BR112020001970A2 - anticorpo que se liga à alfa-sinucleína ativa - Google Patents

Abstract

Um anticorpo monoclonal que se liga à a-sinucleína, e que se liga a fibrilas de tau, e métodos para usar o anticorpo monoclonal, são fornecidos. O anticorpo monoclonal pode ser clone de hibridoma 2F11. Também é fornecida uma composição compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11 e um carreador, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um método para reduzir a-sinucleína ativa em um indivíduo em necessidade do mesmo também é revelado. O método envolve administrar uma quantidade da composição compreendendo 2F11 ao indivíduo. O anticorpo monoclonal 2F11 também pode ser usado para determinar o nível de a-sinucleína ou fibrila de tau em uma amostra biológica.

Description

ANTICORPO QUE SE LIGA À ALFA-SINUCLEÍNA ATIVA Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam a - sinucleína. São também descritos métodos para usar os anticorpos. Antecedentes da invenção

[002] A doença de Parkinson (PD) é um distúrbio neurodegenerativo que afeta aproximadamente 10 milhões de pessoas no mundo inteiro, com aproximadamente 15% delas sofrendo de demência com Corpos de Lewy (DLB). Essas representam as patologias principais envolvendo -sinucleína, uma proteína envolvida nas doenças, embora até a presente data suas funções principais no corpo permaneçam amplamente desconhecidas. As próprias doenças são caracterizadas por uma ampla gama de sintomas incluindo os sintomas de motor primários: tremores em repouso, bradicinesia, rigidez, instabilidade postural, bem como sintomas não motores incluindo perda do sentido de cheiro, constipação, distúrbio de comportamento REM, distúrbios de humor e esquecimento. Recentemente a agregação de -sinucleína também foi mostrada como sendo envolvida em Atrofia Sistêmica Múltipla (MAS). Além de corpos Lewy, o acúmulo da proteína pode resultar em neurites Lewy, em que axônios e dendritos se tornam alongados e distróficos. O acúmulo e deposição eventual de -sinucleína como agregados que formam corpos de Lewy podem ser visualizados como corpos de inclusão de 10 a 20 m em tecido neuronal. Em DLB essas formações são difundidas, levando aos sintomas associados à doença.

[003] Tau é uma proteína associada a microtúbulo que é envolvida na manutenção de transporte axonal e integridade neuronal e tem um papel fisiológico em dendritos. Tau também é expressa em baixos níveis em células gliais. No cérebro humano adulto, seis isoformas de tau são expressas por splicing alternativo a partir do gene MAPT. Mutações no gene MAPT levam a doenças hereditárias associadas ao acúmulo de proteína tau patológica. Taupatias são doenças neurodegenerativas caracterizadas pelo depósito de proteína tau anormal no cérebro. Fenótipos neuropatológicos compreendem doença de Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, anteriormente conhecida como demência de emaranhado neurofibrilar somente, taupatia glial globular (Kovacs, G.G, 2015, Neuropathol. App. Neurobiol., 41, 3–23). A doença de Alzheimer é caracterizada por placas amiloides e emaranhados neurofibrilares no cérebro, com proteína tau sendo o componente primário dos emaranhados (Congdon, E.E., e Sigurdsson, E.M., Nat. Rev. Neurol., publicado on-line em 12 de junho de 2018, Nature.com/nrneurol).

[004] Tradicionalmente, corpos de Lewy contendo -sinucleína foram associados à doença de Parkinson e emaranhados neurofibrilares contendo tau com doença de Alzheimer e várias síndromes de demência frontotemporal. Entretanto, há sobreposição significativa e co-ocorrência de -sinucleína e patologias de tau em um espectro de doenças neurodegenerativas. Por exemplo, agregados de -Sinucleína (corpos de Lewy) foram encontrados em uma alta percentagem (60%) de formas familiares e esporádicas de doença de Alzheimer, enquanto agregados de tau (emaranhados neurofibrilares, NFTs) foram observados na doença de Parkinson. Adicionalmente, corpos de Lewy e emaranhados neurofibrilares foram observados co-localizar, uma vez que as proteínas foram encontradas no produto de agregação um do outro in vivo (Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304).

[005] Alfa-sinucleína é conhecida por ligar diretamente tau e induzir fibrilização de tau (Benussi, L. et. al. 2005, Exp. Cell Res. 308:78-84; Li, X., et. al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304). Como resultado, α-sinucleína e tau são proteínas que são propensas a agregação e desdobramento patológico. Desdobramento inicia uma homo-oligomerização e cascata de agregação culminando em acúmulo cerebral de α-sinucleína agregada e tau em inclusões de proteína insolúveis em múltiplas doenças neurodegenerativas. (Yan, X et. al., 2018 Seminars Cell Devel. Biol. Disponível em URL: doi.org/10.1016/j.semcdb.2018.05.005).

[006] Proteína alfa-sinucleína existe como três isoformas principais, com a mais longa sendo 140 aminoácidos em comprimento. É uma proteína citosólica, embora quantidades pequenas estejam contidas nas vesículas, e possam ser submetidas a exocitose. Essa proteína foi detectada em sangue e fluido cérebro- espinhal (Borghi et al., 2000; El-Agnaf et al., 2006; Kasuga et al., 2010). A α- sinucleína extracelular pode ser envolvida em difusão da doença por todo o cérebro bem como causar morte neuronal e inflamação (Desplats et al., 2009).

[007] O processo pelo qual a -sinucleína se torna uma entidade de formação de doença com propriedades semelhantes a príon não é bem entendido. Alfa-sinucleína pode tomar uma via complexa através de um número desconhecido de intermediários e/ou populações de intermediários a partir de uma proteína solúvel monomérica sem atividade semelhante a príon a um agregado insolúvel com atividade semelhante a príon (vide, por exemplo, figura 1: Técnica anterior; Roberts H.L., Brown D.R., 2015, Biomolecules 5:282-305). O agregado insolúvel com atividade semelhante a príon é capaz de recrutar α- sinucleína solúvel e transformá-la em agregado por um processo que inclui uma alteração estrutural a partir de uma conformação helicoidal encontrada em membranas e no citosol (Bartels et al, 2011; Wang et al, 2011) em uma estrutura de folha-β. Entretanto, o processo de gerar agregados de -sinucleína que são capazes de recrutar monômeros da mesma proteína e promover sua fibrilização inicia com um conjunto desconhecido de populações de oligômero sendo formado.

[008] Uma sequência de peptídeo de 12 aminoácidos em alfa-sinucleína humana (resíduos 71 a 82, que são ausentes em -sinucleína) parece necessária e suficiente para fibrilização da proteína. Esse peptídeo é resistente a proteólise, e pode se tornar o núcleo de filamentos de -sinucleína. Peptídeos sintéticos que correspondem à sequência de 71 a 82 aminoácidos são capazes tanto de auto-polimerizar em filamentos como montar em conjunto e promover montagem de -sinucleína de comprimento total in vitro (Giasson et al., 2001). Esse peptídeo forma reversivelmente folhas- intermoleculares e demonstra um equilíbrio entre as formas monoméricas e oligoméricas (Bédard et al., 2014). Quando em contato com vesículas aniônicas, o peptídeo é submetido a uma alteração de conformação que envolve autoagregação irreversível, caracterizada principalmente por formação de folha-. Isso espelha propriedades estruturais e gerais da proteína de -sinucleína nativa.

[009] Vesículas aniônicas de membrana mostram formação rápida de agregados com o peptídeo 71 a 82 de -sinucleína isolado. Além disso, - sinucleína nativa pode ser mal enovelada ou ser submetida a alteração de conformação levado à oligomerização ao interagir com membranas (Jo et al, 2000, Lee et al., 2002) e ácidos graxos poli-insaturados (Perrin et al., 2001). α- sinucleína helicoidal pode ser convertida diretamente em fibrilas contendo folha-β em membranas fosfolipídicas aniônicas (Comellas et al., 2012). Um protocolo para gerar agregados de α-sinucleína que são capazes de recrutar monômeros da mesma proteína (Volpicelli-Daley et al., 2014) tem uma desvantagem de que variações pequenas em velocidades de rotor, tamanho de frasco e formato (contendo a α-sinucleína) podem afetar o tamanho de bolhas formadas nos frascos e, portanto, a área superficial disponível para o processo de fibrilização, interfere diretamente na etapa de ativação interfacial. US

2004/0143093 ensina o uso de equipamento especializado e interfaces hidrofóbicas dependentes de concentração para tratar de problemas associados à etapa de ativação interfacial. Adicionalmente, mutantes de terminais carbóxi de α-sinucleína apresentam fibrilização sob condições em que a α-sinucleína do tipo selvagem nativa não apresenta (Murray et al., 2003).

