KR20200033880A - 항체 결합 활성 알파 시누클레인 - Google Patents

Abstract

α-시누클레인에 결합하고, tau 소섬유에 결합하는 단클론성 항체, 및 단클론성 항체의 사용 방법이 제공된다. 단클론성 항체는 하이브리도마 클론 2F11일 수 있다. 또한 단클론성 항체 2F11 및 제약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 비히클 또는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다. 필요로 하는 대상체에서 활성 α-시누클레인을 감소시키는 방법이 또한 개시된다. 그 방법은 대상체에게 2F11을 포함하는 조성물의 소정량을 투여하는 단계를 포함한다. 단클론성 항체 2F11은 또한 생물학적 샘플 중의 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다.

Description

항체 결합 활성 알파 시누클레인

본 발명은 α-시누클레인에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한 항체의 사용 방법이 기술된다.

파킨슨병 (PD)은 전세계적으로 대략 천만명에게 영향을 미치는 신경퇴행성 장이며, 그중 약 15%가 루이 소체(Lewy bodies)로 인한 치매 (DLB)를 앓고 있다. 이들은 지금까지 그것의 신체에서의 주요 기능이 대부분 알려지지 않긴 하지만, 질환에 관여하는 단백질인 α-시누클레인을 포함하는 핵심 병리를 나타낸다. 질환 자체는 1차 운동 증상: 휴식 중 떨림, 운동완서증(bradykinesia), 강직, 자세 불안정, 뿐만 아니라 후각 상실, 변비, REM 행동 장애, 기분 장애 및 건망증을 포함한 비운동 증상을 포함한 광범위한 증상에 의해 특징지어진다. 최근에 α-시누클레인의 응집은 또한 다계통 위축 (MSA)에 포함되는 것으로 밝혀졌다. 루이 소체에 더불어, 단백질의 축적은 엑손과 수상돌기가 신장되고 영양을 잃어버리게 되는 루이 뉴라이트를 초래할 수 있다. 루이 소체를 형성하는 응집체로서 α-시누클레인의 축적 및 침착은 신경 조직에서 10 내지 20 μm 봉입체로서 시각화될 수 있다. DLB에서 이들 형성은 광범위하고, 질환과 관련된 증상들로 이어진다.

Tau는 축삭 수송 및 뉴런 무결성을 유지하는 데 관련된 미세소관-관련 단백질임 수상돌기에서 생리적 역할을 한다. Tau는 또한 교질 세포에서 저수준으로 발현된다. 성인 뇌에서, tau의 6개의 이소형태가 MAPT 유전자로부터의 대체 스프랄라이싱에 의해 발현된다. MAPT 유전자의 돌연변이는 tau 단백질의 축적과 관련된 유전성 질환으로 이어진다. 타우병증은 뇌에서의 비정상적인 tau 단백질의 침착을 특징으로 한 신경퇴행성 질환이다. 신경병리학적 표현형은 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 이전에 신경소섬유 엉킴 전용 치매로서 알려진 1차 연령 관련 타우병증, 구형 신경교 타우병증을 포함한다 (Kovacs, G.G, 2015, Neuropathol. App. Neurobiol., 41, 3-23). 알츠하이머병은 뇌에서의 아밀로이드 플라크 및 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하며, 이때 tau 단백질은 엉킴의 1차 구성요소가 된다 (Congdon, E.E., and Sigurdsson, E.M., Nat. Rev. Neurol., published on-line June 12, 2018, Nature.com/nrneurol).

전통적으로, α-시누클레인-함유 루이 소체는 파킨슨병과 관련이 있고 Tau-함유 신경소섬유 엉킴은 알츠하이머병 및 다양한 전두측두엽성 치매 증후군과 관련이 있었다. 그러나, 신경퇴행성 질환의 스펙트럼에서 α-시누클레인과 Tau 병리의 상당한 중복 및 동시 발생이 있다. 예를 들어, α-시누클레인 응집체 (루이 소체)는 알츠하이머병의 가족성 및 산발적 형태에서 높은 백분율 (60%)로 발견되는 한편, tau 응집체 (신경소섬유 엉킴, NFT)는 파킨슨병에서 관찰되었다. 추가적으로, 루이 소체 및 신경소섬유 엉킴은, 단백질이 생체내에서 서로의 응집 생성물에서 발견되었기 때문에, 동시-국지적으로 관찰되었다 (Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304).

알파-시누클레인은 직접적으로 tau에 결합하여 tau의 섬유화(fibrillization)를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Benussi, L. et. el. 2005, Exp. Cell Res. 308:78-84; Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304). 그 결과로서, α-시누클레인 및 Tau는 병리학적으로 잘못 접히고 응집하기 쉬운 단백질이다. 잘못 접힘은 다발성 신경퇴행성 질환에서 불용성 단백질 포함으로 응집된 α-시누클레인 및 Tau의 뇌 축적에서 정점을 찍는 동종-올리고머화 및 응집 캐스케이드를 시작한다 (Yan, X et. al., 2018 Seminars Cell Devel. Biol. available at URL: doi.org/10.1016/j.semcdb.2018.05.005).

알파-시누클레인 단백질은 3가지 주요 이소형태로서 존재하며, 그 중 가장 긴 것은 길이가 140개 아미노산이다. 그것은 시토졸성 단백질이지만, 소량이 소포 내에 함유되기도 하고, 세포외유출이 일어날 수 있다. 이 단백질은 혈액 및 뇌척수액에서 검출되었다 (Borghi et al., 2000; El-Agnaf et al., 2006; Kasuga et al., 2010). 세포외재성 α-시누클레인은 뉴론 사망 및 염증을 유발할뿐만 아니라 뇌 전체에 질환을 확산시키는 데 관여할 수 있다 (Desplats et al., 2009).

α-시누클레인이 프리온-유사 특성을 갖는 질환 형성 실체가 되어가는 과정은 잘 알려져 있지 않다. 알파-시누클레인은 프리온-유사 활성이 없는 단량체, 가용성 단백질로부터 프리온-유사 활성을 가진 불용성 응집체가 되기까지 미지수의 중간체 및/또는 중간체 집단을 통한 복잡한 경로를 취할 수 있다 (예를 들어 도 1: 선행 기술; Roberts H.L., Brown D.R., 2015, Biomolecules 5:282-305 참조). 프리온-유사 활성을 가진 불용성 응집체는 가용성 α-시누클레인을 영입할 수 있고 그것을 막과 시토졸 상에서 발견된 나선 형태로부터 β-시트 구조로의 구조적 변화를 포함하는 과정에 의해 응집체로 변경시킬 수 있다 (Bartels et al, 2011; Wang et al, 2011). 그러나, 동일한 단백질의 단량체를 영입하고 그것의 섬유화를 촉진할 수 있는 α-시누클레인 응집체를 생성하는 과정은 형성되는 올리고머 집단의 미지의 세트로 시작된다.

인간 알파 시누클레인의 12개의 아미노산 펩타이드 서열 (잔기 71 내지 82; β-시누클레인에는 없음)은 단백질의 섬유화에 필요하며 충분한 것으로 나타난다. 이 펩타이드는 단백질 가수분해에 대해 내성이며, α-시누클레인 필라멘트의 핵심이 될 수 있다. 71 내지 82개 아미노산 서열에 상응하는 합성 펩타이드는 필라멘트로 자체 중합 가능하고 시험관내에서 동시 조립되어 전장 α-시누클레인의 조립을 촉진할 수 있다 (Giasson et al., 2001). 이 펩타이드는 분자간 β-시트를 가역적으로 형성하고 단량체 형태 및 올리고머 형태 사이의 평형을 증명한다 (Bedard et al., 2014). 음이온성 소포와 접촉할 때 펩타이드는, 대부분 β-시트 형성을 특징으로 하는, 비가역적 자체 응집을 포함하는 형태적 변화를 진행한다. 이것은 천연 α-시누클레인 단백질의 구조적 및 일반적 특성을 반영한다.

막 음이온성 소포는 α-시누클레인 71 내지 82 펩타이드 단독과의 신속한 응집체 형성을 보여준다. 나아가, 천연 α-시누클레인은 막과 상호작용할 때 (Jo et al, 2000, Lee et al., 2002) 및 다중 불포화 지방산과 상호작용할 때 (Perrin et al., 2001) 올리고머화로 이어지는 잘못 접힘 또는 형태적 변화를 진행할 수 있다. 나선형 α-시누클레인은 음이온성 인지질 막 상에서 소섬유(fibril)를 함유하는 β-시트로 직접 전환될 수 있다 (Comellas et al., 2012). 동일한 단백질의 단량체를 영입할 수 있는 α-시누클레인 응집체를 생성하기 위한 프로토콜 (Volpicelli-Daley et al., 2014)은 로터 속도, 바이알 크기 및 형상 (α-시누클레인을 함유함)의 작은 변화가 바이알 내에서 형성된 거품의 크기에 영향을 미칠 수 있고, 그러므로, 섬유화 과정에 이용할 수 있는 표면적이 직접 계면의 활성화 단계를 간섭한다는 단점을 가진다. US 2004/0143093은 계면의 활성화와 관련된 문제를 해결하기 위하여 특수화된 장비 및 농도 의존성 소수성 계면의 사용을 교시한다. 추가적으로, α-시누클레인의 카르복시 말단 돌연변이는 천연 야생형 α-시누클레인이 섬유화하지 않는 조건 하에서 섬유화를 나타낸다 (Murray et al., 2003).

α-시누클레인 소섬유가 본질적으로 독성인 정도는 명확하지 않다. 성숙한 α-시누클레인 소섬유는 소섬유 조립 및 분해에 의해 생성된 올리고머 집단과 동적 평형 형태로 존재한다. 올리고머의 이종성 혼합물 (크고 작은)은 거의 생리적 조건 하에서 형성될 수 있다 (Cremades et al., 2012). 소섬유가 분해할 때, 생성물은 단량체의 존재 하에 새로운 소섬유의 성장의 근원이 될 수 있다. 소섬유 분해는 생체내에서 세포 배양 중에 α-시누클레인 응집체의 전송 중에 (Desplats et al., 2009), 및 시누클레인병증 모델에서 (Hansen et al, 2011) 일어날 수 있다.

프리온-유사 활성은 올리고머 집단에 의해 직접적으로, 또는 소섬유 분해에 의해 생성된 올리고머 집단으로부터 유발될 수 있는데, 예를 들어, 소섬유 절단은 α-시누클레인 섬유화를 가속화하고 (Shvadchak et al., 2015), 상이한 구조를 가진 올리고머 집단은 소섬유 형성에 대해서는 억제성이거나 소섬유 형성에 대해서는 활성화되었다 (Horvath et al.,2013). 이들 결과는 올리고머 집단이 소섬유 집단을 향해 "경로 상에" 또는 "경로 외에" 있을 수 있음을 시사한다.경로 상의 올리고머 (Lashuel et al., (2002), Kostka et al., (2008), Zhang et al. (2013)), 및 경로 외 올리고머 (Lorenzen et al., (2014), Cherny et al. (2005))는 두 경우 모두 확인되었다.

루이 소체 기저 연구 (Volpicelli-Daley et al., 2014의 방법을 사용함)를 위해 α-시누클레인 응집체 (또한 사전 형성된 소섬유 또는 PPF로도 언급됨)를 제조하는 과정은 α-시누클레인의 기존의 올리고머를 감소시킬 수 있고 (Ariesandi et al., 2013) α-시누클레인 응집체 제조에서 (독성이 없는 다른 올리고머 또는 응집체 집단에 비해) 독성 올리고머 집단 또는 응집체의 수준에 대한 불확실성을 초래한다.

다클론성 및 단클론성 항체는 재조합 α-시누클레인 및 그것의 부분 펩타이드에 대해 만들어졌다 (Giasson, B. I. et al, 2000; Luk et al., 2009). Masliah 등 (Masliah et al., 2005, 2011)은 항-α-시누클레인 항체를 사용한 α-시누클레인에 대한 능동 및 수동 면역화가 α-시누클레인의 침착 및 시누클레인병증의 유전자도입 모델에서 시냅스 손실을 감소시켰음을 교시한다. Bae 등 (Bae et al (2012))은 세포외 α-시누클레인의 전달이 항체로의 면역화에 의해 감소 또는 중단된 것과, 이런 감소된 전달이 미세아교 세포에 의해 우선적으로 수행되어 단백질의 제거 메커니즘을 제공하는 것을 보여주었다. 이들 연구에서, (재조합 단량체 인간 α-시누클레인에 대해 발생된) 항체는 선형 서열 및 확인된 변성된 단량체에 대해 특이적이었다. 항체는 α-시누클레인 올리고머의 구조적, 3차원 형태와 결합하지 않았다. 예를 들어, 단클론성 항체 274 (Bae et al, 2012) 또는 9E4 (및 다른 단클론성 항체; Masliah et al. 2011)는 응집된 형태에서뿐 아니라, 단량체에서 α-시누클레인의 선형 서열을 확인함으로써 α-시누클레인의 응집체 또는 단량체 형태 사이를 구별하지 않는 것으로 관찰되었다.

Lee 등 (2011)은 변성된 α-시누클레인에 대해 감소된 친화도를 가지는 (웨스턴 블롯팅에서) 2개의 단클론성 항체 클론 169 및 171을 확인하였고 전장 변성 재조합 α-시누클레인을 확인하였다.

US 8,809,506은 화학적으로 변경된 α-시누클레인 프로토피브릴(protofibril)과 올리고머 (4-옥소-2-노넨알 및 4-하이드록시-2-노넨알로 화학적으로 변형됨)의 혼합물에 대한 단클론성 항체를 제조하였다. 단클론성 항체는 그것이 독성인 α-시누클레인의 하위집단에 결합하는지, 또는 그것이 독성인 다량체 α-시누클레인 집단에 의해 생성된 선형 또는 3차원 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위해 테스트되지 않았다.

US 8,940,276은 α-시누클레인에 대한 항체를 발생시키는 것을 교시한다. 항체는 독성과 무독성 α-시누클레인 집단 사이를 구별할 수 없었다. 알파-시누클레인은 웨스턴 블롯에서 단량체로서 확인되었고, 그것은 항체가 독성 올리고머에 의해 생성된 3차원 에피토프에 결합하지 않는 것을 시사한다 (그것은 웨스턴 블롯에서 사용된 SDS, 환원된, 끓인 샘플에는 없었을 것이다).

US 9,084,832는 ELISA 기법을 사용하여 α-시누클레인에 대한 항체를 특성화하는데, 상기 기법은 전-소섬유 집단에 대한 높은 친화도를 가지는 것으로 나타나지만, 만약 α-시누클레인 집단이 프리온-유사하거나 독성이라면 표시가 없다. 추가적으로, 항체는 (독성) 올리고머에 특이적인 3차원 형태보다는 오히려, 특이적인 짧은 선형 에피토프에 결합한다.

Ariesandi 등 (2013)은 PPF를 만들기 위한 열처리 포괄 과정이 기존의 올리고머 농도를 감소시키는 것을 교시한다. 이 결과는 상기 선행 기술에서 기술된 항체가 "경로 상에" 있는 α-시누클레인 올리고머의 독성 집단을 표적으로 하는지 또는 "경로 외에" 있는 무독성 올리고머를 표적으로 하는지에 관한 의문을 추가로 제기한다.

α-시누클레인 단백질의 생리적 기능은 알려져 있지 않다. 단백질의 독성은 (소섬유보다는) 문헌에서 잘 규정되어 있지 않은 α-시누클레인 올리고머의 하위집단에 관련되는 것으로 여겨진다. 이들 하위집단 유형 및 농도는 동적이며 생체내에서 조립 및 분해되는 것으로 여겨진다. 악성, 프리온-유사 (독성) 형태 α-시누클레인에 결합할 수 있는 항체를 생성할 필요가 있다.

본 발명은 α-시누클레인에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한 항체를 사용하는 방법이 기술된다.

본 발명에 따르면 수탁 번호 ATCC #PTA-124174 (2017년 5월 11일에 ATCC에 수령됨)를 갖는 하이브리도마에 의해 생성된 단클론성 항체인, 활성 α-시누클레인에 결합하는 단클론성 항체, 또는 분리된 단클론성 항체, 2F11이 제공된다. 또한 본원에는 2017년 5월 11일에 수령된 수탁 번호 ATCC#PTA-124174를 갖는 하이브리도마에 의해 생성된 단클론성 항체의 가변 경쇄, 가변 중쇄, 또는 가변 경쇄 및 가변 중쇄 둘 다를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 기술된다. 또한 본원에서 또한 기술되는 제약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 비히클 또는 부형제에 단클론성 항체 2F11을 포함하는 조성물 또는 백신이 제공된다.

또한 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 감소를 필요로 하는 대상체에서 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유를 감소시키는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 상기 기술된 조성물, 또는 백신의 소정량을 투여하는 단계를 포함한다. 조성물 또는 백신은 대상체에게 경구로, 비강내로, 근육내로, 복강내로, 정맥내로, 또는 피하로 투여될 수 있다. 필요에 따라, 투여 단계 전에, 대상체에서의 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 수준이 측정될 수 있고, 투여 단계 후 일정 시간이 지난 후, 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 하나 또는 하나 이상의 제2 수준이 측정될 수 있다.

또한 본원에서 α-시누클레인, tau 소섬유, 또는 이것들의 조합에 결합하고, 상보성 결정 영역 (CDR)을 규정하는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 단클론성 항체 2F11이 기술된다:

중쇄:

DYYMF (SEQ ID NO:14);

WNDPENGDTEYAPKFQG (SEQ ID NO:15);

NAWDGNYV (SEQ ID NO:16);

경쇄:

TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO:17)

STSNLAS (SEQ ID NO:18)

HQYHRSPPMYT (SEQ ID NO:19).

또한 SEQ ID NO:14 내지 19에 의해 규정된 단클론성 항체의 CDR을 암호화하는 핵산 서열이 제공된다. 예를 들어, 단클론성 항체 2F11의 CDR을 암호화하는 핵산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다:

중쇄:

gactactatatgttt (SEQ ID NO:20)

tggaatgatcctgagaatggtgatactgaatatgccccgaagttccagggc (SEQ ID NO:21)

aatgcatgggatggtaactatgtt (SEQ ID NO:22)

경쇄:

actgccagctcaagtgtaagttccagttacttgcac (SEQ ID NO:23)

agcacatccaacctggcttct (SEQ ID NO:24)

caccagtatcatcgttccccacccatgtacacg (SEQ ID NO:25)

또한 본원에는 인간 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유에 결합하고, 각각 SEQ ID NO:14 내지 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 3개의 중쇄 가변 영역 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:17 내지 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 3개의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단클론성 항체, 또는 분리된 단클론성 항체가 기술된다. 단클론성 항체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:20 내지 25에 의해 정의된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 나아가, 단클론성 항체는 α-시누클레인 활성 응집체, 또는 tau 응집체, 또는 이것들의 조합에 결합하는 것으로서 특성화된다. 제약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 비히클 또는 부형제에, 상기 기술된 단클론성 항체를 포함하는 조성물 또는 백신이 또한 본원에 기술된다.

또한 본원에는 3개의 VH 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고 SEQ ID NO:14 내지 16에 정의된 아미노산 서열을 포함하는 단클론성 항체 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열이 기술된다. 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터 또한 기술된다.

혈액 뇌 장벽을 넘어 이동하기 위한 다중특이적 항체가 또한 본원에 기술된다. 다중특이적 항체는 수탁 번호 ATCC #PTA-124174를 갖는 하이브리도마 (2017년 5월 11일에 ATCC에 수령됨)에 의해 생성된 단클론성 항체 2F11에 부착된 하나 또는 하나 이상의 담체 분자를 포함한다. 다중특이적 항체는 삼중특이적 또는 이중특이적 항체, 예를 들어 1가-이중특이적 항체 또는 2가-이중특이적 항체일 수 있다. 나아가, 다중특이적 또는 이중특이적 항체의 하나 또는 하나 이상의 담체 분자는 트랜스페린 수용체 (TfR)-결합 항체로부터, 또는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 IGF1R)-결합 항체로부터 유래될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 비히클 또는 부형제에, 상기 기술된 다중특이적, 삼중특이적 또는 이중특이적 항체를 포함하는 조성물 또는 백신이 또한 본원에 기술된다.

