KR102288597B1 - 자가포식소체 검출용 탐침 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자가포식소체 검출용 탐침에 관한 것으로, 구체적으로, 살아있는 세포에서 자가포식소체의 LC3A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 또는 GABARAPL2를 특이적으로 검출함으로써 자가포식을 모니터링할 수 있는 새로운 탐침 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 자가포식소체 검출용 탐침은 ATG13의 LC3-상호작용 모티프 (LIR) 부위 및 ApPDE4 (Aplysia phosphodiesterase 4)의 소수성 도메인 HyD 부위를 포함하며, LIR가 자가포식소체의 LC3A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 및 GABARAPL2를 특이적으로 검출할 수 있으며, HyD가 자가포식소체의 막과의 결합력을 향상시킬 수 있으므로, 이를 자가포식소체 검출에 용이하게 이용할 수 있다.

Description

자가포식소체 검출용 탐침 및 이의 용도{A PROBE FOR DETECTING AUTOPHAGOSOME AND USES THEREOF}
본 발명은 자가포식소체를 특이적 및 안정적으로 검출할 수 있는 탐침에 대한 것으로, 구체적으로는 살아있는 세포에서 자가포식소체의 LC3A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 또는 GABARAPL2를 특이적으로 검출 가능하여 자가포식을 특이적으로 모니터링할 수 있는 새로운 탐침과 이의 용도에 관한 것이다.
자가포식(autophagy) 작용은 진화적으로 보존된 리소좀성 분해 경로 (lysosomal degradation pathway)로, 기아(starvation)와 같은 스트레스 상황, 다양한 생리학적 또는 병리학적 조건에 의해 자가포식소체(autophagosome)를 형성하여 오래된 단백질이나, 기능을 잃은 기관(organ) 또는 세포질 내의 구성물들을 제거하고, 병원체 감염 시에는 병원체를 제거하는 등 세포의 항상성을 유지하는 중요한 라이소좀 분해 작용이다 (Baehrecke, E.H., 2005; Yang & Klionsky, 2009; Yang & Klionsky, 2010). 자가포식이 활성화되면, 격리 멤브레인 또는 파고포어(phagophore)로도 알려진 프리오토파고조말 멤브레인(preautophagosomal membrane)이 응집되고 확장되어 이중막-결합된 구조를 이룬 자가포식소체(autophagosome)를 형성한다. 이와 같은 세포질 카고(cargo) 구성 요소들을 격리하는 자가포식소체는 자가포식의 형태학적 특징이다. 그 후, 자가포식소체는 성숙(maturation)을 위해 엔도좀과 융합되거나 세포의 분해를 위해 리소좀과 융합될 수 있다. 이와 같은 자가포식 과정은 여러 관련 단백질들 (AuTophaGy-related proteins)에 의해 조절되며, 이들은 자가포식 유발, 자가포식소체 형성/성숙 또는 이의 카고(cargo)의 분해에 작용한다 (Feng et al, 2014; Zhang & Baehrecke, 2015). 포유동물의 자가포식에 중요한 단백질들 중 LC3/GABARAP 패밀리들은 자가포식소체의 형성, 카고(cargo) 인식 및 카고의 자가포식소체 막으로의 유입(recruitment)과 관련되어있다 (Kalvari et al, 2014). 자가포식은 LC3 및 선택적 자가포식 수용체와의 결합을 통해 우선적으로 카고(cargo)를 선택하는 것이 밝혀졌다 (Birgisdottir et al, 2013; Kalvari et al, 2014).
초기에 자가포식은 자가-소화를 통한 영양분을 제공하여 기아 동안에 세포를 보호하기 위한 방어 메카니즘의 한 종류로 알려져 있었으나, 세포 항상성, 분화 또는 대사 조절과 같은 다양한 생리학적 역할을 하는 것이 밝혀지고 있다 (Klionsky & Codogno, 2013). 최근, 다양한 동물모델 및 질병의 유전자 분석 연구를 통하여 자가포식과정이 당뇨, 고혈압등의 대사성 질환, 퇴행성 뇌질환, 감염성 질환, 그리고 암등의 매우 다양한 질환에서 중요한 역할을 하고 있음이 보고되었으며, 자가포식의 손상은 신경 퇴행성 질환, 리소좀 축적 장애, 간 질환, 일부 암, 근육 병증 및 특정 전염성 질환과 같은 많은 인간 질병에 강력하게 연관되어 있다고 밝혀졌다 (Jiang & Mizushima, 2014; Mizushima et al, 2008; Schneider & Cuervo, 2014). 특히, 자가포식현상이 저하될 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적이 초래되어 이로 인해 신경변성질환이 발생한다고 밝혀져 (Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884), 그 중요성이 부각되고 있다.
