas pueden ser responsables de los efectos secundarios relacionados con los farmacos).

La primera etapa es cargar las proteinas en el gel, que tiene un gradiente de pH de la parte superior a la inferior. El gel de poliacrilamida proporciona una matriz de soporte a traves de la que pueden migrar las proteinas. Este gel tiene un gradiente de pH de la parte superior a la inferior - la parte superior es mas acida de la parte inferior. Una mezcla compleja de proteinas se carga en la parte media del lado izquierdo, en donde el pH neutro, y se aplica un voltaje a traves del gel. Las proteinas migran a continuacion a traves del Vergel hasta que alcanzan su punto isoelectrico (punto en el que su carga es la misma que el pH circundante). Esta tecnica se denomina enfoque

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isoelectrico. El gel se empapa a continuacion en una solution de desnaturalizacion (que hace que las proteinas se desplieguen) que contiene el detergente dodecilsulfato sodico (SDS). Esta molecula tiene una carga muy negativa y se une a todas las proteinas, haciendo de manera eficaz que todas tengan la misma carga. A continuacion se aplica un voltaje a traves del gel de lado a lado con el anodo (terminal positivo) a la derecha. Todas las proteinas se mueven hacia el anodo, pero las proteinas mas pequenas se mueven mas rapido a traves del gel que las mas grandes, separando de este modo las proteinas de acuerdo con su tamano. Los biomarcadores en la matriz de dos dimensiones se pueden detectar usando aquel metodo adecuado conocido en la tecnica. Por ejemplo, los biomarcadores en un gel se pueden etiquetar o tenir (por ejemplo, tincion con Azul de Coomassie o con plata).

Si la electroforesis en un gel genera aplicaciones puntuales que corresponden al peso molecular de uno o mas marcadores de la invencion, la aplicacion puntual se puede analizar adicionalmente mediante analisis de densitometria o espectrometria de iones en fase gaseosa usando cualquier tecnica adecuada, tal como MALDI o SELDI.

Los biomarcadores se pueden someter a proteolisis antes del analisis. Los fragmentos resultantes de esta digestion reflejan la identidad de los biomarcadores, permitiendo de este modo su analisis. Esto es particularmente util para distinguir diferentes marcadores con masas moleculares similares. La proteolisis tambien es util para marcadores con peso molecular elevado que se resuelven menos facilmente con espectrometria de masas que los marcadores mas pequenos. Las proteasas, tales como tripsina, que escinden los marcadores en un numero de fragmentos separados son particularmente utiles.

Los biomarcadores tambien se deben modificar para aumentar la resolucion de la deteccion. Por ejemplo, se puede usar neuraminidasa para retirar restos de acido sialico terminal de las glicoprotelnas, aumentando este modo la union a un adsorbente anionico y aumentando la resolucion de la deteccion.

Por ejemplo, los biomarcadores se pueden modificar mediante la union de una etiqueta de peso molecular especifico. Esta etiqueta se unira a un marcador molecular especlfico, permitiendo la separacibn adicional. Opcionalmente, la identidad de los biomarcadores modificados se puede determinar mediante emparejamiento de sus caracterlsticas flsicas y qulmicas en una base de datos de proteinas (por ejemplo, SwissProt).

La cromatografla liquids de alto rendimiento (HPLC) se puede usar para separar una mezcla de biomarcadores en una muestra basandose en sus diferentes propiedades flsicas, tales como polaridad, carga y tamano. Por lo general, los instrumentos de HPLC consisten en un deposito de fase movil, una bomba, un inyector, una columna de separacion y un detector. Los biomarcadores en una muestra se separan por inyeccion de una alicuota de la muestra en la columna. La mezcla se eluye a traves de la columna a diferentes tasas debido a diferencias en el comportamiento de reparto entre el liquido movil y las fases estacionarias. A continuacion se recoge una fraccion que corresponde al peso molecular y/o propiedades flsicas de uno o mas biomarcadores. La fraccion se analiza mediante espectrometria de iones en fase gaseosa para detectar biomarcadores.

El uso de Biochip de protelna es de interes en particular para determinar la identidad y el nivel de expresion de biomarcadores presentes en la muestra biologica. Normalmente, "biochip de protelna" se refiere a la micromatriz de proteina, que se encuentra en una disposicion ordenada de muchas proteinas diferentes, tales como anticuerpos, cuyas coordenadas en el chip se conocen. Esas proteinas sirven como agentes de captura para proteinas seleccionadas en una muestra. Las proteinas facturadas se hacen detectables o bien etiquetando las directamente con un fluoroforo o, en el caso de chips de anticuerpo, ahadiendo una capa de anticuerpos etiquetados para hacer un sandwich. La posicion en la que la proteina se une revela el tipo de cuerpo al que se une y por lo tanto su identidad. La fuerza de la serial desde una posicion indica el nivel de expresion de proteina. Las micromatrices de anticuerpo tienen la ventaja de tener un alto rendimiento. Los biochips de protelna los pueden proporcionar las Compahias Packard BioScience (Meriden Conn.), Zyomyx (Hayward, Calif.) y Phylos (Lexington, Mass ).

Para confirmar la identidad de la protelna unida en una aplicacion puntual en particular en los Biochips, es necesario realizarun analisis adicional.

Las proteinas capturadas en la superficie de un biochip de proteina se pueden detectar mediante espectrometria de masas, fluorescencia, resonancia de plasmones superficiales, elipsometria o microscopia de fuerza atomica. La espectrometria de masas es un metodo util para deteccion de los biomarcadores de la presente invencion.