또한 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유를 감소시킬 필요가 있는 대상체에서 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유를 감소시키는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 상기 기술된 조성물, 또는 백신의 소정량을 투여하는 단계를 포함한다. 조성물 또는 백신은 대상체에게 경구로, 비강내로, 근육내로, 복강내로, 정맥내로, 또는 피하로 투여될 수 있다. 필요에 따라, 투여 단계 전에, 대상체에서의 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 수준이 측정될 수 있고, 투여 단계 후 일정 시간이 지난 후, 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 하나 또는 하나 이상의 제2 수준이 측정될 수 있다.

샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 측정하는 방법이 또한 본원에서 기술된다. 방법은

i) 샘플의 일부분을 활성 α-시누클레인 단량체와 결합하지 않는 대조군 항체와 사전 혼합한 후 재조합 활성 α-시누클레인 단량체를 첨가하여 대조군 처리를 생성하는 단계,

ii) 샘플의 제2 부분을 단클론성 항체 2F11 (ATCC #PTA-124174, 2017년 5월 11일에 수령됨)과 사전 혼합한 후, 재조합 활성 α-시누클레인 단량체를 첨가하여 활성 처리를 생성하는 단계,

iii) 티오플라빈 검정을 사용하여 대조군 처리 및 활성 처리 둘 다에서 β-시트 구조 형성의 양을 측정하며, 여기서 활성 처리에서 티오플라빈 형광의 감소는, 대조군 처리와 비교할 때, 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함한다.

샘플 중의 tau 응집의 존재를 측정하는 방법이 제공된다. 그 방법은:

i) 샘플의 일부분을 대조군 항체와 사전 혼합한 후 tau 단량체를 첨가하여 대조군 처리를 생성하는 단계,

ii) 샘플의 제2 부분을 단클론성 항체 2F11 (ATCC #PTA-124174)와 사전 혼합한 후, tau 단량체를 첨가하여 활성 처리를 생성하는 단계, 및

iii) 대조군 처리 및 활성 처리 둘 다에서 β-시트 구조 형성의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 여기서 활성 처리에서 β-시트 구조 형성의 양의 감소는, 대조군 처리와 비교할 때, 샘플 중의 tau 응집의 존재를 나타낸다.

샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 측정하는 대체 방법이 또한 기술된다. 방법은 샘플을 단클론성 항체 2F11 (ATCC #PTA-124174, 2017년 5월 11일에 수령됨)에 노출시키는 단계, 및 단클론성 항체 2F11이 샘플 중의 단백질에 결합하는지를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 결합은 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 나타낸다. 샘플은 노출 단계 전에 비변성 전기영동을 사용하여 분리될 수 있고, 분리된 단백질은 단클론성 항체 2F11을 사용하여 웨스턴 분석을 통해 탐지되는데, 여기서 하나 이상의 고분자량 단백질의 결합은 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 나타낸다. 대안적으로, 비변성 샘플의 돗트 블롯은 단클론성 항체 2F11을 사용하여 탐지될 수 있고, 단클론성 항체 2F11의 샘플에의 결합은 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 나타낸다.

샘플 중의 tau 응집의 존재를 측정하는 방법이 또한 기술된다. 그 방법은 샘플을 단클론성 항체 2F11 (ATCC #PTA-124174, 2017년 5월 11일에 수령됨)에 노출시키는 단계, 및 단클론성 항체 2F11이 샘플 중의 단백질에 결합하는지를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 결합은 tau 응집의 존재를 나타낸다. 샘플은 노출 단계 전에 비변성 전기영동을 사용하여 분리될 수 있고, 분리된 단백질은 단클론성 항체 2F11을 사용하여 웨스턴 분석을 통해 탐지되는데, 여기서 하나 이상의 고분자량 단백질의 결합은 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 나타낸다. 대안적으로, 비변성 샘플의 돗트 블롯은 단클론성 항체 2F11을 사용하여 탐지될 수 있고, 단클론성 항체 2F11의 샘플에의 결합은 tau 응집의 존재를 나타낸다.

샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재, 농도, 또는 존재 및 농도 둘 다를 측정하는 추가적인 방법이 제공된다. 그 방법은 샘플을 단클론성 항체 2F11 (ATCC #PTA-124174)을 사용하여 제조된 표면에 적용하는 단계 및 단클론성 항체에 결합된 활성 α-시누클레인 응집체의 발생, 양, 또는 발생 및 양을 측정함으로써 샘플 중의 활성 α-시누클레인 응집체의 존재, 농도, 또는 존재 및 농도 둘 다를 측정하는 단계를 포함한다.

샘플 중의 tau 응집의 존재, 농도, 또는 존재 및 농도 둘 다의 측정 방법이 또한 제공된다. 그 방법은 샘플을 단클론성 항체 2F11 (ATCC #PTA-124174)을 사용하여 제조된 표면에 적용하는 단계 및 단클론성 항체에 결합된 tau 응집의 발생, 양, 또는 발생 및 양을 측정함으로써 샘플 중의 활성 tau 응집의 존재, 농도, 또는 존재 및 농도 둘 다를 측정하는 단계를 포함한다.

시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체가 포함된 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 또는 가족성 알츠하이머병, 타우병증, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 구상 신경교 타우병증으로 진단된 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 기술된다. 그 방법은 상기 정의된 단클론성 항체 2F11, 단클론성 2F11을 포함하는 제약학적 조성물, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

또한 본원에는 시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 또는 가족성 알츠하이머병, 타우병증, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 구상 신경교 타우병증을 치료하는 방법이 개시되며, 방법은 상기 정의된 단클론성 항체 2F11, 단클론성 항체 2F11을 포함하는 제약학적 조성물, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

이 발명의 요약은 본질적으로 발명의 모든 특징을 기술하는 것은 아니다.

발명의 이들 및 다른 특징은 첨부된 도면에 대해 참조가 이루어지는 다음의 설명으로부터 보다 분명해질 것이다:
도 1은 "경로 상에" 있는 독성 α-시누클레인 단량체로부터 아밀로이드 소섬유 형성으로 이어지는 경로를 도시한다. 선행 기술 (Roberts H.L., Brown D.R., 2015, Biomolecules 5:282-305; 또한 URL: mdpi.com/2218-273X/5/2/282에서도 이용 가능함).
도 2A는 다양한 비활성 단량체, 비활성 응집체, 활성 단량체 활성 응집체, 및 이것들의 조합의 인큐베이션 후에 α-시누클레인 베타 시트 구조 형성과 관련된 티오플라빈 검정 결과를 도시한다. 좌측 막대: 1시간 인큐베이션한 후 (37℃에서)의 형광 측정; 우측 막대: 24시간 인큐베이션한 후의 형광 측정 (37℃에서; 상세한 설명에 대해서는 실시예 참조). 도 2B는 비활성 응집체 (내독소의 부재시에 α 시누클레인 단량체로 만들어짐), 또는 활성 응집체 (내독소의 존재 하에 만들어짐)와 함께 인큐베이션된 래트 1차 대뇌피질 세포의 공초점 이미지를 도시한다. 형광은 루이 소체 병리의 검출을 위해 세린 129 포스포-특이적 항체를 사용하여 측정되었다. Hoechst: DAPI 염색; pser129: FITC-표지된 세린 129 포스포-특이적 항체. 도 2C는 활성 인간 α- 시누클레인 소섬유 (상부 패널) 및 비활성 인간 α- 시누클레인 소섬유 (하부 패널)의 전자 현미경 이미지를 도시한다. 막대: 100 nm.
도 3A는 클론 2F11로 프로빙된 마우스 뇌 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 좌측 레인: 마커 (kDa); 우측 레인: 클론 2F11. 마우스 뇌 용해물의 고분자량 밴드는 클론 2F11을 사용하여 확인되었다. 도 3B는 클론 4F1로 프로빙된 마우스 뇌 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 좌측 레인: 마커 (kD); 우측 레인: 클론 4F1. 마우스 뇌 용해물의 저분자량 밴드는 클론 4F1을 사용하여 확인되었다. 도 3C는 클론 3F8로 프로빙된 마우스 뇌 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 좌측 레인: 마커 (kDa); 우측 레인: 클론 3F8. 마우스 뇌 용해물의 저분자량 밴드는 클론 3F8을 사용하여 확인되었다. 도 3D는 클론 2F11로 프로빙된 HeLa 용해물 (α- 시누클레인을 생성하는 것으로 알려져 있음, URL: proteinatlas.org/ENSG00000145335-SNCA/cell 참조)의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 좌측 레인: 마커 (kDa); 우측 레인: 클론 2F11. 마우스 뇌 용해물의 고분자량 밴드는 클론 2F11을 사용하여 확인되었다.
도 4는 도 3A 내지 3C에서 사용된 마우스 뇌 용해물의 단백질 염색을 도시한다. 좌측 레인: 마커 (kDa); 우측 레인: 마우스 뇌 용해물의 Ponceau 염색.
도 5A는 클론 2F11로 프로빙된 면역 침전된 마우스 뇌 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 대략 60 내지 70 kDa의 α-시누클레인의 올리고머 밴드가 표시된다. 좌측 레인: 마커 (kDa); 중간 레인: 블랭크; 우측 레인: 마우스 뇌 용해물. 도 5B는 클론 2F11로 프로빙된 면역 침전된 마우스 뇌 용해물로부터의 관통액의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 대략 60 내지 70 kDa의 α-시누클레인의 올리고머 밴드, α-시누클레인의 트라이머 밴드 및 α-시누클레인의 단량체 밴드가 표시된다. 좌측 레인: 마커 (kDa); 우측 레인: 마우스 뇌 용해물.
도 6은 마우스 α-시누클레인 (상부 서열; 055043; SEQ ID NO:1) 및 인간 α-시누클레인 (하부 서열; P37840; SEQ ID NO:2)의 핵산 서열 정렬을 도시한다.
도 7은 클론 2F11을 사용하여 프로빙된, 파킨슨병 인간 뇌, 인간 뇌 및 마우스 뇌로부터 얻어진 변성된 샘플의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 좌측으로부터 우측으로: 마커 kDa; 파킨슨병에 걸린 인간 뇌; 인간 대조군; 마우스 뇌. 고분자량을 포함한, 다양한 분자량에 걸친 다중 밴드가 파킨슨병이 있거나 없는 인간 뇌 및 마우스 샘플에 존재한다.
도 8A는 클론 2F11을 사용하여 프로빙된, 파킨슨병 인간 뇌, 인간 뇌 및 마우스 뇌로부터 얻어진 샘플의 천연 웨스턴 분석을 도시한다. 좌측으로부터 우측으로: 마커 kDa; 인간 뇌 (대조군); 파킨슨병에 걸린 인간 뇌; 마우스 뇌; 블랭크; 마커 kDa; 마우스 뇌 (샘플 2); 블랭크; α-시누클레인 응집체 (활성); α-시누클레인 단량체 (활성). 도 8B는 클론 4F1을 사용하여 프로빙된, 파킨슨병 인간 뇌, 인간 뇌 및 마우스 뇌로부터 얻어진 샘플의 천연 웨스턴 분석을 도시한다. 좌측으로부터 우측으로: 마커 kDa; 인간 뇌 (대조군); 파킨슨병에 걸린 인간 뇌; 마우스 뇌; 블랭크; 마커 kDa; 마우스 뇌 (샘플 2); 블랭크; α-시누클레인 응집체 (활성); α-시누클레인 단량체 (활성). 마우스 뇌 및 마우스 뇌 2의 용해물은 상이한 공급원으로부터 유래되었고 동일한 방법을 사용하여 제조되었다. 도 8C는 2F11 (좌측 패널) 및 SPC-506 (A11; 우측 패널)에 결합하는 활성 및 비활성 α-시누클레인 응집체 (소섬유)의 돗트 블롯 분석을 도시한다. 상부 블롯: 2 μg 활성 α-시누클레인 응집체; 상부 중간 블롯: 0.5 μg 활성 α-시누클레인 응집체; 하부 중간 블롯: 2 μg 비활성 α-시누클레인 응집체; 하부 블롯: 0.5 μg 비활성 α-시누클레인 응집체. 도 8D는 인간 활성 α-시누클레인 응집체에 결합하는 2F11 나노-금 콘쥬게이트 (검은색 반점)의 전자 현미경 분석을 도시한다. 막대: 100 nm.
도 9A는 티오플라빈 활성 검정의 시간 경과를 도시한다. 샘플 (상부에서 하부로): α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM); α-시누클레인 활성 응집체 (10 nM); α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM); 티오플라빈 대조군 (25 μM). 도 9B는 항체 (2F11; 3F8; 4F1; SMC-104)의 존재 하에 시간 경과 티오플라빈 활성 검정을 도시한다. 항체는 반응이 나타날 때 (시간 0) 반응에 첨가되었다. 샘플 (상부에서 하부로): α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM); α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM) + SMC-104; α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM) + 4F1; α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM) + 3F8; α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM) + 2F11; 활성 응집체 10 nM; 활성 단량체 (100 μM); 티오플라빈 대조군 (25 μM). 도 9C는 항체 (2F11; 3F8; 4F1; SMC-104)의 존재 하에 시간 경과 티오플라빈 활성 검정을 도시한다. 항체는 반응이 시작되기 전에 샘플과 함께 사전 인큐베이션되었다. 샘플 (상부에서 하부로): α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM); α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM) + 3F8; α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM) + SMC-104; α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM) + 4F1; 활성 응집체 (10 nM); α-시누클레인 활성 단량체 (100 μM) + 활성 응집체 (10 nM) + 2F11; 활성 단량체 (100 μM); 티오플라빈 대조군 (25 μM). 도 9D는 Sprague-Dawley 래트로부터의 1차 뇌 세포의 공초점 이미지를 도시한다. 좌측 상부 패널: DAPI 및 pSer129 알파-시누클레인 항체를 사용하여 프로빙된 대조군 (DAPI 염색된 핵만이 확인됨); 우측 상부 패널: 활성 α-시누클레인 소섬유가 첨가되고 DAPI 및 pSer129 알파-시누클레인 항체로 프로브됨 (α-시누클레인 항체에 대한 결합을 나타내는 DAPI 및 pSer129 염색이 나타나며, 이것은 α-시누클레인 병리를 나타냄); 하부 패널: 활성 α-시누클레인 소섬유 + 2F11이 첨가되고 DAPI 및 pSer129 알파-시누클레인 항체로 프로브됨 (DAPI 염색과 pSer129 염색의 바탕 수준을 나타냄). 20x 배율; 막대: 250 μm. 도 9E는 2F11 항체의 존재 및 부재시의 활성 α-시누클레인 올리고머, 비활성 α-시누클레인 올리고머, 활성 α-시누클레인 단량체의 존재하의 인간 SHSY-5Y 세포의 세포 사멸을 도시한다. 세포 사멸 (%): 죽은 세포 수/총 정상 핵 x 100.
도 10은 α-시누클레인의 중복하는 펩타이드와 다양한 항체의 결합을 도시한다. 펩타이드: 1-30 aa (SEQ ID NO:3); 21-50 aa (SEQ ID NO:4); 41-70 aa (SEQ ID NO:5); 61-90 aa (SEQ ID NO:6); 81-100 aa (SEQ ID NO:7); 101-130 aa (SEQ ID NO:8); 121-140 (SEQ ID NO:9). 결합은 ELISA, 돗트 블롯 (DB), 및/또는 웨스턴 블롯 (WB) 분석을 사용하여 측정되었다.
도 11A는 2F11에 대한 가변 영역 (중쇄 - IgG1 아이소타입)의 공통 핵산 서열 (SEQ ID NO:10) 및 아미노산 서열 (SEQ ID NO:11)을 도시한다. 도 11B는 2F11에 대한 경쇄 가변 영역 (카파)의 공통 핵산 서열 (SEQ ID NO:12) 및 아미노산 서열 (SEQ ID NO:13)을 도시한다. 상보성 결정 영역 (CDR)은 밑줄로 표시된다; 리더 서열은 이탤릭체 로 표시된다.
도 12는 다중특이적 항체의 실례의 개략적인 모습을 도시한다. 이 비제한적인 실례에서, 다양한 담체 분자를 포함하는 이중특이적 항체는 개략적인 2F11 (좌측 패널)과 함께 도시된다. 이중특이적 항체는 마우스 Fc (분자의 중간 부분) 및 α-시누클레인 항체 (분자의 상부 부분)를 포함하는 카고(cargo) 분자에 공유적으로 부착된, 2가 (중간 패널) 또는 1가 (우측 패널) 변이체로서의 인슐린 성장 인자 1 수용체의 단일 도메인 (sd-IFG1R-BB; 분자의 하부 부분)을 포함한다.
도 13은 tau로의 티오플라빈 활성 검정의 시간 경과를 도시한다. 항체는 tau 소섬유와 함께 사전 인큐베이션되었고, tau 단량체는 개시를 시작하기 위해 첨가되었다. 형광은 1시간, 24시간, 또는 48시간 인큐베이션 후에 측정되었다. 샘플 (좌에서 우로): tau 단량체 + tau 소섬유 + 2F11; tau 단량체 + tau 소섬유 + SMC-104; tau 단량체 + tau 소섬유; tau 단량체; 및 tau 소섬유.

다음의 설명은 바람직한 구체예의 설명이다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하는", "가지는", "포함하는" 및 "함유하는", 및 이것들의 문법상 변용은 포괄적이거나 단부 개방형이고 추가적인, 미인용 요소 및/또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "본질적으로 ~으로 이루어지는"은 본원에서 용도 또는 방법과 관련하여 사용될 때, 추가적인 요소 및/또는 방법 단계가 존재할 수 있지만, 이들 추가가 인용된 방법 또는 용도가 기능하는 방식에 실질적으로 영향을 미치는 것은 아니라는 것을 나타낸다. 용어 "~으로 이루어지는"은 본원에서 용도 또는 방법과 관련하여 사용될 때, 추가적인 요소 및/또는 방법 단계의 존재를 배제한다. 특정 요소 및/또는 단계를 포함하는 것으로서 본원에서 기술된 용도 또는 방법은 또한, 특정 구체예에서 이들 요소 및/또는 단계로 본질적으로 이루어질 수 있고, 다른 구체예에서 이들 구체예가 구체적으로 언급되는지 여부에 관계없이 이들 요소 및/또는 단계로 이루어질 수 있다. 더불어, 단수의 사용은 복수의 사용을 포함하고, "또는"은 다르게 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "다수의"는 하나 이상, 예를 들어, 둘 이상, 3개 이상, 4개 이상, 등을 의미한다. 본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 기술분야의 통상적인 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은 주어진 값으로부터 대략 +/- 10% 변화를 나타낸다. 이러한 변화는 그것이 구체적으로 언급되는 것과 관계없이, 본원에서 제공된 임의의 주어진 값에 언제나 포함되는 것으로 인지되어야 한다. 본원에서 용어 "포함하는"과 관련하여 사용될 때 단수를 나타내는 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일치한다.

본원에서 사용되는 바, "단백질 수준" 또는 "활성 단백질의 수준"은 샘플, 대상체로부터 얻어진 샘플, 또는 대상체에서 단백질의 양, 또는 상대적인 양을 나타낸다. 단백질 수준은 샘플의 상태를 결정하기 위해 참조 또는 대조군 단백질 수준과 비교될 수 있다. 대상체의 단백질 수준은 절대량, 예를 들어 나노그램/ml 또는 마이크로그램/ml로 표시되거나, 또는 상대량, 예를 들어, 대조군 수준과 비교될 때 신호의 상대적 세기로서; 대조군 단백질 수준과 비교될 때 퍼센트 또는 "배수" 또는 "배수 변화" 증가로서 표현될 수 있다.

유사한 방식으로, 대상체에서 전사물의 "발현 수준"은 대상체의 진단되지 않은 생물학적 샘플 중의 전사물의 양을 나타낸다. 발현 수준은 샘플의 상태를 결정하기 위하여 참조 발현 수준과 비교될 수 있다. 대상체의 발현 수준은 절대량 (예컨대, 나노그램/ml 또는 마이크로그램/ml) 또는 상대량 (예컨대, 신호의 상대적인 세기; 퍼센트 또는 '배수" 또는 "배수 변화" 증가)으로 표시될 수 있다.

