CN106794222B - 使用p75ecd和/或p75诊断或治疗神经障碍的方法 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了一种治疗和/或预防神经病症的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的p75细胞外结构域(p75ECD)或其功能性片段、变体、类似物或衍生物。本文中还描述了一种用于在测试对象中进行阿尔茨海默病(AD)的诊断和/或预后的方法，所述方法包括将所述测试对象的生物样品中的p75ECD和/或p75FL浓度和/或p75ECD：p75FL的比率与从非痴呆对照对象获得的可比生物样品中的p75ECD和/或p75FL浓度和/或p75ECD：p75FL的比率进行比较。

Description

使用P75ECD和/或P75诊断或治疗神经障碍的方法
技术领域
本公开涉及神经障碍的诊断、检测和/或预后方法和/或神经障碍的治疗方法。在具体形式中，本公开涉及神经营养因子受体p75和/或其细胞外结构域的用途。
背景技术
神经营养因子是一小类通过复杂的信号转导途径起作用的分泌的神经营养性因子，其在神经系统中引起广范围的作用，包括参与神经发生、神经元存活、增殖、分化、髓鞘形成、轴突生长和突触可塑性，并且相反地，在神经元发育、成年生活、神经元损伤和疾病的所有阶段参与凋亡和细胞死亡。神经营养因子家族包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT3)和神经营养因子-4/5(NT4/5)。神经营养因子通过结合到至少三种不同类型的受体来介导它们的效应，即原肌球蛋白相关激酶(Trk)受体(TrkA、TrkB和TrkC)、分拣蛋白(sortilin)、以及p75神经营养因子受体(p75；同义词包括p75NTR、p75(NTR)、Gp80-LNGFR、低亲和性神经生长因子受体、低亲和性神经营养因子受体、NGF受体和肿瘤坏死因子受体超家族成员16前体(TNFRSF16))。神经营养因子的高亲和性结合常常涉及这些受体类型中的两类作为共受体相互作用。
取决于高亲和性神经营养因子Trk受体的相对表达水平，p75介导神经元的存活或凋亡。p75经历细胞外结构域(或胞外域)脱落，其中从全长蛋白切除p75的细胞外结构域(p75ECD)。p75ECD脱落在生理上受到肿瘤坏死因子-α转化酶(TACE)的调控，随后受到γ-分泌酶调控的膜内蛋白水解的调控。然而，p75脱落的生理和病理意义是未知的。p75脱落的调控和体内脱落后可扩散的p75ECD的功能尚未被确定。
神经营养因子水平和信号转导途径的改变与广泛的各种神经变性和精神障碍以及神经元损伤例如脊髓损伤中的神经元存活和病理生理学相关，所述神经变性和精神障碍包括阿尔茨海默病(AD)、脑淀粉样血管病(CAA)、亨廷顿病(Huntington's Disease)、帕金森氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和tau蛋白病；但是尚未显示任何人类疾病直接由神经营养因子或它们的受体的缺陷引起。
AD是最常见的痴呆症形式，在全世界有约2千4百万人患有这种疾病。AD的特征在于渐进性的认知退化，包括记忆丧失、进行日常生活活动的能力降低和神经精神症状或行为变化。在病理学上，AD患者的脑的特征在于在正常脑中看不到的“神经原纤维缠结”(NFT)和“淀粉样斑块”。AD中的淀粉样斑块由错误折叠和有毒的淀粉样肽-β(Aβ)蛋白在大脑皮质和海马中的积累形成。Aβ是淀粉样肽前体蛋白(APP)的代谢产物，并且在正常脑中，通过Aβ生产和清除之间的平衡来维持Aβ的稳态水平。在AD患者中失去了这种平衡。有趣的是，已发现Aβ肽是p75的配体，并且它可以激活信号转导级联。已提出p75介导Aβ诱导的神经毒性。
脑淀粉样血管病(CAA)正被越来越多地认为是老年人中自发性脑内出血(ICH)和认知缺损的重要原因。它的特征在于Aβ在大脑皮质和软脑膜中的小至中等尺寸血管的壁中的渐进性沉积，引起血管性痴呆。它偏好后皮质区，然后是额颞叶和顶叶。CAA也可以影响小脑血管，但仅仅很少地影响脑干或基底核中的血管。CAA和AD是不同的病症。然而，4项基于群体的尸检研究的系统性综述指出，在非痴呆患者中CAA患病率为28–38％，在具有痴呆的患者中为55–69％(Keage等，2009)。在82–98％的AD病例中存在CAA，尽管仅在25％的AD病例中看到严重CAA(Charidimou等，2012；Jellinger，2002)。
Tau蛋白病是一类多样化的神经变性疾病，其特征在于tau蛋白在脑中的病理性聚集。Tau蛋白是一种微管结合蛋白(MAP)，其在正常个体中与微管蛋白相互作用以使轴突微管稳定并促进微管蛋白组装成微管。Tau蛋白在中枢神经系统的神经元中丰富并在其他地方较为少见，但是也以非常低的水平表达在CNS星形胶质细胞和少突胶质细胞中。当tau蛋白变得有缺陷并且不再正确地使微管稳定时，可以引起tau蛋白病。这可以引起神经原纤维缠结(NFT)的细胞内积累和形成。Tau蛋白是一种磷蛋白，在最长的tau蛋白同工型上具有多达79个潜在的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点。已报道在正常的tau蛋白中，在这些位点中的约30个上发生磷酸化；然而，超磷酸化伴有NFT的自组装。
NFT可以在多种tau蛋白病中观察到，包括AD、进行性核上性麻痹、拳击手痴呆(慢性创伤性脑病)、额颞叶痴呆和与17号染色体连锁的帕金森症、Lytico-Bodig病(关岛帕金森-痴呆合并症)、缠结优势型痴呆(其具有与AD类似的NFT，但是没有斑块)、神经节胶质细胞瘤和神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、亨廷顿病等。AD患者可能具有不同程度的NFT参与；然而，NFT可能存在于未患有AD的患者中。因此，tau蛋白病是AD的不同组分，其不伴有淀粉样斑块。
正如在本文中公开的，p75ECD已被有利地认识到是一种神经保护因子，其可用于诊断、预防或治疗神经障碍和/或保护神经元免于凋亡和神经变性。此外，有利的是，全长p75(p75FL)的作用可以另外或可选地用于诊断神经障碍，和/或可以靶向该因子以预防或治疗神经障碍和/或保护神经元免于凋亡和神经变性。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种在测试对象中进行阿尔茨海默病(AD)的诊断和/或预后的方法，所述方法包括：
(a)从所述测试对象获得生物样品，
(b)测量所述测试对象的所述生物样品中p75细胞外结构域(p75ECD)和/或全长p75(P75FL)的浓度，以及
(c)将所述测试对象的所述生物样品中p75ECD和/或p75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率与从非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象获得的可比生物样品中p75ECD和/或p75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率进行比较，
其中当所述测试对象中p75ECD和/或p75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象中p75ECD和/或p75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率相比发生改变时，阿尔茨海默病被诊断和/或预后。
在一个实施方式中，所述方法包括：
(a)从所述测试对象获得生物样品，
(b)测量所述测试对象的所述生物样品中p75细胞外结构域(p75ECD)的浓度，以及
(c)将所述测试对象的所述生物样品中p75ECD的浓度与从非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象获得的可比生物样品中p75ECD的浓度进行比较，
其中当所述测试对象中p75ECD的浓度与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比降低时，阿尔茨海默病被诊断和/或预后。
在一个实施方式中，所述方法包括：
(a)从所述测试对象获得生物样品，
(b)测量所述测试对象的所述生物样品中p75ECD和p75FL的浓度，以及
(c)将所述测试对象的所述生物样品中p75ECD和p75FL的浓度与从非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象获得的可比生物样品中p75ECD和p75FL的浓度进行比较，
其中当所述测试对象中p75ECD：p75FL的比率与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比降低时，阿尔茨海默病被诊断和/或预后。
在一个实施方式中，所述方法包括：
(a)从所述测试对象获得生物样品，
(b)测量所述测试对象的所述生物样品中p75FL的浓度，以及
(c)将所述测试对象的所述生物样品中p75FL的浓度与从非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象获得的可比生物样品中p75FL的浓度进行比较，
其中当所述测试对象中p75FL的浓度与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比提高时，阿尔茨海默病被诊断和/或预后。
根据本公开的另一方面，提供了一种治疗和/或预防脑淀粉样血管病(CAA)或tau蛋白病的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的p75细胞外结构域(p75ECD)或其功能性片段、变体、类似物或衍生物。
在本公开的另一方面中，提供了一种保护神经元以抵抗由神经毒性因子例如Aβ引起的凋亡和/或神经变性的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的p75ECD或其功能性片段、变体、类似物或衍生物。
在一个实施方式中，所述p75ECD或其功能性片段、变体、类似物或衍生物是p75ECD。在一个实施方式中，所述p75ECD具有由SEQ ID NO：4提供的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述p75ECD是p75ECD-Fc融合体。在一个实施方式中，所述p75ECD-Fc具有由SEQID NO：6提供的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述p75ECD-Fc融合体作为p75ECD-Fc融合体腺相关病毒(AAV)载体给药。在一个实施方式中，所述p75ECD-Fc融合体是重组肽。在一个实施方式中，所述p75ECD通过腹膜内、脑室内、颅内或肌内注射来给药。
在一个实施方式中，所述对象是人类。
附图说明
图1提供了AAV-p75ECD-Fc载体构建和表征，其中：(a)示出了AAV-GFP载体设计的质粒图，(b)示出了AAV-GFP和AAV-p75ECD-Fc制备物的纯度和均质性的SDS-PAGE分析，(c)示出了AAV-p75ECD-Fc载体设计的质粒图；
图2提供了中枢神经系统中p75ECD的生理水平的证据，具体来说：(a)不同月龄的Wt小鼠的全脑匀浆物的TBS级分中p75ECD的ELISA分析的图示(mon＝月；n＝7)，(b)1月龄和12月龄Wt小鼠的不同脑区中的p75ECD水平(n＝5，平均值±s.e.m.，Student’s t-检验，**P<0.01)，(c)12月龄Wt小鼠的不同脑区中p75FL和p75ECD的Western印迹分析；
图3提供了(a)在阿尔茨海默病(AD)患者和年龄匹配的非痴呆对照(ND)中，通过ELISA获得的人类脑脊液(CSF)中p75ECD的水平的图示(对于AD来说n＝29，对于ND来说n＝27，平均值±s.e.m.，Student’s t-检验，**P<0.01)，(b)人类AD和ND脑组织中全长p75(p75FL)和p75ECD的Western印迹分析，(c)(b)中示出的p75FL和p75ECD的Western印迹条带密度的定量分析，(d)(b)中示出的p75ECD/p75FL Western印迹条带密度的比率(对于AD来说n＝12，对于ND来说n＝12，平均值±s.e.m.，Student’s t-检验，*P<0.05，**P<0.01)；(e)在12月龄AD小鼠(Tg)和野生型同窝仔畜(Wt)的脑匀浆物的Tris缓冲盐水(TBS)级分中，通过ELISA获得的p75ECD的水平的图示(对于Tg来说n＝13，对于Wt来说n＝14，平均值±s.e.m.，Student’s t-检验，**P<0.01)，(f)来自于12月龄Tg和Wt小鼠的脑组织中全长p75(p75FL)的Western印迹分析，(g)(f)中示出的p75FL和p75ECD的Western印迹条带密度的定量分析，以及(h)(f)中示出的p75ECD/p75FL Western印迹条带密度的比率(对于Tg来说n＝13，对于Wt来说n＝14，平均值±s.e.m.，Student’s t-检验，*P<0.05，**P<0.01)；
图4提供了下列图示：(a)在3月龄AD小鼠的左侧脑室中脑室内注射AAV-ECD-Fc或AAV-GFP后，在注射后1周(1w)、2周(2w)、3周(3w)和9个月(9m)时通过AD小鼠脑匀浆物的TBS级分中p75ECD的ELISA分析所分析的ECD-FC的表达水平(对于1w、2w和3w来说每组n＝5，对于9m组来说n＝8)，以及(b)在3月龄时在左侧脑室中脑室内注射AAV-ECD-Fc或AAV-GFP后，通过p75ECD的ELISA分析所分析的12月龄AD小鼠的TBS级分中p75ECD的表达水平与12月龄Wt小鼠的比较(对于注射过AAV-GFP或AAV-ECD-Fc的12月龄Tg小鼠来说n＝8，对于wt小鼠来说n＝13)；平均值±s.e.m.，ANOVA，Tukey试验，**P<0.01)；
图5提供了在Morris水迷宫分析中12月龄小鼠的行为分析的图示，所述小鼠包括Wt同窝仔畜(Wt，n＝16)、未治疗的AD小鼠(Tg，n＝15)、作为对照的在3月龄或9月龄时用AAV-GFP注射的AD小鼠(Con，n＝14)、在9月龄时用AAV-ECD-Fc注射进行治疗的AD小鼠(Tre，n＝12)和在3月龄时用AAV-ECD-Fc注射进行预防的AD小鼠(Pre，n＝11)，显示出(a)平台试验期间的潜伏期(秒)，(b)在训练的最后一天行进的距离(厘米)，(平均值±s.e.m.，ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，**P<0.01，与Con相比)，以及(c)代表性的自主活动跟踪图；在第5天进行的探索试验显示出(d)穿越被移除的平台环形区的次数，以及(e)在平台所处的象限中行进的距离(平均值±s.e.m.；单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，**P<0.01，与Con相比)，以及(f)代表性的自主活动跟踪图；Y-迷宫分析显示出自发交替试验中(g)臂的交替和(h)进入次数，以及新臂试验中的(i)进入次数和(j)时间(平均值±s.e.m.；单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，**P<0.01，与Con相比；#P<0.05，##P<0.01，与Wt相比)；旷场分析显示出(k)竖立次数，(l)行进距离(厘米)，和(m)代表性的自主活动训练图(平均值±s.e.m.；单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，与Con相比)；