LC3/GABARAP 단백질들은 자가포식소체의 마커로 널리 이용되고 있으며, MAP1LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain) 패밀리 (MAP1LC3A [LC3A], MAP1LC3B [LC3B], MAP1LC3B2 [LC3B2] 및 MAP1LC3C [LC3C], 총괄하여 LC3로 불림) 및 GABA(γ-aminobutyric acid) 수용체-관련 단백질들 (GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2/GATE-16 및 GABARAPL3)을 포함한다 (Lee & Lee, 2016; Wild et al, 2014). 종래에는 자가포식소체 형성에 직접적으로 관여하는 LC3에 GFP 또는 RFP를 붙인 RFP-GFP-LC3를 자가포식소체 표지용으로 사용하였다. 그러나, LC3 자체가 자가포식소체 형성에 직접관여하기 때문에, LC3 과발현에 의한 GFP-LC3 양성 응집체 형성, 핵으로의 이동, 영양분의 존재하에도 기본 자가포식소체 수준이 증가하는 등의 다양한 부작용은 피할 수가 없는 문제점이 있어왔다. 또한, 일부 연구자들은 내재된 LC3를 항체로 검출하고자 하였으나, 항체 특이성이 낮거나 일부 조건하에서 특정 유형의 세포에서 검출이 어려운 문제점이 있었으며, 이 검출 방법의 더 중요한 한계는 살아있는 세포에서 내재성 LC3 양성 자가포식소체를 검출하고 추적하는 것이 불가능한 점이었다.
이에, 본 발명의 발명자들은 살아있는 세포에서 내재성 LC3/GABARAP-양성 자가포식소체를 특이적으로 검출 함으로써 자가포식을 특이적으로 모니터링할 수 있는 새로운 탐침을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서는 살아있는 세포에서 자가포식소체에 존재하는 LC3A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 또는 GABARAPL2와 특이적 및 안정적으로 결합하여 효율적으로 자가포식소체를 검출할 수 있는 새로운 탐침을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자가포식소체(autophagosome) 검출용 탐침을 제공한다.
또한, 본 발명은 자가포식(autophagy) 세포 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 자가포식소체 영상화용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, ATG13의 LC3-상호작용 모티프 (LIR)가 자가포식소체를 특이적으로 검출할 수 있으며, ApPDE4 (Aplysia phosphodiesterase 4)의 소수성 도메인 HyD가 자가포식소체의 막과의 결합력을 향상시킬 수 있으므로, ATG13의 LIR 부위 및 군소의 HyD 부위를 포함하는 펩타이드는 살아있는 세포에서 LC3A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 또는 GABARAPL2와 특이적 및 안정적으로 결합하여 효율적으로 자가포식소체를 검출 가능한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 자가포식소체 검출용 탐침이 자가포식소체에 결합하는 것을 나타낸 모식도이다:
HyD: 자가포식소체의 막에 결합하는 소수성 부위 (Aplysia의 phosphodiesterase 4 short-form N-말단의 20개 아미노산 서열 부분);
LIR: 자가포식소체의 LC3-Ⅱ (LC3 또는 GABARAP)에 결합하는 단백질 ATG13(Autophagy related gene 13)의 LIR(LC3-interacting region) 부위; 및
GFP: 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein).
도 2는 본 발명의 자가포식소체 검출용 탐침의 구조를 나타낸 도이다:
HyD: ApPDE4(Aplysia의 phosphodiesterase 4) short-form의 소수성 N-말단의 20개 아미노산 서열 부분;
LIR(ATG13): 자가포식소체의 LC3-Ⅱ (LC3 또는 GABARAP)에 결합하는 단백질 ATG13(Autophagy related gene 13)의 LIR(LC3-interacting region) 부위; 및
GFP: 녹색 형광 단백질.