[010] A extensão a qual fibrilas de -sinucleína são inerentemente tóxicas não é clara. Fibrilas de -sinucleína maduras existem em uma forma de equilíbrio dinâmico com uma população de oligômeros gerados por montagem e desmontagem de fibrila. Uma mistura heterogênea de oligômeros (grande e pequeno) pode se formar sob condições quase fisiológicas (Cremades et al., 2012). Quando as fibrilas são desmontadas, os produtos são capazes de semear crescimento de fibrilas novas na presença de monômeros. A desmontagem de fibrila pode ocorrer in vivo durante transmissão de agregados de -sinucleína em cultura de células (Desplats et al., 2009), e em modelos de sinucleinopatia (Hansen et al, 2011).

[011] A atividade semelhante a príon pode ser causada diretamente por uma população de oligômeros, ou de uma população de oligômeros criada por desmontagem de fibrila, por exemplo, quebra de fibrila acelera fibrilização de - sinucleína (Shvadchak et al., 2015), e populações de oligômero com estruturas diferentes eram inibidoras em direção a uma formação de fibrila ou ativando em direção a formação de fibrila (Horvath et al.,2013). Esses resultados sugerem que populações de oligômero podem estar “no caminho” ou “fora do caminho” em direção à montagem de fibrila. Ambos os oligômeros de oligômero no caminho (Lashuel et al., (2002), Kostka et al., (2008), Zhang et al. (2013)), como oligômeros fora do caminho (Lorenzen et al., (2014), Cherny et al. (2005)) foram identificados.

[012] O processo para fabricar agregados de -sinucleína (também mencionada como fibrilas pré-formadas ou PPFs) para pesquisa baseada em corpo de Lewy (usando os métodos de Volpicelli-Daley et al., 2014), pode reduzir oligômeros preexistentes de α-sinucleína (Ariesandi et al., 2013) e resulta em incerteza com relação ao nível de populações de oligômero tóxico ou agregados em um preparado de agregado de -sinucleína (versus outras populações de oligômeros ou agregados que não são tóxicos).

[013] Anticorpos policlonais e monoclonais foram feitos contra - sinucleína recombinante e peptídeos parciais da mesma, (Giasson, B. I. et al., 2000; Luk et al., 2009). Masliah et al., 2005, 2011 ensinam que imunização ativa e passiva contra α-sinucleína com anticorpos anti-α-sinucleína reduziu o depósito de α-sinucleína e perda sináptica em um modelo transgênico de sinucleinopatia. Bae et al. (2012) mostraram que a transmissão de -sinucleína extracelular foi reduzida ou parada por imunização com anticorpos, e que essa transmissão reduzida foi predominantemente realizada por células da micróglia, fornecendo um mecanismo para depuração da proteína. Nesses estudos, os anticorpos (criados para -sinucleína humana monomérica recombinante) foram específicos para sequências lineares e identificaram monômeros desnaturados. Os anticorpos não estavam se ligando a conformações estruturais tridimensionais de oligômeros de α-sinucleína. Por exemplo, foi observado que anticorpo monoclonal 274 (Bae et al, 2012) ou 9E4 (e outros anticorpos monoclonais; Masliah et al, 2011), identificam a sequência linear de α-sinucleína na forma agregada, bem como em monômeros, desse modo não diferenciando entre o agregado ou formas monoméricas de α-sinucleína.

[014] Lee et al. (2011) identificaram dois clones de anticorpo monoclonal 169 e 171 que tinham afinidade reduzida para α-sinucleína desnaturada (em western blotting) e identificaram α-sinucleína recombinante desnaturada de comprimento total.

[015] US 8.809506 produziu anticorpos monoclonais contra uma mistura de protofibrilas e oligômeros de α-sinucleína quimicamente alterados (quimicamente modificados com 4-oxo-2-nonenal e 4-hidroxi-2-nonenal). Os anticorpos monoclonais não foram testados para determinar se ligavam subpopulações de α-sinucleína que eram tóxicas, ou se ligavam epítopos tridimensionais ou lineares gerados pela população de multímero de sinucleína de que é tóxica.

[016] US 8.940.276 ensina a criação de anticorpos contra α-sinucleína. Os anticorpos não foram capazes de diferenciar entre as populações de α-sinucleína tóxicas e não tóxicas. Alfa-sinucleína foi identificada como um monômero em um Western blot, sugerindo que os anticorpos não ligam um epítopo tridimensional gerado por oligômeros tóxicos (que estariam ausentes em SDS, amostras fervidas, reduzidas usadas em Western blot).

[017] US 9.084.832 caracteriza anticorpos contra α-sinucleína usando técnicas ELISA que parecem ter uma afinidade mais alta para uma população de populações pré-fibrilares, porém não há indicação se as populações de α- sinucleína são semelhantes a príon ou tóxicas. Adicionalmente, o anticorpo se liga a epítopos lineares curtos específicos, ao invés de uma conformação tridimensional específica para um oligômero (tóxico).

[018] Ariesandi et al. (2013) ensinam que o processo inclusivo de tratamento térmico para produzir PFFs reduz as concentrações de oligômero preexistentes. Esse resultado levanta ainda dúvida com relação a se os anticorpos descritos na técnica anterior acima são direcionados a populações tóxicas de oligômeros de α-sinucleína que estão “no caminho”, ou oligômeros não tóxicos que estão “fora do caminho”.

[019] A função fisiológica da proteína α-sinucleína não é conhecida. Supõe- se que a toxicidade da proteína está relacionada a uma subpopulação de oligômeros de α-sinucleína (ao invés de fibrilas) que não são bem definidas na literatura. Esses tipos de subpopulação e concentrações são dinâmicos e provavelmente se montam e desmontam in vivo. Há necessidade de criar um anticorpo que seja capaz de ligar a forma α-sinucleína semelhante a príon (tóxica) virulenta. Sumário da invenção

[020] A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam a α- sinucleína. São também descritos métodos para usar os anticorpos.

[021] De acordo com a presente invenção, é fornecido um anticorpo monoclonal, ou um anticorpo monoclonal isolado, 2F11 que se liga a α-sinucleína ativa, o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma tendo número de acesso ATCC nº PTA-124174 (recebido pelo ATCC em 11 de maio de 2017). Também é descrito na presente invenção é um polinucleotídeo isolado codificando a cadeia leve variável, cadeia pesada variável, ou ambas a cadeia leve variável e a cadeia pesada variável do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma tendo número de acesso ATCC nº PTA-124174, recebido em 11 de maio de 2017. Também é fornecida uma composição ou uma vacina compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11 em um veículo, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável também é descrito na presente invenção.

[022] Também é fornecido método para reduzir α-sinucleína ativa, ou fibrilas de tau, em um indivíduo em necessidade do mesmo compreendendo administrar uma quantidade da composição, ou vacina como descrita acima, ao indivíduo. A composição ou a vacina pode ser administrada ao indivíduo por via oral, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea. Se desejado, antes da etapa de administração, um nível de α-sinucleína ativa, ou fibrilas de tau, no indivíduo pode ser determinado, e após um período de tempo seguindo a etapa de administração, um ou mais de um segundo nível de α- sinucleína ativa, ou fibrilas de tau, podem ser determinados.