En la espectrometria de masas de desorcion por laser, un sustrato o una sonda que contiene marcadores se introduce en un sistema de entrada. Los marcadores se desorben y se ionizan en la fase gaseosa mediante laser a partir de la fuente de ionizacion. Los iones generados se recogen con un ensamblaje de optica ionica, y a continuacion en un analizador de masas de tiempo de vuelo, los iones se aceleran a traves de un campo corto de voltaje elevado tension de alto y se deja que se deriven en una camara de alto vacio. En el otro extremo de la camara de alto vacio, los iones acelerados golpean una superficie detectora sensible en un momento diferente. Dado que el tiempo de vuelo es una funcion de la masa de los iones, el tiempo transcurrido entre la formation de iones y el Impacto en el detector de iones se puede usar para identificar la presencia o ausencia de marcadores de relation especifica de masa con respecto a carga.

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La espectrometri'a de masas de desorcion/ionizacibn por laser asistida por matriz, o MALDI-MS, es un metodo de espectrometria de masas que implica el uso de una molecula que absorbe energia, con frecuencia denominada matriz, para desorber proteinas intactas desde una superficie de sonda. La MALDI se describe, por ejemplo, en el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.118.937 (Hillenkamp et al.) y en el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.045.694 (Beavis y Chait). En la MALDI-MS, por lo general la muestra se mezcla con un material de matriz y se coloca en la superficie de una sonda inerte. Algunas moleculas de absorcion de energia a modo de ejemplo incluyen derivados de acido cinnamico, acido sinapinico ("SPA"), acido ciano hidroxi cinamico ("CHCA") y acido dihidroxibenzoico. Otras moleculas que absorben energia adecuadas son conocidas por los expertos en esta materia. La matriz se seca, formando cristales que encapsulan las moleculas de analito. A continuacidn, las moleculas de analitos se detectan con espectrometria de masas de desorcion/ionizacion por laser. La MALDI-MS es util para detectar los biomarcadores de la presente invencion si la complejidad de una muestra se ha reducido sustancialmente usando los metodos de preparacion descritos anteriormente.

La espectrometria de masas de desorcion/ionizacion por laser de aumento de superficie, o SELDI-MS represents una mejora con respecto a la MALDI para el fraccionamiento y deteccion de biomoleculas, tales como proteinas, en mezclas complejas. SELDI es un metodo de espectrometria de masas en donde las biomoleculas, tales como proteinas, se capturan en la superficie de un biochip de proteina usando reactivos de captura que se unen en el mismo. Por lo general, las moleculas no unidas se lavan de la superficie de la sonda antes de interrogacion. SELDI se describe, por ejemplo, en: documento de patente de Estados Unidos n.° 5.719.060 (Hutchens e Yip, 1998,) documento de patente de Estados Unidos n.° 6.225.047 (Hutchens e Yip, 2001) y Weinberger et al, "Time-of-flight mass spectrometry," en Encyclopedia of Analytical Chemistry, R. A. Meyers, ed., pp 11915-11918 John Wiley & Sons Chichesher, 2000.

Los marcadores en la superficie del sustrato se pueden desorber e ironizar usando espectrometria de iones en fase gaseosa. En un espectrometro de masas habitual, un sustrato o una sonda que comprende marcadores en su superficie se introduce en un sistema de entrada. A continuacion, los marcadores se desorben con una fuente de desorcibn tal como un laser, bombardeo atomico rapido, plasma de alta energia, ionizacion por electronebulizacion, ionizacion por termopulverizacion, MS liquida de iones secundarios, desorcibn de campo, etc. Las especies generadas volatilizadas, desorbidas, constan de iones o agentes neutros formados previamente que se ionizan como una consecuencia directa del sucesor de desorcibn. Los iones generados se recogen con un ensamblaje de optica ionica, y a continuacion el analizador de masas dispersa y analiza los iones que pasan. Los iones que salen del analizador de masas se detectan y a continuacion la informacion se traduce en proporciones de masa con respecto a carga. La deteccion de la presencia de marcadores u otras sustancias por lo general implicara la deteccion de la intensidad de la serial. Esto, a su vez, puede reflejar la cantidad y caracter de marcadores unidos al sustrato.

Inmunoensavos

Los biomarcadores tambien se pueden detectar e identificar a partir de fluidos biologicos mediante inmunoensayo, usando sus propiedades para actuar como un antigeno. El inmunoensayo implica: (a) usar anticuerpos que se unen de forma especifica a los marcadores; (b) mezclar una muestra con el anticuerpo y (c) detectar la presencia de complejo de anticuerpo-marcador en la muestra.

Usando los marcadores purificados, se pueden preparar anticuerpos que se unen de forma especifica a un marcador usando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2a ed. 1986); y Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). Las tecnicas de este tipo incluyen, pero no se limitan a, preparacion de anticuerpo por seleccion de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, asi como preparacion de anticuerpos policlonales y monoclonales mediante inmunizacion de conejos o ratones (vease, por ejemplo, Huse et al., 1989; Ward et al., 1989).

Los anticuerpos primaries especificos permiten cuantificar biomarcadores en fluidos biologicos usando un ensayo inmunoenzimatico (EIA) tal como ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo de transferencia de Western, o un ensayo de transferencia por ranuras (veanse, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos n.05 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Estos metodos tambien se describen en, por ejemplo, Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites y Terr, eds., 7a ed. 1991). La deteccion y cuantificacion de biomarcadores se describe con detalle en los Ejemplos que siguen a continuacion.