도 3은 본 발명의 자가포식소체 검출용 탐침의 자가포식소체 마커와의 co-localization을 확인한 도이다:
HyD-LIR(ATG13)-GFP: 본 발명의 자가포식소체 검출용 탐침; 및
mRFP-LC3A, mRFP-LC3B, mRFP-LC3C, mRFP-GABARAP, mRFP-GABARAPL1 및 mRFP-GABARAPL2: 자가포식소체 특이적 마커인 LC3/GABARAP(LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 및 GABARAPL2)에 적색 형광 단백질이 표지된 단백질.
도 4는 본 발명의 탐침의 LC3/GABARAP(LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 및 GABARAPL2)-양성 자가포식소체로의 localization을 확인한 도이다.
도 5는 자가포식소체에서의 본 발명의 탐침의 검출 강도를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
일 측면에서, 본 발명은 ATG13(Autophagy related gene 13)의 LIR(LC3-interacting region) 부위 폴리펩타이드 및 ApPDE4(Aplysia phosphodiesterase 4) short-form의 N-말단 소수성 도메인을 포함하는 자가포식소체(autophagosome) 검출용 탐침에 관한 것이다.
일 구현예에서, ATG13의 LIR(LC3-interacting region) 부위는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, ApPDE4 short-form의 N-말단 소수성 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 탐침은 표지인자로 표지될 수 있으며, 상기 표지인자는 단백질 (본 발명의 탐침)에 공유 또는 비공유로 결합하여 특정 아미노산 서열의 존재 여부를 표지할 수 있는 물질로써 이에 한정되지 않지만 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuperparamagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 형광물질은 적색 또는 근적외선의 형광을 발광하는 것이라면 이에 한정되지 않지만, 바람직하게는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 알렉사, 보디피 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP) 또는 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 자가포식소체 검출용 탐침은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 전술한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명 폴리펩타이드의 변이체란 본 발명의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 경우에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 탐침의 LIR(LC3-interacting region) 부위는 자가포식소체의 LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 및 GABARAPL2에 특이적으로 결합할 수 있으며, HyD 부위 (Aplysia의 phosphodiesterase 4 short-form의 소수성 N-말단의 20개 아미노산 서열 부분)는 자가포식소체의 멤브레인에 결합하여 자가포식소체와 LIR의 결합을 안정적으로 유지시킬 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 발명자들의 이전 출원 특허 (출원번호 10-2016-0133372)에서 HyD-GFP는 자가포식소체에 위치하지 않았으며, HyD-LIR-GFP가 LIR-GFP보다 LC3 양성 자가포식소체에 효율적이고 안정적으로 위치하는 것을 확인함으로써, HyD 부위로 인해 LIR-GFP가 자가포식소체로 로컬라이제이션(localization)이 증가되는 것을 확인한 바 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 탐침은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 자가포식소체 검출용 탐침을 발현할 수 있는 발현 벡터일 수 있으며, ATG13(Autophagy related gene 13)의 LIR(LC3-interacting region) 부위를 암호화하는 핵산 및 ApPDE4(Aplysia phosphodiesterase 4) short-form의 N-말단 소수성 도메인을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고 GFP로 표지된 탐침을 발현하는 발현 벡터로 형질전환된 세포주에서 자가포식(autophagy) 유발시 자가포식소체 특이적 마커와 co-localization이 일어나는 것을 확인하였으므로, 이를 자가포식소체 검출용 탐침으로 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, 자가포식소체 특이적 "마커(marker)" 또는 "탐침(프로프)(probe)"이란 자가포식소체를 구분하여 검출할 수 있는 물질을 의미하며, 자가포식소체에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두 개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "벡터"라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환, 형질감염 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정"을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다. 그리고 외부 DNA 등이 도입된 세포 등을 '형질전환체'라고 한다.