도 1에서 나타낸 것과 같이, α-시누클레인은 프리온-유사 활성이 없는 단량체, 가용성 단백질로부터 프리온-유사 활성을 가진 불용성 응집체로 되기까지 미지수의 중간체 및/또는 중간체 집단을 통한 복잡한 경로를 취할 수 있다 (예를 들어 도 1 참조: 선행 기술; Roberts H.L., Brown D.R., 2015, Biomolecules 5:282-305, 본원에 참조로 포함됨). 프리온-유사 활성을 가진 불용성 응집체는 가용성 α-시누클레인을 영입하고 α-시누클레인 응집 과정을 시딩할 수 있다.

α-시누클레인 소섬유 형성과 관련된 질환 또는 병리적 상태, 또는 시누클레인병증의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 예컨대 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 및 알츠하이머병의 가족성 사례를 들 수 있다. tau 소섬유 형성과 관련된 질환 또는 병리적 상태, 또는 타우병증의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 전두측두엽성 치매, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 파킨슨병, 픽병, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 및 구상 신경교 타우병증을 들 수 있다.

"α-시누클레인 단량체의 종(species)", 또는 "α-시누클레인 단량체 종"은 α-시누클레인 단량체 (무활성 또는 비활성 α-시누클레인 단량체로도 언급될 수 있음), 및 활성 α-시누클레인 단량체 (독성 α-시누클레인 단량체로도 언급될 수 있음)의 그룹을 포함한다.

"α-시누클레인 올리고머의 종" 또는 "α-시누클레인 올리고머 종"은 무활성 α-시누클레인 올리고머 ("경로 외" 올리고머로도 언급됨), 활성 α-시누클레인 올리고머, 또는 독성 α-시누클레인 올리고머 ("경로의" α-시누클레인 올리고머로도 언급됨)를 포함한다.

"무활성 α-시누클레인 단량체", 또는 "비활성 α-시누클레인 단량체"는 α-시누클레인의 무독성 단량체를 나타낸다. α-시누클레인 단량체의 혼합물은 조합되어 활성 α-시누클레인 올리고머를 형성하지 않는다. 그러나, α-시누클레인 단량체 (비활성) 및 활성 α-시누클레인 단량체의 혼합물은 조합되어 활성 α-시누클레인 올리고머를 형성할 수 있다.

"활성 α-시누클레인 종"은 활성 α-시누클레인 단량체, 독성 α-시누클레인 단량체, 활성 α-시누클레인 응집체, 독성 α-시누클레인 응집체, 활성 α-시누클레인 올리고머, 독성 α-시누클레인 올리고머, 경로의 올리고머, α-시누클레인을 포함하는 β-시트 구조, α-시누클레인 소섬유 중 하나 또는 하나 이상을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, "활성 α-시누클레인 단량체", 또는 "독성 α-시누클레인 단량체"는 다른 활성 α-시누클레인 단량체, 또는 활성 α-시누클레인 응집체와 조합될 때, 활성 또는 독성 α-시누클레인 올리고머의 형성, α-시누클레인, 활성 또는 독성 α-시누클레인 응집체, 또는 α-시누클레인 소섬유를 포함하는 β-시트 구조의 형성을 초래하는 α-시누클레인 단량체의 종을 나타낸다. 활성 α-시누클레인 단량체는 다른 활성 α-시누클레인 올리고머, 활성 α-시누클레인 응집체, 또는 이것들의 조합과 조합될 수 있고, 아밀로이드 소섬 유 형성의 경로를 따라 진행할 수 있다.

본원에서 사용되는 바 "활성 올리고머 α-시누클레인", "독성 α-시누클레인 올리고머", 또는 "경로의 α-시누클레인 올리고머"는 α-시누클레인 소섬유를 신장시키고 생성할 수 있는 (아밀로이드 소섬유; 도 1 참조), 프로토피브릴 올리고머를 생성하기 위해 활성 α-시누클레인 단량체 또는 활성 응집체를 영입하는 능력을 가지는 α-시누클레인 단량체의 생성을 나타낸다.

"활성 응집체" 또는 "활성 α-시누클레인 응집체"는 "사전 형성된 소섬유" (PFF)와 상호교환적으로 사용될 수 있다. PFF 또는 활성 응집체는 활성 α-시누클레인 올리고머, 둘 이상의 활성 α-시누클레인 올리고머를 포함하는 전-소섬유, 둘 이상의 활성 α-시누클레인 올리고머를 포함하는 소섬유, 또는 이것들의 조합의 집합을 나타낸다. PFF, 또는 활성 응집체는 반응을 시딩하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어 도 2B, 9B 내지 9D 참조). 활성 α-시누클레인 응집체는 "비활성 응집체"보다 더 많은 β-시트 함량 및 더 적은 α-나선을 가진다 (표 1; 실시예 2 참조).

"비활성 응집체"는 비활성 α-시누클레인 올리고머, 비활성 α-시누클레인 올리고머를 포함하는 전-소섬유, 비활성 α-시누클레인 올리고머를 포함하는 소섬유, 또는 이것들의 조합의 집합을 나타내기 위해 사용된다. 비활성 응집체는 β-시트를 형성하지 않으며 (도 2 참조), 반응을 시딩하지 않는다 (예를 들어 도 2B, 9B 내지 9D 참조).

아미노산 마우스 및 인간 사이의 퍼센트 동일성 (또는 퍼센트 유사성)은 95%이다 (도 6 참조).

영어 "퍼센트 유사성", "서열 유사성", "퍼센트 동일성", 또는 "서열 동일성은 특정 서열을 언급할 때, 예를 들어 위스콘신 대학교 GCG 소프트웨어 프로그램에서 제시된 것과 같이, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 사용된다 (예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement 참조). 비교용 서열의 정렬 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 비교용 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 Smith & Waterman의 알고리즘 (1981, Adv. Appl. Math. 2:482)을 사용하여, Needleman & Wunsch의 정렬 알고리즘 (1970, J. Mol. Biol. 48:443)에 의해, Pearson & Lipman의 유사성 방법 (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)에 대한 연구에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (예를 들어: Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해 수행될 수 있다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 실례는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘으로, 이것들은 각각 Altschul et al., (1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402) 및 Altschul et al., (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)에서 기술된다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본원에 기술된 매개변수들로, 발명의 핵산 및 단백질에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, BLASTN 프로그램 (뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 워드 길이 (W), 10의 기대치 (E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용할 수 있다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 워드 길이, 10의 기대치 (E), 및 BLOSUM62 채점 매트릭스 (Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 참조), 50의 정렬 (B), 10의 기대치 (E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보센터를 통해 대중적으로 이용 가능하다 (URL: ncbi.nlm.nih.gov/ 참조).

본원에서 사용되는 바 "참조 수준", "참조 단백질 수준", 또는 "대조군 단백질 수준"은 대상체에서 α-시누클레인 소섬유 형성과 관련된 질환 상태 또는 병리적 상태, 예를 들어 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 예를 들어 한정하는 것은 아니지만 파킨슨병을 가지는 것으로 보이는 임의의 적응증이 없는 정상적인 개체에서 또는 개체 집단에서 측정된 α-시누클레인의 양 또는 α-시누클레인 단백질의 양의 범위를 나타낸다. 예를 들어, α-시누클레인, 예를 들어 활성 α-시누클레인 단량체, 또는 활성 올리고머 α-시누클레인의 하나 또는 하나 이상의 활성 종의 참조 수준은 하나 또는 하나 이상의 정상 개체로부터 얻어진 샘플에서 확인된 α-시누클레인 (활성 α-시누클레인 단량체 또는 활성 올리고머 α-시누클레인)의 수준 또는 양을 기준으로 결정될 수 있다. 참조 수준은 절대량 (예컨대, 나노그램/ml 또는 마이크로그램/ml) 또는 상대량 (예컨대, 신호의 상대적인 세기; 대조군 수준 또는 양과 비교할 때 퍼센트 또는 '배수" 또는 "배수 변화" 증가)으로 표시될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "한계갑 수준", "한계값 양", 또는 "한계값 발현 수준"은, 예를 들어, 대조군 샘플 또는 대조군 대상체에서 확인된 α-시누클레인의 수준 또는 양과 비교할 때, 하나 또는 하나 이상의 활성 α-시누클레인 종, 활성 α-시누클레인 단량체 또는 활성 올리고머 α-시누클레인의 참조량 또는 수준을 넘어 약 1.5배수-변화 및 약 20배수-변화 사이, 또는 그 사이의 임의의 양인 생물학적 샘플 중의 α-시누클레인의 양 또는 수준을 나타낸다. α-시누클레인의 한계값 수준은 α-시누클레인 소섬유 형성, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 예를 들어 한정하는 것은 아니지만 파킨슨병과 관련된 질환 상태를 나타낼 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "기준선 수준"은 임의의 처리 전에 또는 임의의 처리 중에 결정되고 제1 생물학적 샘플이 얻어진 후의 시점에 대상체로부터 얻어진 제2 생물학적 샘플로부터 평가되는 α-시누클레인의 제2 발현 수준과 비교하기 위해 사용되는, 대상체로부터 얻어진 제1 생물학적 샘플 중의 α-시누클레인의 양 또는 수준을 나타낸다. 이런 기준선 수준은, 예를 들어, 대상체에서 α-시누클레인 소섬유 형성과 관련된 질환 상태 또는 병리적 상태, 예를 들어 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 예를 들어 한정하는 것은 아니지만 파킨슨병의 진행을 모니터링하는 데, α-시누클레인 소섬유 형성고 관련된 질환 상태 또는 병리적 상태를 가진 대상체에서 치료 요법 또는 치료 양상을 모니터링하는 데, 어떤 치료 요법 또는 치료 양상이 대상체에서 고려되어야 하는지를 결정하는 데, 어떤 치료 요법 또는 치료 양상이 대상체에서 중단되어야 하는지를 결정하는 데, 또는 어떤 치료 요법 또는 치료 양상이 대상체에서 변형되어야 하는지를 결정하는 데 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "정상적인 개체"는 본원에 기술된 하나 이상의 진단 방법 (티오플라빈 검정, 웨스턴 분석, ELISA, 또는 돗트 블롯 분석을 포함함)의 조합을 사용하여 α-시누클레인 소섬유 형성에 대해 테스트되었고, 임의의 활성 α-시누클레인 단량체 또는 활성 올리고머 α-시누클레인을 갖지 않는 것으로 결정된 개체를 나타낸다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "치료법", 및 "치료"는 수령체의 상태를 개선하려는 의도로 수행된 개입을 나타낸다. 개선은 주관적이거나 객관적일 수 있고 치료되는 질환, 장애 또는 병리적 상태와 관련된 증상의 개선, 발달의 예방, 또는 병리의 변경과 관련된다. 그러므로, 용어 치료법 및 치료는 가장 넓은 의미로 사용되고, 다양한 단계에서의 질환, 장애 또는 병리적 상태의 방지 (예방), 조정, 감소, 및 치유를 포함한다. 수령체 상태의 악화의 방지 또한 이 용어에 포함된다. 치료법/치료를 필요로 하는 것들은 이미 질환, 장애 또는 상태를 가지고 있을뿐만 아니라 질환, 장애 또는 상태가 발생하기 쉽거나, 발생할 위험이 있는 것들 및 질환, 장애 또는 병리적 상태가 방지되어야 하는 것들을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 질환 장애 또는 병리적 상태는 다음의 것과 관련된다:

α-시누클레인 소섬유 형성, 또는 시누클레인병증, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 예컨대 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 및 알츠하이머병을 가진 가족성 사례,

tau 소섬유 형성 (응집), 또는 타우병증, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 및 구상 신경교 타우병증, 또는

이것들의 조합.

본원에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유류를 나타내며, 예를 들어, 대상체는 인간일 수 있다. 대안적으로, 대상체는 비인간 영장류, 가축 또는 경작용 동물일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 원하는 효과를 생성하는 화합물의 양을 나타낸다. 예를 들어, 세포 집단, 또는 세포 추출물은 시험관내에서의 그것의 효과를 연구하기 위하여 또는 생체 외 또는 시험관내에서 원하는 치료 효과를 생성하기 위하여 화합물의 유효량과 접촉될 수 있다. 화합물의 유효량은 대상체에서 치료 효과를 생성하기 위해, 예컨대 표적 질환을 예방 또는 치료하기 위하여, 상태와 관련된 증상을 경감시키기 위하여, 또는 원하는 생리적 효과를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 경우에, 화합물의 유효량은 "치료적 유효량", "치료적 유효 농도" 또는 "치료적 유효 용량"이다. 유효량 또는 치료적 유효량은 주어진 대상체에서의 치료 효능의 관점에서 가장 효과적인 결과를 산툴할 조성물의 양이다. 이 양은, 한정하는 것은 아니지만, 화합물의 특성 (활성, 약물동학, 약물역학, 및 생체이용률을 포함함), 대상체의 생리적 상태 (연령, 성별, 질환 유형 및 단계, 일반적인 신체 상태, 주어진 투여량에 대한 반응성, 및 의약의 유형) 또는 세포의 생리적 상태, 제제 중의 제약학적으로 허용되는 담체 또는 담체들의 성질, 및 투여 경로를 포함한, 다양한 인자에 따라 다를 것이다. 적합한 담체의 비제한적인 실례로는 완충제, 안정화제, 염, 항산화제, 복합체 형성제, 동결방지제, 동결건조보호제, 현탁제, 유화제, 항미생물제, 보존제, 킬레이트화제, 결합제, 계면활성제, 습윤제, 오일과 같은 비수성 비히클, 또는 지속성 또는 제어된 방출을 위한 중합체를 들 수 있다. 예를 들어, Berge et al. 1977 (J. Pharm Sci. 66:1-19)을 참조한다. 추가로 유효량 또는 치료적 유효량은 화합물이 단독으로 또는 또 다른 화합물, 약물, 치료법 또는 다른 치료 방법 또는 양상과 함께 투여되는지에 따라 달라질 수 있다. 임상 및 약물학 기술분야의 숙련된 사람은 기본적인 실험을 통해, 즉 세포 또는 대상체의 화합물 투여에 대한 반응을 모니터링하고 그에 따라 투여량을 조정함으로써 유효량 또는 치료적 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 추가적인 안내를 위해서는, 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2005 (전체적으로 본원에 제시된 것처럼 참조로 본원에 포함됨)를 참조한다.

"생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 한정하는 것은 아니지만, 혈액 (전혈, 백혈구, 말초혈 단핵 세포, 혈장, 및 혈청을 포함함), 뇌척수액, 조직 추출물, 및 세포 추출물을 포함한, 대상체로부터 얻어진 또는 다르게는 유래된 임의의 물질, 생물학적 유체, 조직, 또는 세포를 나타낸다. 이것은 또한 전술한 모든 것의 실험적으로 분리된 분획을 포함한다. 예를 들어, 혈액 샘플은 혈청으로 또는 특정 유형의 혈구, 예컨대 적혈구 또는 백혈구 (류코사이트)를 함유한 분획으로 분획화될 수 있다. 필요에 따라, 샘플은 개체로부터의 샘플의 조합, 예컨대 조직 및 유체 샘플의 조합일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한, 예컨대 조직 샘플, 또는 조직 생검으로부터의, 균등화된 고체 물질을 함유한 물질; 또는 조직 배양 또는 세포 배양으로부터 유래된 물질을 포함할 수 있다. 조직은 정상 조직이거나 병든 조직일 수 있다.

비활성 및 활성 α-시누클레인 단량체 및 응집체는 가용성 단량체 및 불용성 응집체가 활성이고 (프리온-유사) (β-시트 구조 형성에 의해 결정되는 바) α-시누클레인을 시딩할 수 있는지, 또는 그것에 의해 시딩될 수 있는지를 결정하기 위해 평가되었다. 도 2에서 나타낸 것과 같이 (실시예 2):

a. 활성 α-시누클레인 응집체와 조합된 비활성 α-시누클레인 단량체, 비활성 응집체, 또는 비활성 α-시누클레인 단량체는 응집 과정을 시딩할 수 없었고 β-시트 구조 형성은 관찰되지 않았으며;

b. 비활성 응집체와 조합된 활성 단량체, 또는 활성 단량체는 자체-시딩할 수 있었고, 활성 단량체 및 활성 응집체 (또는 사전 형성된 소섬유; PFF)는 프리온-유사 응집 반응을 시딩할 수 있었고 β-시트 구조 형성의 증가가 관찰되었다.

활성 α-시누클레인 응집체 및 활성 α-시누클레인 단량체에 대한 마우스 단클론성 항체가 제조되었다. 비활성 버전이 아닌, α-시누클레인 단량체의 활성 형태에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마가 선택되었다. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여, 한 항체, 2F11 (ATCC #PTA-124174, 2017년 5월 11일에 수령됨)이 마우스 뇌 용해물 및 HeLa 용해물에서 고분자량 α-시누클레인 응집체 (>150kDa; 도 3A 및 3D 참조)를 식별하는 것이 관찰된 한편, 다른 α-시누클레인 단클론성 항체 (α-시누클레인 단량체의 활성 형태에의 결합에 의해서도 선택됨)는 15kDa 밴드만을 식별하였다 (4F1, 도 3B; 3F8, 도 3C).

2F11의 중쇄의 핵산 및 아미노산 서열 (SEQ ID NO:10 및 11) 및 경쇄의 핵산 및 아미노산 서열 (SEQ ID NO:12 및 13)이 도 11A 및 11B에 제공된다. 단클론성 항체 2F11은 상보성 결정 영역 (CDR)을 규정하는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

중쇄:

DYYMF (SEQ ID NO:14);

WNDPENGDTEYAPKFQG (SEQ ID NO:15);

NAWDGNYV (SEQ ID NO:16);

경쇄:

TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO:17)

STSNLAS (SEQ ID NO:18)

HQYHRSPPMYT (SEQ ID NO:19).

단클론성 항체 2F11의 CDR을 암호화하는 핵산 서열은 다음의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:

중쇄:

gactactatatgttt (SEQ ID NO:20)

tggaatgatcctgagaatggtgatactgaatatgccccgaagttccagggc (SEQ ID NO:21)

aatgcatgggatggtaactatgtt (SEQ ID NO:22)

경쇄:

actgccagctcaagtgtaagttccagttacttgcac (SEQ ID NO:23)

agcacatccaacctggcttct (SEQ ID NO:24)

caccagtatcatcgttccccacccatgtacacg (SEQ ID NO:25).

단클론성 항체 2F11은 천연 겔 전기영동 하에서 천연 샘플로부터의 α-시누클레인 단량체 (활성)가 아닌 α-시누클레인 올리고머에 결합한다. 뇌 용해물 (마우스로부터 얻음)은 2F11을 사용하여 천연 조건 하에서 면역침전되었고, 침전물 및 관통 흐름 분획은 변성 웨스턴 블롯을 사용하여 분석되었다. 2F11 항체는 면역침전된 천연 뇌 용해물에서 α-시누클레인 올리고머에 결합되었지만 (일단 변성되면 60 내지 70 kDa에서 작동), α-시누클레인 단량체 (활성)에는 결합되지 않았고, 이것은 단량체 밴드가 천연 샘플로부터의 2F11에 의해 면역침전되지 않았음을 증명한다 (도 5A). 그러나, 관통 흐름 분획의 3개의 분획은 이 분획이 변성 조건 하에서 분리되었을 때 2F11에 결합하는 것으로 관찰되었다: 대략 15 kDa의 α-시누클레인 단량체 (활성); 대략 40 kDa의 추정되는 α-시누클레인 트라이머; 및 60 내지 70 kDa의 α-시누클레인 올리고머 (도 5B), 이것은 변성 조건 하에서 (웨스턴 블롯 분석 중에 사용된 것과 같이) 2F11이 안정화된 올리고머 및 단량체 α-시누클레인 둘 다에 결합할 수 있음을 증명한다. 2F11이 tau 응집체에 선택적으로 결합하기 때문에 (도 13 참조), 이 접근법은 또한 tau 응집체의 존재를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

마우스 단클론성 항체 2F11은 인간 뇌로부터의 용해물, 파킨슨 환자로부터의 인간 뇌로부터의 용해물, 및 마우스 뇌로부터의 용해물에서, 변성 하에 (도 7), 또는 천연 조건 하에 (도 8A 및 8B) 웨스턴 블롯 분석을 사용하여, 인간 α-시누클레인에 결합하는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 2F11은 변성 조건 하에서 고분자량 및 중간 분자량 인간 및 마우스 α-시누클레인 올리고머와 결합되었다 (도 7). 천연, 비환원 조건 하에서 (도 8A), 2F11은 인간 뇌 용해물, 파킨슨 뇌 용해물, 및 마우스 뇌 용해물로부터의 고분자량, 대략 60 kDa 내지 약 250 kDa의 α-시누클레인 올리고머에 결합되었다. 그러므로, 2F11은 천연 조건 하에서 α-시누클레인 올리고머 또는 응집체를 식별한다.