Por lo general, el anticuerpo que se une de forma especifica al marcador se ariade a la muestra tomada de un paciente. Opcionalmente, el anticuerpo se puede fijar a un solido que facilitara el lavado y posterior aislamiento del complejo de anticuerpo-proteina. Algunos ejemplos de soportes solidos incluyen vidrio o plastico en forma de, por ejemplo, una placa de microtitulacion, una barra, una perla, o una microperla. Algunos anticuerpos tambien se pueden unir a un sustrato de sonda o "matrices de ProteinChip.RTM". Una muestra se puede diluir en un vehiculo adecuado antes de su incubacion con anticuerpo primario. La mezcla se lava y el complejo de anticuerpo-marcador se puede detectar con un reactivo especifico tal como un anticuerpo secundario etiquetado con perlas magneticas (por ejemplo, DYNABEADS.TM.), colorantes fluorescentes, radioetiquetas, enzimas (por ejemplo, peroxidasa de

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rabano picante, fosfatasa alcalina y otras usadas normalmente en un ELISA), y etiquetas colorimetricas tales como oro coloidal o perlas de vidrioo plastico coloreadas.

Como altemativa, el marcador en la muestra se puede detectar mediante un ensayo de competicion o inhibicion en donde, por ejemplo, dos anticuerpos monoclonales dirigidos frente a epitopos distintos se incuban de forma simultanea con la mezcla.

En los ensayos, pueden ser necesarias etapas de incubacidn y/o lavado despues de cada combinacion de reactivos. Las etapas de incubacidn pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferiblemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubacion dependera del formato de ensayo, identidad del biomarcador, volumen de solucion, concentraciones, ... Normalmente, los ensayos se realizaran a temperatura ambiente, aunque se pueden realizar en un intervalo de temperaturas, tal como de 4 °C a 37 °C.

Los inmunoensayos son utiles para determinar el nivel de expresion de los biomarcadores en una muestra de ensayo. Este nivel de expresion se determina representando los valores absolutos con respecto a una curva patron ( realizada a partir de una proteina conocida por estar presente en una muestra).

El analisis de la deteccion y la cuantificacion de biomarcadores de muestras sometidas a ensayo, genera datos que se presentan en diversos formatos: 1) una " vista del espectro o mapa retenido" en donde una vista de espectro patron representa la cantidad de biomarcador que alcanza el detector en cada peso molecular en particular 2) un "mapa de pico" en donde se visualizan la altura del pico y la informacion de la masa, proporcionando una imagen mas clara y permitiendo que los marcadores con pesos moleculares casi identicos se puedan observar mas facilmente 3) una "vision del gel" en donde cada masa de la vista del pico se puede convertir en una imagen en escala de grises basandose en la altura de cada pico, dando como resultado un aspecto similar a bandas en geles de electroforesis 4) una “superposicion en 3-D" en donde varios espectros se pueden superponer para estudiar cambios sutiles en alturas relativas de picos 5) una "vista de mapa de diferencia" en donde dos o mas espectros se pueden comparar, de forma conveniente resaltando marcadores unicos y marcadores que estan regulados de forma positiva o negativa entre muestras 6) un "Oiagrama de Dispersion Spotfire" en donde los biomarcadores se detectan y se representan como un punto, un eje de la representacion representa la masa molecular aparente de los marcadores detectados y otro eje representa la intensidad de la serial de los marcadores detectados.

Los metodos expuestos en esta patente tienen como objetivo detectar biomarcadores en fluidos biologicos de pacientes que padecen lesiones cerebrales. Este proceso conduct a muchas aplicaciones. A continuacion, la cuantificacion de biomarcadores se puede usar para precisar el diagnostico de lesiones cerebrales de cualquier forma y/o para controlar la respuesta del paciente a un tratamiento, y/o para identificar compuestos que modulan la expresion de estos biomarcadores in vivo o in vitro.

Algunos aspectos y ventajas adicionales se describiran en la siguiente seccion experimental, que solamente se consideraran como ilustrativos.

Ejemplos

A) Proceso de busqueda y procesamiento de datos a la seleccion racional de biomarcadores relevantes para la AD

Un enfoque combinatorio se usa para la seleccion de biomarcadores de AD potenciales y su priorizacion para estudios de validaciones, basandose en busqueda y procesamiento de rutas de datos experimentales disponibles que cubren resultados de estudios funcionales de biologia celular, experimentos de formacion de perfiles de expresion pangenomicos y estudios de asociacion genetica (Herz y Beffert, 2000; Mattson, 2004; Ballatore ef a!., 2007; Li et al., 2008). Este enfoque incluye una serie de etapas consecutivas:

- en primer lugar, los genes asociados de manera funcional o genetica con AD, se agrupan en unidades funcionales descritas anteriormente, relevantemente pequenas, que representan modulos minimos de transduccion de la sehalizacion,

- estos modulos de transduccion de la sehalizacion se combinan adicionalmente y se extienden de forma maxima, basandose en el analisis de estudios funcionales disponibles al publico, para construir rutas relevantes para la AD,

- se definen grandes redes funcionales de interaccion de rutas de sehalizacion relevantes para AD, y

- se da prioridad a biomarcadores individuales o combinaciones racionales de biomarcadores que representan diferentes redes funcionales para anotacion funcional.

Por lo tanto, se selecciona un biomarcador potencial, - ya sea una proteina por si misma o un producto de cualquier reaccion bioquimica catalizada por esta proteina, - y se le da prioridad para estudios de validacion, si se ajusta a los siguientes criterios:

- participacion en la ruta de sehalizacion asociada con el inicio y desarrollo de AD,

- participacion en la red funcional representa de manera convincente por rutas asociadas con AD,

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- facilidad de deteccion en muestras de paciente.

Despues del proceso de busqueda y procesamiento de datos, se seleccionaron 214 genes como biomarcadores de la AD.