图6提供了在作为对照的在3或9月龄时用AAV-GFP注射的12月龄AD小鼠(Con，n＝7-9)、在9月龄时用AAV-ECD-Fc注射进行治疗的AD小鼠(Tre，n＝8-9)和在3月龄时用AAV-ECD-Fc注射进行预防的AD小鼠(Pre)中，通过ImageJ软件定量的每只动物在横跨整个脑的5个等间隔切片中海马(HC)和新皮质(NC)中的Aβ斑块的面积分数、密度和尺寸的分析，显示了(a)使用刚果红染色可视化的Aβ斑块沉积(标尺条＝1mm)；组之间刚果红染色的斑块的(b，左图)面积分数、(b，中图)斑块密度和(b，右图)尺寸的比较；(c)用抗体6E10免疫组织化学染色的Aβ斑块(标尺条＝1mm)；组之间6E10染色的斑块的(d，左图)面积分数、(d，中图)斑块密度和(d，右图)尺寸的比较(对于(a)-(d)来说，对于Con来说n＝11，对于Tre来说n＝9，对于Pre来说n＝8，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，**P<0.01，与Con相比)；(e-i)脑匀浆物和(e-ii)血清的TBS、SDS和甲酸(FA)级分中Aβ40、Aβ42和总Aβ的ELISA分析(对于脑匀浆物来说，对于Con来说n＝11，对于Tre来说n＝9，对于Pre来说n＝8；对于血清来说，对于Con来说n＝14，对于Tre来说n＝12，对于Pre来说n＝11，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，**P<0.01，与Con相比)；(f)显微照片，示出了通过刚果红染色可视化的脑淀粉样血管病(CAA)(标尺条＝1mm)，(g)Con、Tre和Pre组之间CAA特性的比较(n＝8，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，**P<0.01，与Con相比)；(h)Con、Tre和Pre组之间脑微出血的数目的比较(n＝8，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，**P<0.01，与Con相比)；(i)显微照片，示出了APP/PS1转基因AD小鼠中Aβ斑块和ECD-Fc的共定位(标尺条：200μm(黑色)，40μm(白色)，*指示ECD-Fc与淀粉样肽-β斑块的共定位；#指示神经元中的ECD-Fc表达)；
图7提供了来自于作为对照的在9月龄时用AAV-GFP注射的AD小鼠(Con)、在9月龄时用AAV-ECD-Fc注射进行治疗的AD小鼠(Tre)和在3月龄时用AAV-ECD-Fc注射进行预防的AD小鼠(Pre)的结果，其中：(a)显微照片，示出了使用(上图)抗MAP-2抗体和抗NeuN抗体免疫荧光或(下图)抗胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗体免疫组织化学检测的神经元和树突的总体保存的结构(对于Con来说n＝11，对于Tre来说n＝9，对于Pre来说n＝8，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，**P<0.01，与Con相比，标尺条＝100μm)，其被定量(a-i，a-ii，a-iii，a-iv)；(b)显微照片，示出了使用活化的半胱天冬酶-3(cas-3)通过免疫荧光(标尺条＝50μm，上图)或使用TUNEL染色(标尺条＝250μm，下图)检测的神经元凋亡，其被定量(b-i，b-ii，b-iii，b-iv)(对于Con来说n＝11，对于Tre来说n＝9，对于Pre来说n＝8，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，**P<0.01，与Con相比)；(c-i)显微照片，示出了使用CA1锥体神经元(左侧)和不同树突棘(右侧)的代表性高尔基染色的图像进行棘的高尔基染色分析(标尺条＝10μm，n＝3，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，与Con相比)，(c-ii)每μm的棘的定量分析；(c-iii)突触相关蛋白(包括SNAP25和PSD95)的Western印迹，(c-iv)(c-iii)中的数据的定量分析，(c-v)突触蛋白I(Syn I)、VAMP1、突触小泡蛋白(SYP)的Western印迹，以及(c-vi)(g)中的数据的相应定量(n＝8，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，**P<0.01，与Con相比)；(d-i)使用pSer396免疫染色的Tau磷酸化的显微照片(标尺条＝200μm)，(d-ii)使用抗pS396、pT231、pS262和pS199抗体的Tau磷酸化的Western印迹分析(n＝8，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，*P<0.05，**P<0.01，与Con相比)，其结果被定量(d-iii)，以及在每个组中每种(d-iv)抗ps396抗体、(d-v)抗pT231抗体、(d-vi)抗pS262抗体、(d-viii)抗ps199抗体的相对结合强度；(e)用抗MAP-2抗体和DAPI免疫荧光染色的培养的原代小鼠皮质神经元的神经突生长分析的显微照片(n＝35，平均值±s.e.m.，ANOVA，Tukey’s检验，**P<0.01，与Aβ42scr.相比，#P<0.05，与Aβ42相比，标尺条＝50μm)，其被定量(f)；(g)描绘了p75FL和p75ECD在AD发病机理中的作用的流程图；
图8提供了(a)(左侧)Western印迹结果，并且来自于在视黄酸中分化三天然后用5uM Aβ和指明的试剂处理后的SHSY5Y细胞，(右侧)pTau262：总Tau蛋白的比率的定量，显示出ECD-Fc逆转了由Aβ诱导的Tau蛋白过磷酸化(n＝3，平均值±s.e.m.，单向ANOVA，Tukey’s检验，**P<0.01，与对照相比；##P<0.01，与Aβ42相比)，(b)重组p75ECD-Fc对由Aβ诱导的Tau蛋白过磷酸化的浓度依赖性抑制效应的(左侧)Western印迹分析和(右侧)定量(n＝5，平均值±s.e.m.)，以及(c)(左侧)Western印迹分析，并且显示出第9位丝氨酸处的GSK3β磷酸化，(右侧)随着p75ECD-Fc浓度的增加，Ser9处的GSK3β磷酸化/GSK3β的比率的定量(n＝5，平均值±s.e.m.)；
图9提供了来自于p75ECD或GFP在AD(APP/PS1转基因)或野生型小鼠中的外周注射的结果，其中(a)示出了在Morris水迷宫中，在平台试验期间的逃避潜伏期(秒)，(b)示出了在平台试验期间为逃避到平台上所行进的距离，(c)示出了在探索试验中环穿越的次数，(d)显示了Y-迷宫试验中交替和(e)新臂进入的百分率，并且(f)显示了在旷场试验中行进的距离；其中p75ECD-Tg表示肌内注射AAV-p75ECD-Fc的APP/PS1小鼠，GFP-Tg表示肌内注射AAV-GFP的APP/PS1小鼠，Con-Tg表示未接受注射的APP/PS1小鼠，Con-Wt表示未接受注射的野生型小鼠；动物数目＝每组8只，平均值±s.e.m.，Tukey检验；*P<0.05，**P<0.01，与GFP相比；
图10提供了来自于p75ECD或GFP在AD小鼠中的外周注射的结果，其中(a)显示了使用6E10免疫化学染色的Aβ沉积，标尺条＝1mm，(b)用6E10免疫化学染色的Aβ沉积的面积分数的定量，(c)使用刚果红染色的Aβ沉积，标尺条＝1mm，(d)用刚果红染色的Aβ沉积的面积分数的定量，(e)TBS、SDS级分、FA提取物和血清中Aβ水平的ELISA定量，其中NC指示新皮质，HC指示海马，(f)在p75ECD肽腹膜注射(50μg/50μl i.p.)后24小时，血清Aβ40和Aβ42水平显著提高，出血前表示在血液采样之前，动物数目＝8，平均值±s.e.m.，T检验；*P<0.05，**P<0.01；
图11提供了来自于p75ECD或GFP在AD小鼠中的外周注射的结果，其中(a)显示了使用抗GFAP抗体免疫组织化学染色的AD小鼠的新皮质中的星形胶质细胞，(b)GFAP染色的阳性面积分数的定量，标尺条＝1mm，(c)使用抗CD45抗体对AD小鼠的新皮质中的小神经胶质细胞进行免疫组织化学染色，(d)CD45染色的阳性面积分数的定量，其中NC指示新皮质，HC指示海马，动物数目＝8，平均值±s.e.m.，T检验，*P<0.05，**P<0.01；
图12提供了来自于p75ECD或GFP在AD小鼠中的外周注射的结果，其中(a)显示了皮质中pS396的免疫组织学染色，标尺条＝100μm，(b)皮质中pS396阳性面积分数的定量，(c)海马中pS396的免疫组织学染色，标尺条＝100μm，(d)海马中pS396阳性面积分数的定量，在(a)和(c)中将相对强度归一化到Wt，(e)pS396、pS199、pS262和pT231的western印迹分析，(f)pS396、pS199、pS262和PT231的条带的相对强度的定量，动物数目＝8，平均值±s.e.m.，T检验，**P<0.01；
图13提供了在Morris水迷宫(MWM)试验期间，在用重组p75ECD-Fc或Fc处理后pR5(Tau)小鼠的结果，其中(a)示出了逃避潜伏时间，(b，c)在渐进性平台学习试验中为了找到平台的行进距离，(d)在平台象限中花费的时间和(e)进入次数，(f)在不同组之间在探索试验中隐藏的平台位点的穿越次数(*p75ECD-Fc与Fc组相比p<0.05，#野生型与Fc组相比p<0.05；$在野生型中在学习期间与学习的第一天相比p<0.05；￥在p75ECD-Fc中在学习期间与学习的第一天相比p<0.05，*p<0.05)(n＝每组6只，平均值±SEM，ANOVA，Tukey’s事后检验)；
图14提供了下列结果：A)Western印迹，显示出BACE1、sAPPβ、全长APP(APP.FL)和β-肌动蛋白在p75ECD-Fc和Fc处理组中在PR5小鼠脑中的表达，(B)BACE1/β-肌动蛋白的表达比率，(C)sAPPβ/β-肌动蛋白的表达比率(n＝每组5只，平均值±SEM，Student’s t-检验；“Fc”被归一化到100％)；并且
图15提供了下列结果：A)Western印迹图像，显示出在p75ECD-Fc和Fc处理的PR5小鼠脑中Ser202和Thr205处Tau蛋白磷酸化(使用单一“AT8”抗体)和总Tau蛋白的水平，(B)在Ser202和Thr205处磷酸化的Tau蛋白的统计学分析(**p<0.01，与Fc相比)(n＝每组5只，平均值±SEM，Student’s t-检验；“Fc”被归一化到100％)。
具体实施方式
正如本文中公开的，已经认识到个体中存在的全长p75与p75的细胞外结构域(p75ECD)的平衡可能决定所述个体是否患有可以引起大量神经疾病的神经变性。具体来说，已经认识到p75ECD是一种神经保护因子。尽管不愿受到理论束缚，但据信可溶性p75ECD与细胞膜结合的p75竞争配体如神经营养因子，由此阻止可以引起神经元变性和/或凋亡的p57信号转导。
正如本文中所述，已经调查了AD患者和AD小鼠模型的脑和脑脊液(CSF)中p75ECD的水平。一方面，已经认识到AD伴有与正常的非痴呆对照对象相比低的p75ECD水平、高的全长p75(在本文中被称为p75或p75FL)水平和/或低的p75ECD：p75FL比率。此外，已经认识到p75ECD、p75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL比率可以用作诊断或预后标志物。此外，在本文中公开的另一个方面中，已发现p75ECD水平的恢复，例如通过p75ECD的给药，减轻了神经变性疾病例如AD、脑淀粉样血管病(CAA)和Tau蛋白病，并在APP/PS1小鼠模型中在AD的早期和晚期两个阶段中改善学习和记忆。
因此，一方面，本发明提供了一种在测试对象中进行阿尔茨海默病(AD)的诊断和/或预后的方法，所述方法包括：
(a)从所述测试对象获得生物样品，
(b)测量所述测试对象的所述生物样品中p75细胞外结构域(p75ECD)和/或全长p75(P75FL)的浓度，以及
(c)将所述测试对象的所述生物样品中p75ECD和/或p75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率与从非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象获得的可比生物样品中p75ECD和/或p75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率进行比较，
其中当所述测试对象中p75ECD和/或p75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象中p75ECD和/或p75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率相比发生改变时，阿尔茨海默病被诊断和/或预后。
术语“p75FL”、“全长p75”、“p75”和“p75NTR”可互换使用，并且当在本文中使用时，是指整个(全长)p75神经营养因子受体(也被称为p75或p75NTR)。
术语“p75的细胞外结构域”、“p75ECD”、“p75细胞外结构域”、“p75的胞外结构域”和“p75胞外域”可互换使用，并且都是指在近膜区处用肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)/ADAM17切割p75后可以源自于全长p75肽的片段，所述切割释放或“脱落”出作为可溶性肽的p75FL的细胞外结构域(p75ECD)(Weskamp等，2004)。在一个实施方式中，所述p75ECD从p75FL肽脱落，并且在这种实施方式中，所述p75ECD是可溶的。当在本文中使用时，术语“可溶的”表明所述蛋白质、多肽或肽不结合于或者不变得结合于细胞膜，并因此以跨膜(即亲脂性)结构域的所有或实质性部分的不存在或功能性破坏为特征，使得所述蛋白质、多肽或肽不具有任何膜锚定功能。
本文中描述的p75和/或p75ECD可以来自于任何适合的物种。在一个实施方式中，所述p75和/或p75ECD源自于人类。然而，在一个实施方式中，所述p75和/或p75ECD也可以源自于具有商业、科学、医学或个人意义的动物，例如非人类灵长动物、大鼠和/或小鼠和/或其他哺乳动物例如家畜、珍稀动物和伴侣动物(包括竞赛马、绵羊、奶牛、山羊、猪、狮、虎、象、狗、猫、兔、大鼠和小鼠等)。在一个实施方式中，所述p75和/或p75ECD可以源自于灵长动物例如恒河猴、黑猩猩、猩猩、黑猩猩、大猩猩等。
人类全长p75的核苷酸序列被提供在Genbank登记号NM_002507的第126-1409位核苷酸和SEQ ID NO：1中。
人类全长p75的氨基酸序列被提供在SEQ ID NO：2中。
人类p75ECD由SEQ ID NO：2的第29至250位氨基酸构成，并包括作为单一肽的28个氨基酸，随后是4个富含半胱氨酸的结构域，每个结构域含有40个氨基酸残基并各自含有N-糖基化位点(Schor,2005)。人类p75ECD的核苷酸序列被提供在SEQ ID NO：3中。
人类p75ECD的氨基酸序列被提供在SEQ ID NO：4中。
在一个实施方式中，所述p75FL和/或p75ECD可以是遗传或肽变体。本文中指称的p75和/或p75ECD的“变体”，应该被理解为表示由例如等位基因变体编码的p75FL的同工型。在本文中的其他地方进一步详细描述了变体。
当在本文中使用时，术语“测试对象”是指正被评估以备阿尔茨海默病的诊断、检测或预后的个体。在一个实施方式中，测试对象可以是人类。然而，设想了所述对象也可以是具有商业、科学、医学或个人意义的动物，例如非人类灵长动物和其他哺乳动物例如家畜、珍稀动物和伴侣动物(包括竞赛马、绵羊、奶牛、山羊、猪、狮、虎、象、狗、猫、兔、大鼠和小鼠等)。
当在本文中使用时，术语“非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象”是指被认为是正常和良好的个体或一组个体，其具体来说不患有与痴呆相关的神经病症。在一个实施方式中，所述非痴呆对照对象或一组对象在提供所述样品的10年内未发生与痴呆相关的神经病症。在一个实施方式中，所述非痴呆对照对象或一组对象在提供所述样品的5年内未发生神经病症。在一个实施方式中，所述非痴呆对照对象是与所述测试对象相同的物种。在一个实施方式中，所述非痴呆对照对象是年龄匹配的，其中所述非痴呆对照对象在所述测试对象的年龄的10岁之内。在一个实施方式中，所述非痴呆对照对象在所述测试对象的年龄的5岁之内。在一个实施方式中，将所述测试对象的p75ECD和/或p75FL浓度(或者正如本文中所描述的两者的比率)与参考值进行比较，所述参考值已知是非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象中p75ECD和/或P75FL(或其比率)的代表性值。这些参考值可以针对可能影响p75ECD和/或p75FL浓度(或其比率)的因素例如年龄进行调整。