4F1 항체 또한 천연 조건 하에서 고분자량 올리고머와 결합하는 것으로 관찰되었더 (도 8B). 그러나, 4F1은 정제된 병원성 (활성) α-시누클레인 단량체 또는 응집체를 인식하지 못하였다.

그러므로, 천연 시스템에서 2F11은 인간 및 마우스 α-시누클레인을 둘 다 식별하지만, 2F11 항체는 α-시누클레인 단량체 (활성)에 결합하지 않는다. 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 이들 결과는 2F11이 α-시누클레인 응집체에 결합하여 그것이 α-시누클레인 올리고머의 병원성 종, 또는 루이 소체 병리를 생성하는 경로에 직접 관여된 올리고머에 결합하도록 허용하는 것을 나타낸다.

2F11이 인간 및 마우스 α-시누클레인 둘 다와 결합할 수 있었기 때문에, 그리고 마우스와 인간 α-시누클레인 사이의 아미노산의 퍼센트 동일성 (또는 퍼센트 유사성)이 95% (도 6)이기 때문에, 2F11은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 약 95 내지 약 100%, 또는 그 사이의 임의의 %의 서열 유사성을 가지는 α-시누클레인을 식별할 수 있다. 예를 들어, 2F11은 본원에 기술된 천연 또는 변성 조건 하에서 측정되는 바, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%, 또는 그 사이의 임의의 %의 서열 유사성을 가지는 α-시누클레인을 식별할 수 있다.

단클론성 항체 2F11은 또한 시험관내에서 β-시트 구조 형성을 차단하는 것으로 관찰되었다. α-시누클레인 반응의 진행은 도 9A에 나타낸 것과 같이 측정될 수 있다. 이 검정에서, 활성 α-시누클레인 응집체의 존재 하에, 활성 α-시누클레인 단량체는 "시딩"되고, 시간의 경과에 따라 알파 나선 구조로부터 베타 시트로 변화한다 (즉 티오플라빈 형광의 증가가 관찰된다; (상부 라인)). 활성 α-시누클레인 응집체는 β-시트 구조 형성의 약간의 증가를 초래하였지만 (상부 라인으로부터 두 번째) 이 증가는 활성 α-시누클레인 단량체와 조합된 활성 α-시누클레인 응집체의 혼합물의 증가 (상부 라인)보다는 적다. 활성 α-시누클레인 단량체는 시간 경과에 따라 서서히 자체 시딩될 수 있다 (상부로부터 세 번째 라인).

α-시누클레인 반응의 진행은 2F11이 반응이 시작될 때 첨가된 경우 (도 9B), 또는 2F11이 반응이 시작되기 전 다양한 α-시누클레인 종과 함께 사전 인큐베이션된 경우에 (도 9C), 둘 다, 단클론성 항체 2F11의 존재 하에 방해된 것으로 관찰되엇다. 단클론성 항체 4F1 또는 3F8은 2F11의 효과와 비교할 때 동일한 정도로 α-시누클레인 반응의 진향을 억제하지 못하였다. 나아가, 대조군 항체 SMC-104 (hsp70에 대한 마우스 단클론성)는 에 대해 거의 또는 전혀 영향을 미치지 못하였다.

이들 결과는 β-시트 구조를 형성하기 위해 진행되는 α-시누클레인 응집 및 소섬유화 반응에 필요한 구성요소 또는 구조에 2F11 항체가 결합하는 것을 분명하게 보여준다. 그러므로 2F11 항체는 이 반응에 대해 중화 효과를 나타낸다.

이들 결과는 자연 샘플로부터의 올리고머 α-시누클레인의 악성 형태에 대한 2F11의 결합이, 비파킨슨병 뇌에 비해 파킨슨병 뇌로부터 기원하는 인간 뇌 용해물 중의 악성 α-시누클레인 올리고머의 양을 측정하기 위해, 및 인간 뇌 용해물 중의 더 많은 양의 악성 α-시누클레인 올리고머가 파킨슨병 뇌로부터 기원하는지를 확인하기 위해 사용될 수 있음을 시사한다.

그러므로, 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 측정하기 위한 방법이 제공된다. 그 방법은:

i) 샘플의 일부분을 대조군 항체와 사전 혼합한 후 재조합 활성 α-시누클레인 단량체를 첨가하여 대조군 처리를 생성하는 단계,

ii) 샘플의 제2 부분을 단클론성 항체 2F11과 사전 혼합한 후, 재조합 활성 α-시누클레인 단량체를 첨가하여 활성 처리를 생성하는 단계, 및

iii) 대조군 처리 및 활성 처리 둘 다에서 β-시트 구조 형성의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 대조군 처리와 비교할 때, 활성 처리에서 β-시트 구조 형성의 양의 감소는 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 나타낸다.

나아가, 루이 소체 (DLB) 질환을 전달할 수 있는 자연 인간 샘플로부터 분리된 α-시누클레인 올리고머는 활성 α-시누클레인 단량체를 시딩하기 위해 사용될 수 있고 β-시트 구조 형성의 시간 경과 동역학은 티오플라빈 검정 (실시예 5에서 기술된 방법을 사용함)을 사용하여 모니터링되었다. 이 검정은 샘플, 예를 들어, 뇌척수액 (CSF), 혈액, 인간 뇌 용해물, 또는 α-시누클레인 올리고머를 함유할 수 있는 다른 샘플 중의 악성 α-시누클레인 올리고머의 양을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이 검정은 의심되는 파킨슨병 뇌로부터 얻어진 샘플 (테스트 샘플)과 사용될 수 있고 그 결과는 비판킨슨병 뇌로부터 얻어진 샘플 (대조군 샘플)로부터 얻어진 결과와 비교되었고, 대조군 샘플과 비교되었을 때 인간 뇌 용해물 샘플 중의 악성 α-시누클레인 올리고머의 양의 증가는 테스트 샘플 중의 파킨슨병을 나타낸다.

tau와 α-시누클레인 사이의 알려진 상호작용 (Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304)으로 인해, tau 유도된 β-시트 구조 형성에 미치는 단클론성 항체 2F11의 영향이 또한 티오플라빈 검정을 사용하여 조사되었다. 도 13에서 나타낸 것과 같이, 2F11은 시험관내에서 Tau 소섬유, β-시트 구조 형성을 차단하는 것으로 관찰되었다. 바탕 형광 신호는 Tau 소섬유 단독, 또는 Tau 단량체 단독이 검정되었을 때 관찰되었다. 그러나, Tau 단량체와 Tau 소섬유의 혼합물은 시간이 경과함에 따라 β-시트 구조 형성을 나타내는 강력한 형광 신호의 생성을 초래한다. tau 반응의 진행은 2F11이 반응이 시작되기 전 tau 소섬유와 함께 사전 인큐베이션되었을 때 단클론성 항체 2F11의 존재 하에 방해되는 것으로 관찰되었다. 단클론성 항체 SMC-104 (hsp70에 대한 마우스 단클론성)는 tau 반응에 대해 거의 또는 전혀 영향을 나타내지 않았다. 시험관내에서 α-시누클레인 β-시트 구조 형성을 차단하기 위해 첨가된 양과 비교했을 때 더 많은 양의 2F11 항체가 시험관내에서 Tau 소섬유, β-시트 구조 형성을 차단하기 위해 필요하였다.

그러므로, 샘플 중의 tau 응집의 존재를 측정하기 위한 방법이 제공된다. 그 방법은:

i) 샘플의 일부분을 대조군 항체와 사전 혼합한 후 재조합 tau 단량체를 첨가하여 대조군 처리를 생성하는 단계,

ii) 샘플의 제2 부분을 단클론성 항체 2F11과 사전 혼합한 후, tau 단량체를 첨가하여 활성 처리를 생성하는 단계, 및

iii) 대조군 처리 및 활성 처리 둘 다에서 β-시트 구조 형성의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 대조군 처리와 비교할 때, 활성 처리에서 β-시트 구조 형성의 양의 감소는 샘플 중의 tau 응집의 존재를 나타낸다.

이들 결과는 β-시트 구조를 형성하기 위해 진행되는 α-시누클레인 응집 및 소섬유화 반응, 및 tau 반응에 필요한 구성요소 또는 구조에 2F11 항체가 결합하는 것을 분명하게 보여준다. 그러므로 2F11 항체는 이 반응에 대해 중화 효과를 나타낸다.

이들 결과는 자연 샘플로부터의 올리고머 α-시누클레인의 악성 형태에 대한 2F11의 결합이, 비파킨슨병 뇌에 비해 파킨슨병 뇌로부터 기원하는 인간 뇌 용해물 중의 악성 α-시누클레인 올리고머의 양을 측정하기 위해, 및 인간 뇌 용해물 중의 더 많은 양의 악성 α-시누클레인 올리고머가 파킨슨병 뇌로부터 기원하는지를 확인하기 위해 사용될 수 있음을 시사한다.

이들 결과는 또한 샘플로부터의 tau의 소섬유 형태에 대한 2F11의 결합이, 비질환 뇌에 비해 질환 뇌, 예를 들어 알츠하이머병 뇌로부터 기원하는 인간 뇌 용해물 중의 tau 응집체의 존재 또는 부재, 또는 양을 측정하기 위해, 및 인간 뇌 용해물 중의 더 많은 양의 tau 응집체가 질환에 걸린 뇌 조직에 존재하는지를 확인하기 위해 사용될 수 있음을 시사한다.

2F11의 에피토프 결합은 각각 길이가 대략 30개 아미노산인 일련의 중복하는 α-시누클레인 펩타이드에 대해 특성화되었다. 2F11 클론은 또한 α-시누클레인의 활성 형태 (예컨대 4F1, 3F8)에 대한 결합으로서 확인된 다른 단클론성 항체와 비교할 때, 에피토프 결합의 독특한 패턴을 나타냈다 (도 10). 이 분석에서, 2F11은 α-시누클레인의 2개의 C-말단 단편에, 위치 61 내지 90 및 101 내지 130에서 결합하는 것으로 관찰되었다. 이론에 얽매이기를 바라지는 않지만, 2F11의 에피토프 결합 특성은 그것이 알파 시누클레인 응집 및 섬유화 반응의 핵심 구성요소에 결합하고 중화시키는 것을 허용한다.

2F11 항체의 선조체내 주사는 또한 래트 피질 세포에서 로이 소체 병리의 발생을 감소시키는 것으로 관찰되었다. α-시누클레인 소섬유의 피질 조직 안으로의 투여는 α-시누클레인-특이적 항체 pSer129를 사용하여 측정되는 바 α-시누클레인 반응을 시딩하였다. 국지화된 α-시누클레인 응집체의 수, 및 응집체의 크기는 α-시누클레인 소섬유와 단클론성 항체 2F11과의 사전 인큐베이션에 의해 감소되었다. PBS 중의 α-시누클레인 소섬유로 처리된 래트로부터 얻어진 피질 조직의 섹션은 α-시누클레인 항체 (pSer129)의 α-시누클레인 소섬유에의 결합 및 α-시누클레인 응집체 형성 (핵주변 응집 또는 포함)을 가리키는 국지화된 형광을 나타냈다. 대조군 (PBS) 처리된 래트에서는 형광이 관찰되지 않았다 (α-시누클레인 응집체 형성이 없음을 가리킴). 국지화된 형광은 또한 α-시누클레인 소섬유 및 항체 3D10으로 처리된 래트 피질 세포에서 관찰되었고, 이것은 항체 (pSer129)의 α-시누클레인 소섬유에의 결합 및 α-시누클레인 응집체 형성을 가리킨다. α-시누클레인 소섬유 및 항체 3D10을 받은 피질 세포에서 국지화된 결합의 양은 α-시누클레인 소섬유가 단독으로 투여된 래트로부터 얻어진 피질 조직의 슬라이스에서 관찰된 것과 유사하였다. 국지화된 형광이 α-시누클레인 소섬유 및 항체 2F11로 처리된 래트 뇌로부터 얻어진 피질 세포에서 관찰된 한편, 국지화된 결합 부위 (핵주변 응집)의 수, 및 국지화된 결합 부위의 크기는 α-시누클레인 소섬유 단독으로, 또는 α-시누클레인 소섬유 및 항체 3D10으로 처리되었을 때 피질 세포에서 관찰된 결합 부위의 및 크기 ND 어느 하나와 비교할 때 감소하였고, 이것은 뇌 조직의 2F11 항체로의 처리가 생체내에서 래트 피질 세포에서의 루이 소체 병리의 발생을 감소시키는 것을 증명한다. 그러므로 2F11을 사용한 처리는 루이 소체-유사 포함의 형성을 방해 또는 지연시킬 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 바라지는 않지만, 피질 세포에 투여되는 2F11의 양을 증가시키는 것은 또한 생체내에서, 래트 피질 세포에서의 루이 소체 병리의 발생을 추가로 방해, 감소 및/또는 지연시킬 수 있다.

단클론성 항체는 대상체를 면역화하고 생체내에서 α-시누클레인 올리고머화 반응을 감소 또는 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, α-syn 유전자도입 (tg) 마우스 (PD 모델; Masliah et al., 2011) 및 비-tg 마우스가 2F11을 사용하여 면역화될 수 있고, 두 α-syn 유전자도입 (tg) 마우스 및 비-tg 마우스의 행동 반응 (기억 회복)이 시간 경과에 따라 평가된다. 2F11로 면역화된 Tg 마우스는 더 나은 기억 회복력을 가질 수 있고 비 tg 마우스와 유사한 방식으로 그들의 과제를 완료할 수 있음으로써 2F11 항체 처리가 학습 부족을 반전시키는 것을 증명한다.

그 결과로서, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 비히클 또는 부형제에 단클론성 항체 2F11, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적. 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체 (하기 참조)를 포함하는 조성물, 또는 백신을 고려한다. 나아가, 필요로 하는 대상체에서 활성 α-시누클레인의 활성, 또는 tau 응집을 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 그 방법은 대상체에게 소정량의 조성물, 또는 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 조성물, 또는 백신은 대상체에게 경구로, 비강내로, 근육내로, 복강내로, 정맥내로, 또는 피하로 투여될 수 있다.

또한 본원에 개시된 항체, 예를 들어 2F11, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체, 및 제약학적으로 허용되는 담체 (하기 기술됨), 보조제, 또는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물이 개시된다. 치료제, 예를 들어 2F11, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체의 투여는 기술분야에 공지되어 있는 다양한 메커니즘, 이를테면 있는 그대로의 투여를 사용하여 수행되거나, 또는 정맥내, 복강내, 피하 또는 경구 경로, 또는 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 치료제는 또한 치료제가 제약학적으로 사용될 수 있는 조제물로 가공되는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 제약학적 조성물 또는 조제물의 부분으로서 투여될 수 있다.

또한 본원에는 시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 알츠하이머병, 산발성 알츠하이머병, 또는 가족성 알츠하이머병, 타우병증, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 및 구상 신경교 타우병증으로 진단된 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 그 방법은 단클론성 항체 2F11, 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체, 단클론성 2F11를 포함하는 제약학적 조성물, 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체를 포함하는 제약학적 조성물, 단클론성 2F11을 포함하는 백신, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체를 포함하는 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

또한 시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 가족성 알츠하이머병, 타우병증, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 및 구상 신경교 타우병증으로 진단된 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한, 단클론성 항체 2F11, 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체, 2F11을 포함하는 제약학적 조성물, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체를 포함하는 제약학적 조성물의 용도가 개시된다.

또한 시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 또는 가족성 알츠하이머병, 또는 타우병증, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 및 구상 신경교 타우병증을 치료하는 방법이 개시된다. 그 방법은 대상체에게 단클론성 항체 2F11, 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체, 단클론성 항체 2F11을 포함하는 제약학적 조성물, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체를 포함하는 제약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또한 대상체에서 시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 또는 가족성 알츠하이머병을 치료하기 위한, 단클론성 항체 2F11, 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체, 단클론성 항체 2F11을 포함하는 제약학적 조성물, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체를 포함하는 제약학적 조성물의 용도가 개시된다.

또한 시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 또는 가족성 알츠하이머병을 치료하기 위한, 또는 타우병증, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 및 구상 신경교 타우병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 단클론성 항체 2F11, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체의 용도가 개시된다. 또한 시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 또는 가족성 알츠하이머병을 치료하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한, 또는 타우병증, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 및 구상 신경교 타우병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 단클론성 항체 2F11, 또는 2F11을 포함하는 다중특이적, 삼중특이적, 또는 이중특이적 항체가 개시된다.

항체는 단클론성 항체일 수 있다. 항체는 비인간, 영장류화된, 인간화된 또는 전체 인간일 수 있다. 예컨대 설치류 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 다른 아미노산 또는 서열을 인간 항체의 그것에 대해 치환함으로써 비인간 항체를 인간화 또는 영장류화하기 위한 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994) 참조; 이들 문헌은 각각 그 전문이 참조로 본원에 포함됨). 본원에서 사용되는 바, 용어 "항원 결합 도메인"은 항원 결합 활성을 가진 임의의 항체 유도체 또는 단편을 의미한다. 일부 실례에서 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 (즉 VL 및 VH 도메인)을 포함한다. 항체 단편 및 유도체의 비제한적인 실례는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv (즉 단일 사슬 Fv), scFv-Fc, 미니바디, 나노바디, 디아바디, 트라이(아)바디, 다중특이적 항체, 삼중특이적 항체, 이중특이적 항체, 등이다. 많은 다른 항체 단편 및 유도체가 알려져 있고, 그것들의 다양한 비제한적인 실례가 Deyev and Lebedenko (2008, BioEssays 30:904-918, 그 전문이 참조로 포함됨)에서 개시된다. 방법 또는 용도의 일부 구체예에서, 항원 결합 도메인은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, scFv-Fc, 미니바디, 나노바디, 디아바디 또는 트라이(아)바디이다.

하나 또는 하나 이상의 담체 분자, 및 하나 또는 하나 이상의 카고 분자를 포함하는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 또는 삼중특이적 항체를 사용하여 수용체-매개 트랜스사이토시스(transcytosis) 경로를 통해 혈액 뇌 장벽을 가로질러 치료 항체를 수송하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 트랜스페린 수용체 (TfR)-결합 항체 (및 그것의 변이체)는 담체로서 사용될 수 있고, 카고 분자, 예를 들어 2F11과 융합될 때 혈액 뇌 장벽을 가로지를 수 있는 이중특이적 항체를 생성한다 (예를 들어 Zuchero, Y. J, Y., et. Al., 2016, Neuron 89:70-82; Bien.Ly, N. et. al. 2014 J. Exp. Med. 211:233-244; US 2018/8002433; CA 3,000,560 참조; 본원에 참조로 포함됨). 대안적으로, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R)-결합 항체는 담체로서 사용될 수 있고, 카고 분자 2F11에 융합되어, 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 이중특이적 항체를 생성할 수 있다 (예를 들어 WO2015/131256; WO2015/131257; WO2015/131258; 본원에 참조로 포함됨). 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동할 수 있는, 2F11을 포함하는 1가 또는 2가 IGF1R 이중특이적 항체의 실례가 도 12에 도시된다. 절대 항체 (URL: absoluteantibody.com/custom-services/antibody-engineering/ 참조)는 다중특이적 항체의 제조를 기술한다.