B) Identlficacion de biomarcadores de la invencion

Los genes, que identificados a traves de los analisis de datos de los inventores estan asociados con la enfermedad Alzheimer, constituyen biomarcadoresvaliosos para la caracterizacion de la afeccion del paciente y para permitir la identificacion o subclasificacion de la enfermedad.

Un analisis de ELISA de varias muestras de plasma humano se usa para caracterizar biomarcadores de la invencion.

Muestra de plasma

La sangre se extrae, con metodos convencionales, de personas no enfermas, personas con riesgo de desarrollar AD, y pacientes con AD que se estan sometiendo uno a un tratamiento. Las muestras se diluyen en un volumen igual de EDTA (cone) como un anticoagulante y a continuacion se centrifugan (4 °C, 1300 RCF). Se tomaron alicuotas de los sobrenadantes y se congelan en nitrogeno liquido. A continuacion, las muestras se almacenan a - 80 °C.

Analisis de muestras con ELISA

El ELISA de sandwich convencional en microplaca de 96 pocillos se realiza para cuantificar el nivel medio de biomarcadores de la invencion en conjuntos de muestras de plasma de pacientes enfermos (control) o no enfermos. Este analisis de alto rendimiento se realiza usando una estacion de trabajo automatizada de ELISA.

Basicamente, el procedimiento es casi el mismo que para el ELISA de sandwich convencional: las placas de PVC se revisten primero con anticuerpos de captura diluidos en PBS (1 pg por pocillo, una noche a 4 °C), despues de una etapa de lavado (en PBS), a continuacion, las placas se bloquean con un tampon de PBS que contiene BSA al 3 % durante una noche a 4 °C.

A continuacion, las placas se incuban con una solucion de plasma/PBS valorada durante una noche a 4 °C.

Despues de una etapa de lavado, los anticuerpos de deteccion de raton monoclonal se diluyen en tampon de bloqueo y se incuban en los pocillos de la placa durante 2 horas.

Despues de otra etapa de lavado, se realiza una ultima etapa de bloqueo en solucion de metanol con H2C>2 al 0,3 % (para evitar la contaminacion residual de la muestra con peroxidasa). Despues de una etapa de lavado con PBS, las placas se incuban con anticuerpos de deteccion anti raton policlonal, acoplados a HRP durante dos horas.

Despues de una etapa de lavado, se aplican 0,5 mg/ml de solucion de OPD en tampon de citrato y fosfato y se complements con una milesima parte de la solucion de H2O2 al 30 % durante 10-15 min. Se anade un volumen igual de solucion de parada (H2SO4 3 M) y a continuacion se mide la DO490 en cada pocillo.

Analisis de datos a partir de analisis proteomico.

El analisis proteomico (ELISA, mencionado anteriormente) de varias muestras de plasma humano permite a los inventores clasificar los 214 genes que codifican los biomarcadores en circulacion identificados a partir del analisis de busqueda y procesamiento de datos de los inventores, y opcionalmente determinar que proteina o conjunto de proteinas pueden constituir una firma especifica para la AD: En primer lugar, se aplied un analisis de gen a gen en un conjunto de muestras de entrenamiento; este analisis se basa en el Bosque Aleatorio (Diaz-Uriarte & Alvarez de Andres, 2006) que clasifica genes a partir de los mas discriminantes (gem) entre casos y controles con respecto al ultimo al menor (gen2n).

A partir de este analisis, se identified un conjunto de 24 genes como los mejores biomarcadores: La variacion del nivel de proteina correspondiente permite el diagnostico de la enfermedad con una precision de un 60 %. Los genes restantes se agrupan en otros dos listados: se encuentra una variacion significativa en el nivel de proteina de 51 genes en un 50 a un 60 % de sueros de pacientes enfermos mientras que entre un 40 % y un 50 % de los sueros muestran una variacion significativa para los 139 genes restantes (Tabla 4).

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Tabla 4: Clasificacion de biomarcadores en circulacion

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+++ : conjunto preferido de 24 biomarcadores comprendidc en un conjunto para diagnostico de AD:

++ : grupo de 51 biomarcadores, una variacion significativa del mismo se encuentra en un 50 % a un 60 % de las muestras de pacientes enfermos;

+ : grupo de 139 biomarcadores, una variacion significativa del mismo se encuentra en un 40 % a un 50 % de muestras de pacientes enfermos.

C) Otros metodos de identificacion y cuantificacion, a partir de muestras biologicas, de biomarcadores de la presente invencion.

Los metodos que se exponen a continuacion tienen como objetivo la deteccion de biomarcadores identificados en la presente invencion en ftuidos biologicos de pacientes que padecen lesiones cerebrates. La cuantificacion de biomarcadores se puede usar a continuacion para precisar el diagnostico de lesiones cerebrales de cualquier tipo y/o para controlar la respuesta del paciente a un tratamiento, y/o para identificar los compuestos que modulan la expresion de estos biomarcadores in vivo o in vitro.

Las muestras biologicas se toman de voluntaries sanos (controles), con edades, genero, condicion fisica similares y de pacientes con lesion cerebral. Las comparaciones de estas muestras biologicas permiten detectar grupos de biomarcadores que caracterizan la condicion del paciente y permiten identificar o subclasificar la enfermedad.

La deteccion y cuantificacion adecuada de biomarcadores se necesita para reducir la complejidad de las muestras biologicas antes de realizar el analisis de los biomarcadores.

