KR102288613B1

KR102288613B1 - Atg5를 이용한 경도인지장애 또는 치매의 진단 방법

Info

Publication number: KR102288613B1
Application number: KR1020190161078A
Authority: KR
Inventors: 고영호; 조선정; 조철만
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2021-08-11
Also published as: KR20210070847A

Abstract

본 발명은 경도인지장애 및 치매의 진단용 바이오마커 ATG5에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 ATG5를 이용하여 경도인지장애 또는 치매를 진단하는 방법 및 이의 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

ATG5를 이용한 경도인지장애 또는 치매의 진단 방법{A METHOD FOR DIAGNOSING MILD COGNITIVE IMPAIRMENT OR DEMENTIA USING ATG5}

알츠하이머병(Alzheimer's disease: AD)은 치매의 주된 원인이며, 아밀로이드 플라크(amyloid plaques)의 주요 성분인 amyloid-beta (Aβ)의 축적 및 뇌에서의 신경 섬유 매듭 형성을 병리학적 특징으로 한다. 알츠하이머병은 대뇌 피질 및 해마에서의 뉴런 손실을 일으키며, 이는 인지 기능 장애로 이어지게 된다. 종래 연구에 따르면 엔도솜-리소좀 경로(endosomal-lysosomal pathway)는 Aβ를 생성하기 위한 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein: APP)의 프로세싱에 관여한다고 보고되어 있다. 또한 다양한 스트레스 요인의 영향을 받는 뉴런에서는 엔도솜-리소좀 경로 활성의 조절 이상이 관찰되기도 한다. 최근에는 자식작용(autophagy)의 조절 이상이 신경퇴행성질환, AD, 파킨슨병, 리소좀 질환, 암 등 다양한 질병에 관여한다는 연구들이 발표된 바 있다.

자식작용은 리소좀에 의해 단백질 및 소기관의 제거 및 리사이클링에 관여하는 세포 내 메커니즘이다. 자식작용의 조절 이상은 영향을 받는 뉴런에서 자가식포(autophagic vesicles: AV)의 현저한 축적을 유도한다. 손상된 신경성 과정 및 시냅스 말단에서의 비정상적인 AV 축적이 AD 환자에서 관찰된다는 병리학적 증거가 발표된 바 있다. 나아가, 자식작용-리소좀 분해에서의 기능 장애가 AD의 병리학적 특징의 형성보다 선행한다는 것은 명백하다. AD 환자의 유전자 분석에 의하면, 자식작용의 양성 조절 인자가 entorhinal cortex에서 풍부하게 관찰되었으며, 이는 자식작용 관련 유전자가 AD 환자의 뇌에서 상향 조절됨을 시사한다. 그러나 병리학적 관점에서 AD 환자에서 자식작용이 나타남을 보여주는 생체 내(in vivo) 증거는 여전히 부족하고, 따라서 AD에서의 자식작용의 역할에 대해서는 추가 연구가 필요한 상황이다.

자식작용의 중요한 유전자 중 하나인 autophagy-related gene 5 (ATG5)에 의해 암호화된 ATG5는 먼저 ATG7 및 ATG10에 의해 ATG12에 결합한 후 Atg12-Atg5 복합체를 형성하며, LC3(light chain 3)의 지질화를 촉진한다. Beclin-1, ATG12, ATG5 및 LC3 면역반응이 AD 환자의 뉴런과 내피세포에서 관찰된 바 있다. 최근 연구는 자식작용 마커의 혈장 수치의 증가는 관상동맥 전체 폐색 및 소아 뇌성마비와 관련이 있을 수도 있음을 보여주었다. AD에 자식작용이 중요한 역할을 함이 시험관 내(in vitro)에서 확인되었음에도 불구하고, 여전히 실제 AD 환자에서 자식작용이 어떠한 관련성이 있는지는 충분히 연구된 바 없다. 또한, ATG5의 임상적 관련성은 여전히 알려져 있지 않다.