[023] Também é descrito aqui um anticorpo monoclonal 2F11 que se liga a α-sinucleína, fibrilas de tau, ou uma combinação dos mesmos, e compreende as seguintes sequências de aminoácidos que definem as regiões determinantes de complementaridade (CDRs): Cadeia pesada: DYYMF (SEQ ID NO: 14); WNDPENGDTEYAPKFQG (SEQ ID NO: 15); NAWDGNYV (SEQ ID NO: 16); Cadeia leve: TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 17) STSNLAS (SEQ ID NO: 18) HQYHRSPPMYT (SEQ ID NO: 19).

[024] Também é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica as CDRs de anticorpo monoclonal 2F11 como definido pela SEQ ID NO: 14 a 19. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico que codifica as CDRs do anticorpo monoclonal 2F11 pode compreender as seguintes sequências de nucleotídeo: Cadeia pesada: GACTACTATATGTTT (SEQ ID NO: 20)

TGGAATGATCCTGAGAATGGTGATACTGAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGC (SEQ ID NO: 21) AATGCATGGGATGGTAACTATGTT (SEQ ID NO: 22) Cadeia leve: ACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCAC (SEQ ID NO: 23) AGCACATCCAACCTGGCTTCT (SEQ ID NO: 24) CACCAGTATCATCGTTCCCCACCCATGTACACG (SEQ ID NO: 25)

[025] Também é descrito na presente invenção um anticorpo monoclonal, ou um anticorpo monoclonal isolado, que se liga a -sinucleína humana, ou fibrilas de tau, e compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo três regiões determinantes de complementaridade VH (CDRs) compreendendo as sequencias de aminoácidos expostas na SEQ ID NOs: 14 a 16 e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo três CDRs VL compreendendo as sequências de aminoácidos expostas na SEQ ID NOs: 17 a 19, respectivamente. As sequências de aminoácidos do anticorpo monoclonal podem ser codificadas por uma sequência de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeo definidas por SEQ ID NOs: 20 a 25. Além disso, o anticorpo monoclonal é caracterizado por se ligar a um agregado ativo de -sinucleína, ou um agregado de tau, ou uma combinação dos mesmos. Uma composição ou uma vacina compreendendo o anticorpo monoclonal como descrito acima, em um veículo, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável também é descrito na presente invenção.

[026] Também é descrita na presente invenção uma sequência de polinucleotídeos isolada codificando CDRs de um anticorpo monoclonal uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo três regiões determinantes de complementaridade VH (CDRs) e compreendendo as sequências de aminoácidos definidas nas SEQ ID NOs: 14 a 16. Um vetor de expressão compreendendo a sequência de polinucleotídeos também é descrito.

[027] Um anticorpo multiespecífico para transmigrar a barreira hematoencefálica também é descrito na presente invenção. O anticorpo multiespecífico compreende uma ou mais de uma molécula carreadora fixada ao anticorpo monoclonal 2F11 produzido pelo hibridoma tendo número de acesso ATCC nº PTA-124174 (recebido pelo ATCC em 11 de maio de 2017). O anticorpo multiespecífico pode ser um anticorpo triespecífico ou biespecífico por exemplo,

um anticorpo monovalente-biespecífico ou um anticorpo bivalente-biespecífico. Além disso uma ou mais de uma molécula carreadora do anticorpo multiespecífico ou biespecífico pode ser derivada de um anticorpo que se liga a receptor de transferrina (TfR), ou de um anticorpo que se liga a receptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1R). Uma composição ou uma vacina compreendendo o anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico como descrito acima, em um veículo, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável também é descrito na presente invenção.

[028] Também é fornecido um método de reduzir -sinucleína ativa, ou fibrilas de tau, em um indivíduo em necessidade do mesmo compreendendo administrar uma quantidade da composição, ou vacina como descrito acima ao indivíduo. A composição ou a vacina pode ser administrada ao indivíduo por via oral, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea. Se desejado, antes da etapa de administração, um nível de -sinucleína ativa, ou fibrilas de tau, no indivíduo pode ser determinado, e após um período de tempo seguindo a etapa de administração, um ou mais de um segundo nível de - sinucleína ativa, ou fibrilas de tau, pode ser determinado.

[029] Um método para determinar a presença de -sinucleína oligomérica ativa em uma amostra também é descrito na presente invenção. O método compreende i) pré-misturar uma porção da amostra com um anticorpo controle que não se liga a monômero de -sinucleína ativa, seguido por adicionar monômero de -sinucleína ativa recombinante para produzir um tratamento controle, ii) pré-misturar uma segunda porção da amostra com o anticorpo monoclonal 2F11 (ATCC nº PTA-124174, recebido em 11 de maio de 2017), seguido por adicionar o monômero de -sinucleína ativa recombinante para produzir um tratamento ativo,

iii) determinar a quantidade de formação de estrutura de folha- tanto no tratamento controle como no tratamento ativo usando um ensaio tioflavina, em que uma diminuição em fluorescência de tioflavina no tratamento ativo, quando comparado com o tratamento controle, é indicativo da presença da -sinucleína oligomérica ativa na amostra.

[030] Um método para determinar a presença de agregação de tau em uma amostra é fornecido. O método compreendendo: i) pré-misturar uma porção da amostra com um anticorpo controle seguido por adicionar monômero de tau para produzir um tratamento controle; ii) pré-misturar uma segunda porção da amostra com o anticorpo monoclonal 2F11 (ATCC nº PTA-124174), seguido por adicionar o monômero de tau para produzir um tratamento ativo, e iii) determinar a quantidade de formação de estrutura de folha- tanto no tratamento controle como no tratamento ativo, em que uma diminuição na quantidade de formação de estrutura de folha- no tratamento ativo, quando comparado com o tratamento controle, é indicativo da presença da agregação de tau na amostra.

[031] Um método alternativo de determinar a presença de -sinucleína oligomérica ativa em uma mostra também é descrito, o método compreendendo expor a amostra ao anticorpo monoclonal 2F11 (ATCC nº PTA-124174, recebido em 11 de maio de 2017) e determinar se o anticorpo monoclonal 2F11 se liga a proteína na amostra, em que a ligação é indicativa da presença da -sinucleína oligomérica ativa. A amostra pode ser separada usando eletroforese de não desnaturação antes da etapa de exposição, e a proteína separada é sondada usando o anticorpo monoclonal 2F11 através de análise western, em que a ligação de uma ou mais proteína com peso molecular alto é indicativa da presença da -sinucleína oligomérica ativa na amostra. Alternativamente, um dot blot da amostra não desnaturada pode ser sondada usando o anticorpo monoclonal 2F11, e a ligação do anticorpo monoclonal 2F11 à amostra é indicativa da presença da -sinucleína oligomérica ativa.

[032] Um método para determinar a presença de agregação de tau em uma amostra também é descrito. O método compreendendo expor a amostra ao anticorpo monoclonal 2F11 (ATCC nº PTA-124174, recebido em 11 de maio de 2017), e determinar se o anticorpo monoclonal 2F11 se liga à proteína na amostra, em que a ligação é indicativa da presença da agregação de tau. A amostra pode ser separada usando eletroforese de não desnaturação antes da etapa de exposição e a proteína separada é sondada usando o anticorpo monoclonal 2F11 através de análise western, em que a ligação de uma ou mais proteína com peso molecular elevado é indicativa da presença da -sinucleína oligomérica ativa na amostra. Alternativamente, um dot blot da amostra não desnaturada pode ser sondada usando o anticorpo monoclonal 2F11, e ligação do anticorpo monoclonal 2F11 à amostra é indicativa da presença da agregação de tau.

[033] Um método adicional para determinar a presença, concentração ou tanto a presença como a concentração de uma -sinucleína oligomérica ativa em uma amostra é fornecido. O método compreende aplicar uma amostra a uma superfície que foi preparada usando o anticorpo monoclonal 2F11 (ATCC nº PTA- 124174) e determinar uma ocorrência, uma quantidade, ou uma ocorrência e uma quantidade, do agregado de -sinucleína ativa que é ligado ao anticorpo monoclonal, desse modo determinando a presença, concentração, ou tanto a presença como concentração do agregado de -sinucleína ativa na amostra.