그러므로, 본 개시는 또한 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동하기 위한 다중 특이적 항체, 예를 들어 삼중특이적 또는 이중특이적 항체를 제공하며, 이중특이적 항체는 단클론성 항체 2F11에 부착된 담체 분자를 포함한다. 예를 들어, 이중특이적 항체의 담체 분자는 1가-이중특이적 항체 또는 2가-이중특이적 항체 중 어느 하나일 수 있다. 이중특이적 항체는 트랜스페린 수용체 (TfR)-결합 항체, 또는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R)-결합 항체 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예로 한층 더 예시될 것이다.

실시예 1: 물질 및 방법

α-시누클레인 면역원 생성:

비활성 인간 α-시누클레인 단량체 및 응집체를 Volpicelli-Daley et al., 2014 (본원에 참조로 포함됨)를 따르되, 약간 변용하여 제조하였다. α-시누클레인의 단량체 형태를 함유한 분획을 모으고 공급체에 의해 제공된 매뉴얼을 따라 Pierce 고용량 내독소 제거 스핀 칼럼 (Thermo Scientific, #88276)을 사용하여 내독소 제거 과정을 수행하였다. 내독소 수준을 ToxinSensor Chromogenic LAL 내독소 검정 키트 (GenScript, #L00350)를 사용하여 측정하였다. 내독소 수준은 LAL 검정에 의해 측정되는 바 단백질의 μg당 1 EU 미만이었다. 비활성 단량체를 사용하여 비활성 응집체를 만들었다.

활성 마우스 시드 α-시누클레인 응집체 (사전 형성된 소섬유 -PFFs) 및 활성 α-시누클레인 단량체를 Lee 실험실 (신경퇴행성 질환 연구 센터, 미국 펜실베이니아 19104-4283 필라델피아 스프루스 스트리트 3600 소재)로부터 얻었다. 마우스 뇌 용해물을 빅토리아 대학교 (캐나다 비씨 브이8피 5씨2 빅토리아 피너티 로드 3800 소재)에 의해 기증받았다. 인간 뇌 전 조직 용해물 (5 mg/mL)을 Novus Biologicals, #NB820-59177로부터 얻었다. 인간 뇌 파킨슨병 전 조직 용해물 (5 mg/mL)을 Novus Biologicals, #NB820-59407로부터 얻었다. HeLa 용해물을 Rockland Immunochemicals Inc., #W09-000-364로부터 얻었다.

티오플라빈 검정:

티오플라빈 검정은 Murray et al., 2003 (본원에 참조로 포함됨)을 기반으로 하였다. 이 검정은 시간 경과에 따른 β-시트 함량을 측정한다. 형광의 증가는 시딩 반응 중에 응집된 소섬유의 증가로 인한 β-시트 구조의 증가를 가리킨다.

티오플라빈 T 스톡 (1 mM)을 PBS에 25 μM 최종 노도로 희석하였다 (1:40 희석). 95 μL의 희석된 티오플라빈 T를 384 웰의 각 웰에 첨가하고, 샘플 (2.5 μL)을 각 웰에 첨가하고, 용액을 혼합하였다. 대조군의 경우, 2.5 μL의 PBS 단독을 희석된 티오플라빈 T에 첨가하고, 2.5 μL 단량체 α-시누클레인을 희석된 티오플라빈 T에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2분 내지 1시간 동안 인큐베이션하고, 각 웰의 티로플라빈 T 형광을 측정하였다 (여기 450 nm, 방출 500 nm). 상기 기술된 티오플라빈 T 섬정에 대한 변동은 다음과 같았다: 티오플라빈 T 형광을 1시간에서 최대 88시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에 각 웰에서 측정하였다 (여기 450 nm, 방출 485 nm).

사전 인큐베이션 연구를 위하여, 30 ug의 항체를 10 nM α-시누클레인 응집체와 4℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 혼합물을 10000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 1 mL PBS로 세정하였다. 이 단계를 추가적으로 4회 반복하였다. 상층액을 제거하고 α-시누클레인 응집체 (결합된 항체 포함함)를 10 μL PBS에 재현탁하였다.

동시 인큐베이션 연구를 위해, 30 ug의 항체를 티오플라빈 T의 첨가 직전에 단량체 α-시누클레인 및 α-시누클레인 응집체에 첨가하였다.

마우스 단클론성 항체 생성:

마우스 단클론성 항체를 캐나다 비씨 브이8제트 7엑스8 빅토리아 마컴 스트리트 4464 #3204 소재의 ImmunoPrecise Antibodies Ltd (IPA)에서 그들 소유의 RapidPrime 기술을 사용하여 제조하였다. RapidPrime은 5마리의 암컷 BALB/c 마우스의 면역화를 포함하였다.

간접 ELISA에 의한 α-시누클레인 소섬유 항원에 대한 하이브리도마 스크리닝:

ELISA 조건: Corning Costar ELISA 플레이트를 100 μl/웰 CCB (pH 9.6)에 0.1 μg/웰로 활성 α-시누클레인 응집체 또는 활성 α-시누클레인 단량체로 밤새 4℃에서 코팅하고, PBS 중의 3% 탈지분유로 1시간 동안 실온에서 차단하였다.

1차 항체: 100 uL/웰의 하이브리도마 TC sup neat (IPA에서 생성됨)를 1시간 동안 37℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다; PBS-Tween 중의 100 uL/웰의 2차 항체 1:10,000 염소 항-마우스 IgG/IgM (H+L)-HRP (Jackson ImmunoResearch, # 115-035-068)를 1시간 동안 37℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 모든 세척 단계를 30분 동안 PBS-Tween으로 수행하였다. TMB 기질 (BioFxt # TMBW-1000-01)을 50 μL/웰로 첨가하고 반응을 동부피의 1 M HCl로 중단시켰다. 전개 시간: 8.5분. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다.

아이소타입 항체 트래핑 ELISA 조건:

ELISA 플레이트를 1:10,000 염소 항-마우스 IgG/IgM (H&L; Jackson ImmunoResearch, # 115-035-068)으로 탄산염 코팅 완충액 (pH9.6)에서 밤새 4℃에서 코팅하였고, 차단은 없었다.

1차 항체: 1시간 동안 실온에서 흔들어준 100 uL/웰로 플레이트에 있는 하이브리도마 조직 배양 상층액 (neat; 상기에서 개관된 간접 ELISA에 대해 기술한 동일한 항체). 2차 항체: 1시간 동안 실온에서 흔들어준 PBS-Tween 중에 100 uL/웰로 있는 1:5000 염소 항-마우스 IgG-HRP (5개의 하위아이소타입 특이적 항체의 동등한 부분 혼합물, Jackson ImmunoResearch, # 115-035-205, 115-035-206, 115-035-207, 115-035-208, 115-035-209) 또는 1:10,000 염소 항-마우스 IgMμ-HRP (Thermo Scientific, # 31440). 모든 세척 단계를 30분 동안 PBS-Tween으로 수행하였다. TMB 기질을 50 μL/웰로 첨가하고 반응을 동부피의 1 M HCl로 중단시켰다. 전개 시간: 5.5분. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다.

α-시누클레인 활성 단량체, α-시누클레인 활성 응집체 (또는 사전 형성된 소섬유; PFF), α-시누클레인 비활성 단량체, 및 α-시누클레인 비활성 응집체 항원에 대한 간접 ELISA에 의한 마우스 항-α 시누클레인 하이브리도마 테스트.

ELISA 조건: Corning Costar ELISA 플레이트를 다음:

a. 100 μl/웰 CCB (탄산염 코팅 완충액) pH 9.6에서 밤새 4℃에서 0.1 μg/웰의 α-시누클레인 활성 단량체;

b. 100 μl/웰 CCB (pH 9.6)에서 밤새 4℃에서 0.1 μg/웰의 α-시누클레인 활성 응집체 (PFF);

c. 100 μl/웰 CCB (pH 9.6)에서 밤새 4℃에서 0.1 μg/웰의 α-시누클레인 비활성 단량체; 또는

d. 100 μl/웰 CCB (pH 9.6)에서 밤새 4℃에서 0.1 μg/웰의 α-시누클레인 비활성 응집체로 코팅하고,

PBS 중의 3% 탈지분유로 1시간 동안 실온에서 차단하였다.

1차 항체: 하이브리도마 조직 배양 상층액 (neat)을 DMEM 완전 배지 플러스 5% 저(low)-IgG FBS에서 소멸될 때까지 성장시켰다 (>90% 세포 사멸). 배양을 수득하고 400 xg에서 회전시키고 상층액을 새로운 멸균 튜브에 옮겼다. 조직 배양 상층액 (100 μL/웰)을 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 2차 항체: 1시간 동안 37℃에서 흔들어준 PBS-Tween 중의 100 uL/웰의 1:10,000 염소 항-마우스 IgG/IgM (H+L)-HRP. 모든 세척 단계를 30분 동안 PBS-Tween으로 수행하였다. TMB 기질을 50 μL/웰로 첨가하고 반응을 동부피의 1 M HCl로 중단시켰다. 전개 시간: 1분. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다.

웨스턴 블롯팅:

겔을 다양한 항체와 블롯팅하고 프로빙하기 전에, 하기 실시예에서 주지되는 것과 같은 변성 (SDS) 및 비변성 (천연) 조건 하에서 달리게 하였다.

도 3A 내지 3D의 경우, 1차 항체 (전 단락에서 규정한 항- α-시누클레인 상층액)를 트리스-붕산염 식염수 (TBS)에서 1:2의 희석으로 사용하였다; 인큐베이션 온도: 4℃, 인큐베이션 시간: 18시간. 2차 항체는 염소-항-마우스:HRP 콘쥬게이트, 희석: 1:2000이었다. 차단 완충액 (5% 탈지유 TBST), 인큐베이션 온도: 실온; 인큐베이션 시간: 1시간. 전개 용액: Amersham ECL 기질 (GE, # RPN2232), 전개 시간: 6분. 용해물: 레인당 20 μg 마우스 뇌 용해물, 또는 HeLa 용해물. 5X Laemmli 샘플 완충액을 샘플에 첨가하고 10분 동안 90℃에서 인큐베이션한 후에 Licor C-Digit, 또는 GE ImageQuant LAS 500에서 시각화된 겔 위로 로딩하였다.

도 7 (및 펩타이드 웨스턴)의 경우, 1차 항체는 항-α-시누클레인 단백질 G 정제된 상층액 (GE, #29-0485-81)이었고; TBS에 1:1000으로 희석되었다; 인큐베이션 온도: 실온; 인큐베이션 시간: 1시간. 2차 항체는 염소-항-마우스:HRP 콘쥬게이트, 희석: 1:2000이었다. 차단 완충액 (5% 탈지유 TBST), 인큐베이션 온도: 실온; 인큐베이션 시간: 1시간. 전개 용액: SuperSignal^TM West Pico 화학발광 기질 (ThermoFisher Scientific, # 34080), 전개 시간: 6분. 5X Laemmli 샘플 완충액을 샘플에 첨가하고 10분 동안 90℃에서 인큐베이션한 후에 겔 위로 로딩하였다. 천연 샘플의 경우, 5X Laemmli 샘플 완충액 대신 5% 글리세롤을 첨가한 후에 겔 위로 로딩하였다.

돗트 블롯 분석을 위해, 5 μl (0.1 mg/mL)의 각 펩타이드를 니트로셀룰로오스 (ABM, #B500)에 첨가하고 실온에서 15분 동안 건조되도록 하였다. 그런 후 돗트 블롯을 표준 웨스턴 블롯으로서 취급하였다 (도 7을 참조로 상기에서 서술됨).

1차 세포 실험 (도 2A 및 9D)

Sprague-Dawley 1차 대뇌피질 세포를 래트 새끼의 뇌를 해부함으로써 얻었다. 해부 후에, 뇌를 수술용 가위로 기계적으로 절단하고 0.25% 트립신 용액을 사용하여 분해하였다. 트립신 처리를 45분 동안 수행하였고 세포 현탁액을 얻었다. 트립신을 2회기의 원심분리 (750 rpm에서 20분씩)에 의해 세척하고, 세포 현탁액을 라미닌과 사전 인큐베이션되고 DMEM + 10% FBS + Pen/Strep을 채워진 60 mm 세포 배양 접시에 놓은 후 24시간 동안 안정되도록 하였다. 다음날, 60 mm 세포 배양 접시의 상층액 (뉴론을 함유함)을 회수하고, 동일한 성장 배지 (DMEM, 10%FBS, Pen/Strep)에 재현탁하고 원심분리 (500 rpm에서 20분)에 의해 2회 세척하였다. 현탁된 뉴런을 라미닌과 사전 인큐베이션된 22x22 cm 커버슬립 (NaOH 및 95% 에탄올로 사전 처리됨)에 놓았다. 커버슬립을 쌍으로 60 mm 세포 배양 접시에 놓거나 (접시당 2개의 커버슬립) 또는 개별적으로 35 mm 세포 배양 접시에 놓고 이것들을 DMEM + 0.5% FBS + Pen/Strep으로 채웠다. 뉴런을 가라앉도록 놓아두고 2일 동안 성장시킨 후 특정 실험 조건화를 시작하였다. 일단 세포가 준비되면, 세포 배양 배지를 조건화 배지로 교체하였다. 도 9D를 참조하면 조건화 배지는 다음과 같았다:

- 대조군 실험: DMEM + 0.5% FBS + Pen/Strep + 동등한 부피의 음파처리된 DPBS + 동등한 부피의 DPBS;

- 활성 α-시누클레인 단독 첨가: DMEM + 0.5% FBS + Pen/Strep + 4 μg/ml의 음파처리된 활성 α-Syn 소섬유 + 동등한 양의 BPBS;

- 2F11-처리된 뉴런: DMEM + 0.5% FBS + Pen/Strep + 4 μg/ml의 음파처리된 활성 α-Syn 소섬유 + DPBS에 1:400으로 희석된 10 μl의 2F11 항체 (2F11 항체 양은 10 μg과 같음).

대조군 그룹을 DPBS와 함께 인큐베이션하였고, 활성 α-시누클레인 단독 첨가 그룹을 활성 α-시누클레인 소섬유와 함께 인큐베이션하였으며, 2F11 그룹을 활성 α-시누클레인 소섬유 및 2F11 항체와 함께 동시 인큐베이션하였다. 배지의 50%를 새로운 배지 (DMEM + 0.5% FBS + Pen/Strep)로 주 1회 교체하였다.

조건화 배지와 함께 14일 동안 인큐베이션한 후에, 세포를 2% PFA에서 40분 동안 고정시키고, 0.05% Triton-X에서 10분 동안 침투시키고 PBS-BSA 2%로 24시간 동안 차단하였다. 세포를 StressMarq사로부터의 1차 토끼 다클론성 항체로 α-Syn-pSer129 (SPC-742)에 대해 1;100으로 밤새 염색하였고, 2차 항체는 α-Syn-pSer129에 대한 염소-항-토끼-Alexa-488 (녹색)이었다. 인큐베이션은 2시간이었다. 모든 샘플을 DAPI로 대조염색하였다.

에피토프 맵핑을 위한 펩타이드 합성 (도 10)

활성제로서 HCTU 및 Fmoc 화학을 사용하여 인간 α-시누클레인 (Uni Prot P37840)의 중복 서열을 반영하여, 다음의 펩타이드 (Atlantic Peptides, USA)를 Rainin Symphony 합성기 상에서 생성하였다 (우측에 잔기 번호). N-말단을 C-6 스페이서 (Ahx)에 콘쥬게이션시켰고, 차례로 N-말단에서 시스테인 잔기에 콘쥬게이션시켰다. 펩타이드를 C-18 칼럼 상에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 분석을 질량에 대해 전기 분무 및 순도에 대해서 분석용 LC를 사용하여 수행하였다. 사용한 BSA는 Fishers Scientific사 제품 77110이었고 사용한 콘쥬게이션은 제품과 함께 제공된 프로토콜을 따랐다.

AA 1-30: MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA (SEQ ID NO:3);

AA 21-50: KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH (SEQ ID NO:4);

AA 41-70: GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV (SEQ ID NO:5);

AA 61-90: EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA (SEQ ID NO:6);

AA 81-110: TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE (SEQ ID NO:7);

AA 101-130: GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE (SEQ ID NO:8);

AA 121-140: DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (SEQ ID NO:9).

에피토프 맵핑을 위한 ELISA 조건: Nunc® MaxiSorp^TM 98 웰 플레이트 ELISA 플레이트를 100 μl/웰 CCB (pH 9.6) 중의 0.1 μg/웰로 BSA에 콘쥬게이트된 펩타이드로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 그런 후 플레이트를 PBS 중의 3% 탈지유 분말로 3시간 동안 실온에서 차단하였다. 100 μL/웰 항체 (1 μg/mL)를 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 실온에서 1시간 동안 PBS-Tween 중의 100 uL/웰로 2차 항체 1:10,000 염소 항-마우스 IgG/IgM (H+L)-HRP. 모든 세척 단계를 30분 동안 PBS-Tween으로 수행하였다. TMB 기질을 100 μL/웰로 첨가하였고 반응을 동등한 부피의 1 M HCl로 중단시켰다. 전개 시간: 15 분. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다.

면역침전, 및 관통 흐름 분석 (도 5A 및 5B)

1.2 mg의 2F11을 시아노겐 브로마이드 활성화된 세파로오스 (Sigma, #C9142-1G)에 제조사의 프로토콜을 사용하여 커플링하였다. 2 mg의 마우스 뇌 용해물을 수지와 함께 4℃에서 8시간 동안 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 칼럼을 PBS로 세척한 후 0.1 M 글리신, pH 2.7로 용출하였다.

전자 현미경 (도 2C, 8C)

음파처리된 160 μl의 α-Syn 소섬유 부분표본을 DMEM + 10% FBS에 1 ml의 최종 부피로 재현탁하였다. 그런 후 현탁액을 2 마이크로원심분리 튜브에, 각 튜브에 원래 재현탁액의 0.5 ml의 최종 부피로 분리하고 40분 동안 17,000 rpm에서 원심분리하였다. 상층액의 80%를 버리고 나머지 부피를 DMEM + 10% FBS + 1:400 희석의 2F11 (1.25 μg의 항체) 또는 DMEM + 10% FBS + 동등한 부피의 DPBS에 0.5 ml의 최종 부피로 재현탁하였다. 1차 항체 (또는 음성 대조군에 대해서는 DPBS만)와의 인큐베이션을 24시간 동안 허용하였다. 다음날, 두 튜브를 40분 동안 17,000 rpm에서 원심분리하고, 상층액의 80%를 따로 보관하고 나머지 부피를 0.5 ml의 DMEM + 10% FBS에 재현탁하고 세척하고 17,000 rpm에서 40분 동안 원심분리하였다. 상층액의 80%를 따로 보관하고 나머지 부피를 양 튜브에서 모두 DMEM + 10% FBS + 18 nm 금 입자와 콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG에 재현탁하였다. 2차 항체 인큐베이션을 2시간 한 후, 튜브를 40분 동안 17,000 rp에서 원심분리하였다. 상층액의 80%를 따로 보관하고 나머지 부피를 DMEM+10% FBS에 재현탁하였다. 재현탁을 40분 동안 17,000 rpm에서의 원심분리에 의해 세척하였다. 마지막으로, 부피의 80%를 따로 보관하고 부피 (대략 100 μl)의 대략 4 μl의 나머지를 투과 전자 현미경 금속 그리드의 상부에 놓고 우라닐 아세테이트로 염색하였다.

실시예 2: 비활성 및 활성 α-시누클레인 단량체 및 응집체의 생성

비활성 및 활성 α-시누클레인 단량체 및 응집체를 실시예 1에서 서술한 대로 얻었다. 가용성 단량체 및 불용성 응집체가 활성이고 (프리온-유사) 시딩할 수 있는지, 또는 α-시누클레인 응집 과정에 의해 시딩될 수 있는지를 평가하기 위하여, 단량체 및 응집체의 두 세트를 실시예 1에서 기술한 티오플라빈 검정을 사용하여 함께 테스트하고 1시간 또는 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 활성 및 비활성 두 응집체뿐만 아니라, 단량체도 검정하였다. 대조군은 티오플라빈 단독, PBS 단독 및 비활성 단량체를 포함하였다. 그 결과를 도 2A에 제공한다. 이 검정에서, 증가된 α-시누클레인 응집은 β-시트 구조 형성에서 상응하는 증가를 초래한다. 티오플라빈은 β-시트 구조에 결합하고, 이 형태에서 티오플라빈은 450 nm에서 여기될 때 (485 nm에서) 형광을 낸다. 485 nm에서의 형광의 양은 티오플라빈 결합의 양에 좌우되고, 결합의 양은 β-시트 구조 형성의 양과 상관이 있다. 그 결과로서, 티오플라빈 형광의 증가는 β-시트 구조 형성의 증가를 나타낸다.