중추 신경계(central nervous system: CNS)에서, 자식작용은 노화, 영양 부족 및 뇌의 허혈에 의해 활성화될 수 있다. 최근 급성 허혈성 뇌졸중(acute ischemic stroke) 환자의 뇌척수액(cerebrospinal fluid: CSF) 및 말초 혈액에서 LC3B 및 Beclin-1과 같은 자식작용 마커의 증가가 보고되었다. 또한, 혈장 ATG5 수치는 건강한 대조군과 비교하여 관상 동맥 질환 환자에서 더 높았고, 뇌성 마비 환자의 혈장 ATG5 수치는 대조군보다 더 낮았다. 그러나, AD 환자의 혈액에서 자가포식소체 합성 및 자식작용 플럭스(autophagic flux)를 포함하는 자식작용 경로의 조절에 대해서는 알려진 바가 없다.

한국특허공개번호 제10-2018-0119371호에서는 ATG13의 LIR 부위 폴리펩티드 및 ApPDE4의 short-form의 N-말단 소수성 도메인을 이용하여 치매 및 알츠하이머병을 진단하는 방법을 개시하고 있다. 상기 특허문헌에서는 LC3A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 또는 GABARAPL2를 바이오마커로 사용하여 치매 또는 알츠하이머병을 진단하고자 하였으며, ATG5를 바이오마커로 언급하고 있지 않다.

한국특허공개번호 제10-2018-0119371호

본 발명자들은 경도인지장애 또는 치매의 잠재적 바이오마커로서 자식작용 마커들의 중요성을 확인하고자 하였고, 그 중 자식작용 시스템의 단백질, 특히 ATG5가 경도인지장애 또는 치매의 바이오마커로 작용하는지 여부를 확인하고자 하였다.

이에 따라 본 발명에서는 경도인지장애 또는 치매와 관련된 바이오마커 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 단백질 ATG5의 발현 수준을 측정하여 경도인지장애 또는 치매를 효과적으로 진단하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 ATG5 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료로부터 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 경도인지장애 또는 치매의 진단 방법을 제공한다. 바람직하게는,

일 실시태양에서, 상기 방법은 생물학적 시료에서 측정한 ATG5 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서 측정한 수준보다 높은 경우, 경도인지장애 또는 치매로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 상기 치매는 알츠하이머 치매일 수 있다.

본원에서 "생물학적 시료(biological sample)"란, 체내의 위 단백질의 발현 정도를 확인할 수 있은 모든 시료를 의미하며, 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락, 소변 등일 수 있으며, 바람직하게는 혈액일 수 있다.

본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침강법, 면역침강법, 면역형광법, 질량분석법, 단백질 칩, DNA 칩, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 샌드위치 분석법(sandwich assay), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 또는 웨스턴 블롯팅(western blotting)일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 시료 중 ATG5 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 경도인지장애 또는 치매의 진단용 조성물 또는 진단 키트를 제공한다. 이 때 상기 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머, 또는 리간드일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

ATG5 단백질을 경도인지장애 또는 치매, 바람직하게는, 알츠하이머병 유형의 치매에 대한 바이오마커로서 이용함으로써, 경도인지장애 또는 치매를 보다 효과적이고 빠르게 진단할 수 있다.

치매의 병인은 매우 다양하며 현재까지 치료제가 없고, 조기 진단을 통한 치매 발병 및 진행 속도 지연만이 최선인 상황에서, 본 발명의 바이오마커로서의 ATG5 단백질을 이용한 치매 진단법을 통해, 환자와 가족의 삶의 질을 향상시킬 뿐만 아니라 사회경제적으로 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a 및 1b는 Aβ_1-40를 처리한 primary rat cortical neurons의 immunoblotting 결과 및 ATG5-ATG12 복합체의 상대적 발현 정도를 나타낸다.
도 1c 및 1d는 Aβ_1-40를 처리한 HUVEC의 immunoblotting 결과 및 ATG5-ATG12 복합체의 상대적 발현 정도를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 HUVEC 배지에서의 ATG5 및 ATG12의 western blotting 결과 및 ATG5의 상대적 발현 정도를 나타낸다.
도 2c 및 2d는 건강한 대조군 기증자(C) 및 AD 환자 혈장에서의 ATG5 western blotting 결과 및 ATG5의 상대적 발현 정도를 나타낸다.
도 3은 건강한 대조군, MCI 및 치매 환자 각각의 혈액에서 ATG5의 농도변화를 나타낸 그래프이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.