[034] Um método para determinar a presença, concentração ou ambas presença e concentração, de uma agregação de tau em uma amostra também é fornecido. O método compreende aplicar uma amostra a uma superfície que foi preparada usando o anticorpo monoclonal 2F11 (ATCC nº PTA-124174) e determinar uma ocorrência, uma quantidade ou uma ocorrência e uma quantidade, da agregação de tau que é ligada ao anticorpo monoclonal, desse modo determinando a presença, concentração, ou tanto a presença como a concentração, da agregação de tau na amostra.

[035] Um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo que foi diagnosticado com uma sinucleinopatia, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica ou doença de Alzheimer familiar, uma taupatia, uma condição patológica caracterizada por emaranhados neurofibrilares, doença de Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente, taupatia glial globular, também é descrito. O método compreende administrar o anticorpo monoclonal 2F11 como definido acima, a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11, ou o anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, ao indivíduo.

[036] Também é revelado um método para tratar uma sinucleinopatia, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica ou doença de Alzheimer familiar, uma taupatia, uma condição patológica caracterizada por emaranhados neurofibrilares, doença de Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente, taupatia glial globular. O método compreende administrar o anticorpo monoclonal 2F11 como definido acima, a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11, ou o anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, ao indivíduo.

[037] Esse sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características da invenção. Breve descrição dos desenhos

[038] Essas e outras características da invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da seguinte descrição na qual referência é feita aos desenhos apensos em que:

[039] A figura 1 mostra um caminho que leva à formação de fibrila amiloide a partir de monômeros de -sinucleína tóxicos “no caminho”. Técnica anterior (Roberts H.L., Brown D.R., 2015, Biomolecules 5:282-305; também disponível em URL: mdpi.comq2218-273X/5/2/282).

[040] A figura 2A mostra resultados de ensaio de tioflavina associados à formação de estrutura de folha-beta de -sinucleína após incubação de vários monômeros inativos, agregados inativos, monômeros ativos agregados ativos, e combinação dos mesmos. Barra esquerda: determinação de fluorescência após tempo de incubação de 1 hora (a 37°C); barra direita: determinação de fluorescência após tempo de incubação de 24 horas (a 37°C, vide Exemplos para detalhes). A figura 2B mostra imagens confocais de células corticais primárias de rato incubadas com agregados inativos (feitos com monômeros de -sinucleína na ausência de endotoxina), ou agregados ativos (feitos na presença de endotoxina). Fluorescência medida usando anticorpo específico fosforilado na serina 129 para a detecção de patologia de Corpo de Lewy. Hoechst: marcação DAPI; pser 129: anticorpo específico fosforilado na serina 129 rotulado com FITC. A figura 2C mostra imagens de microscopia eletrônica de fibrilas de -sinucleína ativas humanas (painel superior) e fibrilas de -sinucleína inativas humanas

(painel inferior). Barra: 100 nm.

[041] A figura 3A mostra uma análise de Western blot de lisado de cérebro de camundongo sondado com clone 2F11. Faixa esquerda: marcador (kDa); clone da faixa direita 2F11. Uma banda com peso molecular alto no lisado de cérebro de camundongo foi identificada usando clone 2F11. A figura 3B mostra uma análise de Western blot de lisado de cérebro de camundongo sondado com clone 4F1. Faixa esquerda; marcador (kD); clone da faixa direita 4F1. Uma banda de baixo peso molecular no lisado de cérebro de camundongo foi identificada usando clone 4F1. A figura 3C mostra um Western blot de lisado de cérebro de camundongo sondado com clone 3F8. Faixa esquerda: (kDa); clone da faixa direita 3F8. Uma banda de baixo peso molecular no lisado de cérebro de camundongo foi identificada usando clone 3F8. A figura 3D mostra uma análise de Western blot de lisado de HeLa ((conhecido por produzir -sinucleína, vide URL: proteinatlas org/ENSG00000145335-SNCA/cell), sondado com clone 2F11. Faixa esquerda: marcador (kDa); clone da direita 2F11. Uma banda de alto peso molecular no lisado de cérebro de camundongo foi identificada usando clone 2F11.

[042] A figura 4 mostra uma marcação de proteína do lisado de cérebro de camundongo usado nas figuras 3A a 3C. Faixa esquerda: marcador (kDa); faixa direita: marcação Ponceau do lisado de cérebro de camundongo.

[043] A figura 5A mostra uma análise de Western blot de lisado de imunoprecipitado de cérebro de camundongo sondado usando clone 2F11. Uma banda oligomérica de -sinucleína de aprox. 60 a 70 kDa é indicada. Faixa esquerda: marcador (kDa); faixa média: vazia; faixa direita: lisado de cérebro de camundongo. A figura 5B mostra uma análise de Western blot do fluxo através do lisado de cérebro de camundongo precipitado imune sondado usando clone 2F11. Uma banda oligomérica de -sinucleína de aprox. 60 a 70 kDa, uma banda trimérica de -sinucleína e uma banda monomérica de -sinucleína são indicadas. Faixa esquerda: marcador (kDa), faixa direita: lisado de cérebro de camundongo.

[044] A figura 6 mostra um alinhamento de sequências de ácido nucleico de -sinucleína de camundongo (sequência superior: 055043; SEQ ID NO: 1) e - sinucleína humana (sequência inferior: P37840; SEQ ID NO: 2).

[045] A figura 7 mostra uma análise de Western blot de amostras desnaturadas obtidas do cérebro humano com doença de Parkinson, cérebro humano e cérebro de camundongo, sondadas usando clone 2F11. Da esquerda para a direita: marcador kDa; cérebro humano com doença de Parkinson; controle humano; cérebro de camundongo. Múltiplas bandas sobre uma faixa de pesos moleculares, incluindo pesos moleculares altos, estão presentes em cérebro humano com e sem doença de Parkinson e amostras de camundongo.

[046] A figura 8A mostra uma análise Western nativa de amostras obtidas do cérebro humano com doença de Parkinson, cérebro humano e cérebro de camundongo, sondados usando clone 2F11. Da esquerda para a direita: marcador: kDa; cérebro humano (controle); cérebro humano com doença de Parkinson; cérebro de camundongo; branco; marcador kDa; cérebro de camundongo (amostra 2); branco; agregado de -sinucleína (ativo); monômero de -sinucleína (ativo). A figura 8B mostra uma análise Western nativa de amostras obtidas a partir do cérebro humano com doença de Parkinson, cérebro humano e cérebro de camundongo, sondados usando clone 4F11. Da esquerda para a direita: marcador kDa; cérebro humano (controle); cérebro humano com doença de Parkinson; cérebro de camundongo; branco; marcador kDa; cérebro de camundongo (amostra 2); branco, agregado de -sinucleína (ativo); monômero de -sinucleína (ativo). Lisado de cérebro de camundongo e cérebro de camundongo 2 foram de fontes diferentes e preparados usando o mesmo método. A figura 8C mostra análise de dot blot de agregados de -sinucleína ativa e inativa (fibrila se ligando a 2F11 (painel esquerdo) e SPC-506 (A11; painel da direita). Blot superior: 2 g de agregado de -sinucleína ativa; blot médio superior: 0,5 g de agregado de -sinucleína ativa; blot médio inferior: 2 g de agregado de -sinucleína inativa; blot inferior: 0,5 g de agregado de - sinucleína inativa. A figura 8D mostra análise de microscopia eletrônica de conjugado de nano-ouro e 2F11 (pontos pretos) se ligando a agregados de - sinucleína ativa. Barra: 100 nm.