1시간 또는 37시간 동안의 인큐베이션 후에, β-시트 구조 형성을 나타내는 것인 형광의 증가 없음이 비활성 단량체 또는 비활성 응집체로 관찰되었다. 그러나, 활성 단량체는 24시간에 걸쳐 자체 시딩 및 β-시트 구조를 생성할 수 있었다. 활성 응집체 (PFF) 또한 1시간 및 24시간 후에 형광의 증가를 초래하였지만, 이 증가는 를 생성하는 데 필요한 단량체 빌딩 블록이 없을 때에는 정체기가 되었다.

비활성 응집체와 비활성 단량체의 조합은 형광의 증가 없음을 초래하였고, 이것은 비활성 응집체가 비활성 단량체를 시딩할 수 없었을 뿐 아니라, 비활성 단량체에 의한 자체 시딩이 일어날 수 없었음을 시사한다. 비활성 단량체와 활성 응집체 (PFF)의 조합은 비활성 단량체가 β-시트 구조를 생성하기 위한 빌딩 블록으로서 기능할 수 없었기 때문에 첨가 PFF (활성 응집체) 단독으로서 유사한 수준의 형광을 생성한다. 그러나, 활성 단량체가 비활성 응집체와 조합되었을 때 24시간에 걸쳐 형광의 큰 증가가 관찰되었다. 이것은 활성 단량체가 자체 시딩할 수 있다는 것을 증명하는 결과와 일치한다. 마지막으로, 활성 단량체 및 응집체가 둘 다 함께 사용되었을 때, 형광 판독의 큰 증가가 1시간 및 24시간 후에 모두 생성되었고, 이것은 PFF (활성 응집체)에 의한 활성 단량체에 대한 시딩 과정에 의한 응집을 나타낸다.

α-시누클레인의 원편광 이색성 분석

원편광 이색성을 미국 샌디에고 소재의 Alliance Protein Laboratories에 의해 원거리 자외선에 대해 Jasco-J-1500 분광편광계, 0.1 cm 셀을 사용하여 수행하였다. 2차 구조를 CDNN 버전 2.1, Guid223; Bohm, G., Muhr, G., and Jaenicke, R (1992) Quantitative analysis of protein far UV circular dichroism spectra by neural networks. Protein Eng. 5, 191-195)에 따라 계산하였다.

실시예 1에서 기술한 것과 같이 제조한 무활성 또는 비활성 단량체는 활성 단량체에 대해 유사한 2차 구조를 가지는 것으로 나타난다. 다른 한편으로 활성 α-시누클레인 응집체는 원편광 이색성 측정을 사용하여 2차 구조를 측정함으로써 측정된 바 더 많은 β-시트 함량 및 더 적은 α-나선을 가지는 것으로 나타난다 (표 1).

원편광 이색성 측정을 사용한 활성 및 비활성 단량체, 및 활성 또는 비활성 응집체의 2차 구조 함량.

	α-나선, %	역평행 β-시트, %	평행 시트, %	회전, %	무작위, %
활성 단량체	6	33	4	25	38
비활성 단량체	6	29	4	30	40
비활성 응집체	13	29	6	17	34
활성 응집체	7	36	5	21	36

활성 응집체는 생체내에서 α-시누클레인 응집을 시딩한다

도 2B에서 나타낸 것과 같이, 루이 소체 병리의 검출을 위해 세린 129 포스포-특이적 항체를 사용하여 (실시예 1에서 기술한 방법), 내독소의 부재하에 α-시누클레인 단량체로 만들어진 비활성 응집체는 어떠한 pSer 129 염색 (비활성 응집체 - pSer129)을 나타내지 않으며, 이것은 비활성 응집체가 래트 1차 대뇌피질 세포에서 내인성 α-시누클레인 응집을 시딩하지 않는 것을 가리킨다. 그러나, 내독소의 존재하에 만들어진 활성 응집체는 활성 α-시누클레인 응집체로 사전 처리된 세포의 pSer129 염색 (활성 응집체 - pSer129 참조)에 의해 증명되는 바 α-시누클레인 응집을 시딩한다.

비활성 응집체와 활성 응집체 간 차이를 한층 더 확실하게 하기 위하여, 두 유형 모두 전자 현미경 하에서 시각화하였다. 비활성 α-시누클레인 소섬유는 활성 α-시누클레인 필라멘트보다 가는 필라멘트를 형성하였고 비활성 α-시누클레인 소섬유는 덜 촘촘하게 쌓였다. 나아가, 비활성 α-시누클레인 소섬유는 상당히 더 길어서, 길이가 수 마이크로미터에 이르렀다. 다른 한편으로 활성 α-시누클레인 소섬유는 길이가 약 55 내지 75 nm였고 약 6 내지 8 nm의 폭을 가졌다 (도 2C 참조).

이들 결과는 α-시누클레인 단량체 및 응집체의 두 집단: 활성 α-시누클레인 집단 및 비활성 α-시누클레인 집단이 있음을 증명한다.

실시예 3: 활성 α-시누클레인 집단에 대한 단클론성 항체의 생성.

활성 α-시누클레인 응집체 및 활성 α-시누클레인 단량체 (실시예 1)에 대한 마우스 단클론성 항체를 실시예 1에서 기술한 것과 같이 RapidPrime 기술을 사용하여 제조하였다. 클론의 제1 라운드에 대한 초기 스크리닝 실험을 간접 ELISA를 사용하여 활성 단량체 또는 활성 응집체 (PFF)에 대해 수행하여 (항원이 플레이트 위에 코팅되는 경우, 스크리닝되는 항체는 그것에 결합하는 것이 허용되고 그런 후 이 결합이 마우스 단클론성에 대해 특이성을 가지며 또한 TMB와의 검출 색 반응을 촉매하기 위해 양고추냉이 과산화효소에 결합되는 2차 항체를 첨가함으로써 검출된다; 실시예 1), 양성 클론을 확인하였다. 선택한 항체-분비 하이브리도마를 그것들의 항체 역가에 의해 확인한 후 실시예 1에서 기술한 것과 같이 동형분류하였다. α-시누클레인 단량체의 비활성 버전이 아닌, 활성 형태에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마를 선택하였다. α-시누클레인 단량체의 활성 형태에 결합한 전체 20개의 단클론성 항체를 확인하였다.

선택한 단클론성 항체의 추가의 특성확인을 변성된 마우스 뇌 샘플 및 HeLA 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 사용함으로써 수행하였다. 다른 항-알파 시누클레인 항체와 비교할 때 독특한 밴딩 패턴을 초래한 한 개의 항체 (2F11)를 확인하였다. 2F11의 서열은 SEQ ID NO:10 내지 13에 제공된다; 도 11A 및 11B).

도 3A에서 나타낸 것과 같이, 2F11은 단량체 α-시누클레인과 정상적으로 회합된 15 kDa 밴드와 반대로 고분자량 밴드 (>150 kDa)를 식별하였다. 4F1 (도 3B) 및 3F8 (도 3C)을 포함한, 다른 α-시누클레인 단클론성 항체는 15 kDa 밴드를 식별하는 것으로 관찰되었다. 클론 4F1 및 3F8을 전부 동일한 특이성을 보이는 대략 20개의 단클론성 항체 모음으로부터 무작위로 선택하였다. 나아가, 2F11은 HeLa 용해물에서 고분자량 밴드 (>150 kDa)를 식별하였다 (도 3D; α-시누클레인을 생성하는 것으로 알려짐, URL:proteinatlas.org/ENSG00000145335-SNCA/cell 참조).

웨스턴 블롯 앙에서 2F11에 의해 확인된 강력한 양성 신호는, 단백질 수준이 Ponceau 염색, 또는 쿠마찌 블루 염색을 사용한 검출 수준 아래였기 때문에, 고수준의 단백질의 결과인 것으로 나타나지 않았다. 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 이 결과는 2F11에 의해 식별된 단백질이, 단클론성 항체에 대한 다중 결합 부위를 제공할 수 있고 농도가 낮음에도 불구하고 높은 웨스턴 블롯 반응을 생성할 수 있는 많은 알파 시누클레인 분자를 포함하는 (적어도 10개를 시사하는 분자량) 올리고머일 수 있음을 시사한다.

2F11의 중쇄 및 경쇄의 핵산 및 아미노산 서열을 도 11에 제공한다.

7.23 및 7.27의 분명한 pI를 갖는 2개의 IgG1 밴드를 갖기 위해 2F11 항체의 pI를 측정하였다 (Focus Proteomics (미국)에서 분석된 Biorad ReadyStrip 시스템을 사용하여 측정됨).

2F11의 질량 분석은 이것이 24,139 질량을 가진 경쇄 및 50,155 질량을 가진 중쇄를 가졌음을 보여주었다 (분석은 캐나다 빅토리아 소재 빅토리아 대학교 프로테오믹스 센터에서 수행함).

2F11을 사용한 면역침전

2F11이 웨스턴 블롯에서 단량체 알파 시누클레인 단백질에 대해 거의 또는 전혀 친화성을 보이지 않았다는 사실을 고려하여, 2F11을 실시예 1에서 기술한 것과 같은 천연 조건 하에서 마우스 뇌 용해물을 면역침전시키기 위하여 사용하였다. 침전 및 관통 흐름 분획을 얻었고 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 재조사하였다 (단백질을 항체로부터 제거한 후에 그것을 웨스턴 블롯을 작동시킴으로써 수지로부터 용출시키는 한편 항체는 수지에 공유 결합된 채로 남아 있었다). 그 결과를 도 5A 및 5B에 나타낸다.

만약 2F11 항체만이 천연 용해물에서 α-시누클레인 올리고머에 결합하였다면, 면역 침전의 웨스턴 분석은 안정화된 올리고머를 나타내고 단량체는 나타내지 않았을 것으로 예상되며, 바로 이것이 관찰되었다 (도 5A). 도 5A에서 나타낸 것과 같이, 2F11은 면역 침전된 마우스 뇌 용해물에서 α-시누클레인의 60 내지 70 kDa 올리고머를 식별하였다.

단백질의 단량체 종은 면역 침전된 올리고머로부터 세척된 물질 (관통 흐름 분획)에 존재할 것으로 예상될 수 있었고, 바로 이것이 관찰되었다 (도 5B). 도 5B를 참조하면, 2F11은 3개 분획에 결합하는 것으로 관찰되었다: α-시누클레인 단량체 (대략 15 kDa), 추정되는 α-시누클레인 트라이머 (대략 40 kDa), 및 α-시누클레인 올리고머 (60 내지 70 kDa).

2F11은 활성 α-시누클레인 단량체에 결합하지 않는다

생체내에서 2F11의 결합을 평가하기 위하여, BV-2 미세신경교 세포를 활성 α-시누클레인 올리고머, 또는 2F11 항체와 사전 인큐베이션한 활성 α-시누클레인 단량체 중 어느 하나로 처리하였다.

마우스 미세신경교 BV-2 세포를 폴리-L-리신으로 코팅된 유리 커버슬립 상의 24-웰 접시에 100,000개 세포/웰로 24시간 동안 시딩하였다. 50 μg/ml의 활성 α-시누클레인 올리고머를 5 μg/ml의 단클론성 α-시누클레인; 항체 (2F11), 또는 대조군 IgG와 함께 혈청이 없는 DMEM에서 1시간 동안 진동기 상에서 실온에서 사전 인큐베이션하였다. 50 μg/ml의 활성 α-시누클레인 단량체를 5 μg/ml의 단클론성 α-시누클레인 항체 (2F11)와 함께 혈청이 없는 DMEM에서 1시간 동안 진동기 상에서 실온에서 사전 인큐베이션하였다. 알파-시누클레인 면역 복합체를 함유한 250 μl의 배지를 표시된 웰에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 처리 후에, 세포를 10% 중성-완충 포르말린으로 고정시키고 이중 면역세포화학 (ICC)에 적용하였다. 알파-시누클레인 면역 복합체 중의 2F11 항체를 Alexa 488에 콘쥬게이트된 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 검출하였다. 내부화 경로를 토끼 다클론성 LAMP-1 (ab24170, 1:200)을 사용하여 검출하였다; LAMP-1의 검출은 Cy5에 콘쥬게이트된 항-토끼 IgG를 사용하여 달성하였다. 핵을 Hoechst 33258을 사용하여 대조염색하였다.

올리고머-결합된 2F11은 쉽게 검출되었고 세포 표면에서 주로 국지화되는 것으로 나타났다. 그러나, 2F11은 알파-시누클레인 단량체와 면역 복합체를 형성하지 못하였다 (데이터 미도시).

이들 결과는 2F11이 천연 샘플로부터의 천연 조건 하에서 단량체가 아닌 알파 시누클레인 올리고머에 결합하는 것과, (웨스턴 블롯 분석 중에 사용된) 변성 조건 하에서 안정화된 올리고머 및 단량체 α-시누클레인이 전부 2F11에 의해 식별되는 것을 나타낸다.

실시예 4: 마우스 단클론성 항체는 인간 α-시누클레인에 결합한다.

마우스와 인간 α-시누클레인 사이의 유사성은 95%이다 (도 6 참조). 마우스를 면역시키기 위해 사용한 α-시누클레인은 그 기원이 마우스였다. 2F11이 인간 샘플 중의 고분자량 α-시누클레인 올리고머를 식별하는지를 결정하기 위하여, 인간 뇌로부터의 용해물, 파킨슨 환자로부터의 인간 뇌로부터의 용해물, 및 마우스 뇌로부터의 용해물을 변성 조건 하에서 (도 7) 및 천연 조건 하에서 (도 8A 및 8B) 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 비교하였다.

도 7을 참조하면, 2F11 항체는 그것이 고분자량 및 중간 분자량 올리고머에 결합하는 적어도 이중 마우스 및 인간 특이성을 가진 것을 보였다. 150 kDa 밴드는 인간 뇌 용해물보다 파킨슨 뇌 용해물에서 약간 더 우세하였지만, 마우스 뇌 용해물에서보다는 적었다. 동일 항체는 또한 인간 및 마우스 샘플 둘 다에서 변성 조건 하에서 단량체 α-시누클레인 밴드를 식별하였다.

도 8A를 참조하여, 천연 (비환원) 조건 하에서 2F11 항체의 결합을 조사하였다. 천연 겔을 블롯팅하였고 2F11 항체, 및 4F1 항체로 프로빙하였다 (도 8B). 그 결과는 2F11이 샘플에 따라, 파킨슨 뇌 용해물을 포함한 인간 뇌 용해물, 및 마우스 뇌 용해물 전체에서 대략 60 kD 내지 약 250 kD의 고분자량 올리고머에 결합하였음을 보여주었다. 2F11은 또한 천연 조건 하에서 정제된 활성 병원성 α-시누클레인 단량체 또는 응집체에 결합하는 것으로 관찰되었다. 4F1 항체 또한 천연 조건 하에서 고분자량 올리고머에 결합하는 것으로 관찰되었다. 그런, 4F1 항체는 정제된 활성 병원성 α-시누클레인 단량체 또는 응집체를 인식하지 못하였다.

결과는 천연 시스템에서 2F11이 인간 및 마우스 샘플에 전부 결합할 수 있음을 보여준다. 나아가, 2F11 항체 (및 4F1 항체)는 천연 조건 하에서 활성 알파 시누클레인 단량체에 결합하지 못하였다. 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 2F11은 활성 α-시누클레인 응집체에 대해 독특한 결합 패턴을 가져서 그것이 활성 α-시누클레인 올리고머의 병원성 종, 또는 루이 소체 병리를 생성하기 위한 경로에 직접 관여하는 활성 올리고머에 결합하는 것을 허용할 수 있다.

결과는 파킨슨의 뇌 용해물이 올리고머 α-시누클레인 존재를 가지는 것을 보여준다. 또한 그것은 항체가 마우스 특이적인 것이 아니라 그것의 종 반응성을 인간에까지 확장하는 것을 보여준다.

활성 인간 α-시누클레인 응집체에 결합하는 2F11

2F11 항체가 활성 인간 α-시누클레인 응집체 및 비활성 인간 α-시누클레인 응집체에 결합하는 특이성을 돗트 블롯에 의해 조사하였다. 이 검정에서, 활성 및 비활성 시누클레인 유형을 니트로셀룰로오스 위에 놓고 2F11을 사용하여 프로빙하였다. 본 발명자들은 또한 활성 및 비활성 α-시누클레인 올리고머/소섬유 종에서 전소섬유성 Aβ 올리고머 (Kayed. R, et. al. 2007. Molecular Neurodegeneration 2007, 2:18 doi:10.1186/1750-1326-2-18)에 대한 양성 특이성을 가진 항체 A11의 능력을 테스트하였다. 그 결과를 도 8C에 나타내며, 2F11 항체만이 활성 α-시누클레인 응집체에 결합한 것을 나타낸다. Kayed 등 (2007)에 의해 α-시누클레인 올리고머에 결합하는 것으로 제시된 A11 항체는 비활성 올리고머/소섬유 종에만 결합한다.

2F11 항체가 올리고머 α-시누클레인 소섬유에 결합한 것을 추가로 증명하기 위하여, 전자 현미경을 사용하였다. 2F11 항체를 나노 금 입자에 콘쥬게이팅하고 활성 α-시누클레인 응집체에 결합되도록 허용하였다. 도 8D에서 나타낸 것과 같이, 2F11 항체는 활성 인간 α-시누클레인 응집체에 결합하였다.

종합적으로, 이들 결과는 2F11 항체가 활성 α-시누클레인 응집체에 대해 특이적이며, 응집체의 두 종 (즉 활성 및 비활성 α-시누클레인 응집체)이 서로 유사하지 않은 것을 증명한다.

실시예 5: 2F11은 시험관내에서 β-시트 구조 형성을 차단한다

α-시누클레인 β-시트 구조 형성

티오플라빈 시험관내 검정을 사용하여 다양한 항체의 존재 하에 α-시누클레인 반응의 진행을 측정하였다. 전형적인 α-시누클레인 반응의 시간 동역학을 도 9A에 나타낸다. 활성 α-시누클레인 응집체 및 활성 α-시누클레인 단량체의 존재 하에 (상부 라인), 활성 α-시누클레인 단량체는 "시딩"되고 티오플라빈 형광의 상응하는 증가와 함께 시간 경과에 따라 알파 나선 구조로부터 베타 시트로 변화한다 (도 2A; 실시예 2에서 관찰된 결과와 유사함).

활성 α-시누클레인 단량체 및 α-시누클레인 응집체는 둘 다 β-시트 구조 형성, 및 티오플라빈 형광 증가를 위해 존재할 필요가 있다. 활성 α-시누클레인 응집체는 시간 경과에 따라 티오플라빈 형광의 약간의 증가를 초래하였지만 (상부 라인으로부터 두 번째), β-시트 구조 형성의 양은 활성 α-시누클레인 응집체 + an 활성 α-시누클레인 단량체의 혼합물의 그것 (상부 라인)보다 적다. 도 2에 나타낸 결과와 유사하게, 활성 α-시누클레인 단량체는 시간 경과에 따라 서서히 자체 시딩할 수 있다 (상부로부터 세 번째 라인).

이 검정을 사용하여, 모두 동일한 아이소타입 항체 (IgG1 카파)인 항체 2F11, 4F1 및 3F8, 및 무작위 아이소타입 대조군 항체: hsp70에 대한 마우스 단클론성, StressMarq, cat code# SMC-104)가 활성 α-시누클레인 응집체 및 활성 α-시누클레인 단량체의 존재 하에 티오플라빈 형광의 반응 동역학에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과를 도 9B (반응이 시작될 때 첨가된 항체) 및 도 9C (반응이 시작되기 전 사전 인큐베이션된 항체)에 나타낸다.