当在本文中使用时，术语“浓度”意欲是指生物样品中p75ECD和/或p75FL分子的量或水平，并且意欲涵盖绝对量(例如以mg/ml、ng/ml、pg/ml、ng/g等度量的样品中p75ECD和/或p75FL分子的量)和相对量(例如通过Western印迹上特定条带的染色的密度测定分析所测量的，其中所述测试对象的结果可以任选地针对非痴呆对照对象的结果进行归一化)两者。根据其中测量的浓度是绝对量的本公开的第一方面，将所述测试对象中p75ECD和/或p75FL分子的绝对浓度与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象中p75ECD和/或p75FL的绝对浓度进行比较，以确定是否存在浓度变化(即提高或降低)。或者，当测量的浓度是相对量(例如通过Western印迹分析的密度测定分析所测量的)时，将测试对象中p75ECD或p75FL分子浓度的染色强度(或其他相对测量值)与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象中p75ECD和/或p75FL浓度的染色强度(或所述其他相对测量值)进行比较，以确定是否存在浓度变化(即提高或降低)。
对于本领域技术人员来说，显然所述p75ECD：p75FL的比率可以通过用p75ECD的绝对或相对浓度除以p75FL的绝对或相对(相应地)浓度容易地计算。
所述生物样品可以是可被取样用于测定p75FL和/或p75ECD浓度的任何适合的身体样品类型。例如，所述生物样品可以选自脑组织、脑脊液(CSF)、血清、血浆、全血和外周血单核细胞(PBMC)和淋巴细胞。然而，本领域技术人员将会认识到，其他组织类型的体液可能适合于取样p75FL和p75ECD水平。在一个实施方式中，所述生物样品是脑脊液。在一个实施方式中，所述生物样品是脑组织。在一个实施方式中，所述生物样品选自淋巴细胞、血浆、血清和/或全血。
在所述生物样品是脑组织的实施方式中，所述脑组织样品可以在对象死亡后获得，或者可以是使用本领域技术人员公知的标准活检技术获得的组织活检样品。所述脑组织可以任选地通过本领域技术人员已知的方法例如匀浆和/或超声进行处理。本领域技术人员将会认识到，如有必要，其他组织类型可以类似地进行处理。在所述生物样品是CSF的实施方式中，所述CSF可以使用本领域技术人员已知的标准CSF收集技术例如通过腰椎穿刺来获得。
当在本文中指称时，术语在非痴呆对照对象中所测量的“可比生物样品”是指与测试对象所测量的生物样品相同或相似类型的生物样品，或者其中一种身体样品中的p75FL、p75ECD浓度和/或p75ECD：p75FL比率可以准确地预测另一种身体样品中的p75FL、p75ECD浓度和/或p75ECD：p75FL比率(相应地)的生物样品。例如，本领域技术人员将会理解，血清样品中被分析物的浓度基本上等同于血浆样品中同一被分析物的浓度，因为血浆与血清之间的差异仅在于血清不含纤维蛋白原和其他凝血因子。因此，在一个实施方式中，血浆和血清是可比生物样品。此外，本领域技术人员将会理解，血清或血浆样品中被分析物的浓度对应于全血样品中所述被分析物浓度的约两倍，因为全血包含大约一半的血清或血浆。因此，可以将全血中被分析物的浓度与血浆或血清进行比较，因为可以通过简单计算转换出可比较的浓度。
正如本文中所公开的，已令人吃惊地认识到在AD患者和AD小鼠中，与它们的非痴呆对应者相比p75ECD的浓度降低，此外，在AD患者和AD小鼠中，与它们的非痴呆对应者相比p75FL的浓度提高。此外，正如本文中所公开的，已经注意到在AD患者和AD小鼠中，与它们的非痴呆对应者相比p75ECD：p75FL的比率降低。
因此，在一个实施方式中，一种在测试对象中进行阿尔茨海默病(AD)的诊断和/或预后的方法包括：
(a)从所述测试对象获得生物样品，
(b)测量所述测试对象的所述生物样品中p75细胞外结构域(p75ECD)的浓度，以及
(c)将所述测试对象的所述生物样品中p75ECD的浓度与从非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象获得的可比生物样品中p75ECD的浓度进行比较，
其中当所述测试对象中p75ECD的浓度与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比降低时，阿尔茨海默病被诊断和/或预后。
所述测试对象中可以被认为“与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比降低”以便确定阿尔茨海默病是否被诊断或预后的p75ECD浓度，可以随着对象的物种、所使用的具体身体样品类型和对象的年龄而变。在一个实施方式中，在所述测试对象中，与非痴呆对照相比p75ECD浓度降低约25％至99％。在一个实施方式中，在所述测试对象中，与非痴呆对照相比p75ECD浓度降低约25％至90％。在一个实施方式中，在所述测试对象中，与非痴呆对照相比p75ECD浓度降低约30％至80％。在一个实施方式中，在人类AD患者中，与非痴呆人类对照相比p75ECD浓度降低约50％。在一个实施方式中，在脑脊液(CSF)中所述降低为约50％。在一个实施方式中，在脑组织中所述降低为约75％。在一个实施方式中，在人类AD患者中，与非痴呆人类对照相比人类脑组织中的p75ECD水平降低至少75％。在一个实施方式中，对AD进行诊断或预后的测试对象的CSF中p75ECD的浓度低于500pg/ml。类似地，在在一个实施方式中，在AD小鼠中，与野生型(wt)同窝仔畜相比小鼠CSF中的p75ECD浓度降低约50％，或者在可替选或附加实施方式中，在小鼠脑组织中所述降低为约50％。
正如本文中所公开的，已认识到在非痴呆对照中，CSF中p75ECD的正常人类浓度范围为约500pg/ml至约1300pg/ml。在一个实施方式中，使得AD被诊断或预后的人类测试对象的CSF中p75ECD的降低的浓度为低于500pg/ml，优选地低于400pg/ml。在一个实施方式中，使得AD被诊断或预后的人类测试对象的CSF中p75ECD的降低的浓度为低于300pg/ml。
在另一个实施方式中，本公开提供了一种在测试对象中进行阿尔茨海默病(AD)的诊断和/或预后的方法，所述方法包括：
(a)从所述测试对象获得生物样品，
(b)测量所述测试对象的所述生物样品中p75ECD和全长p75(p75FL)的浓度，以及
(c)将所述测试对象的所述生物样品中p75ECD和p75FL的浓度与从非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象获得的可比生物样品中p75ECD和p75FL的浓度进行比较，
其中当所述测试对象中p75ECD：p75FL的比率与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比降低时，阿尔茨海默病被诊断和/或预后。
在一个实施方式中，所述测试对象中p75ECD：p75FL的比率与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比降低至少30％。在一个实施方式中，所述比率降低至少50％。在一个实施方式中，所述比率降低至少75％。在一个实施方式中，所述比率降低至少90％。在一个实施方式中，所述比率降低至少99％。
在又一个实施方式中，本公开提供了一种在测试对象中进行阿尔茨海默病(AD)的诊断和/或预后的方法，所述方法包括：
(a)从所述测试对象获得生物样品，
(b)测量所述测试对象的所述生物样品中p75FL的浓度，以及
(c)将所述测试对象的所述生物样品中p75FL的浓度与从非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象获得的可比生物样品中p75FL的浓度进行比较，
其中当所述测试对象中p75FL的浓度与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比提高时，阿尔茨海默病被诊断和/或预后。
在一个实施方式中，所述测试对象中p75FL的浓度与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比提高10％至500％(也就是说，1.1至5倍)。在一个实施方式中，所述p75FL的浓度提高20％至300％(也就是说，1.2至3倍)。在一个实施方式中，所述p75FL的浓度提高30％至200％(也就是说，1.3至2倍)。在特定实施方式中，在人类脑组织中所述p75FL的浓度提高至少200％(2倍)或优选地300％(3倍)。
然而，出于本公开第一方面的方法的目的，所述测试对象中可以被认为与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象相比提高的浓度、降低的浓度或提供降低的比率的p75FL和/或p75ECD的量，可以随着所比较的因子(例如p75FL、p75ECD或p75ECD：p75FL的比率)、所使用的具体身体样品类型和对象的年龄而变。
在一个实施方式中，在本公开的第一方面中测量的p75FL和/或p75ECD是肽。
定量或测量p75FL和/或p75ECD肽的浓度可以使用本领域技术人员已知的适合的技术来进行，例如通过将染色与已知蛋白标准品进行比较以测量分子的绝对浓度，或者通过使用密度测定分析来比较测试对象与正常非痴呆对照之间的相对染色强度以测量相对浓度，包括使用本文中所描述的方法。p75FL和/或p75ECD肽的浓度可以使用本领域技术人员公知的技术来测定，例如使用抗p75FL和/或p75ECD抗体或其片段定量从Western印迹分析、免疫测定法例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)和免疫组织化学(例如使用组织活检的切片化样品，包括免疫荧光染色)获得的结果。然而，也可以使用本领域技术人员公知的其他方法来检测和定量p75FL和/或p75ECD的水平，例如包括检测p75FL和/或p75ECD与可以结合p75FL和/或p75ECD的任何其他配体(例如Aβ)的结合的方法。用于确定测试身体样品中存在的p75FL和/或p75ECD的量的特别适合的方法是以各种不同的夹心、竞争或其他测定方式利用被标记的分子的免疫测定法。这些免疫测定法将产生指示p75FL和/或p75ECD的存在或不存在的信号。此外，由这些免疫测定法产生的信号的强度可能直接或间接地(例如成反比)与样品中存在的p75FL和/或p75ECD的量相关。用于确定测试身体样品中存在的p75FL和/或p75ECD的量的其他适合的方法是包括测量p75FL和/或p75ECD特有的物理或化学性质例如精确的分子质量或核磁共振(NMR)谱的方法。因此，这些方法可以使用生物传感器、偶联到免疫测定法的光学装置、生物芯片、分析装置如质谱仪、NMR分析仪和层析装置来进行。其他适合的方法可以包括沉淀(例如免疫沉淀)、电致化学发光(即电产生的化学发光)、电致化学发光夹心免疫测定法(ECLIA)、解离增强镧系元素荧光免疫测定法(DELFIA)、闪烁迫近测定法(SPA)、比浊法、浊度测定法、乳胶增强比浊法和浊度测定法。此外，本领域技术人员公知的方法如凝胶电泳、Western印迹和质谱法也可以单独或与上述其他适合的方法组合使用。本领域技术人员将会认识到，其他方法可能适合于按照本文中描述的方法检测p75或p75ECD肽的浓度。
正如本领域技术人员将会理解的，全长p75FL肽和p75ECD肽可以使用识别p75FL肽的不同区域的特异性抗体来辨别。例如，第一种抗体可以特异性识别并结合p75的细胞外结构域(p75ECD)但是不结合细胞内或跨膜区，例如本文中使用的抗p75ECD抗体(兔多克隆抗体，9650)；并且第二种抗体可以特异性识别并结合p75的细胞内或跨膜区(p75ICD)但是不结合细胞外结构域，例如本文中使用的抗p75NTR抗体(兔多克隆抗体，AB1554，Millipore，US)或抗NGF受体p75抗体(目录号AB1554，Millipore，US)。本领域技术人员将会认识到，在本公开的方法中，可以容易地使用特异性识别并结合p75的细胞外结构域但不结合细胞内或跨膜区，或者特异性识别并结合p75的细胞内或跨膜区但不结合细胞外结构域的其他适合的抗体。
然而，在一个实施方式中，在全长p75的情形中可能存在至少一些p75ECD，所述全长p75可能与细胞组分结合。也就是说，在一个实施方式中，全长p75作为跨膜蛋白与细胞制备物的细胞膜组分结合，而可溶性(“脱落的”)p75ECD将与细胞、组织和/或体液制备物的可溶性组分结合。在一个实施方式中，正如本领域技术人员将会认识到的，可以通过Western印迹，在尺寸(即分子量)的基础上将可溶性(“脱落的”)p75ECD与全长p75的情形中存在的p75ECD区分开。或者，在一个实施方式中，正如本领域技术人员将会理解的，可以通过从细胞制备方法中省略去污剂或类似物质，使得可以通过离心将细胞膜(以及因此膜结合的全长p75)与制备物的可溶性组分(以及因此可溶性p75ECD)分开，而将可溶性或“脱落的”p75ECD与全长p75ECD区分开。可能也可以通过使用适合的对照定量抗p75ECD抗体与样品结合的强度和抗p75ICD抗体的结合强度并使用简单的计算来计算绝对量或比率，来确定p75ECD的量或p75ECD：p75FL的比率。
所述第一方面的方法使得p75FL和/或p75ECD的量或其比率的变化能够被用作阿尔茨海默病存在的诊断标志物。然而，这种方法的灵敏度和特异性可能不仅仅取决于所述方法的分析“质量”，其还可能取决于关于什么构成异常结果的定义。也就是说，通常，对于任何特定标志物来说，患有和未患疾病的对象的标志物水平的分布交叠，使得基于该标志物的诊断/预后测试不能以完全的准确性将正常(即非痴呆)对象与患病对象绝对区分开。因此，在某些实施方式中，所述方法可以进一步包括计算接受者工作特征(ROC)曲线，例如通过将p75FL和/或p75ECD的量的变化值对该值在“正常”和“患病”对象中的相对频率进行作图。然后将以这种方式计算的ROC曲线下面积用作在测试身体样品中确定的p75FL和/或p75ECD的量的变化允许正确诊断或预后的概率的度量。此外，即使在所确定的p75FL和/或p75ECD的量的变化可能被认为不准确时，ROC曲线也可以使用，因为只要有可能将结果排序，就仍可以计算ROC曲线。例如，可以将从来自于对象的测试身体样品确定的p75FL和/或p75ECD的量按照程度排序(例如l＝低，2＝正常，3＝高)。然后可以将这种排序与来自于正常对象的结果相关联，并按照本领域技术人员公知的方法产生ROC曲线(例如Hanley和McNeil，1982)。
因此，测试身体样品中p75FL和/或p75ECD的量的确定可以包括下列步骤：(i)将p75FL和/或p75ECD与特异性配体相接触，(ii)任选地除去未结合的配体，以及(iii)测量结合的配体的量。结合的配体(其可能通过共价和/或非共价结合来结合)将产生强度信号。正如上面指明的，所述配体可以选自抗p75FL和/或p75ECD抗体或其片段，但是也可能选自可以结合p75FL和/或p75ECD的任何其他配体，例如与p75FL和/或p75ECD结合的任何化合物(包括肽、多肽、核酸、适体(例如核酸或肽适体)、糖蛋白例如胎球蛋白和小分子)。然而，优选地，所述配体选自抗p75FL和/或p75ECD抗体或其片段(包括多克隆和单克隆抗体及其能够结合p75FL和/或p75ECD的片段例如Fv、Fab和F(ab)2片段，以及重组抗体例如单链抗体(例如scFV抗体))。制备这些配体的方法对于本领域技术人员来说是公知的。
在一个实施方式中，所述配体特异性结合p75FL和/或p75ECD。当在本文中使用时，术语“特异性结合”意味着所述配体不应与测试身体样品中存在的另一种肽、多肽或物质显著结合(也就是说，与其显著“交叉反应”)。优选地，特异性结合的p75FL和/或p75ECD的结合亲和性比任何其他相关肽、多肽或物质高至少3倍，更优选地高至少10倍，最优选地高至少50倍。非特异性结合可能是可容忍的，如果它仍可以例如根据它在Western印迹上的尺寸或通过p75FL和/或p75ECD在所述样品中相对较高的丰度而明确地区分并测量的话，或者如果它可以使用阴性对照样品或正常对象对照样品进行控制的话。所述配体可以被共价或非共价偶联到标记物，以允许对所述配体进行检测和测量。适合的标记可以通过本领域技术人员公知的任何直接或间接方法来进行。