[047] A figura 9A mostra um curso de tempo do ensaio de atividade de tioflavina. Amostras (do topo para a parte inferior): monômero ativo de α- sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM); agregado ativo de α-sinucleína (10 nM); monômero ativo de α-sinucleína (100 µM); controle de tioflavina (25 µM). A figura 9B mostra o curso de tempo de ensaio de atividade de tioflavina na presença de anticorpos (2F11; 3F8; 4F1; SMC-104). Os anticorpos foram adicionados à reação quando a reação foi iniciada (tempo zero). Amostras (do topo para a parte inferior): monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM); monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM) + SMC-104; monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM) + 4F1; monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM) + 3F8; monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM) + 2F11; agregado ativo (10 nM); monômero ativo (100 µM); controle de tioflavina (25 µM). A figura 9C mostra o curso de tempo de ensaio de atividade de tioflavina na presença de anticorpos (2F11; 3F8; 4F1; SMC-104). Anticorpos foram pré- incubados com a amostra antes do início da reação. Amostras (do topo para a parte inferior): monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM); monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM) + 3F8; monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM) + SMC-104;

monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM) + 4F1; agregado ativo (10 nM); monômero ativo de α-sinucleína (100 µM) + agregado ativo (10 nM) + 2F11; monômero ativo (100 µM); controle de tioflavina (25 µM). A figura 9D mostra imagens confocais de células de cérebro primárias de ratos Sprague-Dawley. Painel esquerdo superior: controle, sondado usando DAPI e anticorpo alfa-sinucleína pSer129 (somente núcleos corados com DAPI são identificados); painel superior direito: adição de fibrilas de -sinucleína ativa e sondadas com DAPI e anticorpo alfa-sinucleína pSer129 (mostra marcação com pSer129 e DAPI indicando ligação ao anticorpo -sinucleína, indicativo de patologia de -sinucleína); painel inferior: adição de fibrilas de -sinucleína ativa + 2F11 e sondadas com DAPI e anticorpo alfa-sinucleína pSer129 (mostra marcação com DAPI com níveis de fundo de marcação com pSer129). Ampliação de 20x; barra: 250 m. A figura 9E mostra morte celular de células SHSY-5Y humanas na presença de oligômeros de -sinucleína ativa, oligômeros de - sinucleína inativa, monômeros de -sinucleína ativa na presença e ausência do anticorpo 2F11. Morte celular (%): número de células mortas/total de núcleos normais x 100.

[048] A figura 10 mostra ligação de vários anticorpos com peptídeos de sobreposição de -sinucleína. Peptídeos: 1-30 aa (SEQ ID NO: 3); 21-50 aa (SEQ ID NO: 4); 41-70 aa (SEQ ID NO: 5); 61-90 aa (SEQ ID NO: 6); 81-100 aa (SEQ ID NO: 7); 101-130 aa (SEQ ID NO: 8); 121-140 (SEQ ID NO: 9). Ligação determinada usando ELISA, dot blot (DB), e/ou análise Western blot (WB).

[049] A figura 11A mostra a sequência de ácido nucleico de consenso (SEQ ID NO: 10) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) da região variável (cadeia pesada – isotipo IgG1) para 2F11. A figura 11B mostra a sequência de ácido nucleico de consenso (SEQ ID NO: 12) e a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 13) da região variável de cadeia leve (Kappa) para 2F11. Regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são sublinhadas; a sequência líder é identificada em itálico.

[050] A figura 12 mostra uma representação esquemática de exemplos de anticorpos multiespecíficos. Nesse exemplo não limitante, anticorpos biespecíficos, compreendendo várias moléculas carreadoras são mostrados juntamente com um esquemático de 2F11 (painel esquerdo). O anticorpo biespecífico compreende um domínio único de receptor de fator de crescimento de insulina 1 (sd-IFG1R-BB, porção inferior da molécula) como uma variante bivalente (painel médio) ou monovalente (painel da direita), fixado de modo covalente a uma molécula de carga compreendendo um Fc de camundongo (porção média da molécula) e um anticorpo -sinucleína (porção superior da molécula).

[051] A figura 13 mostra um curso de tempo do ensaio de atividade de tioflavina com tau. Anticorpos foram pré-incubados com fibrila de tau e monômero de tau foi adicionado para iniciar o iniciado. Fluorescência foi determinada após 1, 24 ou 48 horas de incubação. As amostras (esquerda para a direita): monômero de tau + fibrila de tau + 2F11; monômero de tau + fibrila de tau + SMC-104; monômero de tau + fibrila de tau; monômero de tau; e fibrila de tau. Descrição Detalhada

[052] A seguinte descrição é uma modalidade preferida.

[053] Como usado na presente invenção, os termos “compreendendo”, “tendo”, “incluindo” e “contendo” e variações gramaticais dos mesmos, são inclusivos ou abertos e não excluem elementos não citados adicionais e/ou etapas de método. O termo “consistindo essencialmente em” quando usado aqui com relação a um uso ou método, indica que elementos adicionais e/ou etapas de método podem estar presentes, porém que essas adições não afetam materialmente o modo no qual o método citado ou uso funciona. O termo “consistindo em” quando usado na presente invenção com relação a um uso ou método exclui a presença de elementos e/ou etapas de método adicionais. Um uso ou método descrito na presente invenção como compreendendo certos elementos e/ou etapas também pode, em certas modalidades, consistir essencialmente nesses elementos e/ou etapas, e em outras modalidades consistir naqueles elementos e/ou etapas, quer ou não essas modalidades sejam especificamente mencionadas. Além disso, o uso do singular inclui o plural e “ou” significa “e/ou” a menos que de outro modo mencionado. O termo “pluralidade” como usado na presente invenção significa mais de um, por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, e similares. A menos que de outro modo definido na presente invenção, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica. Como usado na presente invenção, o termo “aproximadamente” se refere a aproximadamente +/- 10% de variação de um valor dado. Deve ser entendido que tal variação é sempre incluída em qualquer valor dado fornecido aqui, sendo especificamente mencionado ou não. O uso da palavra “um” ou “uma” quando usado na presente invenção em combinação com o termo “compreendendo” pode significar “um”, porém também é compatível com o significado de “um ou mais”, “pelo menos um” e “um ou mais de um”.

[054] Como usado na presente invenção, um “nível de proteína” ou “nível de proteína ativa” se refere a uma quantidade, ou uma quantidade relativa da proteína em uma amostra, uma amostra obtida de um indivíduo ou em um indivíduo. O nível de proteína pode ser comparado com um nível de proteína controle ou referência para determinar um status da amostra. O nível de proteína de um indivíduo pode estar em quantidade absoluta por exemplo,

nanograma/mL ou micrograma/mL, ou pode ser expresso como uma quantidade relativa, por exemplo, uma intensidade relativa de um sinal quando comparado com um nível controle; uma percentagem ou aumento de “vezes” ou “alteração de vezes” em comparação com um nível de proteína controle.

[055] Em um modo similar, um “nível de expressão” de um transcrito em um indivíduo se refere a uma quantidade de transcrito em amostra biológica não diagnosticada de um indivíduo. O nível de expressão pode ser comparado com um nível de expressão de referência para determinar um status da amostra. O nível de expressão de um indivíduo pode estar em quantidade absoluta (por exemplo, nanograma/mL ou micrograma/mL) ou uma quantidade relativa (por exemplo, intensidade relativa de sinais, uma porcentagem de aumento de “vezes” ou “alteração de vezes”).

[056] Como mostrado na figura 1, -sinucleína pode assumir um caminho complexo através de um número desconhecido de intermediários e/ou populações de intermediários a partir de uma proteína solúvel monomérica sem atividade semelhante a príon a um agregado insolúvel com atividade semelhante a príon (vide, por exemplo, a figura 1; Técnica anterior; Roberts H.L., Brown D.R., 2015, Biomolecules 5:282-305, que é incorporado aqui por referência). O agregado insolúvel com atividade semelhante a príon é capaz de recrutar - sinucleína solúvel e semear o processo de agregação de -sinucleína.

[057] Os exemplos de uma doença ou condição patológica associada à formação de fibrila de -sinucleína, ou sinucleinopatias, incluem, porém não são limitadas a, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, tal como doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica, e casos familiares com doença de Alzheimer. Exemplos de uma doença ou condição patológica associada à formação de fibrilas de tau ou taupatias, incluem, porém não são limitadas a, uma condição patológica caracterizada por emaranhados neurofibrilares, doença de Alzheimer, demência frontotemporal, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, doença de Parkinson, doença de Pick, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente e taupatia glial globular.