[실시예 1]

AD 발병시 ATG5-ATG12의 결합 증가 분석

자식작용의 활성화가 Aβ clearance에 관련되어 있고 AD의 발병에 영향을 미친다는 증거가 존재한다. ATG5-ATG12의 결합이 자가포식소체(autophagosome)의 형성에 중요한 역할을 수행하므로, 본 실시예에서는 뉴런과 내피질 세포에 Aβ를 처리하였을 때, ATG5-ATG12의 결합이 증가하는지 확인하고자 하였다.

[실시예 1-1]

primary rat cortical neurons을 합성 Aβ_1-40 펩티드로 48시간 동안 처리한 후에, anti-ATG12로 Western blotting을 수행하여 ATG12와 ATG5의 결합 수준을 분석하였다.

그 결과를 도 1a 및 1b에 나타내었다. 구체적으로, 도 1a 및 1b는 Tubulin을 loading control로 하여 Aβ_1-40를 농도별로 처리한 primary rat cortical neurons의 Western blotting 결과 및 tubulin에 대한 ATG5-ATG12 복합체의 상대적 발현 정도를 나타낸 것인데, 이로부터, Aβ_1-40농도가 증가함에 따라 ATG12와 ATG5의 결합 역시 증가함을 확인하였다.

[실시예 1-2]

인간 제대 정맥 내피 세포 (human umbilical vein endothelial cells: HUVEC)를 합성 Aβ_1-40 펩티드로 24시간 동안 처리한 후에, ATG12와 ATG5의 결합 수준을 immunoblotting으로 분석하였다.

그 결과를 도 1c 및 1d에 나타내었다. 구체적으로, 도 1c 및 1d는 Tubulin을 loading control로 하여 Aβ_1-40를 농도별로 처리한 HUVEC의 Western blotting 결과 및 tubulin에 대한 ATG5-ATG12 복합체의 상대적 발현 정도를 나타낸 것인데, 이로부터, Aβ_1-40농도가 증가함에 따라 ATG5-ATG12 복합체의 결합 역시 증가함을 확인하였다.

상기의 결과로부터, 일정 농도 이상의 Aβ로 처리된 뉴런 및 내피질 세포에서의 ATG12와 ATG5의 결합이 증가함이 확인되었다. 따라서 Aβ가 세포에서 ATG5와 ATG12의 결합을 유도함을 확인할 수 있었다.

[실시예 2]

AD 세포모델 및 치매환자 혈장에서 ATG5의 발현 정도 확인

본 실시예에서는 Aβ를 처리한 HUVEC 및 AD 환자의 혈장에서 ATG5의 발현 정도를 측정하였다.

[실시예 2-1]

세포 조건 배지(cell-conditioned media)에서 ATG5의 분비 정도 확인

본 실시예에서는 Aβ로 처리된 세포로부터 ATG5 및 ATG12가 조건 배지로 분비되는지 여부를 확인하고자 하였다.

HUVEC에 24시간 동안 0~10μM Aβ_1-40을 처리한 후, western blotting을 수행하였다.

그 결과는 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, Aβ를 처리한 조건 배지의 ATG5 수치가 증가하였고, Aβ의 처리량이 많을수록 ATG5의 분비도 증가하는 경향을 나타내었다. 이에 반해 western blot 분석 결과, 조건 배지에서 ATG12 밴드는 확인할 수 없었다.

[실시예 2-2]

인간 혈장에서 ATG5의 발현 정도 확인

본 실시예에서는 AD 환자의 혈장에서 ATG5의 농도를 확인하고자 하였다.

AD 환자 및 건강한 대조군 기증자의 혈장을 채취하여 western blotting을 수행하였다.

그 결과는 도 2c 및 2d에 나타낸 바와 같이, 건강한 대조군에 비해 AD 환자에서 혈장 ATG5 수치가 증가한 것으로 확인되었다.

위 결과로부터, AD 환자에서는 ATG5의 발현 정도가 증가함을 확인하였다.