正如本文中公开的，已认识到可以从组织和体液(包括CSF和脑组织)容易地确定p75FL和p75ECD浓度。血清和淋巴细胞中p75和p75ECD肽的水平也可以使用本领域技术人员已知的标准方法例如ELISA和Western印迹容易地检测(参见例如Zhou等，2013)。因此，也可以使用类似的技术任选地检测其他组织和体液类型中的p75FL和/或p75ECD。在一个实施方式中，p75FL是一种跨膜分子，并且可以在细胞中检测。例如，p75可以在各种不同的细胞类型中检测，例如淋巴细胞、巨噬细胞、皮肤细胞、施旺细胞和许多神经元细胞。使用本领域技术人员已知的技术例如ELISA和Western印迹，可以容易地检测源自于外周血的淋巴细胞中的p75水平(参见例如Zhou等，2013)。
然而，本领域技术人员将会认识到，可以通过测量细胞内编码p75FL的信使RNA(mRNA)分子的量，间接地定量p75FL水平。例如，p75mRNA可以在各种不同的细胞类型中检测，例如淋巴细胞、巨噬细胞、皮肤细胞、施旺细胞和许多神经元细胞。事实上，使用本领域技术人员已知的技术例如实时反转录酶PCR(实时RT-PCR)(参见例如Zhou等，2013)和RT-PCR，可以容易地检测源自于外周血的淋巴细胞中的p75mRNA水平。
在一个实施方式中，所述第一方面的方法可用于进行AD的预后，其中所述测试对象中p75ECD和/或P75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率与所述非痴呆对照对象或一组非痴呆对照对象中p75ECD和/或P75FL的浓度和/或p75ECD：p75FL的比率相比发生改变，即使在所述测试对象中不存在AD症状的迹象或仅存在AD症状的微弱迹象。
正如本文中公开的，还已认识到p75ECD是一种神经营养分子，其可以针对淀粉样肽β毒性提供保护并减少与tau蛋白病相关的tau蛋白磷酸化。正如本文中公开的，在过表达Aβ的小鼠模型中通过给药p75细胞外结构域(p75ECD)，可以减少与神经病症例如阿尔茨海默病(AD)、脑淀粉样血管病(CAA)或tau蛋白病相关的迹象和/或症状。这种给药可以通过改善学习和记忆、保护神经元免于由淀粉样肽β引起的神经变性、并减少tau蛋白磷酸化来减少所述神经病症的迹象和/或症状。
因此，另一方面，本公开提供了一种治疗或预防脑淀粉样血管病(CAA)或tau蛋白病的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的p75细胞外结构域(p75ECD)。
CAA是一种不同于AD的病症，其特征在于Aβ在大脑皮质和软脑膜中的小到中等尺寸血管的壁中的渐进性沉积，引起血管性痴呆。正如本文中公开的，已发现在AD小鼠模型中，在p75ECD给药后，p75ECD的给药减小了CAA病变。因此，在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗或预防脑淀粉样血管病(CAA)的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的p75细胞外结构域(p75ECD)。
尽管不愿受到理论束缚，但据信tau蛋白病是一类神经变性疾病，其伴有被称为神经原纤维缠结(NFT)的有缺陷的过磷酸化tau蛋白在脑中的病理性聚集。Tau蛋白病可以包括具有tau蛋白过磷酸化的任何神经变性疾病，包括AD、帕金森氏病、运动神经元病、额颞叶变性、亨廷顿病和皮克氏病(Pick's Disease)。正如本文中公开的，已发现p75ECD的给药减少了tau蛋白在多个位点例如第396、262、199位丝氨酸和第231位苏氨酸处的磷酸化。因此，在一个实施方式中，本公开提供了一种治疗或预防tau蛋白病的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的p75细胞外结构域(p75ECD)。
当在本文中使用时，术语“治疗”意欲是指p75ECD的给药减轻或改善了AD、CAA或tau蛋白病的至少某些迹象或症状。
当在本文中使用时，术语“预防”意欲是指p75ECD的给药发生在AD、CAA和/或tau蛋白病的诊断之前，并减轻、改善了ADD、CAA和/或tau蛋白病的至少某些迹象或症状或者延迟其发作；或者是指p75ECD的给药阻止了ADD、CAA和/或tau蛋白病的迹象或症状的恶化。因此，术语“预防”意欲包括预防性治疗。
给药的p75ECD可以来自于任何目标物种(例如人类、小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、奶牛、马、非人类灵长动物等)。然而，在一个实施方式中，所述p75ECD是人类p75ECD。在一个实施方式中，所述p75ECD可以具有SEQ ID NO：3中提供的核苷酸序列或SEQ ID NO：4中提供的氨基酸序列。
在可替选实施方式中，所述p75ECD可以是该序列的功能性片段、变体、类似物或衍生物。例如，p75ECD(或其功能性片段)的变体、类似物或衍生物由不同于p75ECD(或其功能性片段)，但在生物活性、特别是与促神经营养因子和Aβ肽结合的能力上保留了与p75ECD的相似性的分子构成。p75ECD(或其功能性片段)的变体、类似物或衍生物可以与p75ECD(或其功能性片段)具有显著的总体结构相似性，或者仅仅与p75ECD(或其功能性片段)的负责所述生物活性的一个或多个区域具有结构相似性。通常，变体、类似物或衍生物由相关氨基酸序列的一个或多个氨基酸的修饰提供，或者是所述修饰的结果。例如，包含SEQ ID NO：4中提供的序列的功能性片段的变体、类似物或衍生物通过向该氨基酸序列添加一个或多个氨基酸、从该氨基酸序列缺失一个或多个氨基酸和/或从该氨基酸序列置换一个或多个氨基酸来提供，或者是上述修饰的结果。也涵盖了氨基酸的反转和引起氨基酸序列改变的其他突变变化。这种类似物或衍生物可以通过在多核苷酸分子中引入核苷酸变化使得在诱变的多核苷酸分子表达后获得所需氨基酸变化或通过以其他方式合成掺有所需氨基酸变化的氨基酸序列来制备。氨基酸的置换可以包括保守或非保守氨基酸置换。保守氨基酸置换意味着将氨基酸残基用具有相似特性并且不显著改变所述肽或多肽的生物活性的另一个氨基酸替换。示例性的保守氨基酸置换被提供在下面的表1中。设想的具体保守氨基酸是：G，A，V，I，L，M；D，E；N，Q；S，T；K，R，H；F，Y，W，H；以及P，Nα-烷基氨基酸，其可能在序列上具有少量变化，但是不引起生物活性的任何显著降低或变化。这些变化可以包括保守氨基酸置换例如Gly，Ala，Val，Ile，Leu，Met；Asp，Glu，Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg，His；Phe，Tyr，Trp，His；和Pro，Nα-烷基氨基酸；以及非保守氨基酸置换。
表1示例性的保守氨基酸置换
Figure BDA0001112183600000261
Figure BDA0001112183600000271
*指示优选的保守置换
当通过合成制备类似物或衍生物时，所述类似物或衍生物可能包括不由遗传密码编码的一个或多个氨基酸例如羧基谷氨酸和羟脯氨酸，或者可能包括D-氨基酸代替L-氨基酸。因此，所述类似物或衍生物可以是p75ECD(或其功能性片段)的模拟物例如肽模拟物。然而，p75ECD(或其功能性片段)的类似物或衍生物不必定具有氨基酸序列同一性和/或相似性，并且事实上，类似物或衍生物可能完全不是蛋白质。
应该理解，由与SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6中提供的氨基酸序列具有少量改变的氨基酸序列编码的肽，仍然可能落于本发明的范围之内，只要所述肽能够结合p75并阻止通过p75的信号转导即可。具体来说，p75ECD的天然变体(或同工型)或源自于非人类物种的p75ECD肽被认为是落于所公开的方法的p75ECD或p75ECD-Fc融合肽的范围之内。
在一个实施方式中，p75ECD包含p75ECD融合体，其中p75ECD被融合到融合配偶体。所述融合配偶体可以是本领域技术人员已知的任何适合的融合配偶体，例如免疫球蛋白的Fc区、人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)等，只要所述p75ECD保留至少一些它的生物活性即可。融合产物可以通过从编码所述融合产物的适合的构建物表达所述产物，或通过以其他方式将p75ECD化学连接到融合配偶体来生产。所述融合配偶体应该提高所述p75ECD在体内的稳定性和血清半衰期。在一个实施方式中，将p75ECD融合到免疫球蛋白的Fc结构域，以形成p75ECD-Fc融合体。所述Fc结构域可以是来自于任何适合的免疫球蛋白的任何适合的Fc结构域。然而，在优选实施方式中，所述Fc结构域来自于人类IgG。
在一个实施方式中，所述Fc区能够二聚化以产生p75ECD的二聚体形式。然而，其他融合配偶体可能能够形成其他类型的寡聚体，例如三聚体、四聚体、五聚体等。因此，p75ECD可能是寡聚体例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等。在一个实施方式中，所述p75ECD可以是二聚体。在一个实施方式中，所述p75ECD-Fc融合体可以是p75ECD-Fc二聚体。
在一个实施方式中，所述p75ECD-Fc融合体包含连接到人类IgG1的Fc部分的人类p75ECD分子。本领域技术人员将会认识到，取决于例如所使用的连接物，融合体可能具有大量不同的核苷酸和氨基酸序列。然而，在一个实施方式中，在SEQ ID NO：5中提供了人类p75ECD-人类IgG1Fc结构域融合体(人类p75ECD-Fc)的核苷酸序列。
类似地，在一个实施方式中，人类p75ECD-Fc融合体的氨基酸序列被提供在SEQ IDNO：6中。在一个实施方式中，SEQ ID NO：6包含在SEQ ID NO：6的第1-169位氨基酸处的p75ECD肽，随后是在第170至179位残基处的连接物“DKTHTCPPCP”，随后是在第180至396位残基处的Fc结构域。然而，应该认识到，p75ECD-Fc融合体可以是由SEQ ID NO：6所提供的序列的功能性片段、变体、类似物或衍生物。本文中别处描述了功能性片段、变体、类似物或衍生物。
在一个实施方式中，将p75ECD或p75ECD融合体作为核苷酸分子给药到所述对象。这种核苷酸分子可以由例如表达载体或表达盒构成。优选的表达载体包括能够实现所需宿主细胞类型的转导的病毒载体，例如反转录病毒载体、腺病毒载体和源自于腺相关病毒(AAV)的载体，例如本领域技术人员公知的那些。包含编码本公开的p75ECD或p75ECD融合体的核苷酸序列的病毒载体可用于在所需位点处提供p75ECD或p75ECD融合体的体内来源，用于神经障碍的治疗或预防。
在优选实施方式中，将p75ECD或p75ECD融合体通过病毒载体给药，已知所述病毒载体提供以适合于基因疗法的方式将核苷酸递送到细胞内的工具。正如本领域技术人员将会理解的，腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯性疱疹病毒载体可以用作病毒载体，因为它们都能将核苷酸递送到细胞用于基因治疗的目的。通过病毒载体递送p75ECD或p75ECD融合体可以介导药剂在CNS(例如脑)中的长期表达，并且由于许多神经障碍的慢性本质，p75ECD或p75ECD融合体的持续分泌是合乎需要的。在一个实施方式中，AAV载体的使用是有利的，这是因为所述载体可以作为单次注射(例如颅内或脑室内注射)给药，可以提供药剂的长期分泌，并且此外也被认为是非常安全的，在动物或人类中尚未报道过病理事件。AAV载体已知是用于基因疗法递送的工具。因此，在一个实施方式中，病毒载体可以是AAV载体。所述AAV载体可以是本领域技术人员已知的任何适合的腺相关病毒载体，例如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12等。在一个实施方式中，所述AAV载体是AAV8。
“治疗有效量”是在对象中引发有益或治疗效果的任何量。在一个实施方式中，用于任何适合的对象的AAV载体的剂量在1x 106至6x1013个病毒基因组/kg对象体重之间。在一个实施方式中，用于任何适合的对象的AAV载体的剂量在1x1011至6x1012个病毒基因组/kg对象体重之间。
正如本领域技术人员充分认识到的，给药的腺相关病毒载体的剂量可以变化。例如，对于人类对象来说，在美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)的机构的临床试验中，患者中使用的“安全”剂量为6x1012个病毒基因组(vg)/kg体重。然而，对于本文中描述的方法来说，给药到人类对象的腺病毒载体的剂量可以在1x106至6x1013vg/kg体重的范围内。在一个实施方式中，给药到人类对象的腺病毒载体的剂量在1x1010至6x1012个病毒基因组/kg体重之间。在一个实施方式中，给药到人类对象的腺病毒载体的剂量在1x1011至3x1012个病毒基因组/kg体重之间。在一个实施方式中，腺病毒的剂量可以更高，例如1x1014、1x1015、1x1016、1x1017、1x1018、1x1018、1x1019、1x1020等，只要这些剂量被认为是安全的即可。
可以使用用于在物种间转换药物等价剂量的美国食品和药物监督管理局(USFood and Drug Administration)(FDA)标准，在身体表面积的基础上将人类对象中使用的AAV载体的剂量转换成适合用于其他动物的剂量[以mg/kg为单位的人类等价剂量＝以mg/kg为单位的动物剂量×(以kg为单位的动物体重/以kg为单位的人类体重)0.33](食品和药物监督管理局，2003)。因此，在小鼠中的“安全”剂量可以是8×1010个病毒基因组。然而，本领域技术人员将会认识到，给药到小鼠对象的腺相关病毒载体的剂量可以在1x105至1x1013个病毒基因组的范围内。在一个实施方式中，给药到小鼠对象的腺相关病毒载体的剂量可以在1x108至1x1012个病毒基因组的范围内。在一个实施方式中，给药到小鼠对象的腺相关病毒载体的剂量可以在1x109至1x1011个病毒基因组的范围内。
在本发明的这一方面的一个实施方式中，p75ECD或p75ECD-Fc融合体是重组肽。重组p75ECD或p75ECD-Fc融合肽可以使用本领域技术人员已知的任何适合的技术来生产，例如通过在培养的细菌系统(例如大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母表达系统、昆虫表达系统、病毒表达系统或在真核细胞表达系统中表达，或者所述肽可以人工合成等，所有这些都为本领域技术人员所知。
在一个实施方式中，给药的重组p75ECD或p75ECD-Fc融合肽的剂量可以是在对象中引发有益或治疗效果的任何适合的量，并且可能随着给药途径而变。在一个实施方式中，所述剂量为每天约0.01至约500mg/kg对象体重，其可以在单剂或多剂中给药。优选地，所述剂量为每天约0.1至约250mg/kg，更优选为每天约0.5至约20mg/kg。
在一个实施方式中，本公开的这一方面的p75ECD、p75ECD融合体、p75ECD-Fc或AAV-p75ECD-Fc与可药用载体、赋形剂和/或稀释剂相组合提供。适合的可药用载体、赋形剂和/或稀释剂对于本领域技术人员来说是公知的。
本公开的这一方面的p75ECD、p75ECD融合体、p75ECD-Fc或AAV-p75ECD-Fc可以通过任何适合的途径给药到所述对象，例如口服、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、颅内、鞘内或脑室内途径。然而，优选地，所述p75ECD或p75ECD-Fc被腹膜内、肌内、鞘内或脑室内给药。
另一方面，提供了一种通过阻断经过p75的信号转导来保护神经元免于凋亡和/或神经变性的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的p75ECD或其类似物。在一个实施方式中，所述p75ECD或其类似物阻止选自Aβ、proNGF、proBDNF和proNT3的神经毒性分子与p75的结合。这一方面的方法使用上面描述的实施方式。