도 9B에 나타낸 검정의 경우, 30 μg의 항체를 100 μM의 활성 α-시누클레인 단량체에 10 nM 활성 α-시누클레인 응집체와 함께 첨가하였다. 첨가된 항체가 없을 때, 활성 α-시누클레인 응집체 및 활성 α-시누클레인 단량체 (상부 라인), 활성 응집체 (하부로부터 세 번째 라인) 또는 활성 단량체 (하부로부터 두 번째 라인)의 존재 하에 β-시트 구조 형성의 시간 경과 동역학은 도 9A에서 관찰된 것과 유사하다. 그러나, SMC-104 (상부 라인으로부터 두 번째) 4F1 (상부 라인으로부터 세 번째) 또는 3F8 (상부 라인으로부터 네 번째)이 반응 혼합물에 첨가되었을 때, 총 티오플라빈 형광의 감소가 관찰되었고, β-시트 구조 형성의 유의한 증가가 여전히 관찰되었다. 티오플라빈 형광은 2F11의 존재하에 크게 감소하였고 (하부로부터 네 번째 라인), 이것은 2F11 항체의 존재 하에 감소된 β 시트 구조 형성을 보여준다.

2F11 항체의 첨가는 고도로 파괴적이고 처음 1000분 (16시간)에 걸쳐 β-시트 구조 형성의 속도를 감소시킨다. 그러나, 활성 α-시누클레인 응집체 + 활성 α-시누클레인 단량체로 관찰된 반응 속도 (상부 라인)는 4F1 또는 3F8, 또는 대조군 항체, SMC-104의 조재 하에 활성 기질의 반응 속도와 유사하였다.

도 9C에 나타낸 검정의 경우, 30 μg의 항체를 10 nM의 활성 α-시누클레인 응집체에 60분 동안 첨가하였고, 혼합물을 세척하여 임의의 미결합 항체를 제거한 후 100 μM 활성 α-시누클레인 단량체를 첨가하여 반응이 시작되게 하였다. 첨가된 항체가 없을 때, 활성 α-시누클레인 응집체 및 활성 α-시누클레인 단량체 (상부 라인), 활성 응집체 (하부로부터 네 번째 라인) 또는 활성 단량체 (하부로부터 두 번째 라인)의 존재 하에 β-시트 구조 형성의 시간 경과 동역학은 도 9A에서 관찰된 것과 유사하다.

반응이 시작되기 전 항체와 응집체의 사전 인큐베이션은 2F11 항체가 활성 α-시누클레인 단량체 단독 (하부로부터 두 번째 라인), 또는 α-시누클레인 응집체 단독 (하부로부터 네 번째 라인) 중 어느 하나와 유사한 방식으로 응집 활성을 완전히 억제하는 것 (하부로부터 세 번째 라인)을 초래하였다. 2F11 반응 혼합물의 존재 하에 처음 1000분에 걸친 형광의 증가 속도 또한 활성 α-시누클레인 응집체 및 활성 α-시누클레인 단량체 (상부 라인)와 비교하여 크게 감소하였고, 활성 α-시누클레인 단량체, 또는 α-시누클레인 응집체 중 어느 하나로 관찰된 동역학과 다시 비슷하였다.

반응이 시작되기 전 3F8 및 4F1과의 활성 α-시누클레인 응집체의 사전 인큐베이션은 처음 1000분에 걸쳐 형광의 증가 속도를 변경시키지 못하였고, 아이소타입 대조군 (SMC-104) 항체와의 사전 인큐베이션과 비교했을 때 총 형광의 약간의 차이만을 초래하였다.

이들 결과는 2F11 항체가 β-시트 구조를 형성하기 위하여 진행될 α-시누클레인 응집 및 소섬유화 반응에 필요한 구성요소 또는 구조에 결합하는 것을 분명히 보여준다. 그러므로 2F11 항체는 이 반응에 대해 중화 효과를 나타낸다.

Tau β-시트 구조 형성

tau와 α-시누클레인 사이의 알려진 상호작용 (Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304)으로 인해, tau 유도된 β-시트 구조 형성에 미치는 단클론성 항체 2F11의 영향을 티오플라빈 검정을 사용하여 조사하였다. Tau 소섬유를 Li W, Lee VM. (2006, Biochemistry. 45(51):15692-15701. doi: 10.1021/bi061422+)에서 기술한 것과 같은 방법을 사용하여 제조하였다.

항체 (60 ug의 2F11 또는 SMC-104)를 10 nM Tau 소섬유와 함께 1시간 동안 4℃에서 흔들어 주면서 인큐베이션하였다. 혼합물을 10000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 1 mL의 PBS로 세정하였다. 이 단계를 4회 추가로 반복하였다. 상층액을 제거하고 Tau 소섬유 (결합된 항체 포함)를 10 μL PBS에 재현탁한 후 25 μM Tau 단량체를 첨가하여 반응이 시작되게 하였다. 티오플라빈 T 스톡을 25 μM의 최종 농도로 첨가하였다. 티오플라빈 T 형광을 37℃에서 1시간 내지 최대 48시간 동안 흔들어주면서 인큐베이션한 후에 각 웰에서 측정하였다 (여기 450 nm, 방출 485 nm). 그 결과를 도 13에 나타낸다.

Tau 소섬유 단독, 또는 Tau 단량체 단독을 검정했을 때 바탕 형광 신호를 관찰하였다. 그러나, Tau 단량체와 Tau 소섬유의 혼합물은 β-시트 구조 형성을 가리키는 강력한 형광 신호의 생성을 초래한다. tau 반응의 진행은 반응이 시작되기 전 단클론성 항체 2F11을 tau 단량체 및 tau 소섬유와 함께 사전 인큐베이션했을 때 방해받는 것으로 관찰되었다. 단클론성 항체 SMC-104 (hsp70에 대한 마우스 단클론성)는 tau 반응에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 못하였다.

이들 결과는 단클론성 항체 2F11이 시험관내에서 Tau 소섬유, β-시트 구조 형성을 차단하는 것을 보여준다.

실시예 6: 2F11은 생체내에서 활성 α-시누클레인 소섬유-유도된 루이 소체 병리를 억제한다

실시예 5에서 나타낸 것과 같이, 2F11이 시험관내에서 α- 시누클레인의 응집을 억제하는 능력을 보였던 사실을 고려하여, Sprague-Dawley 래트 배아 뇌로부터 수득한 1차 대뇌피질 세포에서 α- 시누클레인 응집을 억제하는 2F11 항체의 능력을 조사하였다.

도 9D에 나타낸 것과 같이, DAPI로 처리되고 pSer129 알파-시누클레인 항체로 프로빙된 대조군 샘플 (상부 좌측 패널)은 단지 DAPI 염색된 핵만을 보여준다. 1차 뇌 세포에 활성 α-시누클레인 소섬유를 첨가한 후 DAPI 염색 및 pSer129 알파-시누클레인 항체로 프로빙한 것은 DAPI 염새된 핵 및 pSer129 항체로 염색된 세포 둘 다를 보여주고 (상부 우측 패널) pSer129의 α-시누클레인 항체에의 결합, 및 뇌 세포에서의 α-시누클레인 유도된 병리를 나타낸다. 활성 α-시누클레인 소섬유 및 2F11을 1차 뇌 세포에 첨가하고 DAPI에 노출시키고 pSer129 알파-시누클레인 항체로 프로빙했을 때, pSer129 염색의 미량 바탕 수준을 포함한 DAPI 염색된 핵이 관찰되었다 (하부 패널). 그러므로 α-시누클레인 응집체의 첨가는 1차 대뇌피질 세포에서 루이 소체 병리를 유도하였지만 (상부 우측 패널), 2F11 항체가 α-시누클레인 응집체와 함께 첨가되었을 때, 루이 소체 병리는 억제되었다 (하부 패널).

이들 결과는 2F11이 1차 뇌 세포에서 활성 α-시누클레인 소섬유-유도된 루이 소체 병리를 억제하는 것을 증명한다.

2F11 항체의 선조체내 주사는 1차 래트 피질 세포에서 루이 소체 병리의 발생을 감소시킨다.

2F11 항체가 생체내에서, 래트 피질 세포에서 루이 소체 병리의 발생을 중화시키는 능력을 또한 조사하였다. 래트를 주사 후 30일째에 안락사시켰다 (dpi). 생후 4개월의 수컷 Long Evans 래트를 무작위로 배정하여 4개 그룹으로 나누었다. 그들에게 멸균된 PBS (대조군, 4 μl PBS), 음파처리된 사전 형성된 α-syn 소섬유 (PFF; 총4.2 ug) 또는 PFF 플러스 해당되는 경우 항체 (2 μg) 중 하나를 1 부위에 선조체내 주사하였다. 2개의 항체 (2 μg 항체)를 루이 소체 병리 형성을 중화시키는 능력에 대해 테스트하였다: 시험관내에서 병리를 중화시키는 것으로 알려진 2F11, 및 시험관내에서 병리 발생을 중화시킬 수 없는 또 다른 α- 시누클레인 항체인 3D10.

선조체내 주사 전에, -80℃에서 보관한 PFF를 해동하고 실온에서 Sonic Dismembrator 모델 100 (Fisher Scientific)을 사용하요 10% 동력에서 60 펄스로 음파처리하였다 (총 30초, 0.5초 전원 온, 0.5초 전원 오프). 안락사된 래트 (이소플루란 흡입)를 뇌정위장치에 넣었다. 두개골을 메스 블레이트를 사용하여 중앙선 절개를 시행함으로써 노출시키고, 두개골의 표면을 건조시켜서 브레그마(bregma)를 확인하였다. 경막까지 1 mm 직경의 구멍을 드릴로 뚫었다. 멸균 PBS, PFF 또는 해당되는 경우 항체를 포함한 PFF를 우측 뒤쪽 선조체에 한 부위에서 총 4 μl의 부피로 (두개골로부터 AP +1.6 mm, ML +2.4 mm, DV 4.2 mm), 5 μl Hamilton 주사기를 사용하여 분당 0.4 μl의 속도로 주사하였다. 각 주사 후에, 주사기를 그 자리에 2분 동안 놓아둔 후 천천히 뺐다. 동물을 수술 후 매주 모니터링하였고 주사 후 30일 후에 희생시켰다 (dpi).

동물을 200 mL의 헤파린 처리된 0.1 M 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로, 이어서 0.1 M PBS에 희석된 200 mL의 4% 파라포름알데하이드 (PFA)로 심장을 가로질러 관류시켰다. 관류 후에, 뇌를 해부하고 동일한 고정 용액 (0.1 M PBS 중의 4% PFA)에 밤새 4℃에서 침지시킴으로써 고정시켰다. Vibratome (Leica VT1000S)을 사용하여, 뇌를 저온 PBS 중에서 50 마이크로미터 섹션으로 잘랐다. 6개의 슬라이스당 1개를 동일한 웰에서 유지시켰다. 동물 당 1개의 웰을 사용하여 면역형광 염색을 수행하였다. 섹션을 12-웰 플레이트의 웰에 분리하고 1시간 동안 실온에서 3 mL의 2% 소혈청 알부민 (BSA) 및 0.1 M PBS 중의 0.2% 트리톤-100X에서 인큐배이션하였다. 샘플을 차단하고 침투시킨 후, 슬라이스를 10분 동안 2% BSA-PBS에서 총 3회 세척하였다. StressMarq SPC-742 (세린 120 포스포-특이적 α-시누클레인 항체)의 1:500 희석을 2% BSA-PBS에서 제조하여 각 웰에 첨가하였다. 슬라이스를 밤새 4℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였고 이때 웰 당 총 부피는 3 mL이었다. 샘플을 10분 동안 2% BSA-PBS에서 총 3회 세척하였다. Alexa Fluor 488와 콘쥬게이트된 염소-항-토끼 2차 항체의 1:400 희석을 2% BSA-PBS에서 제조하여 각 웰에 첨가하였다. 슬라이스를 2시간 동안 실온에서 흔들어주면서 인큐베이션하였고 이때 웰당 총 부피는 3 mL이었다. 샘플을 10분 동안 2% BSA-PBS에서 2회 세척한 후 DAPI로 10분 동안 대조염색하고 PBS에서 10분 동안 세척하였다. 슬라이스를 마운팅하고, 대략 40분 동안 건조되도록 놓아둔 후 커버슬립을 Fluoromont-G (ThermoFisher Scientific, Catalog #00-4958-02)와 함께 첨가하였다. Olympus BX51 공초점 현미경 및 Fluoview FV1000 소프트웨어를 사용하여 이미지를 취하였다. DAPI를 405 nm 레이저로 여기시키고 Alexa-488을 461 nm 레이저로 여기시켰다. 모든 획득 매개변수 (예컨대 레이저 파워, HV, 게인, z-단계)는 샘플 사이에서 일정하게 유지시켰다.

PBS 중의 α-시누클레인 소섬유로 처리한 래트로부터 얻어진 피질 조직의 섹션은 α-시누클레인 항체 (pSer129)의 α-시누클레인 소섬유에의 결합 및 α-시누클레인 응집체 형성을 가리키는 국지화된 형광을 나타냈다. 그러나, PBS (대조군) 처리된 래트에서, 형광은 관찰되지 않았고, 이것은 α-시누클레인 응집체 형성이 없음을 가리킨다. 국지화된 형광을 또한 α-시누클레인 소섬유 및 항체 3D10으로 처리한 래트 피질 세포에서 관찰하였고, 이것은 항체 (pSer129)의 α-시누클레인 소섬유에의 결합 및 α-시누클레인 응집체 형성을 가리킨다. α-시누클레인 소섬유 및 항체 3D10을 받은 피질 세포에서 국지화된 결합의 양은 α-시누클레인 소섬유가 단독으로 투여된 래트로부터 얻어진 피질 조직의 슬라이스에서 관찰된 것과 유사하였다. 국지화된 형광이 α-시누클레인 소섬유 및 항체 2F11로 처리된 래트 뇌로부터 얻어진 피질 세포에서 관찰된 한편, 국지화된 부위의 수, 및 국지화된 결합 부위의 크기는 둘 다, α-시누클레인 소섬유 단독, 또는 α-시누클레인 소섬유 및 항체 3D10으로 처리되었을 때 피질 세포에서 관찰된 결합 부위의 수 및 크기 중 어느 하나와 비교할 때 감소하였다.

상기 결과는 2F11 항체로의 뇌 조직의 처리가 생체내에서, 래트 피질 세포에서의 루이 소체 병리의 발생을 감소시키는 것을 증명한다.

2F11은 α- 시누클레인의 세포독성 효과를 감소시킨다

α- 시누클레인은 세포독성 효과를 가지는 것으로 알려져 있고, 따라서 2F11 항체가 SHSY-5Y 세포에서 세포독성을 감소시키는 능력을 조사하였다.

인간 SHSY-5Y 세포를 96-웰 플레이트에 20,000개 세포/웰로 시딩하고 10 μM RA의 존재 하에 5일 동안 분화시켰다. 세포를 1x PBS로 세척하고 α-시누클레인 항체 (2F11)가 α-시누클레인 올리고머의 독성 효과를 중화시키는 능력을 테스트하였다. 활성 α-시누클레인 올리고머, 비활성 α-시누클레인 올리고머, 및 활성 α-시누클레인 단량체 (25 μg/ml 또는 50 μg/ml)를 혈청이 없는 DMEM에서 5 μg/ml의 단클론성 2F11와 함께 2시간 동안 진동시에서 실온에서 사전 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고 활성 α-시누클레인 응집체+2F11 항체를 함유한 100 μl의 배지를 관련 웰에 첨가하고 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 처리 후, 세포를 10% 중성 완충 포르말린으로 즉시 고정시키고 β-III 튜불린 항체를 사용하여 면역염색하였다 (β-III 튜불린이 뉴런 세포 마커로서 사용됨). 세포 사멸을 총 세포의 퍼센트 또는 β-III 양성 뉴런의 퍼센트로서 표시하였다. 그 결과를 도 9E에 나타낸다.

활성 α- 시누클레인 올리고머를 인간 SHSY-5Y 세포에 첨가한 후 활성 α-시누클레인 응집체를 첨가하는 것은 대조군 (미처리) 세포, 비활성 활성 α-시누클레인 올리고머에 노출된 세포, 또는 활성 α-시누클레인 단량체에 노출된 세포와 비교할 때 더 높은 수준의 세포 사멸을 초래하였다. 이 결과는 활성 α- 시누클레인 올리고머가 활성 α- 시누클레인 응집체에 의해 영입될 수 있고, 반응은 비활성 α- 시누클레인 올리고머와 비교하여 세포 사멸의 증가를 초래하는 것을 증명한다.

활성 α- 시누클레인 올리고머를 인간 SHSY-5Y 세포에 첨가한 후 활성 α-시누클레인 응집체+2F11 항체를 첨가하는 것은 세포 사멸을 비활성 활성 α-시누클레인 올리고머, 또는 활성 α-시누클레인 단량체에 노출된 세포에서 관찰된 수준으로 감소시켰다 (대략 2.5배). 이들 결과는 2F11이 생체내에서 α-시누클레인 올리고머의 독성 효과를 차단 또는 중화시키는 것을 가리킨다.

실시예 7: 에피토프 맵핑

에피토프 binding of the 2F11, 및 4F1, 3F8 (및 실시예 3에서 기술된 것과 같이 제조된 항체)을 포함한 여러 다른 항체의 에피토프 결합을 길이가 대략 30개 아미노산인 α-시누클레인 펩타이드에의 결합에 의해 평가하였고, 이때 각 α-시누클레인 펩타이드는 인접한 아미노산의 약 10개 아미노산 잔기와 중복한다 (상기 기술됨: "Peptide synthesis for epitope mapping").

일련의 중복하는 펩타이드를 BSA에 결합시킨 후 ELISA, 돗트 블롯 (DB) 또는 웨스턴 블롯 (WB)을 사용하여 분석하였다.

실시예 3에서 기술한 것과 같이, 대략 20개 항체를 활성 α-시누클레인 단량체에 결합하는 것으로서 선택하였지만, 그것들은 천연 또는 변성 조건 하에서 차등적인 결합을 나타냈다. 그러므로, 맵핑 분석을 위해 변성 및 천연 결합 조건 둘 다를 포함하도록 3가지 방법을 선택하였다. 이들 방법은 다음을 포함하였다: 웨스턴 블롯 (변성 조건 하에서), 돗트 블롯 (비변성 조건 하에서, 웨스턴 블롯에 유사한 출력 시스템을 사용하지만 도데실 황산 나트륨과 같은 이온성 계면활성제, 환원제 및 끓는 온도로 샘플을 변성시키지 않음), 및 ELISA (비변성 조건 하에서). 실시예 3에서 처음에 선택한 항체 중 15개의 결합 분석의 결과를 도 10에 나타낸다.

도 10에 나타낸 결과로부터, 2F11 클론이 독특한 에피토프 맵을 나타냈는데, 바로 아미노산 61 내지 90 및 아미노산 101 내지 130에 특이적으로 결합하는 유일한 클론이었다 (ELISA를 사용하여 측정됨). 나머지 항체는 영역의 상이한 조합에 결합하였다. 예를 들어, 클론 3F8 또한 C-말단 섹션에 강력한 결합을 나타냈다 (아미노산 101 내지 130 및 121 내지 140; 변성 및 비변성 방법을 모두 사용함). 크론 3F8은 또한 아미노산 41 내지 70에도 결합하였다.

이들 결과는 2F11 항체의 독특한 성질을 추가로 나타낸다. 2F11의 독특한 결합 용량은 그것이 알파 시누클레인 응집 및 섬유화 반응의 핵심 구성요소에 결합하여 중화시키는 것을 허용한다.

실시예 8: 악성 올리고머 α-시누클레인을 측정하기 위한 ELISA

샌드위치-기반 ELISA 테스트를 2F11을 사용하여 준비한다. 대조군 처리를 위해, 4F1 및 3F8 항체를 사용할 수 있다. 재조합 α-시누클레인 시드, 또는 활성 α-시누클레인 응집체를 표준으로서 사용할 수 있다. ELISA 검정을 사용하여 악성 올리고머 α-시누클레인을 선택적으로 측정할 수 있다. 검정은 비활성 단량체 또는 비활성 응집된 α-시누클레인을 식별하지 않는다.