I) Procesamiento de muestras

En primer lugar, se usaron columnas de cromatografia de agotamiento disponibles en el mercado para eliminar o reducir marcadores de la muestra no relevantes o sobre representados. A continuacion, se pueden usar tecnicas de rutina para fraccionar muestras en fracciones que contengan biomarcadores con propiedades de union similares u otras caracteristicas fisicoquimicas. Como un ejemplo, en la tecnica se conocen bien algunas tecnicas de cromatografia liquids (cion portamano, intercambio ionico, afinidad por heparina, ...). En la cromatografia liquida de alto rendimiento (HPLC), se aplica una alta presion en la columns de separacion una vez que la muestra se carga. La HPLC normalmente proporciona una mejor separacion de los biomarcadores que la cromatografia liquida comun.

a) Tecnicas de cromatografia

Cromatografia por exclusion

La cromatografia por exclusion se podria usar para dividir una muestra de acuerdo con el tamario de las particulas/moleculas. Las proteinas de alto peso molecular se eluyen en las primeras fracciones de elucion, con las ultimas conteniendo un porcentaje mas elevado de moleculas pequerias (las columnas de exclusion por tamafios disponibles en el mercado pueden ser Columnas de Filtracion en BIO Gel Discovery® o Columnas de Filtracion en Gel TSK-GEL, Sigma Aldrich)

Cromatografia de intercambio ionico

Una muestra se divide mediante cromatografia de intercambio ionico que permite la separacion de moleculas de acuerdo con sus caracteristicas de carga. Las resinas de intercambio ionico estan disponibles en el mercado y permiten el fraccionamiento de una muestra en fracciones de elucion clasificadas de acuerdo con su pH. Las columnas de intercambio anionico se usa para separar proteinas con carga negativa, peptidos asi como polinucleotidos; las columnas de intercambio cationico se usa para separar proteinas que tienen una carga globalmente positiva, (por ejemplo, Columnas de intercambio cationico o anionico TSK-GEL de TosoH Corp., Sigma Aldrich)

Cromatografia de Bioafinidad

Las propiedades de interaccion de los biomarcadores, con proteinas, metabolitos, etc., se pueden usar para separarios.

Como un ejemplo, se usa cromatografia con heparina sobre la base de interaccion de afinidad con heparina y caracteristicas de carga. La heparina, un mucopolisacarido sulfatado, se unira a marcadores con restos cargados con carga positiva. Por lo tanto, una muestra se eluye de manera secuencial, con cada eluyente teniendo diferente pH o concentraciones de sal: es probable que el eluyente que tiene un pH acido este cargado con carga debilmente positiva mientras que una fraccion que tiene un pH elevado esta cargada con carga fuertemente positiva.

Una muestra se puede separar mediante aislamiento de proteinas que tengan una caracteristica especifica, por ejemplo modificacion despues de la traduccion tal como glicosilacion. Por ejemplo, una muestra de fluido cerebroespinal se carga sobre una columna de cromatografia con lectina (que tiene una afinidad elevada hacia los azucares): las proteinas glicosilada se unirein a la columna de lectina y las proteinas no glicosiladas pasaran a traves del flujo continuo. Las proteinas glicosilada se eluyen a continuacion de la columna de lectina con un eluyente que contiene un azucar, por ejemplo, N-acetil-glucosamina y estan disponibles para analisis adicional.

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Cromatoarafia en serie

Una forma eficaz para dividir una muestra es avanzar a estas acciones secuenciales realizando etapas sucesivas de cromatografia que se basan en diferentes tecnicas de separacion. En cada etapa, se pueden analizar los marcadores retenidos o eluidos.

b) Tecnicas de electroforesis en gel

Los biomarcadores en una muestra se separan de acuerdo con su masa molecular realizando una Electroforesis en Gel de SDS PoliAcrilamida (conocida como SDS-PAGE). La electroforesis en gel de dos dimensiones (2D-PAGE) es un electroforesis de dos etapas que se puede usar para analizar mezclas de protefnas.

La primera etapa es el enfoque isoelectrico. Las proteinas se cargan en un gel que tiene un gradiente de pH de la parte superior a la inferior. Las proteinas migran a continuacion a traves del gel hasta que alcanzan su punto isoelectrico. La segunda etapa es una SDS PAGE convencional: las proteinas separan a continuacion de acuerdo con su Masa Molecular. Los biomarcadores separados de este modo en el gel de dos dimensiones se pueden detectar usando cualquier metodo conocido que se conozca bien en la tecnica. Por ejemplo, los biomarcadores en un gel se pueden etiquetar o tenir (por ejemplo, tincion con Azul de Coomassie o con plata).

La comparacion de un gel de 2D de referenda con un gen de 2D correspondiente con una muestra de un paciente enfermo permite la identificacion de biomarcadores presentes o ausentes y ademas la determinacion de la proporcion de expresion relativa de biomarcadores de interes. Las aplicaciones puntuales de los biomarcador ex se pueden analizar adicionalmente mediante analisis de densitometria o espectrometrla de iones en fase gaseosa usando cualquier tecnica adecuada, tal como MALDI (vease II).

II) Identificacion y analisis cuantitativo de biomarcadores

a) Biochips

Micromatrices de proteina

El uso de Biochip de proteina es de interes en particular para determinar la identidad y la expresion de un conjunto de biomarcadores presentes en una muestra biologica.

Los biomarcadores una muestra biologica se capturan primero con agentes de captura representados en la superficie de la micromatriz. Los agentes de captura pueden ser no especificos: estos usan el mismo principio que las tecnicas de cromatografia basandose en el uso de propiedades fisicoquimicas de moleculas (pH, carga, hidrofobia, etc.). A continuacion, se usa espectrometria para identificar biomarcadores que se han retenido con agentes de captura. Esta tecnica, denominada SELDI MS, es util para analisis de alto rendimiento de una muestra compleja, que proporciona niveles de expresion de un gran conjunto de biomarcadores e identifica el biomarcador(s) relevante en una mezcla de moleculas.