[실시예 3]

경도인지장애 및 치매환자의 혈장 내 ATG5의 농도 분석

ATG5 농도가 임상적으로 명백하게 치매와 관련이 있는지 확인하기 위해, 경도인지장애 (Mild Cognitive Impairment: MCI), 치매(Dementia) 환자 및 건강한 대조군의 혈장 내 ATG5 농도를 조사하였다. 본 실시예에서는 ATG12의 농도 역시 함께 조사하였다.

표 1은 모집단의 특성을 나타낸 것이다. 모든 값은 평균 ± SEM으로 나타내었다. 69명의 치매 환자 평균 연령은 75.3 ± 0.71, 82명의 MCI 환자 평균 연령은 73.59 ± 0.54, 대조군에 해당하는 127명의 건강한 기증자의 평균 연령은 72.0 ± 0.4세이다. 치매 환자(Dementia)의 75.3 %, 경도인지장애 환자(MCI)의 58.5 %, 대조군의 59 %가 여자이다.

혈장 내 ATG5 및 ATG12 농도의 분석을 위해 sensitive ELISA(효소면역측정법)을 사용하였다. 모든 혈장 샘플은 표본화되어 블라인드 상태에서 분석 전까지 -80 °C에 저장되었다. ATG5 및 ATG12의 농도는 효소-연결 면역 흡착 분석 키트의 제조업체 지침에 따라(USCN, Wuhan, China) 측정하였다.

Kruskal-Wallis 검사 결과, 혈장 내 ATG12 및 ATG5 농도는 치매(Dementia) 환자, 경도인지장애(MCI) 환자 및 대조군 사이에 유의한 차이를 나타냈다. 그 결과를 표 1에 나타내었다 (p = 0.019, p = 0.023). 모든 값은 평균 ± SEM 로 나타내었다. 혈장 ATG12 농도는 MCI(17.2 ± 0.61ng/mL) 환자가 대조군(19.85 ± 0.62ng/mL)보다 낮았다. Mann-Whitney U-test에 따를 때, ATG5의 혈장 농도는 대조군 (129.0 ± 4.1 ng / mL)과 비교하여 MCI (152.9 ± 6.9 ng / mL) 또는 치매 (149.3 ± 7.5 ng / mL) 환자에서 유의하게 상승 하였다. 도 3은 표 2의 데이터 중 ATG5 수치를 그래프로 나타낸 것이다.

위 결과로부터 ATG5 농도는 경도인지장애(MCI) 및 치매(Dementia) 환자에서 증가함이 확인되었고, 이로부터 인간 혈액에서 ATG5는 경도인지장애 및 알츠하이머 치매의 진단에 유용한 바이오마커가 될 수 있음이 확인되었다.

[실험 방법]

1. 피실험자

피실험자의 치매 및 MCI 진단은 Korean version of Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD-K) 신경 심리 검사에 의해 이루어졌으며, 모든 참가자는 발표된 지침에 따라 임상적으로 평가되었다. 각 치매 환자는 정신 장애의 진단 및 통계 매뉴얼 제 4 판의 기준을 충족하였다. 모든 치매 환자는 Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA)에 의해 확립된 AD 기준을 충족하였다. MCI의 진단은 Mayo Clinic 기준에 근거하였다. 총 278명의 피실험자로부터 혈액샘플을 채취하였다. 글로벌 임상 치매 등급 (CDR) 점수는 정상의 경우 0, 중등도의 치매의 경우 2 또는 3이다. 모든 참가자에게서 서면 동의를 받았고, 연구는 질병관리본부의 기관심사위원회(IRB)의 승인을 받았다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.

2. 세포 배양

인간 제대혈 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 Lonza (Walkersville, MD, USA)로부터 구입하여 Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) -MV BulletKit (Lonza)에서 배양하였다. 실험을 위한 HUVEC는 passages 5 내지 9에서 사용되었다. 인간 iPSC 유래 신경 전구체 줄기 세포는 Axol Bioscience (Little Chesterford, UK)에서 구입하여 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 대뇌 피질 뉴런으로 분화시켰다. 배아 쥐 뇌의 피질로부터 수득한 primary rat cortical neurons을 B27 (Invitrogen)이 보충된 neurobasal 배지에 유지시켰다.