另一方面，提供了一种治疗和/或预防神经变性障碍或tau蛋白病的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的p75细胞外结构域(p75ECD)或其类似物，其中所述神经变性障碍或tau蛋白病选自阿尔茨海默病、CAA、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、唐氏综合征、亨廷顿病、帕金森氏病、运动神经元病、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、皮克氏病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、嗜银颗粒病、只有缠结的痴呆(tangle-only dementia)、包含球状节的白质tau蛋白病、额颞性痴呆和与17号染色体连锁的帕金森症。这一方面的方法使用上面描述的实施方式。
实施例
实施例1诊断和治疗神经疾病
材料和方法
试剂和抗体
AAV8-CBA-p75NTR-ECD-Fc(AAV-ECD-Fc)和AAV8-CBA-GFP(AAV-GFP)的载体由Virovek(Hayward,CA,USA)生产并纯化。pcDNA3-人类全长p75NTR来自于RainerNiedenthal博士(Institute for Physiological Chemistry/Biochemistry,HannoverMedical School,Hannover,Germany)。合成的Aβ42(目录号62080)和混杂的Aβ42(目录号62046)购自American Peptide(Sunnyvale,CA,USA)。
人类p75ECD-Fc和Fc重组蛋白如下所述来制备。人类p75ECD和Fc核苷酸构建物分别使用引物(表2)和PCR，在标准条件下并使用人类cDNA作为DNA来源来生产，然后对于p75ECD-Fc融合蛋白来说，使用标准条件通过重叠PCR将片段融合在一起。
表2用于人类p75ECD-Fc和Fc克隆的PCR引物对序列
Figure BDA0001112183600000321
在p75ECD-Fc和Fc构建物产生后，使用Nco-I和EcoR-I限制性酶将它们克隆到pET-28a(+)载体(Merck Millipore)中，然后转化到大肠杆菌DH10B感受态细胞中，随后转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中。为了表达p75ECD-F和Fc重组肽，将p75ECD-Fc和Fc的大肠杆菌BL21储用物接种在大体积Luria Broth(LB)培养基中并在37℃温育直至OD值达到0.4-0.6，然后使用1mM IPTG在37℃下诱导p75ECD和Fc在大肠杆菌中表达3小时。在4℃下以5,000RPM将大肠杆菌离心15min，然后将沉淀颗粒重悬浮在低渗裂解缓冲液(10mM tris，2mM EDTA，25mM NaCl，0.1％Triton X-100，1-2mg/ml溶菌酶，pH＝8.0)中，并在超声处理后通过在4℃高速离心(15,000RPM)30min来提取上清液。为了收获p75ECD-Fc和Fc，使上清液穿过蛋白-G琼脂糖凝胶柱，然后通过施加100mM甘氨酸pH 2.5将p75ECD-Fc和Fc从蛋白-G琼脂糖凝胶洗脱。随后，将甘氨酸溶液中的蛋白质在4℃下在PBS中透析，并通过考马斯蓝染色验证肽的纯度。也可以使用任何重组蛋白的常规生产方法，在酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞中生产P75EC-Fc。
在本研究中使用的抗体是：抗p75NTR抗体(兔多克隆，AB1554,Millipore，US)，抗p75ECD抗体(兔多克隆，9650，来自于Moses Chao教授(Department of Cell Biology，Skirball Institute，New York，USA)的慷慨馈赠)，抗TACE(ADAM-17)抗体(兔多克隆，ab2051，Abcom，US，用于检测肿瘤坏死因子α转化酶)，抗人类IgG Fc抗体(小鼠单克隆，MAB1302，Millipore，US，用于检测p75ECD-Fc)，抗β淀粉样肽抗体(小鼠单克隆，6E10，Covance，US)，抗sAPPβ抗体(兔多克隆，SIG-39138，Covance，US)，抗淀粉样肽前体蛋白C-端抗体(751-770aa)(兔多克隆，171610，Calbiochem，US，用于检测APP全长和CTF切割产物)，抗APP C-端(678-695aa)抗体(兔多克隆，6687，由C.Haass教授(Ludwig-MaximiliansUniversity Munich，Munich，Germany)善意提供)，抗BACE C-端抗体(小鼠单克隆，克隆61-3E7，Millipore，US，用于检测β-位点APP切割酶)，抗BACE1细胞外结构域抗体(小鼠单克隆，MAB931，R&D，US，用于在体外研究中检测细胞BACE1水平)，抗脑啡肽酶抗体(兔多克隆，AB5458，Millipore，US)，抗RAGE抗体(兔多克隆，克隆DD/A11，Millipore，US，用于检测晚期糖基化终末产物的受体)，抗LRP(小鼠单克隆，5A6，Calbiochem，US，用于检测低密度脂蛋白受体相关蛋白)，抗IDE N-端(97-273)抗体(兔多克隆，PC730，Millipore，US，用于检测胰岛素降解酶)，抗NeuN抗体(小鼠单克隆，MAB377，Millipore，US，用于检测神经元核)，抗ChAT抗体(兔多克隆，ab137349，Abcam，US，用于检测胆碱乙酰转移酶)，抗MAP2抗体(小鼠单克隆，05-346，Millipore，US，用于检测微管结合蛋白2)，抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(兔单克隆，04-1062，Millipore，US，用于检测活性星形胶质细胞)，抗活性半胱天冬酶-3抗体(兔多克隆，ab13847，Abcam，US，用于检测凋亡)，抗CD45抗体(大鼠单克隆，ab25386，Abcam，US，用于检测活性小神经胶质细胞)，抗SNAP25抗体(兔多克隆，AB1762，Millipore，US，用于检测突触体结合蛋白-25)，抗PSD95抗体(小鼠单克隆，MAB1596，Millipore，US，用于检测突触后密度蛋白95)，抗SYP抗体(小鼠单克隆，MAB332，Millipore，US，用于检测突触小泡蛋白)，抗突触蛋白I抗体(兔多克隆，574778，Millipore，US)，抗VAMP1抗体(兔单克隆，ab151712，Abcam，US，用于检测囊泡相关膜蛋白1)，抗pS396抗体(兔多克隆，11102，Signalway Antibody，US，用于检测在第396位丝氨酸处磷酸化的tau蛋白)，抗pT231抗体(兔多克隆，11110，Signalway Antibody，US，用于检测在第231位苏氨酸处磷酸化的tau蛋白)，抗pS262抗体(兔单克隆，ab92627，Abcam，US，用于检测在第262位丝氨酸处磷酸化的tau蛋白)，抗pS199抗体(兔单克隆，ab81268，Abcam，US，用于检测在第199位丝氨酸处磷酸化的tau蛋白)，抗总tau蛋白抗体(兔多克隆，ab39524，Abcam，US)，抗GSK3(α+β)(phosphoY279+Y216)抗体(兔多克隆，ab52188，Abcam，US)，抗GSK3β抗体(兔单克隆，ab18893，Abcam，US，用于检测糖原合成酶激酶-3β)，抗GSK3β(phospho S9)抗体(兔单克隆，ab75814，Abcam，US，用于检测在第9位丝氨酸处磷酸化的糖原合成酶激酶-3β)，抗3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(绵羊多克隆，OSG00034W，Osenses，澳大利亚)和抗β-肌动蛋白抗体(兔多克隆，ab8227，Abcam，US)。
人类CSF和脑组织样品制备
关于人类脑脊液(CSF)样品的研究得到第三军医大学大坪医院伦理委员会(Ethics Committee of Daping Hospital of the Third Military MedicalUniversity)批准。对于CSF取样来说，征召了总共56位研究参与者(对于AD来说n＝29，对于ND来说n＝27)。从所有参与者或他们的代理人获得了对腰椎穿刺和CSF取样的书面知情同意书。AD的诊断按照国家神经和沟通障碍和中风研究所(National Institute ofNeurological and Communicative Disorders and Stroke)(NINCDS-ADRDA)的判据(Raffi，2013；McKhann等，1984)，包括简短精神状态检查(MMSE)来做出。在禁食过夜后在8:00AM将CSF样本收集在无菌玻璃管中，并立即储存在-80℃下用于将来的生物化学分析。关于人类脑样品的研究得到南佛罗里达大学伦理委员会(Ethics Committee of Universityof South Florida)批准(Pro00011605)。来自于组织学验证过的阿尔茨海默病病例和年龄匹配的非痴呆个体的尸检人脑样品从Banner Sun Health Research Institute(SunCity,AZ,USA)获得。
动物
APPswe/PS1DE9转基因小鼠(其被用作AD模型，并在本文中被称为“AD小鼠”)过表达APP的瑞典突变并且也在外显子9中具有PS1缺失，这引起实质Aβ载量提高，并伴有从4月龄起出现的Aβ斑块，神经胶质细胞活化，以及在6月龄时通过径向臂水迷宫证实并在12-13月龄时使用Morris水迷宫试验观察到的认知功能缺损。
对于某些实验来说，AD/p75-/-和AD/p75+/+小鼠被用于调查p75对淀粉样肽前体蛋白(APP)加工的影响。在C57BL/6背景上表达APPswe/PS1DE9(AD)的转基因(Tg)小鼠株系(Castellani和Perry，2012)和129sv背景上的p75-/-(p75NTR/外显子III_/_)小鼠从Jackson实验室获得(编号005864)，并在第三军医大学动物房(Third Military MedicalUniversity Animal House)和南澳大利亚大学(University of South Australia)饲养。为了获得AD/p75-/-和AD/p75+/+小鼠以调查p75对淀粉样肽前体蛋白(APP)加工的影响，将p75-/-小鼠与AD小鼠杂交，并在按照供应商的说明书进行PCR基因分型后，对动物进行研究。
将所有动物在22℃和12h光/暗周期下维持在标准条件下，并随意取用食物和水。按照NHMRC指南，进行的所有小鼠饲养程序都得到第三军医大学动物福利委员会(ThirdMilitary Medical University Animal Welfare Committee)和南澳大利亚大学病理学系动物伦理委员会(Animal Ethics Committee of South Australian Pathology)批准(16b/12)。在体内实验中将AD小鼠随机分组。
测量人类脑脊液(CSF)以及人脑和小鼠脑中的p75ECD水平
人类CSF(对于AD来说n＝29，对于ND来说n＝27)和人类脑组织样品(对于AD来说n＝12，对于ND来说n＝12)中p75ECD的水平通过ELISA和Western印迹来定量。CSF中人类p75ECD的ELISA定量使用NGFR/TNFRSF16试剂盒(目录号DY367，R&D Systems，US)，按照制造商的说明书进行。人类脑匀浆物样品的p75ECD通过Western印迹，使用抗NGF受体p75抗体(目录号AB1554，Millipore，US)来检测。使用相同流程来进行12月龄AD小鼠(Tg)和野生型同窝仔畜(Wt)(对于Tg来说n＝13，对于Wt来说n＝14)的脑匀浆物的Tris缓冲盐水(TBS)级分中p75ECD的检测。
测量人类和小鼠脑中的TACE活性
肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)是切割p75并释放出p75ECD的主要酶。人类CSF(对于AD来说n＝29，对于ND来说n＝27)中的TACE活性使用
Figure BDA0001112183600000361
520TACE活性测定试剂盒(目录号72085，ANASPEC，US)来测量。按照制造商的说明书，在激发/发射＝490nm/520nm处监测酶活性。也使用TACE抗体(目录号ab2051，Abcom，US)，通过Western印迹来检测AD小鼠脑中TACE的表达水平。
Aβ42的寡聚体形式的制备
在本研究中，使用Aβ42的寡聚体形式。按照以前描述的流程制备合成的Aβ42和混杂的Aβ42。简单来说，将Aβ42肽以1mg/ml的浓度溶解在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP，目录号105228，Sigma，US)中，并在eppendorf管中分成等分试样(100μg/管)。允许HFIP在通风橱中蒸发，并将得到的透明肽膜在真空下干燥过夜，然后将沉积颗粒储存在-20℃直至使用。对于Aβ42的寡聚化来说，将干燥的沉积颗粒重悬浮在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中至终浓度为100μM，然后在4℃温育24小时。在使用前通过Western印迹检查Aβ42的寡聚体形式(Saadipour,K.等，2013)。
SH-SY5Y细胞培养和测定法
人类成神经细胞瘤SH-SY5Y购自北京协和医学院(Peking Union MedicalCollege)的细胞资源中心(Cell Resource Center)(CRC)，并在由DMEM/Ham’s F-12的1:1混合物构成并增补有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1％抗生素–抗真菌剂混合物的生长培养基中，在5％CO2的加湿培养箱中在37℃下培养。所有体外测定进行至少三次。
为了在体外评估p75ECD对抗Aβ毒性的作用，使用3-(4,5-甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴化物(MTT)进行细胞存活性测定。在96孔培养板(50,000个细胞/孔)中生长24小时后，将SH-SY5Y细胞用0.3-10uM Aβ42或10ug/ml重组p75ECD-Fc联合0.3-10uM Aβ42处理24小时，然后在37℃下与0.5mg/ml MTT(目录号M5655，Sigma，US)温育4h。然后将由活细胞中的线粒体脱氢酶产生的不溶性紫色甲臜晶体在37℃下，在100μl含10％(w/v)SDS的HCl(0.01M)溶液中溶解15min，并通过微孔板读板器(Synergy H4,Bio Tek)测量在563nm处的光密度。
为了评估p75ECD针对神经突塌陷的保护效果，进行神经突生长测定。在DMEM/F-12中温育24小时后，将SH-SY5Y细胞在含有1％FBS和10μM在DMSO中稀释的全反式视黄酸(目录号R2625,Sigma,US)的培养基中培养7天，然后在存在或不存在10μg/ml重组ECD-Fc的情况下用5μM Aβ处理24小时，然后用4％聚甲醛固定10min。通过显微术获取来自于不同组的共计50个神经元的图像，使用ImageJ测量神经突的长度并将数据表示成平均值±s.e.m.，当p<0.05时获得显著性。组之间的可变性通过单向ANOVA和Tukey's事后检验来确定。
为了在体外检查p75ECD对tau蛋白磷酸化的影响，将SH-SY5Y细胞在10μM全反式视黄酸中分化3天，然后在存在或不存在10μg/ml重组p75ECD-Fc或兔抗p75ECD抗体(9650，纽约大学的Moses Chao教授)的情况下与0.1至10uM的不同浓度的Aβ42寡聚体温育24小时。对细胞裂解物进行Western印迹，其中使用pS262抗体(目录号ab92627,Abcam,US)、总tau蛋白抗体(目录号ab39524,Abcam,US)、GSK3(α+β)抗体(目录号ab52188,Abcam,US)、pSer9GSK3β抗体(ab75814,Abcam,US)和作为载样对照的GAPDH抗体(目录号OSG00034W,Osenses,澳大利亚)。
原代皮质神经元培养物和测定法