[058] Uma “espécie de monômero de -sinucleína” ou uma “espécie de monômero de -sinucleína” inclui o grupo de um monômero de -sinucleína (que também pode ser denominado um monômero de -sinucleína não ativa ou inativa) e um monômero de -sinucleína ativa (pode ser também denominado um monômero de -sinucleína tóxica).

[059] Uma “espécie de oligômero de -sinucleína” ou uma “espécie de oligômero de -sinucleína” inclui um oligômero de -sinucleína não ativa (também denominado oligômero “fora do caminho”), um oligômero de - sinucleína ativa, ou oligômero de -sinucleína toxica (também denominado oligômero de -sinucleína “no caminho”).

[060] Um “monômero de -sinucleína não ativa” ou “um monômero de - sinucleína inativa” se refere a monômero não tóxico de -sinucleína. Uma mistura de monômeros de -sinucleína não se combinam para formar um oligômero de -sinucleína ativa. Entretanto, uma mistura de monômero de - sinucleína (inativa) e monômero de -sinucleína ativa pode combinar para formar um oligômero de -sinucleína ativa.

[061] Uma “espécie de -sinucleína ativo” se refere a um ou mais de um monômero de -sinucleína ativa, um monômero de -sinucleína tóxica, um agregado de -sinucleína ativa, um agregado de -sinucleína tóxica, um oligômero de -sinucleína ativa, um oligômero de -sinucleína tóxica, um oligômero no caminho, uma estrutura de folha- compreendendo -sinucleína,

uma fibrila de -sinucleína.

[062] Como usado na presente invenção, um “monômero de -sinucleína ativa” ou um “monômero de -sinucleína tóxica” se refere a uma espécie de um monômero de -sinucleína que, quando combinado com outros monômeros de -sinucleína ativa, ou agregados de -sinucleína ativa, resulta na formação de um oligômero de -sinucleína tóxica ou ativa, a formação de uma estrutura de folha- compreendendo -sinucleína, um agregado de -sinucleína ativa ou tóxica, ou uma fibrila de -sinucleína. Um monômero de -sinucleína ativa é capaz de combinar com outros oligômeros de -sinucleína ativa, agregados de -sinucleína ativa ou uma combinação dos mesmos, e prosseguir ao longo do caminho de formação de fibrila amiloide.

[063] Como usado na presente invenção, uma “-sinucleína oligomérica ativa”, um “oligômero de -sinucleína tóxica” ou um “oligômero de -sinucleína no caminho” se refere a população de monômeros de -sinucleína que têm a capacidade de recrutar um monômero de -sinucleína ativa ou um agregado ativo para produzir oligômeros protofibrilares, que podem alongar e produzir fibrilas de -sinucleína (fibrilas amiloides, vide a figura 1).

[064] Um “agregado ativo” ou um agregado de -sinucleína ativa” pode ser usado de modo intercambiável com “fibrilas pré-formadas” (PFFs). PFFs ou agregados ativos se referem a uma coleção de oligômeros de -sinucleína ativa, pré-fibrilas compreendendo dois ou mais oligômeros de -sinucleína ativa, fibrilas compreendendo dois ou mais oligômeros de -sinucleína ativa ou uma combinação dos mesmos. PFFs, ou agregados ativos, podem ser usados para semear uma reação (vide, por exemplo, as figuras 2B, 9B a 9D). Agregados de - sinucleína ativa têm mais teor de folha- e menos -hélice do que “agregados inativos” (vide a tabela 1; exemplo 2).

[065] Um “agregado inativo” é usado para se referir a uma coleção de oligômeros de -sinucleína inativa, pré-fibrilas compreendendo oligômeros de -sinucleína inativa, fibrilas compreendendo oligômeros de -sinucleína inativa, ou uma combinação dos mesmos. Agregados inativos não formam folhas- (vide a figura 2), e não semeiam uma reação (vide, por exemplo, a figura 2B, 9B a 9D).

[066] A percentagem de identificação de aminoácidos (ou percentagem de similaridade) entre a -sinucleína de camundongo e de humano é 95% (vide a figura 6).

[067] Os termos “percentagem de similaridade”, “sequência de similaridade”, “percentagem de identidade” ou “sequência de identidade”, ao se referir a uma sequência específica, são usados, por exemplo, como exposto no programa de software GCG da Universidade de Wisconsin, ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 suplemento). Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser realizado, usando por exemplo, o algoritmo de Smith & Waterman, (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), pelo algoritmo de alinhamento de Needleman & Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48:443), pela busca por método de similaridade de Pearson & Lipman, (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), por implementações computadorizadas desses algoritmos (por exemplo: GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.).

[068] Um exemplo de um algoritmo adequado para determinar percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., (1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402) e Altschul et al., (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são usados, com os parâmetros descritos na presente invenção, para determinar identidade de sequência para os ácidos nucleicos e proteínas da invenção. Por exemplo, o programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) pode usar como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambos as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP pode usar como padrão um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10 e a matriz de classificação BLOSUM62 (vide Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as fitas. O software para executar análises BLAST é disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information (vide URL: ncbi.nlm.nih.gov/).

[069] Um “nível de referência”, um “nível de proteína de referência” ou um “nível de proteína controle” como usados na presente invenção, refere-se a uma quantidade de -sinucleína ou uma faixa de quantidades de proteína de - sinucleína medida em um indivíduo normal ou em uma população de indivíduos sem qualquer indicação de ter um estado de doença ou condição patológica associada à formação de fibrila de -sinucleína em um indivíduo, por exemplo, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, por exemplo, porém não limitada a, doença de Parkinson. Por exemplo, um nível de referência de uma ou mais de uma espécie(s) ativa(s) de -sinucleína, por exemplo, um monômero de -sinucleína ativa, ou uma -sinucleína oligomérica ativa, pode ser determinado com base no nível ou quantidade de -sinucleína (um monômero de -sinucleína ativa ou uma -sinucleína oligomérica ativa) identificada em amostras obtidas de um ou mais de um indivíduo normal. Um nível de referência pode ser uma quantidade absoluta (por exemplo, nanograma/mL ou micrograma/mL) ou uma quantidade relativa (por exemplo, intensidade relativa de sinais; uma percentagem de aumento de “vezes” ou

“alteração de vezes” quando comparado com um nível controle ou quantidade).

[070] Como usado na presente invenção, um “nível de limiar”, “quantidade limiar” ou “nível de expressão limiar” se refere a uma quantidade ou um nível de -sinucleína em uma amostra biológica que está entre aproximadamente uma alteração de 1,5 vez e aproximadamente uma alteração de 20 vezes, ou qualquer quantidade entre as mesmas, em relação a uma quantidade de referência ou nível de uma ou mais de uma espécie de -sinucleína ativa, um monômero de -sinucleína ativa ou uma -sinucleína oligomérica ativa, por exemplo, quando comparado com o nível ou quantidade de -sinucleína identificada em uma amostra controle ou um indivíduo controle. Um nível limiar de -sinucleína pode ser indicativo de um estado de doença que é associado à formação de fibrila de -sinucleína, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, por exemplo, porém não limitado a, doença de Parkinson.

[071] Como usado na presente invenção, um “nível de linha base” se refere a uma quantidade ou um nível de -sinucleína em uma primeira amostra biológica obtida de um indivíduo que é determinada antes de qualquer tratamento ou durante qualquer tratamento e é usada como comparação com um segundo nível de expressão de -sinucleína que é avaliado a partir de uma segunda amostra biológica que é obtida do indivíduo em um tempo após a primeira amostra biológica ser obtida. Esse nível de linha de base pode ser usado, por exemplo, em monitorar o progresso de um estado de doença ou condição patológica associada à formação de fibrila de -sinucleína em um indivíduo, por exemplo, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, por exemplo, porém não limitado a, doença de Parkinson, monitorar um regime de tratamento ou modalidade de tratamento em um indivíduo tendo um estado de doença ou condição patológica associada à formação de fibrila de - sinucleína, determinar se um regime de tratamento ou modalidade de tratamento deve ser considerado em um indivíduo, determinar se um regime de tratamento ou modalidade de tratamento deve ser descontinuado em um indivíduo, ou determinar se um regime de tratamento ou modalidade de tratamento deve ser modificado em um indivíduo.