일 측면에서, 본 발명은 자가포식소체 검출용 탐침을 포함하는 자가포식(autophagy) 세포 검출용 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 자가포식소체 검출용 탐침을 유효성분으로 포함하는 자가포식소체 영상화용 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 자가포식소체 검출용 탐침을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 세포주에 형질전환시키는 단계; 및 상기 탐침의 발현 정도를 형광 신호로 확인하는 단계를 포함하는 자기포식소체 세포 검출 또는 영상화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 탐침은 살아있는 세포에서 자가포식소체를 특이적으로 검출할 수 있어, 자가포식소체의 형성 여부를 통한 자가포식 작용 진행 정도를 분석하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 살아있는 세포에서 자가포식 과정을 실시간으로 검출 또는 영상화할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 자가포식소체 검출용 탐침을 포함하는 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease) 진단용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 자기포식-관련 질환은 퇴행성 신경질환, 암, 리소좀 축적 장애, 심근증, 노화, PCD(type II programmed cell death), 제2형 당뇨병 및 박테리아 감염증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 퇴생성 신경질환은 치매(dementia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 픽병(Pick's Disease) 및 파킨슨-ALS(amyotrophic lateral sclerosis)-치매 복합증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 암은 폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 부갑상선암, 식도암, 전립선암, 뇌암, 피부암, 골육종, 연부조직육종, 신경교종, 림프종, 비인두암, 후두암, 부신암, 결장암, 요관암, 담낭암, 방광암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 두경부암, 악성흑색종, 백혈병, 복합 골수종, 만성 골수성 백혈병, 신경아종 및 재생불량성 빈혈로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 영상화용 또는 진단용 조성물 내의 유효성분으로서의 본 발명의 탐침의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게 는 0.1 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 '고형분 중량'은 추출물 중 용매 성분을 제거하고 남은 성분의 중량을 말한다.
본 발명의 영상화용 또는 진단용 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 자가포식소체 검출용 탐침을 포함하는 자가포식-관련 질환(autophagy-related disease) 진단용 조성물을 생물시료에 투여하는 단계; 및 상기 탐침의 형광 강도를 측정하는 단계를 포함하는 자기포식 관련 질환의 진단에 정보를 제공하는 방법이 제공될 수 있다. 이 때, 탐침의 형광물질의 위치와 강도를 정상 시료와 비교하여 자가포식 작용에 의한 자가포식소체 형성 여부를 확인할 수 있다. 탐침의 형광 강도는 앞서 설명한 탐침에 포함된 형광물질로부터 발생하는 형광 또는 형광 세기를 통상의 방법(예컨대, 형광현미경, 형광분광기 등)으로 측정하여 수행될 수 있다. 상기 생물시료는 동물, 바람직하게는 포유류 (예컨대, 사람을 포함하는 영장류, 설치류)로부터 유래하는 것으로, 상기 동물의 생체 또는 생체로부터 분리된 조직 또는 세포일 수 있다. 또한, 상기 정상시료는 자기포식 관련 질환을 앓고 있지 않은 동물, 바람직하게는 포유류(예컨대, 사람을 포함하는 영장류, 설치류), 또는 이로부터 분리된 조직 또는 세포를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "자가포식 관련 질환"이란, 자가포식작용이 관여하여 유발되거나 또는 악화되는 질환을 의미한다. 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 악성종양, 신경퇴행성 질환, 허혈성 질환, 당뇨병, 폐섬유화증 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는, 유방암, 폐암, 섬유육종, 대장암 등의 악성종양; 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등의 신경퇴행성 질환; 협심증, 심근경색 (myocardiac infarction), 심부전(cardiac failure), 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증, 급성 허혈성 뇌졸중 등의 허혈성 질환; 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 등의 당뇨병, 폐섬유화증 등이 될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 그 중에서도 본 발명은 자가포식 관련 질환에 대한 정보를 제공하는 것에 유용하다. 본 발명에서는 자가포식소체 수의 증감 특성은 유용한 지표(진단 마커)로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 자가포식소체 검출용 탐침을 발현하는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 세포에 자가포식(autophagy) 작용을 유발하는 단계; 상기 탐침의 형광 신호를 분석하는 단계; 및 상기 후보 물질에 의해 자가포식소체 형성이 억제되는 경우에 상기 후보 물질은 자가포식 억제제로 판정하는 단계를 포함하는, 자가포식 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 후보 화합물은 각종 화합물, 단백질, 핵산 등을 모두 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 자가포식소체 검출용 탐침을 발현하는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 탐침의 형광 신호를 분석하는 단계; 상기 후보 물질에 의해 자가포식소체가 형성되는 경우에 상기 후보 물질은 자가포식 활성제로 판정하는 단계를 포함하는, 자가포식 활성제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 후보 화합물은 각종 화합물, 단백질, 핵산 등을 모두 포함할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 자가포식소체 특이적 탐침 HyD - LIR ( ATG13 )-GFP 제조
자가포식소체에 더욱 안정적으로 결합시켜 검출 효율을 높이기 위해, 자가포식소체 LC3/GABARAP에 결합하는 단백질 ATG13(Autophagy related gene 13)의 LIR(LC3-interacting region)에 자가포식소체의 막에 결합하는 HyD(hydrophobic domain)을 추가하여 자가포식소체 검출용 탐침을 제조하였다 (도 1).