3. 항체 및 시약

anti-ATG5 및 anti-ATG12는 Cell Signaling Technology (MA, USA)에서 구입하였고 anti-tubulin은 Millipore (MA, USA)에서 구입하였다. 합성 Aβ_1-40 펩티드 (Invitrogen, Camarillo, CA, USA)를 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (Sigma, Saint Louis, MO, USA)에 용해시키고 이어서 동결 건조시켰다. 동결 건조된 펩티드는 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 재용해시켜 사용하였다.

4. 동물 실험

모든 동물 실험은 질병관리본부의 실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침을 준수하여 수행되었으며, KCDC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다.

5. ELISA에 의한 자식작용 마커의 측정

모든 세포가 없는 혈장 시료를 채취하였고, 환자군에 대해 알지 못하는 조사자가 ATG5 및 ATG12에 대해 함께 분석할 때까지, 상기 시료를 -80 °C에서 저장시켰다. ATG5 및 ATG12의 농도를 제조사의 지시서(USCN, Wuhan, China)에 따라 ELISA를 통해 측정하였다.

6. Western blotting

Western blotting은 다음과 같이 수행되었다. 세포 및 마우스 피질 영역을 방사성 면역 침전 분석 완충액(RIPA buffer; 20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM Na₃VO₄, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.2 mM PMSF, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate)에 용해시키고, Bradford protein assay를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 양의 용해물을 MES SDS 버퍼(Life technology, NY, USA) 중의 bolt 4 ~ 12 % Bis-Tris 구배 겔로 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (Millipore, Billerica, MA)으로 옮기고, 실온에서 5 % 탈지분유로 1시간 동안 블로킹하였다. 막을 anti-ATG5(1:1,000), anti-ATG12(1:1,000), anti-튜불린(1:10,000)과 인큐베이션시켰다.

7. 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction)

실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(Real-time reverse transcription polymerase chain reaction)은 다음과 같이 수행되었다. SYBR Green two-step qRT-PCR 키트 (Applied Biosystems, Warrington, UK)를 사용하여 Real-time quantitative RT-PCR 분석을 수행하였다. PCR 단편을 95 ℃에서 10 분 동안 증폭시킨 후, 95 ℃에서 15 초 동안 및 58 ℃에서 1 분 동안 40 회 사이클로 증폭시켰다. 다음과 같은 프라이머가 사용되었다.

ATG5 sense 5'-GGCCATCAATCGGAAACTCA-3' and antisense 5'-ACAGGACGAAACAGCTTCTG-3

ATG12 sense 5'-TGTGTTGCAGCTTCCTACTTCA-3' and antisense 5'-TCAATGAGTCCTTGGATGGTTC-3

p62 sense 5'-TCCAGTCCCTACAGATGCCA-3' and antisense 5'-GAGAGGGACTCAATCAGCCG-3

LC3A sense 5'-CGCTACAAGGGTGAGAAGCA-3' and antisense 5'-TTCACCAGCAGGAAGAAGGC-3'.

RT-qPCR 분석은 QuantStudio 6 Felx Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, Warrington, UK)에서 수행되었다. 대조군 및 샘플의 Ct 값을 계산하고 전사 수준을 2^-ΔΔCt 방법으로 분석하여 기준 유전자 수준으로 정규화 하였다. 모든 RT-qPCR 반응을 3 회 수행하였다.

8. 통계적 분석

모든 통계 분석 결과는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타내었다. 본 연구의 통계적 분석은 SPSS 12.0 (IBM, NY, USA)을 사용하여 수행되었다. p <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

Claims

환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 ATG5 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 단백질 발현 수준을 정상 대조군 시료로부터 측정된 수준과 비교하는 단계
를 포함하는, 경도인지장애 또는 치매의 진단 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 생물학적 시료에서 측정한 ATG5 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서 측정한 수준보다 높은 경우, 경도인지장애 또는 치매로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 진단 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침강법, 면역침강법, 면역형광법, 질량분석법, 단백질 칩, DNA 칩, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 샌드위치 분석법(sandwich assay), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 및 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 진단 정보 제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머 치매인 것을 특징으로 하는, 진단 정보 제공 방법.
시료 중 ATG5 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 경도인지장애 또는 치매의 진단용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머, 또는 리간드인 것을 특징으로 하는 것인, 진단용 조성물.