[072] Como usado na presente invenção, “indivíduo normal” se refere a um indivíduo que foi testado em relação à formação de fibrila de -sinucleína usando uma combinação de um ou mais métodos de diagnóstico como descrito aqui (incluindo, ensaio de tioflavina, análise Western, ELISA, ou análise de dot blot) e determinado não ter nenhum monômero de -sinucleína ativa ou - sinucleína oligomérica ativa.

[073] Os termos “terapia” e “tratamento”, como usados de modo intercambiável na presente invenção, referem-se a uma intervenção executada com a intenção de melhorar o estado de um receptor. A melhora pode ser subjetiva ou objetiva e está relacionada à melhora dos sintomas associados a, evitar o desenvolvimento de ou alterar a patologia de uma doença, distúrbio ou condição patológica sendo tratada. Desse modo, os termos terapia e tratamento são usados no sentido mais amplo, e incluem a prevenção (profilaxia), moderação, redução e cura de uma doença, distúrbio ou condição patológica em vários estágios. Prevenção de deterioração do estado de um receptor também é abrangida pelo termo. Aqueles em necessidade de terapia/tratamento incluem aqueles já tendo a doença, distúrbio ou condição bem como aqueles propensos a, ou em risco de desenvolver a doença, distúrbio ou condição e aqueles nos quais a doença, distúrbio ou condição patológica deve ser evitada. No contexto da presente invenção, a doença, distúrbio ou condição patológica é associada a: formação de fibrila de -sinucleína, ou sinucleinopatias, incluindo, porém não limitada(s) a, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, como doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica e casos familiares com doença de Alzheimer, formação de fibrila de tau (agregação), ou taupatias, incluindo, porém não limitado(s) a, uma condição patológica caracterizada por emaranhados neurofibrilares, doença de Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente e taupatia glial globular, ou uma combinação das mesmas.

[074] O termo “indivíduo” ou “paciente”, como usado na presente invenção, refere-se a um mamífero, por exemplo, o indivíduo pode ser um ser humano. Alternativamente, o indivíduo pode ser um primata não humano, um animal doméstico ou um animal agrícola.

[075] O termo “quantidade eficaz” como usado na presente invenção se refere a uma quantidade de um composto que produz um efeito desejado. Por exemplo, uma população de células, ou um extrato de células, pode ser colocada em contato com uma quantidade eficaz de um composto para estudar seu efeito in vitro ou produzir um efeito terapêutico desejado ex vivo ou in vitro. Uma quantidade eficaz de um composto pode ser usada para produzir um efeito terapêutico em um indivíduo, como evitar ou tratar uma condição alvo, aliviar sintomas associados à condição ou produzir um efeito fisiológico desejado. Em tal caso, a quantidade eficaz de um composto é uma “quantidade terapeuticamente eficaz”, “concentração terapeuticamente eficaz” ou “dose terapeuticamente eficaz”. A quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade da composição que fornecerá os resultados mais eficazes em termos de eficácia de tratamento em um dado indivíduo. Essa quantidade variará dependendo de uma variedade de fatores, incluindo, porém não limitado às características do composto (incluindo atividade, farmacocinética, farmacodinâmica, e biodisponibilidade), a condição fisiológica do indivíduo (incluindo idade, sexo, tipo e estágio da doença, condição física geral, capacidade de resposta a uma dada dosagem, e tipo de medicação) ou células, a natureza do veículo ou veículos farmaceuticamente aceitáveis na formulação e a via de administração. Exemplos não limitadores de veículos adequados incluem um tampão, um agente de estabilização, um sal, um antioxidante, um agente de complexação, um crioprotetor, um lioprotetor, um agente de suspensão, um agente emulsionante, um agente antimicrobiano, um conservante, um agente quelante, um agente de ligação, um tensoativo, um agente umectante, um veículo não aquoso como um óleo ou um polímero para liberação controlada. Vide, por exemplo, Berge et al. 1977 (J. Pharm. Sci. 66:1- 19). Além disso, uma quantidade eficaz ou terapeuticamente eficaz pode variar dependendo de se o composto é administrado individualmente ou em combinação com outro composto, droga, terapia ou outro método terapêutico ou modalidade. Uma pessoa versada na técnica clínica e farmacológica será capaz de determinar uma quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz através de experimentação de rotina, a saber, pelo monitoramento da resposta de uma célula ou indivíduo à administração de um composto e ajustar a dosagem de acordo. Para orientação adicional, vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Edição, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2005, que é pelo presente incorporado por referência como se totalmente exposto na presente invenção.

[076] Uma “amostra biológica” ou “amostra” se refere a qualquer material, fluido biológico, tecido ou célula obtida ou de outro modo derivada de um indivíduo incluindo, porém não limitado a, sangue (incluindo sangue integral,

leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, plasma e soro), fluido cerebrospinal, um extrato de tecido e um extrato celular. Isso também inclui frações experimentalmente separadas de todo o anterior. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser facionada em soro ou em frações contendo tipos específicos de células de sangue, como hemácias ou glóbulos brancos (leucócitos). Se desejado, uma amostra pode ser uma combinação de amostras a partir de um indivíduo, como uma combinação de um tecido e amostra de fluido. Uma amostra biológica pode incluir também materiais contendo material sólido homogeneizado, como de uma amostra de tecido, ou uma biopsia de tecido; ou materiais derivados de uma cultura de tecido ou uma cultura de célula. Tecido pode ser tecido normal ou tecido doente.

[077] Monômeros e agregados de -sinucleína inativa e ativa foram avaliados para determinar se os monômeros solúveis e agregados insolúveis estavam ativos (semelhantes a príon) e capazes de semear, ou ser semeados, pelo processo de agregação de -sinucleína (como determinado por formação de estrutura de folha-). Como mostrado na figura 2 (Exemplo 2): a. monômeros de -sinucleína inativa, agregados inativos, ou monômeros de -sinucleína inativa combinados com agregados de -sinucleína ativa não foram capazes de semear o processo de agregação e nenhuma formação de estrutura de folha- foi observada; b. monômeros ativos, ou monômeros ativos combinados com agregados inativos foram capazes de se auto semear, e monômeros ativos e agregados ativos (ou fibrilas pré-formadas; PFFs) foram capazes de semear a reação de agregação semelhante a príon e um aumento na formação de estrutura de folha- foi observada.

[078] Anticorpos monoclonais de camundongo foram preparados contra os agregados de -sinucleína ativa e monômeros de -sinucleína ativa. Hibridomas secretando anticorpos na forma ativa do monômero de -sinucleína, porém não a versão inativa, foram selecionadas. Usando análise de Western blot, observou- se que um anticorpo, 2F11 (ATCC nº PTA-124174, recebido em 11 de maio de 2017) identifica um agregado de α-sinucleína com alto peso molecular em lisado de cérebro de camundongo e lisado de HeLa (>150kDa; vide as figuras 3A e 3D), enquanto outros anticorpos monoclonais de α-sinucleína (também selecionados por ligar a forma ativa de monômero de α-sinucleína), somente identificaram uma banda de 15kDa (4F1, Figura 3B; 3F8, Figura 3 C).

[079] O aminoácido e sequências de aminoácidos das cadeias pesada (SEQ ID NOs:10 e 11) e leve (SEQ ID NOs:12 e 13) de 2F11 são fornecidas nas figuras 11A e 11B. O anticorpo monoclonal 2F11 compreende as seguintes sequências de aminoácido que definem as regiões determinantes de complementaridade (CDRs): Cadeia pesada DYYMF (SEQ ID NO: 14); WNDPENGDTEYAPKFQG (SEQ ID NO: 15); NAWDGNYV (SEQ ID NO: 16); Cadeia leve: TASSSVSSSYLH (SEQ ID NO: 17); STSNLAS (SEQ ID NO: 18); HQYHRSPPMYT (SEQ ID NO: 19).