구체적으로, 군소(Aplysia)의 phosphodiesterase 4 (ApPDE4) short-form의 소수성 도메인인 N-말단의 20개 아미노산 부위 (HyD) (서열번호 4)를 암호화하는 뉴클레오티드를 하기 표 1의 서열번호 2 및 3의 프라이머쌍을 이용하여 PCR로 증폭한 뒤, 제한효소 NheI 및 HindⅢ로 절단하여 pGFP-N3 벡터로 삽입하여 pGFP-N3-HyD를 제작하였다. 또한, 하기 표 1의 서열번호 5 내지 7의 프라이머를 이용하여 ATG13의 LIR 모티프 (서열번호 8)를 암호화하는 유전자 부위를 증폭한 뒤, 제한효소 HindⅢ 및 KpnI로 절단하고 pGFP-N3-HyD 벡터로 삽입하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에 GFP가 표지된 자가포식소체 특이적 탐침 HyD-LIR(ATG13)-GFP를 제작하였다 (도 2).
서열 (5' -> 3') 서열명칭
서열번호 2 CTAGGGCTAGCGCCACCATGCAGAAGCTGAATTTC HyD 정방향 프라이머
서열번호 3 CGCCCAAGCTTACCGTCGCGGTTTTTCCC HyD 역방향 프라이머
서열번호 4 MQKLNFLSPLFNKNGKNRDG HyD 아미노산 서열
서열번호 5 AATACCCATGATGACTTTGTTATCATAGACTTTAAACCAGCTT ATG13 정방향 프라이머 1
서열번호 6 CGCCCAAGCTTGGGGGCAGCAGTGGCAATACCCATGATGACTTT ATG13 정방향 프라이머 2
서열번호 7 GACGGTACCAATGTCATCTTTAGAAAAAGCTGGTTTAAAGTCTA ATG13 역방향 프라이머
서열번호 8 GGSSGNTHDDFVMIDFKPAFSKDDI ATG13의 LIR 모티프
실시예 2. 자가포식소체 특이성 검증용 mRFP -LC3/ GABARAP 패밀리 벡터 제작
mRFP(spectral variants monomeric red fluorescent protein)는 하기 표 2의 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 증폭한 뒤, 제한효소 BamHI 및 NotI로 절단하여 pGFP-C3 벡터의 GFP 위치에 삽입하여 pmRFP-C3 벡터를 제작하였다. 그 후, pmRFP-C3 벡터를 제한효소 NheI 및 HindⅢ로 절단한 뒤 pcDNA3.1 벡터에 삽입하여 pcDNA3.1-mRFP를 제작하였다.
또한, 자가포식소체 형성에 연관된 GABARAP 및 GABARAPL2를 PCR로 증폭한 뒤 제한효소 HindⅢ 및 SalI로 절단하여 pmRFP-C3 벡터로 삽입하였다. 동일한 방법으로 LC3A, LC3C 및 GABARAPL1도 증폭한 뒤, 제한효소 BamH1 및 NotI로 절단하여 pcDNA3.1-mRFP 벡터로 삽입하였다. 그 결과, 자가포식소체 특이적 마커인 mRFP-LC3A, mRFP-LC3B, mRFP-LC3C, mRFP-GABARAP, mRFP-GABARAPL1 및 mRFP-GABARAPL2를 제작하였다.