Los agentes de captura tambien pueden ser especificos de biomarcadores desconocidos. Los anticuerpos, proteinas

presa, aptameros.....se podrian usar para generar "biochip de proteina" dedicado a la deteccion y/o cuantificacion

de biomarcadores que se estan buscando.

La tecnologia de micromatrices de anticuerpos se deriva de los inmunoensayos de captura o de captura competitiva, de tipo sandwich, (vease a continuacion). Los anticuerpos se unen en orden a una superficie de la micromatriz. La muestra acondicionada opcionalmente o parcialmente purificada (vease I), se incuba con la micromatriz. A continuacion, la mezcla se lava y el complejo de anticuerpo-biomarcador se detecta con un reactivo especifico tal como un anticuerpo secundario etiquetado con perlas magneticas (por ejemplo, DYNABEADS.TM ), colorantes fluorescentes, radioetiquetas, enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina y otras usadas normalmente en un ELISA), y etiquetas colorimetricas tales como perlas de oro coloidal o vidrio coloreado o de plastico.

Los biochips de proteina estan disponibles en el mercado para busqueda de familias de proteinas o rutas celulares especificas (por ejemplo, BioRay (Norcross, Georgia); Sigma Aldrich's micromatrices de panorama) o se pueden diseriar a demanda (por ejemplo, Primorigen biosciences (Madison, Wisconsin); Arrayit Corporation (Sunnyvale, California); MicroBioChips Sas (Paris, Francia)).

Chips de ADN

Los chips de ADN se usan para dos aplicaciones.

En primer lugar, permiten una cuantificacion de la expresion genetica del nivel de ARN, tambien denominada formacion de perfiles de expresion genetica. La formacion de perfiles de expresion genetica consiste en medir los niveles de expresion del ADNc de miles de genes. Los genes cuya expresion se ve influida por una patologia o un tratamiento se pueden identificar de este modo y usar como biomarcadores (King y Sinha, 2001, Ghanem et a!., 1992). Los chips de ADN se pueden usar como un enfoque complementario para detectar la variabilidad en la

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Los chips de ADN tambien se pueden usar para detectar polimorfismos, por ejemplo polimorfismo de un solo nucleotido (SNP) o microdeleciones, permitiendo la identification de marcadores geneticos asociados con la enfermedad.

El genoma se puede identificar sistematicamente de este modo para la presencia de polimorfismos asociados con una enfermedad o una respuesta al tratamiento, convirtiendose en biomarcadores utiles. (Anderson et al., 2006, Shi, 2001; Chial, 2008).

b) Espectrometria de masas

La espectrometria de masas (MS) se puede usar a identificar un biomarcador o biomarcadores purificados presentes en una fraccion de muestra obtenida durante el procesamiento de la muestra. Los biomarcadores de proteina se pueden someter a proteolisis antes del analisis. Los fragmentos resultantes de esta digestion reflejan la identidad de los biomarcadores, permitiendo de este modo su analisis. Esto es particularmente util para distinguir diferentes marcadores con masas moleculares similares (purificados a partir de un SDS PAGE por ejemplo) o presentes en una misma fraccion de elucidn. La proteolisis amen es util para marcadores con peso molecular elevado que se pueden resolver menos facilmente mediante espectrometria de masas que los marcadores mas pequehos. Algunas proteasas, tales como tripsina, que escinden los marcadores en un numero de fragmentos separados estan disponibles en el mercado.

Puede ser necesario modificar los biomarcadores de proteinas modificados despues de la traduccion para aumentar la resolucion de la deteccion. Por ejemplo, se puede usar neuraminidasa para retirar restos de acido sialico terminales de glicoproteinas, aumentando de este modo la union a un adsorbente anionico y aumentando la resolucion de la deteccion.

Varias mejoras en tecnicas de espectrometria de masas se pueden usar para identificar biomarcadores presentes en una muestra: espectrometria de masas en tandem (MS-MS), ionizacion por electronebulizacidn, espectrometria de masas de desorcion por laser, espectrometria de masas de desorcion/ionizacion por laser asistida por matriz (MALDI-MS), MALDI-TOF-MS.

Estas tecnicas son utiles para detectar los biomarcadores de la presente invencion una vez que la complejidad de una muestra se ha reducido sustancialmente usando los metodos de preparacion descritos anteriormente.

La espectrometria de masas de desorcion por laser de aumento de superficie (SELDI-MS) representa una mejora con respecto a MALDI para el fraccionamiento y deteccion de biomoleculas presentes en una cantidad de vivir en mezclas complejas. En la tecnica de SELDI-MS, las biomoleculas, tales como proteinas, se capturan en la superficie de un biochip de proteina usando reactivos de captura que se unen en el biochip. Al igual que en las tecnicas de cromatografia mencionadas anteriormente, los reactivos de captura se usan para reducir la complejidad de una muestra biologica, usando propiedades fisicoquimicas de las biomoleculas (revisado en De Bock M, 2010; documento de Patente de Estados Unidos n.° 6528320 (Hutchens e Yip)).

c) Inmunoensavos

Algunos biomarcadores tambien se pueden detectar, identificar y cuantificar a partir de fluidos biologicos con inmunoensayos, usando sus propiedades para actuar como un antigeno. Algunos anticuerpos especificos para los biomarcadores de interes se pueden producir usando metodos que se usan en la actualidad estan disponibles en el mercado (Vease, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)). El nivel de expresion de los biomarcadores se determina mediante la representacion de valores absolutos con respecto a una curva patron (realizada a partir de una proteina de la que se sabe que esta presente en una muestra). Algunos inmunes a los de este tipo pueden ser, por ejemplo: radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sandwich", ensayos de inmunoprecipitacion, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusion en gel, ensayos de inmunodifusidn, inmunoensayos de fluorescencia y similares. Los ensayos de este tipo son de rutina y se conocen bien en la tecnica (Vease, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)).