실시예 9: 마우스 면역화

알파-syn 유전자도입 (tg) 마우스 (PD 모델; URL: jax.org/strain/004479; Masliah et al., 2011 참조) 및 비-tg 마우스를 2F11, 3F8, 및 4F1 항체를 사용하여 Masliah et al. 2011에서 정의된 것과 같이 6개월 동안 매주 복강내 주사로 별도로 면역화한다.

행동 반응

α-syn 유전자도입 (tg) 마우스 및 비-tg 마우스 모두의 행동 반응을 Masliah et al. 2011에서 기술된 것과 같이 6개월 동안 매주 복강내 주사한 후에 Water 미로, Pole 테스트 및 Rotarod 테스트를 사용하여 평가한다. 그 결과는 면역화된 tg 마우스가 더 나은 기억 회복력을 가지며 비 tg 마우스와 유사한 방식으로 그들의 과제를 완요할 수 있었는지을 결정하고 항체 처리가 학습 부족을 반전시키는지를 결정한다.

혈장 수준

마우스 혈장 및 뇌척수액에서의 2F11, 3F8, 4F1 항체의 역가를 6개월 기간에 걸쳐 결정한다. 뇌에서 증가하는 역가는 항체가 혈액 뇌 장멱을 가로지를 수 있음을 보여줄 것이다.

면역조직화학

6개월 후에, 동물을 희생시키고 그들이 해마 및 신피질의 샘플을 (Masliah et al. 2011에 기술된 것과 같이) 면역조직화학적으로 분석한다. 그 결과는 면역화된 tg 마우스가 그들의 해마 및 신피질에서 변경된 수준의 α-시누클레인을 가진 것을 보여줄 수 있다.

모든 인용물은 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 하나 이상의 구체예와 관련하여 기술되었다. 그러나, 다양한 변화 및 변형이 청구범위에서 정의되는 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있는 것이 기술분야의 숙련된 사람들에게 명백할 것이다.

참고문헌

Borghi R, Marchese R, Negro A, Marinelli L, Forloni G, Zaccheo D, et al. Full length alpha-synuclein is present in cerebrospinal fluid from Parkinson's disease and normal subjects. Neurosci Lett 2000;287:65-7.

El-Agnaf OM, Salem SA, Paleologou KE, Curran MD, Gibson MJ, Court JA, et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. FASEB J 2006;20:419-25.

Desplats, P.; Lee, H.; Bae, E.; Patrick, C.; Rockenstein, E.; Crews, L.; Spencer, B.; Masliah, E.; Lee, S. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of -synuclein. PNAS 2009, 106, 13010-13015.

Kasuga K, Tokutake T, Ishikawa A, Uchiyama T, Tokuda T, Onodera O, et al. Differential levels of alpha-synuclein, beta-amyloid42 and tau in CSF between patients with dementia with Lewy bodies and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2010;81:608-10.

Bartels, T., Choi, J. G. and Selkoe, D. J. α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature (2011), 477, 107-110.

Wang. W., Petrovic, I., Chittuluru, J., Kaganovich, A, et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:17797-17802.

Giasson, B. I., Murray, I. V. J., Trojanowski, J. Q., and Lee, V. M.-Y. (2001) A hydrophobic stretch of 12 amino acid residues in the middle of α-synuclein is essential for filament assembly. J. Biol. Chem. 276, 2380-2386.

Bedard, L., Lefevre, T., Morin-Michaud, E., and Auger, M. (2014) Besides Fibrillization: Putative Role of the Peptide Fragment 71-82 on the Structural and Assembly Behaviour of the α-synuclein. Biochemistry, 53, 6463-6472.

Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., and Lee, V. M-Y. (2014). Nature Protocols, 9(9), 2135-2145.

Jo, E., McLaurin, J., Yip, C.M., St George-Hyslop, P., and Fraser, P.E. (2000). alpha-synuclein membrane interactions and lipid specificity. J. Biol. Chem. 275, 34328-34334.

Lee, H.J., Choi, C., and Lee, S.J. (2002). Membrane-bound alpha-synuclein has a high aggregation propensity and the ability to seed the aggregation of the cytosolic form. J. Biol. Chem. 277, 671-678

Perrin, R.J., Woods, W.S., Clayton, D.F., and George, J.M. (2001). Exposure to long chain polyunsaturated fatty acids triggers rapid multimerization of synucleins. J. Biol. Chem. 276, 41958-41962.

Comellas, G., Lemkau, L.R., Zhou, D.H., George, J.M., and Rienstra, C.M. (2012). Structural intermediates during a-synuclein fibrillogenesis on phospholipid vesicles. J. Am. Chem. Soc. 134, 5090-5099.

Murray, I. V. J., Giasson, B. I., Quinn, S. M., Koppaka, V., Axelsen, P. H., Ischiropoulos, H., Trojanowski, J. Q. and Lee, V. M-y. (2003). Role of α-synuclein carboxy-terminus on fibril formation in vitro. Biochemistry, 42, 8530-8540.

Cremades, N.; Cohen, S.I.A.; Deas, E.; Abramov, A.Y.; Chen, A.Y.; Orte, A.; Sandal, M.;Clarke, R.W.; Dunne, P.; Aprile, F.A.; et al. Direct observation of the interconversion of normal and toxic forms of α-synuclein. Cell 2012, 149, 1048-1059.

Hansen, C.; Angot, E.; Bergstrφm, A.; Steiner, J.A.; Pieri, L.; Paul, G.; Outeiro, T.F.; Melki, R.; Kallunki, P.; Fog, K. α-synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J. Clin. Investig. 2011, 121, 715-725.

Shvadchak, V., Claessens, M. M. A. E., and Subramaniam, V. (2015). Fibril breaking accelerates α-synuclein fibrillization. J. Phys. Chem. B., 119, 1912-1918.

Horvath, I., Sellstedt, M., Weise, C., Nordvall, L-M., Prasad, G. K., Olofsson, A., Larsson, G., Almqvist, F., and Willung-Stafshede, P. (2013). Modulation of α-synuclein fibrillization by ring-fused 2-pyridones: templation and inhibition involve oligomer with different structures.

Lashuel, H.A.; Petre, B.M.; Wall, J.; Simon, M.; Nowak, R.J.; Walz, T.; Lansbury, P.T. α-synuclein, especially the Parkinson's disease-associated mutants, forms pore-like annular and tubular protofibrils. J. Mol. Biol. 2002, 322, 1089-1102.

Kostka, M.; Hogen, T.; Danzer, K.M.; Levin, J.; Habeck, M.; Wirth, A.; Wagner, R.; Glabe, C.G.; Finger, S.; Heinzelmann, U.; et al. Single particle characterization of iron-induced pore-forming alpha-synuclein oligomer. J. Biol. Chem. 2008, 283, 10992-11003.

Zhang, H.; Griggs, A.; Rochet, J.-C.; Stanciu, L.A. In vitro study of -synuclein protofibrils by cryo-EM suggests a Cu2+ -dependent aggregation pathway. Biophys. J. 2013, 104, 2706-2713.

Lorenzen, N.; Nielsen, S.B.; Buell, A.K.; Kaspersen, J.D.; Arosio, P.; Vad, B.S.; Paslawski, W.; Christiansen, G.; Valnickova-Hansen, Z.; Andreasen, M.; et al. The role of stable-synuclein oligomer in the molecular events underlying amyloid formation. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 3859-3868.

Cherny, R.A.; Culvenor, J.G.; Bottomley, S.P.; Masters, C.L. Dopamine promotes α-synuclein aggregation into SDS-resistant soluble oligomer via a distinct folding pathway. FASEB J. 2005, 19, 1377-1379.

Giasson, B. I., Jakes, R.., Goedert, M., Duda, J. E., Leight, S., Trojanowski, J. Q., and Lee, V. M.-Y. (2000). A panel of epitope-specific antibodies detects protein domains distributed throughout human α-synuclein in Lewy bodies in Parkinson's disease. J. Neurosci. Res. 59, 528-533.

Luk, K. C., Song, C., O'Brien, P., Stieber, A., Branch, J. R., Brunden, K. R., Trojanowski, J. Q., and Lee, V. M.-Y. (2009). Exogenous α-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellualar inclusions in cultured cells. PNAS, 106(47), 20051-20056.

Masliah E, Rockenstein E, Adame A, Alford M, Crews L, Hashimoto M, Seubert P, Lee M, Goldstein J, Chilcote T, Games D, Schenk D (2005) Effects of alpha-synuclein immunization in a mouse model of Parkinson's disease. Neuron 46:857-868.

Masliah E, Rockenstein E, Mante M, Crews L, Spencer B, Adame A, Patrick C, Trejo M, Ubhi K, Rohn TT, Mueller-Steiner S, Seubert P, Barbour R, McConlogue L, Buttini M, Games D, Schenk D (2011) Passive immunization reduces behavioral and neuropathological deficits in an alpha synuclein transgenic model of Lewy body disease. PLoS One 6:e19338.

Bae, E-J., Lee, H-J., Rockenstein, E., Ho, D-H., Park E-B., Yang, N-Y., Desplats, P., Masliah E., and Lee, S-J. (2012). Antibody-Aided Clearance of Extracellular α-synuclein Prevents Cell-to-Cell Aggregate Transmission. Journal of Neuroscience, September 26, 2012, 32(39):13454-13469.

Lee, H-J., Bae, E-J., Jang, A., Ho, D-H, Cho, E-D., Suk, J-E., Yun, Y-M, Lee, S-J. (2011). Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specicities. Journal of Neuroscience Methods 199; 249- 257.

Lannfelt, L., Bergstrom, J., Ingelsson, M., Gellerfors, P. Antibodies and vaccines for use in therapeutic and diagnostic methods for α-synuclein-related disorders US Patent 8,809,506B2.

Weihofen, A., Grimm, J., Nitsch, R., Hock, C. Human anti-alpha-synuclein antibodies. US Patent 8,940,276B2.

Nordstrom, E., Kasrayan, A., Ekberg, M., Screpanti Sundquist, V., Lannfelt, L., Holmquist, M. protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for Parkinson's disease, dementia with Lewy bodies and other α-synucleinopathies. US Patent 9,084,832B2

Ariesandi, W., Chang, C-F., Chen, T-E., and Chen, Y-R. (2013). Temperature-Dependent Structural Changes of Parkinson's alpha-synuclein Reveal the Role of Pre-Existing Oligomer in Alpha-synuclein Fibrillization. PLOS ONE, 8(1); e53487.

SEQUENCE LISTING <110> StressMarq Biosciences Inc <120> ANTIBODY BINDING ACTIVE ALPHA-SYNUCLEIN <130> V810016WO <140> n/a <141> 2018-08-02 <150> 62/540,435 <151> 2017-08-02 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Thr Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Asn Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Met Gly Lys Gly Glu Glu Gly Tyr Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Gly Ser Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 2 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> AA 1-30 peptide <400> 3 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> AA 21-50 peptide <400> 4 Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys Thr Lys Glu Gly 1 5 10 15 Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val Val His 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> AA 41-70 PEPTIDE <400> 5 Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val Val His Gly Val Ala Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> AA 61-90 PEPTIDE <400> 6 Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala 1 5 10 15 Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala 20 25 30 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> AA 81-110 PEPTIDE <400> 7 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 1 5 10 15 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> AA 101-130 PEPTIDE <400> 8 Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met 1 5 10 15 Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu 20 25 30 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> AA 121-140 PEPTIDE <400> 9 Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Pro Glu Ala 20 <210> 10 <211> 411 <212> DNA <213> artificial <220> <223> variable region (heavy chain - IgG1 isotype) of for 2F11 <400> 10 atgaaatgca gctgggtcat cttcttcctg atggcagtgg ttataggaat caattcagag 60 gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaggtcag gggcctcagt caagttgtcc 120 tgcacagctt ctggcttcaa cattaaagac tactatatgt tttgggtgaa gcagaggcct 180 gaacagggcc tggagtggat tggatggaat gatcctgaga atggtgatac tgaatatgcc 240 ccgaagttcc agggcaaggc cactatgact gcagacacat cctccaacac agcctaccta 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtaatgc atgggatggt 360 aactatgtta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 411 <210> 11 <211> 137 <212> PRT <213> artificial <220> <223> variable region (heavy chain - IgG1 isotype) of for 2F11 <400> 11 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Ile Gly 1 5 10 15 Ile Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Lys Asp Tyr Tyr Met Phe Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Asn Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Asn Ala Trp Asp Gly Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 12 <211> 396 <212> DNA <213> artificial <220> <223> light chain variable region (Kappa) of for 2F11 <400> 12 atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctct aggggaacgg 120 gtcaccatga cctgcactgc cagctcaagt gtaagttcca gttacttgca ctggtaccag 180 cagaagccag gatcctcccc caaactctgg atttatagca catccaacct ggcttctgga 240 gtcccacctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcagc 300 atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccaccagt atcatcgttc cccacccatg 360 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 396 <210> 13 <211> 130 <212> PRT <213> artificial <220> <223> light chain variable region (Kappa) of for 2F11 <400> 13 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 100 105 110 Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Met Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu 130 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (heavy chain) <400> 14 Asp Tyr Tyr Met Phe 1 5 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (heavy chain) <400> 15 Trp Asn Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (heavy chain) <400> 16 Asn Ala Trp Asp Gly Asn Tyr Val 1 5 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (light chain) <400> 17 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (light chain) <400> 18 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (light chain) <400> 19 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (heavy chain) <400> 20 gactactata tgttt 15 <210> 21 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (heavy chain) <400> 21 tggaatgatc ctgagaatgg tgatactgaa tatgccccga agttccaggg c 51 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (heavy chain) <400> 22 aatgcatggg atggtaacta tgtt 24 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (light chain) <400> 23 actgccagct caagtgtaag ttccagttac ttgcac 36 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (light chain) <400> 24 agcacatcca acctggcttc t 21 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> monoclonal antibody 2F11 (light chain) <400> 25 caccagtatc atcgttcccc acccatgtac acg 33

Claims (25)

1. ATCC PTA-124174 하에 기탁된 단클론성 항체 2F11.
2. 제약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 비히클 또는 부형제에, 제1항에서 정의된 단클론성 항체 2F11을 포함하는 조성물.
3. 제약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 비히클 또는 부형제에, 제1항에서 정의된 단클론성 항체 2F11을 포함하는 백신.
4. 필요로 하는 대상체에서 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유 형성을 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 소정량의 제2항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
5. 필요로 하는 대상체에서 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유 형성을 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 소정량의 제3항의 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 조성물은 대상체에게 경구로, 비강내로, 근육내로, 복강내로, 정맥내로, 또는 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 백신은 대상체에게 경구로, 비강내로, 근육내로, 복강내로, 정맥내로, 또는 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제4항에 있어서, 투여 단계 전에, 대상체에서 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 수준이 측정되고, 투여 단계 후 일정 시간이 지난 후에, 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 제2 수준이 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제5항에 있어서, 투여 단계 전에, 대상체에서 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 수준이 측정되고, 투여 단계 후 일정 시간이 지난 후에, 활성 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 제2 수준이 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 측정하는 방법으로서,
    i) 샘플의 일부분을 대조군 항체와 사전 혼합한 후 재조합 활성 α-시누클레인 단량체를 첨가하여 대조군 처리를 생성하는 단계,
    ii) 샘플의 제2 부분을 제1항에서 정의된 단클론성 항체 2F11과 사전 혼합한 후, 재조합 활성 α-시누클레인 단량체를 첨가하여 활성 처리를 생성하는 단계,
    iii) 티오플라빈 검정을 사용하여 대조군 처리 및 활성 처리 둘 다에서 β-시트 구조 형성의 양을 측정하며, 여기서 활성 처리에서 티오플라빈 형광의 감소는 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
11. 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 존재를 측정하는 방법으로서, 샘플을 제1항에서 정의된 단클론성 항체 2F11에 노출시키는 단계, 단클론성 항체 2F11이 샘플 중의 단백질에 결합하는지를 측정하며, 여기서 결합은 활성 올리고머 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 샘플은 노출 단계 전에 비변성 전기영동을 사용하여 분리되고, 분리된 단백질은 단클론성 항체 2F11을 사용하여 웨스턴 분석을 통해 프로빙되며, 하나 이상의 고분자량 단백질의 결합은 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 존재를 나타내는 것임을 특징으로 하는 방법.
13. 제11항에 있어서, 샘플의 돗트 블롯은 단클론성 항체 2F11을 사용하여 프로빙되고, 단클론성 항체 2F11의 샘플에의 결합은 활성 올리고머 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 존재를 나타내는 것임을 특징으로 하는 방법.
14. 시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 알츠하이머병, 산발성 알츠하이머병, 또는 가족성 알츠하이머병으로 진단된 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 제1항에서 정의된 단클론성 항체 2F11, 또는 단클론성 2F11을 포함하는 제약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
15. 시누클레인병증, 루이 소체를 특징으로 하는 병리적 상태, 파킨슨병, 루이 소체를 포함한 치매, 다계통 위축증, 산발성 알츠하이머병, 또는 가족성 알츠하이머병을 치료하는 방법으로서, 제1항에서 정의된 단클론성 항체 2F11, 또는 단클론성 항체 2F11을 포함하는 제약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
16. 샘플 중의 활성 올리고머 α-시누클레인, 또는 tau 소섬유의 존재, 농도, 또는 존재 및 농도 둘 다를 측정하는 방법으로서, 샘플을 제1항의 단클론성 항체 2F11을 사용하여 제조된 표면에 적용하는 단계 및 단클론성 항체에 결합된 활성 α-시누클레인 응집체, 또는 tau 응집체의 발생, 양, 또는 발생 및 양을 측정함으로써 샘플 중의 활성 α-시누클레인 응집체, 또는 tau 응집체의 존재, 농도, 또는 존재 및 농도 둘 다를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
17. 미노산 서열, 단클론성 항체의 CDR을 암호화하는, SEQ ID NO:14 내지 19에 의해 정의된 아미노산 서열을 포함하는 단클론성 항체.
18. 제17항에 있어서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:20 내지 25에 의해 정의된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 단클론성 항체.
19. 제17항에 있어서, 단클론성 항체는 α-시누클레인 활성 응집체, tau 소섬유, 또는 이것들의 조합에 결합하는 것을 특징으로 하는 단클론성 항체.
20. 혈액 뇌 장벽을 가로질러 이동하기 위한 다중특이적 항체로서, 다중특이적 항체는 제1항의 단클론성 항체에 부착된 하나 또는 하나 이상의 담체 분자를 포함하는 다중특이적 항체.
21. 제20항에 있어서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이고, 이중특이적 항체는 1가-이중특이적 항체 또는 2가-이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 다중특이적 항체.
22. 제21항에 있어서, 이중특이적 항체의 하나 이상의 담체 분자는 트랜스페린 수용체 (TfR)-결합 항체로부터, 또는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R)-결합 항체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 다중특이적 항체.
23. 샘플 중의 tau 응집의 존재를 측정하는 방법으로서,
    i) 샘플의 일부분을 대조군 항체와 사전 혼합한 후 tau 단량체를 첨가하여 대조군 처리를 생성하는 단계,
    ii) 샘플의 제2 부분을 단클론성 항체 2F11과 사전 혼합한 후, tau 단량체를 첨가하여 활성 처리를 생성하는 단계, 및
    iii) 대조군 처리 및 활성 처리 둘 다에서 β-시트 구조 형성의 양을 측정하며, 여기서 활성 처리에서 β-시트 구조 형성의 양의 감소는, 대조군 처리와 비교할 때, 샘플 중의 tau 응집의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
24. 타우병증, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 또는 구상 신경교 타우병증으로 진단된 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 제1항에서 정의된 단클론성 항체 2F11, 또는 단클론성 2F11을 포함하는 제약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
25. 타우병증, 신경소섬유 엉킴을 특징으로 하는 병리적 상태, 알츠하이머병, 픽병, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽성 치매, 은친화성 그레인 질환, 1차 연령 관련 타우병증, 신경소섬유 엉킴 전용 치매, 또는 구상 신경교 타우병증을 치료하는 방법으로서, 제1항에서 정의된 단클론성 항체 2F11, 또는 단클론성 항체 2F11을 포함하는 제약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.

Images