서열 (5' -> 3') 서열명칭
서열번호 9 CGCGGATCCATGGCCTCCTCCGAGGAC pmRFP-N3용 mRFP 정방향 프라이머
서열번호 10 ATAAGAATGCGGCCGCTTAGGCGCCGGTGGAGTG pmRFP-N3용 mRFP 역방향 프라이머
실시예 3. HyD - LIR ( ATG13 )-GFP 의 자가포식소체 검출 확인
3-1. HyD - LIR ( ATG13 )-GFP 및 자가포식소체 마커의 co-localization 확인
본 발명의 자가포식소체 특이적 탐침인 HyD-LIR(ATG13)-GFP의 자가포식소체 검출 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1 및 2의 벡터들로 MEF 세포주를 형질전환한 뒤, 자가포식(autophagy)을 유발하여 LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 및 GABARAPL2와 HyD-LIR(ATG13)-GFP의 co-local을 형광 이미지로 확인하고 정량하였다.
구체적으로, MEFs(mouse embryonic fibroblast) 세포주를 10% (v/v)의 우태아혈청 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)로 5% CO2 및 37℃의 조건으로 배양하였다. 그 후, 상기 실시예 1 및 2에서 제작한 HyD-LIR(ATG13)-GFP와 mRFP-LC3A, mRFP-LC3B, mRFP-LC3C, mRFP-GABARAP, mRFP-GABARAPL1 또는 mRFP-GABARAPL2를 Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)으로 상기 MEFs에 함께 트랜스펙션하고 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 자가포식작용을 유발하기 위하여, 상기 인큐베이션한 MEFs에 100 nM의 라파마이신(rapamycin) 및 10mM의 NH4Cl (리소좀에 의한 분해(lysosomal degradation)를 억제)을 처리하고 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 37℃의 5% (v/v) CO2 인큐베이터 내에서 살아있는 상태의 세포들 중 최소 20개의 세포를 랜덤으로 선택하여 형광 이미지를 공초점 레이저 현미경(confocal laser-scanning microscope)을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 자가포식소체 특이적 탐침 HyD-LIR(ATG13)-GFP가 자가포식소체 마커인 mRFP-LC3A, mRFP-LC3B, mRFP-LC3C, mRFP-GABARAP, mRFP-GABARAPL1 및 mRFP-GABARAPL2와 co-localization된 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
3-2. HyD - LIR ( ATG13 )-GFP 및 자가포식소체 마커의 co-localization 정량
상기 실시예 3-1의 형광 이미지를 ZEN 이미징 소프트웨어 (Carl Zeiss)를 이용하여 두 채널에서의 세포 내 HyD-LIR(ATG13)-GFP 및 LC3/GABARAP-양성 자가포식소체 스팟을 분석하여 본 발명의 탐침과 자가포식소체 마커의 co-localization을 정량 분석하였다. 구체적으로, 탐침 양성 mRFP-LC3/GABARAP 스팟의 비율을 HyD-LIR(ATG13)-GFP-양성 스팟과 LC3/GABARAP-양성 스팟이 co-localization한 스팟의 수를 LC3/GABARAP-양성 스팟의 총 수로 나눠 계산함으로써 자가포식소체에 위치한 (localization) 본 발명의 탐침을 확인하였다 (표 3 및 도 4). 또한, 한 세포의 자가포식소체 및 세포질의 최소 5 부분에서 자가포식소체 또는 세포질에서의 형광 강도의 평균값을 측정하고, 랜덤하게 선택된 20개 이상의 세포에서의 A/C 비율을 정량함으로써 자가포식소체/세포기질 (A/C) 형광 강도 비율을 구해, 자가포식소체에서의 본 발명의 탐침의 검출 강도를 확인하였다 (표 3 및 도 5). 모든 통계 데이터는 GraphPad Prism 5 (GraphPad, Inc., La Jolla, CA, USA)를 이용하여 계산되고 그래프화하였다.