La MS es util para detectar y cuantificar cualquier tipo de biomarcador, proteina, y ademas carbohidratos, lipidos o biomolecula de cualquier tipo: la MS se puede usar para realizar analisis metabolomicos (Boccard J. et al., 2010). Los resultados con los estudios metabolomicos o proteomicos realizados usando, por ejemplo, MS o chips de proteinas se pueden mejorar usando biomarcadores identificados a partir de datos genomicos obtenidos con matrices de ADN (asi como nivel de expresion de ARN, o datos de polimorfismo).

Resultados: Identificacion de conjuntos de biomarcadores de AD.

Los inventores han identificado numerosas combinaciones de biomarcadores de AD usando tecnicas de cromatografia y micromatrices de proteinas como se ha descrito anteriormente. Los conjuntos de biomarcadores de

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D) Metodos de deteccion de la presencia por riesgos de AD en una muestra de plasma humano usando biomarcadores de la invencion.

I) Diagnostico de la AD usando ensayo de ELISA

Las muestras de sangre se recogen con metodos convencionales de personas que desean evaluar el riesgo de AD o la presencia de AD. La muestra de control se prepara a partir de la mezcla de varias muestras de sangre de voluntaries sanos. Las muestras se diluyen en un volumen igual de EDTA (cone) como un anticoagulante, y a continuacion se centrifugan (4 °C, 1300 RCF). Se tomaron alicuotas de los sobrenadantes y se congelan en nitrogeno liquido. A continuacion, las muestras se almacenan a -80 °C.

El protocolo de ELISA se realiza de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la parte B). En primer lugar, las placas de PVC se revisten con anticuerpos para cada uno de los 24 biomarcadores preferidos enumerados en la Tabla 4. Estos anticuerpos se diluyen en PBS (1 pg por pocillo, una noche ha 4 °C), despues de una etapa de lavado (en PBS), a continuacion, las placas se bloquean con un tampon de PBS que contiene BSA al 3 % durante una noche a 4 °C.

El ELISA de tipo sandwich se realiza en micro placas de 96 potrillos convencionales para cuantificar el nivel de biomarcadores de la invencion en muestras de plasma de pacientes sometidos a ensayo. Este analisis de alto rendimiento se realiza usando una estacion de trabajc de ELISA automatizada. Las placas se incubaron a continuacion con una solucion de plasma/PBS valorada durante una noche a 4 °C.

Despues de una etapa de lavado, los anticuerpos de deteccion de raton monoclonal se diluyen en tampon de bloqueo y se incuban en los pocillos de la placa durante 2 horas. Despues de otra etapa de lavado, se realiza una ultima etapa de bloqueo en solucion de metanol con H202 al 0,3 % (para evitar la contaminacidn residual de la muestra con peroxidasa). Despues de una etapa de lavado con PBS, las placas se incuban con anticuerpos de deteccion anti raton policlonal, acoplados a HRP durante dos horas.

Despues de una etapa de lavado, se aplican 0,5 mg/ml de solucion de OPD en tampon de citrato y fosfato y se complements con una milesima parte de la solucion de H202 al 30 % durante 10-15 min. Se shade un volumen igual de solucion de parada (H2SO4 3 M) y la union de anticuerpo/proteinas se evalua con la medida de la DO490 en cada pocillo para cada una de las 24 proteinas biomarcadoras.

Por ultimo, el riesgo de AD o la presencia de AD se determina mediante evaluacion del perfil de union de proteinas biomarcadoras para capturar anticuerpos (es decir, numero e identidad de biomarcadores para los que se observa una diferencia significativa en el nivel de proteina entre muestras de ensayo y de control) determinando si la variacion del nivel de proteina correspondiente esta de acuerdo con las variaciones del nivel que se han observado durante la etapa de identificacion de los biomarcadores.

II) Diagnostico de AD usando micromatrices de ADN

El protocolo clasico se usa para deteccion de secuencias de ADN con micromatriz de ADN. Las muestras de sangre de pacientes que desean su diagnostico para el riesgo de AD por la presencia de AD se recogen en tubos de ARN en sangre PAXgene (Qiagen). Las muestras de sangre extraidas de pacientes sanos se recogen, se mezclan para constituir la muestra de referenda que se trata como la muestra de sangre a diagnosticar.

El ARN total se extrae de estas muestras usando el Kit de ARN en sangre PAXgene (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

El ARN total se cuantifica, y de 5 pg a 10 pg de ARN se transcriben de forma inversa. El ADNc de ds se sintetiza. A continuacion se realiza la transcripcion in vitro usando aa dUTP, y los ARNa se etiquetan indirectamente con esteres de Cy-colorantes.

Los chips de ADN que contienen sondas de ADN complementarias con la secuencia de nucleotidos que codifica cada uno de los 24 biomarcadores se usaron para deteccion de la presencia o el riesgo de la AD. Cada portaobjetos se hibrida con los ARNa etiquetados de la muestra a diagnosticar con respecto a los ARNa etiquetados de la muestra de referenda. Se realizan indicaciones de intercambio de colorante. La hibridacion de la sonda-diana se detecta y se cuantifica y de la formacion de perfiles de expresion genetica se evalua. La presencia 0 el riesgo de la AD se calcula como una funcion del numero de biomarcadores, cuya expresion se altera en comparacion con su expresion en pacientes sanos.