皮质神经元从1日龄129sv小鼠脑分离，并在聚D-赖氨酸(目录号P7280,Sigma,US)预包被的盖玻片上培养。在接种后24小时，将神经元在存在或不存在重组p75ECD-Fc(10μg/ml)的情况下用5μM Aβ42寡聚体处理24小时，然后将神经元用4％聚甲醛固定10min，随后用DAPI(目录号D9542,Sigma,US)和MAP-2(目录号05-346,Millipore,US)染色。以上面描述的方式收集并分析神经突图像。
为了调查Aβ对TACE表达的影响，从1日龄129sv小鼠分离皮质神经元并在6孔板中培养，在接种后72小时，将神经元与浓度为0.3、1、3和10μM的Aβ42寡聚体温育24小时，然后在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中收获细胞裂解物。将细胞裂解物超声处理，然后在4℃下以14,000rpm离心10min，使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific,Rockford,USA)确定上清液的总蛋白浓度，并使用TACE抗体(目录号ab2051,Abcom,US)对30μg总蛋白进行Western印迹，以便定量TACE蛋白的表达水平。
为了阐明Aβ是否通过p75介导APP的产淀粉样肽加工，从携带过表达的APPswe/PS1DE9并带有/不带有p75基因的1日龄AD/p75-/-和AD/p75+/+小鼠分离皮质神经元并在6孔板中培养，在接种后72小时，将神经元用0.1和0.3μM Aβ42寡聚体处理24小时，然后将细胞裂解物收获在RIPA缓冲液中，并使用APP抗体(目录号171610,Calbiochem,US)、sAPPβ抗体(目录号SIG-39138,Covance,US)和BACE1抗体(目录号MAB931,R&D,US)进行Western印迹，以定量内源性APP。
AAV-ECD-Fc载体生产和纯化
使用Bac-to-bac系统，按照制造商的流程(Invitrogen)产生重组杆状病毒。首先，使用含有靶基因的pFastBac穿梭质粒分别转化DH10Bac感受态细菌，选择来自每种构建物的两个重组杆粒克隆(白色菌落)，并使用标准技术制备DNA“小量制备物”。然后将DNA小量制备物用于转染Sf9细胞以产生重组杆状病毒。将重组杆状病毒扩增一次并用于AAV生产。具体来说，将Sf9细胞培养到约1x 107个细胞/ml并稀释到约5x 106个细胞/ml。将200ml体积的稀释的Sf9培养物用含有AAV Rep和Cap基因的辅助重组杆状病毒和含有靶基因的第二重组杆状病毒进行双重感染，以进行AAV载体生产。在感染后3天，收获Sf9细胞并在SF9裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.8，50mM NaCl，2mM MgCl2，1％Sarkosyl，1％Triton X-100和140单位/ml的全能核酸酶(Benzonase))中裂解。基因组DNA通过在37℃温育1小时进行消化。通过以8,000rpm离心30min除去细胞碎片。将澄清的裂解物装载到CsCl逐级梯度上，并以28,000rpm进行20小时的超离心。通过带有18号针头的注射器抽出病毒条带，装载到第二个CsCl上并以65,000rpm进行20小时的线性超离心。然后抽出病毒条带并使其穿过2个PD-10脱盐柱(GE HealthCare)以除去CsCl和去污剂，并在同时与含有0.001％普兰尼克(pluronic)F-68的PBS缓冲液进行交换。使用对应于靶基因的QPCR引物进行定量实时PCR(qPCR)，以确定AAV载体基因组拷贝数。
将购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)的含有全长p75(NM_002507)的质粒和含有p75-ECD-Fc的质粒提供给Virovek，并将p75ECD-Fc插入到AAV8载体(由Virovek提供)中，所述载体含有具有AAV2磷脂酶结构域的AAV8衣壳序列，以提高AAV8的效能。具有AAV2磷脂酶结构域的AAV8衣壳序列的序列被提供在SEQ IDNO：13中，其中所述AAV2磷脂酶结构域序列包含第26至431位核苷酸。AAV-ECD-Fc载体由Virovek产生、生产和纯化。简单来说，将靶基因克隆到Virovek的AAV生产穿梭质粒中。使用Virovek专有的BAC-TO-AAV技术产生重组杆状病毒并将其用于感染Sf9细胞，以生产AAV载体。通过双重CsCl超离心来纯化AAV载体并使用PD-10脱盐柱进行缓冲液交换。使用定量实时PCR方法确定AAV滴度，并通过SDS-PAGE和随后的SimplyBlue Safestain测定法验证纯度(图1)。使用p75质粒作为模板并使用SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中提供的引物，对p75-ECD片段进行PCR扩增。使用p75-ECD-Fc作为模板并使用由SEQ ID NO：11和12提供的引物，对Fc片段进行PCR扩增。所述PCR在标准条件下进行。
脑室内注射
将APP/PS1转基因小鼠在3月龄时用AAV-ECD-Fc或AAV-GFP注射到左侧脑室中一次用于“预防”，或在9月龄时注射一次用于AD的“治疗”。注射坐标点从前卤起按照立体定位坐标系(Stereotaxic Coordinates)获取：前后向，-0.6mm；侧向，1.2mm；腹向，2.2mm。AAV注射剂量为8×1010个病毒基因组，其按照用于在物种间转换药物等价剂量的美国食品和药物监督管理局(US Food and Drug Administration)(FDA)标准，在身体表面积的基础上从美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)机构的患者中使用的安全剂量(ClinicalTrials.gov)转换而来[以mg/kg为单位的人类等价剂量＝以mg/kg为单位的动物剂量×(以kg为单位的动物体重/以kg为单位的人类体重)0.33](食品和药物监督管理局，2003)。
行为表型分型
操作人员和调查人员对分组和干预信息完全不知情。所有动物在12月龄时经历行为任务，包括Morris水迷宫、Y-迷宫和旷场试验。Morris水迷宫试验按照以前报道的方案并做出少量修改来进行(Wang Y.J.等，2010；Yau J.L.等，2007；Markowska,A.L等，1993)。简单来说，它由连续4天每天4次平台试验和随后的探索试验构成。表现被视频记录并通过图像分析软件(ANY-maze,Stoelting)进行分析。在平台试验中，测量路径距离和潜伏期；并且在探索试验中，测量象限时间和环穿越(Markowska,A.L等，1993)。自发交替试验和新臂探索在Y-迷宫中进行。对于自发交替试验来说，允许小鼠在5min时间内自由地移动通过迷宫。交替被定义为在交叠的三个一组设置中依次进入3个臂中(Sarter,M.等，1988)。交替百分率被计算为实际(总交替数)与可能的交替数(被定义为臂进入次数减去2)的比率乘以100。对于新臂探索来说，将小鼠置于所选的起始臂(出发臂)的末端，并在将一条臂(新臂)阻断的情况下允许它探索迷宫5min(Jung,W.R等，2008)。在间隔2小时后，允许小鼠自由探索所有3条臂。新臂进入次数和在新臂中花费的时间被计算为在3min检索试验期间在所有3条臂中的总时间的百分率。对于旷场试验来说，将每只小鼠置于旷场装置中央(Dellu,F.等，1992；Conrad,C.D等，1999)。使用计算机追踪系统(Limelight,ActiMetrics)追踪路径3min。此外，记录竖立、梳理、排便和排尿。
组织取样
通过过量给药6％水合氯醛(6ml/kg)将动物人道处死。从右心房获取血样，然后用100ml在正常盐水中的0.1％NaNO2进行心脏内灌注。分离脑并在可读精度为1mg的数字电子天平(BX-420H,Shimadzu Scientific Instruments)上称重。将用于组织学分析的右脑半球在4％聚甲醛(pH 7.4)中固定24h，并在30％蔗糖中温育24h以备随后的冷冻保护。使用冷冻超薄切片机以35μm的厚度切出脑的冠状切片，并在4℃下储存在含有0.1％叠氮化钠的PBS中直至使用。将左脑半球在液氮中速冻，并储存在-80℃下用于将来的生物化学分析。
p75ECD-Fc表达的分析
在脑室内注射AAV-ECD-Fc后AD小鼠脑中p75ECD-Fc的表达，通过ELISA、Western印迹和免疫组织化学来检查。对于ELISA来说，将新鲜脑称重并在TBS中匀浆。将匀浆物在4℃下以10,000×g离心10分钟，并收集得到的上清液。如上所述检测TBS中的p75ECD-Fc。对于Western印迹来说，将脑提取物的10μl TBS级分与等体积的2×载样缓冲液混合，装载在10％SDS-PAGE凝胶上并电泳。将凝胶转移到硝酸纤维素膜，然后将其与抗人类IgG Fc抗体(Millipore)或抗NGF受体p75抗体(Millipore)温育，随后与IRDye 800CW第二抗体(LI-COR)温育，并使用Odyssey荧光扫描仪进行扫描。对于免疫组织化学来说，使用抗人类IgGFc抗体(目录号MAB1302,Millipore,US)，按照以前描述的自由漂浮免疫组织化学方案(Wang Y.J.等，2009b)对组织切片进行染色。进行免疫荧光以检查ECD-Fc与神经元或星形胶质细胞或小神经胶质细胞之间的共定位，对于p75ECD-Fc来说使用人类IgG Fc抗体(目录号MAB1302,Millipore,US)，对于神经元来说使用NeuN抗体(目录号MAB377,Millipore,US)，对于星形胶质细胞来说使用GFAP抗体(目录号04-1062,Millipore,US)，对于小神经胶质细胞来说使用CD45抗体(ab25386,Abcam,US)。使用共聚焦荧光显微镜(Radiance2000MP,Bio-Rad)观察切片。
病理学和定量图像分析
对于密实的Aβ斑块染色来说，将一系列切片固定并用刚果红(目录号C6277,Sigma,US)染色。简单来说，将跨越整个脑的一系列5个等间距组织切片(相隔～1.3mm)用氯化钠工作溶液(含有在80％乙醇中饱和的氯化钠和0.01％氢氧化钠)在室温处理20分钟，然后直接放置在刚果红工作溶液(含有在氯化钠工作溶液中饱和的刚果红)中45分钟，并在无水乙醇中快速脱水。使用恒定的灯泡温度和曝光以4×放大倍数收集图像，其中所有图像在同一观察期内获取。对总Aβ、小神经胶质细胞增多、星形胶质细胞增多和微出血的染色按照以前的描述进行处理(Wang,Y.J.等，2009b)。简单来说，随机选择切片并使用自由漂浮免疫组织化学分别对总Aβ(目录号6E10,Covance,US)、小神经胶质细胞(目录号ab25386,Abcam,US)、星形胶质细胞(目录号04-1062,Millipore,US)和tau蛋白磷酸化(pS396抗体，目录号11102,Signalway Antibody,US)进行染色。将切片与第一抗体在4℃下温育过夜，并用生物素标记的第二抗体和ABC试剂盒(目录号PK6200,Vector Laboratories,US)进一步显色，使用二氨基联苯胺和葡萄糖氧化酶作为底物。选择新皮质和海马区域用于通过Image J对Aβ、小神经胶质细胞、星形胶质细胞免疫染色和刚果红阳性Aβ斑块进行自动定量，得到针对所分析的组织区域的总阳性染色的面积分数。使用各个测量值的平均值来计算组平均值和s.e.m.。
对于脑淀粉样血管病(CAA)染色来说，使用刚果红方法对一系列5个连续切片进行染色。微出血染色和定量按照以前描述的方法进行(Wang,Y.J.等，2009a)。简单来说，将一系列5个切片固定在载玻片上，并使用在2％盐酸中的2％亚铁氰化钾(目录号455989,Aldrich,US)对含铁血黄素染色15min，然后在1％中性红(目录号N4638,Sigma,US)溶液中在室温下复染10min。在显微镜下对每个脑的所有切片上的微出血情况进行计数，并计算每个切片的含铁血黄素沉积物的平均数目。所有图像分析以盲法方式进行处理。
Aβ斑块与ECD-Fc的共定位
将8只小鼠中每只动物的覆盖海马的一系列3个等间距组织切片进行免疫组织化学或免疫荧光染色。对于免疫组织化学来说，将切片用刚果红染色，随后与抗人类IgG Fc抗体温育。对于免疫荧光来说，将切片用硫代黄素S(目录号T3516,Sigma,US)和抗人类IgG Fc抗体染色，并使用共聚焦荧光显微镜(Radiance 2000MP,Bio-Rad)观察。
Aβ的ELISA定量
脑Aβ的ELISA分析如前所述进行处理(Wang Y.J.等，2009b)。简单来说，将冷冻的脑在含有蛋白酶抑制剂的TBS中匀浆并超声处理。将匀浆物在4℃下以100,000g离心1h并收集得到的上清液，其代表TBS可溶性级分。将得到的沉淀颗粒悬浮在含有2％SDS和蛋白酶抑制剂的水中并超声处理。将SDS增溶的匀浆物在4℃下以100,000×g离心1h并收集得到的上清液，其代表SDS可溶性级分。然后将得到的沉淀颗粒在70％甲酸(FA)中萃取并离心，收集得到的上清液，其代表FA不溶性级分。在ELISA测定之前，通过在1M Tris磷酸盐缓冲液(pH11)中1:20稀释来中和甲酸萃取物，然后在样品缓冲液中稀释。按照制造商的说明书，通过ELISA定量测量脑提取物和血清中Aβ40和Aβ42的浓度(SIG-38954用于Aβ40，SIG-38956用于Aβ42，Covance,US)。使用原始匀浆物中脑组织的湿重，将脑Aβ的最终值表示成每克脑湿重的皮摩尔数。
β-分泌酶活性分析
按照制造商的方案测量β-分泌酶活性(目录号K360-100,Bio Vision,US)。简单来说，将新鲜脑组织在液氮中粉碎，并分成等分试样以用于分泌酶测定。在产品试剂盒中提供的提取缓冲液中提取分泌酶，并通过添加与报告分子EDANS和DABCYL偶联的分泌酶特异性肽来测量它们的活性。所述肽被分泌酶的切割将EDANS与DABCYL物理分开，允许释放出荧光信号，所述荧光信号与分泌酶的酶活性水平成正比。在355nm的激发波长和510nm的发射波长下读取荧光信号，截止值为495nm。
神经元凋亡的分析
为了测定凋亡细胞，使用TUNEL染色和使用抗活化半胱天冬酶-3抗体的免疫荧光。将每只动物的5个切片用于TUNEL或活化半胱天冬酶-3染色。对于TUNEL染色来说，将35μm福尔马林固定的冠状脑切片中的凋亡细胞，使用原位死亡检测试剂盒POD(目录号11684817910,Roche)，按照制造商的说明书进行标记。将切片固定在载玻片上并在通风橱中干燥，然后在室温下与封闭溶液温育10分钟，并用PBS洗涤两次。在冰上在通透化溶液中温育2min后，将切片用PBS漂洗两次，将切片周围的区域干燥。向切片添加TUNEL反应混合物，并在加湿培养箱中，在加湿条件下和暗处在37℃温育60min。将载玻片用PBS漂洗三次，并向切片添加Converter-POD。在37℃温育30min后，向切片添加DAB(3,3'-二氨基联苯胺)底物或可替选的POD底物，并在室温温育10min。对于免疫荧光染色来说，简单来说，将切片在PBS-Tween20中漂洗3×2min，并与PBS中的3％BSA在室温温育30min，与针对活性半胱天冬酶-3的第一抗体(目录号ab13847,Abcam,US)在4℃温育过夜，用PBS漂洗两次，并与PBS中的Alexa
Figure BDA0001112183600000451
第二抗体在室温下温育60min。使用黑箱将载玻片上的切片避光保护，在PBS中漂洗3×5min并用抗荧光淬灭封片液封片。使用共聚焦荧光显微镜(Radiance2000MP,Bio-Rad)观察切片。
通过高尔基染色定量树突棘
将动物用6％水合氯醛(6ml/kg)麻醉，并用含有0.5％亚硝酸钠的0.9％氯化钠，然后用4％甲醛心脏内灌注。将小鼠脑用含有5％重铬酸钾、5％水合氯醛和4％甲醛的高尔基染料溶液进一步灌注。在灌注后，将脑切成0.1cm×0.1cm区段并转移到含有高尔基染料溶液的50ml不透明小管中，在室温下3天，然后浸泡在1％硝酸银溶液中，在不透明小管中继续3天。使用振动超薄切片机(Leica,VT1000S,Germany)将脑连续切片成35μm厚的切片。由对注射条件不知情的研究人员在高放大倍数(1000×)下估算树突棘的数目。
蛋白质印迹