 Autophagosome/Cytosol ratio of the fluorescent intensity
(Sensor-positive mRFP-LC3 spots (ratio))
LIR protein LC3A LC3B LC3C GABARAP GABARAP-L1 GABARAP-L2
ATG13 4.89±0.26
(0.96±0.01) 		2.56 ±0.11
(0.86±0.01) 		5.09±0.25
(0.95±0.01) 		4.21±0.14
(0.98±0.00) 		4.88±0.22
(0.99±0.00) 		4.54±0.18
(0.99±0.00)
상기 결과를 통해, 본 발명의 자가포식소체 특이적 탐침 HyD-LIR(ATG13)-GFP가 자가포식소체 마커인 mRFP-LC3A, mRFP-LC3C, mRFP-GABARAP, mRFP-GABARAPL1 및 mRFP-GABARAPL2와 co-localization하는 비율이 mRFP-LC3B에 비해 현저해, 본 발명의 탐침이 LC3A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 및 GABARAPL2 양성 자가포식소체를 검출 가능함을 확인할 수 있었다 (도 4). 또한, HyD-LIR(ATG13)-GFP의 세포질과 자가포식소체에서의 형광 강도를 비교한 결과, LC3A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 또는 GABARAPL2 양성 자가포식소체와 강하게 결합 (co-local)하고 있어, LC3B 양성 자가포식소체에 비해 현저하게 검출 효과가 높음을 알 수 있었다 (도 5).
상기 실시예 결과를 통해, 본 발명의 HyD-LIR(ATG13)-GFP가 자가포식소체 특이적이며, 특히, LC3A, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 또는 GABARAPL2를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 자가포식소체 검출용 탐침으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A PROBE FOR DETECTING AUTOPHAGOSOME AND USES THEREOF <130> PN1704-159 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HyD-LIR(ATG13) amino acid sequence <400> 1 Met Gln Lys Leu Asn Phe Leu Ser Pro Leu Phe Asn Lys Asn Gly Lys 1 5 10 15 Asn Arg Asp Gly Lys Leu Gly Gly Ser Ser Gly Asn Thr His Asp Asp 20 25 30 Phe Val Met Ile Asp Phe Lys Pro Ala Phe Ser Lys Asp Asp Ile 35 40 45 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HyD forward primer <400> 2 ctagggctag cgccaccatg cagaagctga atttc 35 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HyD reverse primer <400> 3 cgcccaagct taccgtcgcg gtttttccc 29 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HyD amino acid sequence <400> 4 Met Gln Lys Leu Asn Phe Leu Ser Pro Leu Phe Asn Lys Asn Gly Lys 1 5 10 15 Asn Arg Asp Gly 20 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATG13 forward primer 1 <400> 5 aatacccatg atgactttgt tatcatagac tttaaaccag ctt 43 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATG13 forward primer 2 <400> 6 cgcccaagct tgggggcagc agtggcaata cccatgatga cttt 44 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATG13 reverse primer <400> 7 gacggtacca atgtcatctt tagaaaaagc tggtttaaag tcta 44 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ATG13 LIR motif <400> 8 Gly Gly Ser Ser Gly Asn Thr His Asp Asp Phe Val Met Ile Asp Phe 1 5 10 15 Lys Pro Ala Phe Ser Lys Asp Asp Ile 20 25 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRFP forward primer <400> 9 cgcggatcca tggcctcctc cgaggac 27 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRFP reverse primer <400> 10 ataagaatgc ggccgcttag gcgccggtgg agtg 34

Claims (12)

  1. ATG13(Autophagy related gene 13)의 LIR(LC3-interacting region) 부위 폴리펩타이드 및 ApPDE4(Aplysia phosphodiesterase 4) short-form의 N-말단 소수성 도메인을 포함하는 자가포식소체(autophagosome) 검출용 탐침.
  2. 제 1항에 있어서, ATG13의 LIR(LC3-interacting region) 부위는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 자가포식소체 검출용 탐침.
  3. 제 1항에 있어서, ApPDE4 short-form의 N-말단 소수성 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 자가포식소체 검출용 탐침.
  4. 제 1항에 있어서, 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuperparamagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 자가포식소체 검출용 탐침.
  5. 제 1항에 있어서, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP) 또는 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP)로 표지된 자가포식소체 검출용 탐침.
  6. 제 1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 자가포식소체 검출용 탐침.
  7. 제 1항의 자가포식소체 검출용 탐침을 포함하는 자가포식(autophagy) 세포 검출용 조성물.
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