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Claims (7)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para detectar la presencia de riesgo de enfermedad de Alzheimer (AD) en un mamifero vivo, o para ayudar en el diagnostico y subclasificacion de AD, metodo que comprende determinar la cantidad (relativa) o la presencia, ausencia o alteracion de un conjunto de biomarcadores diana en una muestra de fluido biologico de dicho mamifero y comparar el nivel medido del biomarcador(es) con un valor de referenda, en donde una desviacion de dicho valor de referenda es indicativo de la presencia, riesgo, progresion o gravedad de AD, y en donde dicho conjunto de biomarcadores comprende una proteina o acido ribonucleico (ARN) codificado por cada uno de los siguientes genes: APBA1, ATG7, BECN1, CD44, CDH2, COL18A1, ERBB4, F3, FLNA, FYN, GRIN2B, IL20, ITPR1, LRP8, MTOR, NPPC, NRP1. PDGFC, R0B01, SEMA3E, TGFB1, THBS1, VEGFR1 y WWOX.
2. 2. Un metodo para predecir y/o evaluar la respuesta de un mamifero a un tratamiento frente a AD o la eficacia de un tratamiento de este tipo en un sujeto, metodo que comprende determinar la cantidad (relativa) o la presencia, ausencia o alteracion de un conjunto de biomarcadores diana en una muestra del mamifero y comparar el nivel medido del biomarcador(es) con un valor de referenda, en donde una desviacion de dicho valor de referenda es indicativo de la respuesta de dicho sujeto o de la eficacia del tratamiento, y en donde dicho conjunto de biomarcadores comprende una proteina o ARN codificado por cada uno de los siguientes genes: APBA1, ATG7, BECN1, CD44, CDH2, COL18A1, ERBB4, F3, FLNA, FYN, GRIN2B, IL20, ITPR1, LRP8, MTOR, NPPC, NRP1, PDGFC, R0B01, SEMA3E, TGFB1, THBS1, VEGFR1 y WWOX.
3. 3. El m6todo de la reivindicacion 1 o 2, en donde el conjunto de biomarcadores comprende adicionalmente al menos una proteina o ARN codificado por un gen seleccionado de: A2M, ACHE, ALDH2, ANXA1, APOA1, ATP2A3, CASK, CASP8, CDH1, CDH5, CDKN1A, CHAT, CTNND2, DOCK3, EDN1, F13A1, FGF2, FLNB, GABRB2, ITGA1, LAMA1, LAMA3, LEPR, LRP1, MAP2, MMP9, NFATC2, NOS3, NOTCH3, NPPB, PDGFA, PDGFB, PIK3CB, PLAU, PLXDC2, PLXNA2, PRKG1, PRNP, PTK2, RYR2, SEMA5A, SERPINA6, SERPINB2, SERPIND1, STAT3, THBS2, TNF, TP53, TRPC4, TSC1 y VEGFA.
4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en donde el conjunto de biomarcadores comprende adicionalmente al menos una proteina o ARN codificado por un gen seleccionado de: ABCC4, ACC2, ACTN1, ADAM12, ADRA1A, AKAP13, ALCAM, ANXA3, ARHGEF11, ARHGEF12, ATF3, ATM, ATP6V1C1, ATR, BAP1, BGLAP, BIN1, BRIP1, BSN, CACNA1D, CALCB, CDC42BPB, CDH12, CDH13, CHEK1, CHL1, CLTC, COL3A1, COPS7B, CSF1, CSH1, CSNK1A1, CTNNA2, CUL1, CYP11A1, DAAM1, DGKZ, DLG3, DOCK2, EGF, EGFR, EPB41L2, ERC1, F2, FAS, FER1L3, FES, FKBP1A, FSTL5, GFRA3, GFRA4, GH1, GRIP1, GUCY2D, HGF, HIPK1, HMBOX1, HRG, HSP90B1, HSPA5, HYOU1, IGF2, IL16, IL6ST, IL8, INS, IPPK, IQGAP1, IQGAP2, ITGA9, JAK1, LEP, LETMD1, LIFR, LRP2, LRP6, LTBP1, MAD1L1, MAML3, MMP2, MMP3, MSR1, MUC1, MYO10, NCAM1, NCK1, NGF, NISCH, NOS1, NOTCH2, NPPA, NRIP1, NTF3, OPRM1, PCAF, PCLO, PDE3A, PDE5A, PFKP, PIK3CA, PLA2G2A, PLAT, PLG, PRL, PRLR, PSAP, PSD3, PTGS2, PTK2B, PTPRF, PTPRG, PTPRM, RELN, RET, RIMS2, ROCK1, RPS6KA1, RPS6KA2, RPS6KB1, SCN9A, SERPINA5, SERPINC1, SERPINE1, SERPINE2, SNAP25, SPP1, SREBF2, STAT5B, SV2B, TIMP2, TNFSF11, TRIO, TSC2, UBE3A, VCL, VIL2, WASPIP, XDH y ZFHX1B.
5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la determinacion de la cantidad (relativa) o la presencia, ausencia o alteracion de dichos biomarcadores es simultanea o secuencial.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la muestra se selecciona entre fluido cerebroespinal, suero, plasma, saliva y orina.
7. 7. Uso de un kit en el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende un soporte solido que comprende agentes de captura unidos al mismo, en donde cada uno de dichos agentes de captura se une a un biomarcador del conjunto de biomarcadores como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.