使用Western印迹分析全长p75(p75FL)、p75ECD、参与Aβ产生和降解的分子、tau蛋白磷酸化以及与突触可塑性相关的突触蛋白(SNAP25、突触蛋白1、VAMP1和PSD95)的水平。使用包含50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、1％Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、2mM焦磷酸钠、1mM EDTA、25mMβ-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4、0.5μg/ml亮抑酶肽、1-2mM PMSF的RIPA缓冲液，在每毫克脑组织添加9μl RIPA缓冲液的比率的基础上，提取动物脑匀浆物中的蛋白质。对样品进行SDS-PAGE(8–15％丙烯酰胺)凝胶电泳。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜。印迹使用下列抗体来探测：识别APPfl、CTFβ和CTFα的抗APP C-末端抗体(171610,Calbiochem,US)，抗BACE1抗体(克隆61-3E7,Millipore,US)，抗脑啡肽酶抗体(目录号AB5458,Millipore,US)，抗RAGE抗体(克隆DD/A11,Millipore,US)，抗LRP抗体(5A6,Calbiochem,US)，抗IDE抗体(PC730,Millipore,US)，抗phospho-tau蛋白抗体包括pS396(目录号11102,Signalway Antibody,US)、pT231(目录号11110,Signalway Antibody,US)、pS199(目录号ab81268,Abcam,US)、pS262(目录号ab92627,Abcam,US)，抗SNAP25抗体(目录号AB1762,Millipore,US)，抗突触小泡蛋白抗体(目录号MAB332,Millipore,US)，抗突触蛋白I抗体(目录号574778,Millipore,US)，抗VAMP1抗体(ab151712,Abcam,US)，抗PSD95抗体(MAB1596,Millipore,US)，抗β-肌动蛋白抗体(ab8227,Abcam,US)。将条带密度归一化到β-肌动蛋白的条带密度。将膜与IRDye800CW第二抗体(LI-COR)温育，并使用Odyssey荧光扫描仪进行扫描。
IL-6、IL-1β、INF-γ和TNF-α浓度的ELISA定量
分别使用BMS603、BMS6002、BMS606、BMS607ELISA，按照制造商的说明书(eBioscience)定量测量脑提取物的TBS级分和血清中IL-6、IL-1β、INF-γ、TNF-α的水平。使用原始匀浆物中脑组织的湿重，将脑IL-6、IL-1β、INF-γ、TNF-α的最终值表示成每克脑湿重的皮摩尔数。
统计分析
没有从统计分析排除任何数据。对于数据收集来说，将所有样品编号，并且分析研究人员对于样品的身份不知情。
除非另有陈述，否则文本和图中的数据都被表示成平均值±s.e.m。使用Tukey's检验、Students t-检验、单向ANOVA或双向重复测量ANOVA来分析组之间的统计比较，以检验值的显著性。使用Spearman’s秩相关系数来评估p75ECD水平与Aβ负荷、炎症和行为表现的相关性。P值<0.05被认为是显著的。所有这些分析都使用用于13.0版Windows的SPSS来进行。
结果
在AD对象和APPswe/PS1dE9小鼠的脑中p75ECD的脱落被下调
在Wt小鼠中，全脑或不同区域中p75ECD的水平随着年龄而提高(图2a、b)。可溶性p75ECD存在于野生型(Wt)小鼠的脑的许多不同区域(图2b、c)、外周神经节和器官(数据未示出)中。数据表明，在正常的非痴呆对照个体中，p75ECD的脱落是一种生理过程并与衰老相关。
通过ELISA测量了来自于AD患者和ND对照的脑脊液(CSF)中的p75ECD水平。p75ECDELISA的灵敏度达到150pg/ml，并且正如通过在相同样品上的Western印迹所证实的，它是特异性的(r＝0.8198，p<0.0001)(数据未示出)。AD患者(n＝29)的脑脊液(CSF)中的p75ECD水平显著低于ND对照的CSF中的水平(n＝27，P<0.01)(图3a)。对于非痴呆对照来说，CSF中p75ECD浓度的平均值±s.e.m为864±30pg/ml，并且范围从549到1233pg/ml。对于AD患者来说，CSF中p75ECD浓度的平均值±s.e.m为343±33pg/ml并且范围从94到848pg/ml。因此，在AD患者中，与ND对照相比，CSF中p75ECD浓度的平均值低2.22倍。
在AD对象的脑中(图3b、c、d)和APPswe/PS1dE9(AD)小鼠的脑中(图3e、f、g)，通过Western印迹证实了p75ECD的存在。在人类AD患者中，与年龄和性别匹配的非痴呆对照(ND，n＝12)相比，脑(顶叶皮质)中的p75ECD水平显著降低(P<0.05，图3c)。归一化到非痴呆对照的AD患者中p75ECD浓度的相对强度的平均值±s.e.m为22±3％，意味着与非痴呆对照相比，AD中p75ECD的强度降低超过4倍。
作为比较，与ND对照相比，在人类AD患者中全长(FL)p75(p75FL)显著增加(P<0.01，n＝12；图3c)。归一化到非痴呆对照的AD患者中p75FL浓度的相对强度的平均值±s.e.m为315±20％，意味着与非痴呆对照相比，AD中p75FL的强度提高超过3倍。
尤其是，与ND对照相比，AD患者中p75ECD与p75FL(p75ECD：p75FL)的比率显著降低(图3d)。对于AD患者来说，所述比率的平均值±s.e.m(归一化到非痴呆对照的平均值±s.e.m)为0.11±0.02％。因此，与非痴呆对照相比，AD患者中的所述比率低9倍。这些结果表明，与正常的非痴呆对照相比，AD患者中除去ECD的p75加工显著降低。
表3从阿尔茨海默病(AD)患者和非痴呆(ND)对照获得的CSF中p75ECD的原始数据值，单位为pg/ml
Figure BDA0001112183600000481
Figure BDA0001112183600000491
在12月龄AD小鼠的脑中，当与它们的Wt同窝仔畜相比时，p75ECD和p75FL的异常表达是明显相似的(图3e、f、g、h)。具体来说，通过ELISA测定的小鼠脑中p75ECD水平的平均值±s.e.m水平为75±5ng/ml；而wt同窝仔畜中p75ECD浓度为201±10ng/ml(图3e)。因此，与wt小鼠中相比，在AD小鼠中p75ECD低2.7倍。
与wt同窝仔畜相比，在AD小鼠的脑中p75FL以显著更高的水平表达(图3f、g)；并且与wt同窝仔畜相比，在AD小鼠中p75ECD以显著更低的水平表达(图3f、g)。具体来说，与wt同窝仔畜相比，在AD小鼠中p75ECD的相对强度的平均值±s.e.m.为65±4％(图3g)。因此，与wt对照相比，在AD小鼠中p75ECD浓度低约0.35倍。
与wt对应物相比，在AD小鼠中p75ECD与p75FL的比率显著降低(图3h)。具体来说，归一化到wt小鼠的AD小鼠中p75ECD：p75FL比率的平均值±s.e.m.为48±4％，意味着与wt同窝仔畜相比，在AD小鼠中所述比率低2.1倍(图3h)。
在AD动物中，脑p75ECD水平与认知缺损、脑Aβ负荷和炎症负相关(表3、4和5)。
表4脑p75ECD水平与脑炎症的相关性
Figure BDA0001112183600000501
表5脑p75ECD水平与脑中的Aβ负荷的相关性
Figure BDA0001112183600000511
表6脑p75ECD水平与行为表现的相关性
变量 系数 标准误差 t值 P值 95.0％置信区间
MWM中的潜伏期 -0.127 0.039 -3.229 0.005 -0.210―-0.044
Y-迷宫中的交替 0.159 0.040 4.002 0.001 -0.076―0.243
旷场中的竖立 0.064 0.016 4.078 0.001 -0.031―-0.096
MWM，Morris水迷宫
尽管不愿受到理论束缚，但这些结果表明与正常的野生型同窝仔畜相比，AD中除去ECD的p75加工显著降低。
据报道，肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)是切开p75的ECD的主要酶(Weskamp,G.等，2004)。正如本文中公开的，已发现在AD小鼠的脑中(数据未示出)和AD患者的CSF中(数据未示出)，与它们的ND或wt对应物相比TACE活性显著降低。与年龄匹配的Wt对照相比，AD小鼠中TACE的表达也降低(数据未示出)。与提高TACE依赖性的p75切割的神经生长因子(NGF)(Urra,S.等，2007；Kommaddi,R.P.等，2011)相反，小鼠皮质神经元的Aβ处理以剂量依赖性的方式显著降低TACE表达(数据未示出)。尽管不愿受到理论束缚，但这些结果表明AD中可溶性p75ECD的减少是Aβ的下游毒性作用。
通过递送重组人类ECD-Fc基因来恢复AD小鼠的脑p75ECD水平
考虑到重组ECD-Fc可以破坏Aβ-p75相互作用并抑制Aβ聚集(Wang,Y.J.等，2011)，并且如上所述在AD脑中p75ECD水平降低，因此认为AD脑中p75ECD水平的恢复可能保护神经元对抗Aβ的病理作用。使用腺相关病毒8(AAV8)将人类p75ECD和人类IgG Fc片段的融合基因(AAV-ECD-Fc)在3月龄时(在脑中产生淀粉样斑块之前)递送到AD小鼠的侧脑室中，以检查ECD递送是否可用于预防Aβ相关疾病，并且也在9月龄时(当淀粉样斑块已明确产生时)递送所述融合基因，以检查ECD递送是否可用作治疗以减轻Aβ相关疾病的症状。所使用的AAV的剂量等同于在AAV的人类临床试验中使用的剂量。使用表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的AAV作为对照。ECD-Fc转入基因的表达在递送后一周时被检测到，并且在新皮质、海马和丘脑的神经元中保持稳定直至12月龄时挑选动物进行处死，正如使用只检测从转入基因表达的ECD-Fc但是不检测内源性p75ECD的抗人类Fc抗体所检测的(数据未示出)。
当在3月龄时将AAV-ECD-Fc注入到左侧脑室中时，使用抗人类IgG Fc抗体(α-IgG-Fc)在注射有AAV的动物的脑切片中检测到p75ECD-Fc的免疫荧光，其中ECD-Fc在皮质、海马和丘脑中表达(数据未示出)。p75ECD-Fc在神经元中表达，但是不在小神经胶质细胞或星形胶质细胞中表达(数据未示出)。在AAV-ECD-Fc注射后1周(1w)、2周(2w)、3周(3w)和9个月(9m)时，AD小鼠脑匀浆物的TBS级分中p75ECD的ELISA分析显示出稳定的表达(图4a)。在12月龄时，转染后AD小鼠的脑中ECD-Fc的水平与年龄匹配的Wt小鼠的ECD水平相似(图4b)。
在AD小鼠中脑p75ECD水平的恢复阻止认知减退
在3或9月龄时用AAV-ECD-Fc处理的AD小鼠(分别作为预防(Pre)或治疗(Tre))与AAV-GFP处理的对照小鼠(con)相比在Morris水迷宫中表现更好。这表现在：随着渐进性的平台学习试验，逃避潜伏时间和逃避到平台上所花费的行进距离显著减少(图5a、b、c)，以及在没有平台的探索试验中平台区域穿越的次数增加和在平台象限中花费的时间更长(图5d、e、f)。这些数据表明，不论是在3月龄时作为预防给药还是在9月龄时作为治疗给药的p75ECD-Fc，在AD小鼠中都显著改善空间学习和记忆。预防和治疗两个组中的小鼠与给药GFP的对照相比在Y-迷宫和旷场试验中也表现更好，正如由在Y-迷宫试验中进入新臂的次数更多和自发交替更高所反映的(图5g、h、i、j)。这表明给药p75ECD-Fc的小鼠的工作记忆比给药GFP的对照小鼠更好。在旷场试验中给药ECD-Fc的小鼠与给药GFP的对照小鼠相比，还具有更高的竖立次数、更长的行进距离并且在中央区中花费的时间减少(图5k、l)，这与Wt小鼠相当。所述数据表明，给药p75ECD-Fc的小鼠与给药GFP的对照AD小鼠相比具有更好的总体自主活动。因此，在AD小鼠中，ECD给药提供了对记忆和行为的保护性效果。
脑p75ECD水平的恢复降低了AD小鼠的脑和血液中的Aβ水平
在3月龄(预防)或9月龄(治疗)时给药p75ECD-Fc的AD小鼠中，与给药GFP的对照相比，海马(HC)和新皮质(NC)中刚果红染色斑块的面积分数和密度降低约50％(图6a、b、c、d)，意味着在p75ECD处理后淀粉样斑块减少50％。在预防和治疗组中给药p75ECD-Fc的AD小鼠中，与对照相比，使用抗体6E10通过免疫组织化学鉴定的海马和皮质中淀粉样斑块的载量也减少(图6e)。
也使用刚果红染色来检查小鼠的脑淀粉样血管病(CAA)。如图6(f)中所示，p75ECD-Fc降低了CAA的严重性，正如通过血管中的刚果红染色所证实的。正如从图6(g)显然看到的，p75ECD-Fc将CAA病变数目减少约50％，其中为对照组鉴定到的CAA病变数目的平均值±s.e.m.为3.95±0.12，而预防组为2.05±0.13，并且治疗组为1.75±0.20。在预防和治疗两个组中微出血数目的平均值±s.e.m.也减少约50％(图6h)，对照组的微出血数目的平均值±s.e.m.为0.63±0.03，而预防组的微出血数目的平均值±s.e.m.为0.375±0.13，并且治疗组的微出血数目的平均值±s.e.m.为0.22±0.02。这表明在Aβ负荷增加的对象中作为治疗或预防而给药p75ECD-Fc，减轻了CAA病理。
有趣的是，正如通过免疫组织化学所检测的，p75ECD-Fc位于刚果红或硫代黄素S阳性斑块周围或内部(图6i)，表明表达的人类p75ECD-Fc与Aβ斑块结合并相互作用。与组织学结果相一致，ELISA试验也显示出在预防和治疗两个组中，脑匀浆物的TBS、SDS和甲酸级分中以及血清中总Aβ和Aβ40或Aβ42的水平显著降低(图6i、j)。因此，这一结果表明p75ECD-Fc给药降低了脑和血液中的Aβ水平。
在AD小鼠中脑p75ECD水平的恢复通过抑制BACE1表达减少了APP的产淀粉样肽加工
在偶发性AD中，Aβ上调β-位点APP切割酶(BACE1)的表达并驱动引起AD发病的恶性循环。然而，尚不了解何种受体介导所述Aβ-JNK-BACE1恶性循环。尽管不愿受到理论束缚，但已提出p75可能上调Aβ生产(Wang Y.J.等，2011)，形成正反馈。调查了Aβ-p75与p75ECD-Fc的相互作用的破坏是否可以影响APP加工和Aβ生产。在预防和治疗两个组中，p75ECD-Fc处理显著减少了BACE1的表达和活性、APP的β-切割产物(CTFβ)和Aβ生产(数据未示出)。然而，Aβ降解酶脑啡肽酶(NEP)和胰岛素降解酶(IDE)以及Aβ血脑屏障(BBB)转运分子低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)和晚期糖基化终末产物的受体(RAGE)没有变化(数据未示出)。
为了确定p75ECD在体内抑制淀粉样肽生成的机制，检查了BACE1、APP和APP片段在原代神经元中的表达。他们认识到，对Aβ42β或Aβ25-35做出响应，培养的原代神经元中BACE1表达和sAPPβ水平剂量依赖性地增加(数据未示出)。这种增加被重组ECD-Fc的存在或在p75KO神经元中被废止(数据未示出)。Aβ也在AD/p75+/+神经元中(p<0.05)但是不在AD/p75-/-神经元中(数据未示出)剂量依赖性地提高APP表达。在AD/p75-/-神经元中，在存在或不存在Aβ的情况下，与ADp75+/+神经元中(数据未示出)相比，全长APP的水平提高(p<0.001)但sAPPβ的水平降低(p<0.001)，表明p75是Aβ促进的产淀粉样肽的APP加工所需要的。因此，结果表明p75是介导Aβ诱导的BACE1上调的关键受体，并在驱动AD发病机理的Aβ-BACE1恶性循环中发挥关键作用。正如本文中所公开的，认识到p75ECD-Fc处理可以打破这种恶性循环，因为数据表明p75ECD-Fc通过抑制BACE1表达而减少了Aβ生产。
在AD小鼠中脑p75ECD水平的恢复减弱神经突变性、神经元死亡和Tau蛋白磷酸化
与给药GFP的对照AD小鼠相比，在预防和治疗两个组中，海马中对NeuN染色的面积分数(神经元)以及MAP-2树突和ChAT阳性轴突增加(图7a)，表明p75ECD-Fc处理可以保护AD小鼠的海马中的神经元结构。在预防和治疗两个组中，海马中通过高尔基染色方法检测到的树突棘的数目显著增加(图7b)，表明p75ECD-Fc可以保护胆碱能神经元和海马神经元抵抗Aβ诱导的毒性。在预防和治疗两个组的脑中，突触蛋白(包括主要突触泡蛋白p38突触小泡蛋白、泡相关膜蛋白(VAMP)1、突触体结合蛋白25(SNAP25)、突触后密度蛋白95(PSD95)和突触蛋白I(Syn I))的水平显著提高(图7b)，表明p75ECD-Fc可以保护神经元突触和中枢神经系统的连通性以抵抗Aβ的毒性。在预防和治疗组中，海马中鉴定凋亡细胞的活化半胱天冬酶-3和TUNEL染色的面积分数显著低于对照(图7c)。因此，与体内数据相一致，重组p75ECD-Fc保护原代皮质神经元免于由Aβ触发的神经突塌陷(图7e)。
预防和治疗两个组的海马中Tau-phospho-Ser396阳性神经元的面积分数低于对照(图7d，上图和中图)。在预防和治疗两个组的脑中，在包括第396、262、199位丝氨酸和第231位苏氨酸的多个位点处Tau蛋白磷酸化的水平一致且显著地降低(图7d，中图和下图)，表明p75ECD-Fc的给药降低了与tau蛋白病相关的tau蛋白磷酸化。尽管不愿受到理论束缚，但据认为p75ECD对Tau蛋白磷酸化的作用是通过阻断激活上游GSK3β的Aβ(Chakravarthy,B.等，2012)。事实上，已发现在人类SH-SY5Y细胞系中，重组p75ECD-Fc肽和p75受体中和抗体两者都可以对Aβ作出响应而阻断Tau蛋白的Ser262磷酸化的增加(图8a)。此外，重组p75ECD-Fc剂量依赖性地抑制由Aβ42触发的S262的磷酸化和p-Ser9-GSK3β的增加(图8b、c)。这些数据表明，在SH-SY5Y细胞中，p75ECD-Fc通过抑制GSK3β活性来降低Aβ诱导的Tau蛋白过磷酸化。因此，p75ECD水平的升高可以提供保护以对抗Aβ诱导的轴突和神经突变性、神经元死亡和与Tau蛋白病相关的Tau蛋白过磷酸化。
在AD小鼠的脑中脑p75ECD水平的恢复减弱小神经胶质细胞增多、星形胶质细胞增多和炎症
脑炎症(包括小神经胶质细胞增多和星形胶质细胞增多)是AD的次级标志。与对照组相比，在预防和治疗两个组中，皮质和海马中CD45(小神经胶质细胞增多)和GFAP(星形胶质细胞增多)染色的面积分数显著减少(数据未示出)。在预防和治疗两个组中，TBS级分和血清中炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6的水平也低于对照组中的水平(数据未示出)。在学习和记忆任务中更好的表现和减少的神经炎症是ECD-Fc治疗后淀粉样肽负荷、Tau蛋白磷酸化和神经变性减少的可能的继发结果。
ECD-Fc基因通过AAV8的递送被良好地耐受
在动物研究期间，没有发生动物死亡，并且没有观察到明显的异常行为。基因递送不显著影响动物体重或肝脏酶(数据未示出)。在主要器官(包括脑、肌肉、心脏、肝脏、肺、肾和肠)中没有观察到可辨别的病理形态(数据未示出)。这些数据表明ECD-Fc融合基因在脑中的长期表达被AD小鼠良好地耐受，指示了AAV-ECD-Fc治疗的安全性。
讨论
正如本文中公开的，已认识到可溶性p75ECD(即从p75脱落后)是对AD潜在有用的治疗剂和标志物。可溶性p75ECD在生理上分布于中枢和外周神经系统两者中，并且受到衰老的发育调控。已经认识到，在AD对象和小鼠的脑中p75ECD水平显著降低，这可能是由Aβ诱导的TACE的表达和活性的降低造成的。此外，还发现p75ECD保护神经元以对抗Aβ诱导的神经毒性，并且抑制BACE1表达和Tau蛋白磷酸化。此外，在AD小鼠的脑中通过给药p75ECD-Fc来恢复p75ECD水平，保护脑以对抗神经变性。
脱落后的可溶性p75ECD的功能以前并不了解。正如本文中公开的，已经认识到p75ECD是一种神经营养分子，在AD脑中保护神经元对抗神经变性。令人吃惊的是，在AD中p75ECD水平显著降低，表明AD中的切割过程被Aβ损害。由于TACE是调控p75ECD生产的生理脱落酶(Westkamp等，2004)，AD脑中p75ECD水平的降低可能是由Aβ触发的TACE的表达和活性降低所造成的p75切割受损的结果。
正如本文中公开的，已发现p75介导Aβ诱导的BACE1上调，因为p75ECD-Fc和p75敲除的小鼠两者都可以阻断Aβ诱导的BACE1上调并抑制产淀粉样肽的APP加工。本文中描述的数据表明p75FL是驱动Aβ-BACE循环的核心角色。AD脑中p75ECD水平的降低可能有助于Aβ的过量生产，加剧恶性循环；并且体内p75ECD水平的恢复可以抑制BACE1表达和相关的产淀粉样肽途径。p75ECD可以打断对AD中Aβ的过量生产有贡献的Aβ-BACE1恶性循环。
p75ECD在引起AD发病机理的Aβ级联反应的多个水平上保护神经元，包括抑制Aβ聚集和沉积(Wang,Y.J.等，2011)、Aβ的过量生产和神经毒性以及Aβ诱导的Tau蛋白磷酸化。在体外和体内使用p75ECD-Fc和p75抗体的处理能够阻断Tau蛋白磷酸化，表明Aβ诱导的Tau蛋白磷酸化可能由p75介导。合在一起，p75ECD是一种新的神经营养分子，其在AD中减少，并保护脑抵抗Aβ毒性。恢复AD脑中的p75ECD水平可能是AD的理想治疗方法。
实施例2p75ECD的效果的特异性
为了调查p75ECD-Fc对淀粉样肽负荷的特异性，通过在8月龄AD小鼠的海马中注射重组p75ECD-Fc或两种对照蛋白之一(人类IgG或与人类IgG Fc融合的重组人类成纤维细胞生长因子受体4ECD(FGFR4-Fc))，进行了另外的实验。单次注射重组p75ECD-Fc但不是人类IgG或FGFR4-Fc，在注射后一周也显著减少注射位点上淀粉样斑块的面积分数(数据未示出)。为了调查p75ECD-Fc如何影响脑中的淀粉样肽负荷的潜在机制，使用ThT试验和透射电子显微术(TEM)可视化检查了p75ECD-Fc对Aβ原纤维形成和解聚的影响。数据显示，p75ECD-Fc但不是对照蛋白人类IgG或FGFR4-Fc，抑制了原纤维形成中的Aβ荧光和预先形成的Aβ纤维的荧光(数据未示出)。TEM可视化确定了p75ECD-Fc但不是人类IgG或FGFR4-Fc，阻止Aβ纤维的形成并使预先形成的Aβ纤维解聚(数据未示出)。数据表明，在体内p75ECD-Fc对淀粉样肽负荷的影响是特异性事件，并且不是由非特异性的蛋白质-Aβ相互作用造成的。
另外，与体内数据相一致，在体外，重组p75ECD-Fc但不是人类IgG和重组FGFR4-Fc，抑制SH-SY5Y细胞的细胞死亡并保护皮质神经元免于由Aβ触发的神经突塌陷(数据未示出)。
这些实验表明，p75ECD-Fc对淀粉样肽负荷的影响是由p75ECD的作用特异性造成的。
实施例3p75ECD-Fc在AD小鼠中的肌内递送减轻AD病理并改善认知功能
如下所述用AAV-ECD-Fc对AD小鼠(APP/PS1转基因小鼠)或野生型进行肌内注射：在3月龄时，将雌性APP/PS1转基因小鼠在胫前肌处用5μl中的2×109个AAV-ECD-Fc或AAV-GFP载体基因组肌内注射。在12月龄时，将所有小鼠处死并对脑进行取样。对照组接受AAV-GFP，但是其他处理都一致。在处理后，使用Morris水迷宫试验对小鼠进行测试。在某些实验中，将小鼠用重组p75ECD-Fc肽以每只小鼠50μg/50μl的量腹膜内注射一次。其他实验如上所述来进行。
在AD小鼠中p75ECD的肌内递送改善认知减退
与AAV-GFP处理的小鼠相比，用AAV-ECD-Fc处理的小鼠在Morris水迷宫试验中表现更好。这表现在：随着渐进性的平台学习试验，逃避潜伏时间和逃避到在平台上所行进的距离显著减少，以及平台区域穿越的次数更多(图9a、b、c)。数据表明，AAV-ECD-Fc处理在AD小鼠中显著改善空间学习和记忆。此外，与AAV-GFP处理的对照相比，AAV-ECD-Fc处理的小鼠在Y-迷宫和旷场试验中也表现更好。这由在Y-迷宫试验中进入新臂的次数更多和自发交替更高所反映(图9d和e)。这表明AAV-ECD-Fc处理的小鼠的工作记忆比对照小鼠更好。在旷场试验中，与AAV-GFP处理的对照相比，在AAV-ECD-Fc处理的小鼠中观察到更长的行进距离(图9f)，表明ECD-Fc处理的小鼠与对照AD小鼠相比具有更好的探索活性。然而，在组之间游泳速度没有显著差异，表明小鼠具有可比的运动活性。因此，这一数据显示出肌内p75ECD递送在AD小鼠中改善认知减退。
p75ECD的肌内递送减少AD小鼠的脑和血液中的Aβ负荷
与AAV-GFP处理的对照相比，在AAV-ECD-Fc处理的AD小鼠中，通过刚果红染色或免疫组织化学鉴定到的海马和新皮质中的淀粉样肽斑块负荷减少(图10a至d)。与组织学结果相一致，ELISA测定试验也显示出在AAV-ECD-Fc处理的AD小鼠中，脑匀浆物的Tris缓冲盐水、SDS和甲酸级分中以及血清中的Aβ40和Aβ42显著减少(图10e)。然而，在腹膜内注射p75ECD-Fc的AD转基因小鼠中的急性试验中，在每只小鼠以50ug/50ul的量腹膜内注射p75ECD肽一次后24小时，血清Aβ40和Aβ42水平显著提高(图10f)，表明p75ECD可以促进Aβ从脑外流到外周中。
p75ECD-Fc的肌内递送减弱AD小鼠脑中的小神经胶质细胞增多、星形胶质细胞增多和炎症
脑炎症(包括小神经胶质细胞增多和星形胶质细胞增多)是AD病理继Aβ之后的次级标志。与AAV-GFP处理的AD小鼠相比，在AAV-ECD-Fc处理的AD小鼠中，新皮质和海马中CD45(小神经胶质细胞增多)和GFAP(星形胶质细胞增多)染色的面积分数显著减少(图11)，正如由GFAP和CD45阳性染色面积的分数减少所反映的。因此，除了淀粉样肽负荷降低之外，在学习和记忆任务中提高的表现和减少的神经炎症是ECD-Fc治疗的可能结果。
实施例4在AD小鼠中p75ECD-Fc的肌内递送减弱Tau蛋白磷酸化
为了评估Tau蛋白病理学，如上所述检查了在AAV-ECD-Fc处理的AD小鼠中Tau蛋白在pS396、pT231、pS199和pS262处的磷酸化，并与AAV-GFP处理的对照进行比较。在这些位点处的磷酸化使用上面描述的抗pS396、pT231、pS262和pS199抗体来调查。在本研究中选择这些磷酸化位点是因为它们是AD小鼠中Tau蛋白过磷酸化的常见位点。与GFP组中相比，在p75ECD处理组中皮质和海马中Tau-phospho-Ser396阳性神经元的面积分数显著更低(图12a、b、c和d)。在处理组的脑中，在包括第396、262、199位丝氨酸和第231位苏氨酸的多个位点处Tau蛋白磷酸化的水平一致且显著地降低(图12e和f)。这些发现表明p75ECD提供保护对抗Tau蛋白过磷酸化。
实施例5用p75ECD-Fc治疗Tau蛋白病小鼠
在患有阿尔茨海默病或额颞叶痴呆(FTD)的患者的脑中，过磷酸化的tau蛋白的聚集体是显著的。在家族性FTD病例中鉴定到tau突变后，已将它们在动物模型中重现。这包括我们以前产生的转基因模型pR5，其在神经元中表达FTD(P301L)突变体微管结合蛋白tau(MAPT)(Deters等，2008)。该小鼠的特征在于tau蛋白聚集，包括缠结(NFT)形成、记忆缺损和线粒体功能障碍。在本实验中，将3月龄pR5小鼠随机分成两个不同的组。在治疗的第一周，将10mg/kg的p75ECD-Fc或5mg/kg的Fc重组蛋白每周两次通过腹膜内注射给药到小鼠，以便在小鼠血浆中提供足够量的蛋白。然后对于3个月的总治疗时间的剩余时间段来说，所述小鼠每周两次通过腹膜内注射接受在150-200μl体积的PBS中的5mg/kg的重组p75ECD-Fc或2.5mg/kg的重组Fc蛋白。
p75ECD-Fc对患有Tau蛋白病的小鼠的认知功能的影响
为了在PR5小鼠中评估p75ECD-Fc对学习和记忆功能的影响，将12只3月龄小鼠分成两组，并接受p75ECD-Fc或Fc重组蛋白3个月。对野生型小鼠进行平行测试。使用一组年龄和性别匹配的野生型小鼠作为对照。PR5小鼠的Morris水迷宫(MWM)试验显示，与Fc组相比，p75ECD-Fc在学习试验的第2、4和5天期间显著减少逃避潜伏时间(图13A)，并且在学习试验的第2、3和5天期间显著减少行进距离(图13B和C)。野生型和p75ECD-Fc组中的学习过程得到改善。在野生型组中，在学习过程中观察到与第1天相比，在第3、4和5天中逃避潜伏期和行进距离的显著减少。在p75ECD-Fc组中，在学习过程中，与第1天相比，在第4和5天中逃避潜伏期和行进距离减少，而在学习过程中，在Fc组中没有观察到学习的显著改进。然而，p75ECD-Fc在探索试验期间不改变在目标象限中的平均时间(图13D)、进入平台象限的次数(图13E)。在不同组之间，在探索试验中穿越平台的次数不变(图13F)。所述结果表明在PR5小鼠中p75ECD-Fc可以改善学习过程。
p75ECD-Fc降低PR5小鼠脑中BACE1的表达和sAPPβ生产
为了在PR5小鼠中评估p75ECD-Fc对AD标志的影响，对来自于p75ECD-Fc和Fc处理组两者的脑裂解物进行Western印迹，并与用于测量AD生物标志物蛋白BACE1、sAPPβ和全长APP(APP.FL)的不同第一抗体温育。在Western印迹数据中，PR5小鼠脑中BACE1和sAPPβ的表达水平证实了p75ECD-Fc显著降低BACE1表达(p<0.05)(图14A和B)。此外，还观察到在PR5小鼠中，与Fc组相比，p75ECD-Fc处理组中sAPPβ的水平降低(图14A和C)。
在PR5小鼠脑中p75ECD-Fc抑制Tau蛋白磷酸化(p.Ser202和Thr205)
为了在PR5小鼠中测试p75ECD-Fc是否抑制Tau蛋白磷酸化，对来自于用p75ECD-Fc或Fc处理的PR5小鼠的脑裂解物进行Western印迹分析，以便使用小鼠phosphor-PHF-TaupSer202+Thr205单克隆(AT8)抗体检测Tau磷酸化的蛋白。我们的数据表明，在PR5小鼠中p75ECD-Fc显著减少Tau(Ser202和Thr205)磷酸化(p<0.01)(图15A和B)。
在整个本说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则短语“包含”和“包括”及其变化形式应该被理解为暗示包含所陈述的整数或一组整数，但是不排除任何其他整数或一组整数。
在本说明书中对任何现有技术的参考，不是并且也不应被认为是承认以下任何形式的建议：这些现有技术形成公知常识的一部分。
本领域技术人员将会认识到，本发明的用途不限于所描述的具体应用。在优选实施方式中，本发明也不限于本文中描述或描绘的具体要素和/或特征。应该认识到，本发明不限于所公开的一个或多个实施方式，而是能够进行大量的重新排列、修改和替换，而不背离由权利要求所阐述和定义的本发明的范围。
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Claims (6)

1.p75细胞外结构域(p75ECD)在制备用于治疗和/或预防脑淀粉样血管病(CAA)的药物中的用途，其中所述p75ECD由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的用途，其中所述p75ECD被融合到免疫球蛋白的Fc结构域，以形成p75ECD-Fc融合体，其中所述p75ECD-Fc由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成。
3.权利要求2的用途，其中所述p75ECD-Fc融合体以p75ECD-Fc融合体腺相关病毒(AAV)载体的形式给药。
4.权利要求2的用途，其中所述p75ECD-Fc融合体是重组肽。
5.权利要求1的用途，其中所述p75ECD通过腹膜内、脑室内、鞘内或肌内注射来给药。
6.权利要求1的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防CAA的对象是人类。
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Denomination of invention: Diagnostic or therapeutic methods for neurological disorders using P75ECD and/or P75

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Pledgee: Bank of Jiangsu Co.,Ltd. Suzhou Branch

Pledgor: SUZHOU AUZONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980001477

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