[080] A sequência de ácido nucleico que codifica as CDRs de anticorpo monoclonal 2F11 compreende as seguintes sequências de nucleotídeos: Cadeia pesada: GACTACTATATGTTT (SEQ ID NO: 20)

TGGAATGATCCTGAGAATGGTGATACTGAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGC (SEQ ID NO: 21)

AATGCATGGGATGGTAACTATGTT (SEQ ID NO: 22) Cadeia leve ACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCAC (SEQ ID NO: 23) AGCACATCCAACCTGGCTTCT (SEQ ID NO: 24) CACCAGTATCATCGTTCCCCACCCATGTACACG (SEQ ID NO: 25).

[081] O anticorpo monoclonal 2F11 se liga a oligômeros de -sinucleína porém não a monômeros de -sinucleína (ativa) sob condições de eletroforese de gel nativo a partir de amostras nativas. Lisado de cérebro (obtido do camundongo) foi imunoprecipitado sob condições nativas usando 2F11, e o precipitado e o fluxo através de frações foram analisados usando Western blot de desnaturação. O anticorpo 2F11 se ligou a oligômeros de -sinucleína (correndo a 60-70 kDa após desnaturado) no lisado de cérebro nativo imunoprecipitado, porém não se ligou a monômero de -sinucleína (ativo), demonstrando que nenhuma banda monomérica foi imunoprecipitada por 2F11 a partir da amostra nativa (figura 5A). Entretanto, três frações da fração de fluxo direto foram observadas ligar 2F11 quando essa fração foi separada sob condições de desnaturação: monômero de -sinucleína (ativa) de aprox. 15 kDa, um trímero de -sinucleína putativo de aprox. 40 kDa; e oligômero de - sinucleína 60-70 kDa (figura 5B), demonstrando que sob condições de desnaturação (como usado durante análise de Western blot) 2F11 é capaz de se ligar tanto a oligômeros estabilizados como a -sinucleína monomérica. Uma vez que 2F11 se liga seletivamente a agregados de tau (vide a figura 13), essa abordagem pode ser também usada para determinar a presença de agregados de tau.

[082] Observou-se que o anticorpo monoclonal de camundongo 2F11 se liga a -sinucleína humana em lisados do cérebro humano, lisados de cérebro humano a partir de um paciente com Parkinson e lisado de um cérebro de camundongo, usando análise de Western blot em condições de desnaturação (figura 7) ou nativas (figuras 8A e 8B). Por exemplo, 2F11 se ligou a oligômeros de -sinucleína humanos e de camundongo de alto peso molecular e médio sob condições de desnaturação (figura 7). Em condições nativas, não redutoras (figura 8A), 2F11 se ligou a oligômeros de -sinucleína com alto peso molecular a partir de lisados de cérebro humano, lisado de cérebro com Parkinson, e lisado de cérebro de camundongo, de aprox. 60 kDa a aproximadamente 250 kDa. Portanto, 2F11 identifica oligômeros de -sinucleína ou agregados em condições nativas.

[083] Também se observou que o anticorpo de 4F1 se liga a oligômeros com peso molecular mais alto em condições nativas (figura 8B). Entretanto, 4F1 não reconheceu agregados ou monômeros de -sinucleína patogênicos purificados (ativos).

[084] Portanto, em um sistema nativo 2F11 identifica -sinucleína tanto humana como de camundongo, porém o anticorpo 2F11 não se liga a monômero de -sinucleína (ativa). Sem desejar ser limitado por teoria, esses resultados indicam que 2F11 se liga a agregados de -sinucleína permitindo que a mesma se ligue a espécies patogênicas de oligômeros de -sinucleína, ou um oligômero diretamente envolvido no caminho para criar a patologia de Corpo de Lewy.

[085] Uma vez que 2F11 foi capaz de se ligar a -sinucleína tanto humana como de camundongo, e uma vez que a percentagem de identificação de aminoácidos (ou percentagem de similaridade) entre -sinucleína de camundongo e humano é 95% (figura 6), 2F11 é capaz de identificar -sinucleína tendo aproximadamente 95 a aproximadamente 100%, ou qualquer quantidade entre as mesmas, similaridade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Por exemplo, 2F11 pode identificar -sinucleína tendo 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%, ou qualquer quantidade entre as mesmas, similaridade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, como determinado sob condições nativas ou desnaturadas como descrito na presente invenção.

[086] Também observou-se que o anticorpo monoclonal 2F11 bloqueia a formação de estrutura de folha- in vitro. O progresso da reação de -sinucleína pode ser determinado como mostrado na figura 9A. Nesse ensaio, na presença de um agregado de -sinucleína ativa, um monômero de -sinucleína ativa é “semeada”, e alterações de uma estrutura alfa-helicoidal para folha-beta ao longo do tempo (isto é, um aumento em fluorescência de tioflavina é observado; (linha superior). Agregados de -sinucleína ativa resultaram em um leve aumento em formação de estrutura de folha- (segunda a partir da linha superior) porém esse aumento é menor que aquele da mistura de um agregado de -sinucleína ativa combinada com um monômero de -sinucleína ativa (linha superior). Monômeros de -sinucleína ativa podem se auto semear lentamente ao longo do tempo (terceira linha a partir do topo).

[087] O progresso da reação de -sinucleína foi observado como sendo interrompido na presença de anticorpo monoclonal 2F11, tanto quando 2F11 foi adicionado no início de reação (figura 9B), ou quando 2F11 foi pré-incubado com as várias espécies de -sinucleína antes do início de reação (figura 9C). Anticorpos monoclonais 4F1 ou 3F8 não inibiram o progresso da reação de - sinucleína até o mesmo ponto quando comparado com o efeito de 2F11. Além disso, um anticorpo controle SMC-104 (monoclonal de camundongo contra hsp70) teve pouco a nenhum efeito sobre a reação de -sinucleína.

[088] Esses resultados mostram claramente que o anticorpo 2F11 se liga a um componente ou estrutura que é necessária para a agregação de -sinucleína e reação de fibrilização prosseguir para formar a estrutura de folha-. O anticorpo 2F11 portanto, mostra um efeito de neutralização sobre essa reação.

[089] Esses resultados sugerem que a ligação de 2F11 à forma virulenta de -sinucleína oligomérica a partir de amostras naturais pode ser usada para determinar a quantidade de oligômero de -sinucleína virulenta no lisado de cérebro humano originado de um cérebro com doença de Parkinson versus um cérebro sem doença de Parkinson, e identificar se quantidades mais altas de oligômero de -sinucleína virulenta em lisado de cérebro humano originam de um cérebro com doença de Parkinson.

[090] Portanto, um método é fornecido para determinar a presença de - sinucleína oligomérica ativa em uma amostra. O método compreendendo: i) pré-misturar uma porção da amostra com um anticorpo controle, seguido por adicionar o monômero de -sinucleína ativa recombinante para produzir um tratamento controle, ii) pré-misturar uma segunda porção da amostra com o anticorpo monoclonal 2F11, seguido por adicionar o monômero de -sinucleína ativa recombinante para produzir um tratamento ativo e iii) determinar a quantidade de formação de estrutura de folha- tanto no tratamento controle como no tratamento ativo, em que uma diminuição na quantidade de formação de estrutura de folha- no tratamento ativo, quando comparado com o tratamento controle, é indicativo da presença da -sinucleína oligomérica ativa na amostra.

[091] Além disso, os oligômeros de -sinucleína isolados de amostras humanas naturais que podem transmitir a doença de Corpo de Lewy (DLB) podem ser usados para semear monômeros de -sinucleína ativa e a cinética de curso de tempo de formação de estrutura de folha- monitorada usando o ensaio de ioflavina (usando o método descrito no exemplo 5). Esse ensaio pode ser usado para determinar a quantidade de oligômero de -sinucleína virulenta em uma amostra, por exemplo, fluido cerebrospinal (CSF), sangue, lisado de cérebro humano, ou outra amostra que pode conter oligômero de -sinucleína. Esse ensaio pode ser usado com amostras obtidas de um cérebro com suspeita de doença de Parkinson (amostra de teste) e os resultados comparados com os resultados obtidos de uma amostra obtida a partir de um cérebro sem doença de Parkinson (amostra controle), onde um aumento na quantidade de oligômero de -sinucleína virulenta na amostra de lisado de cérebro humano, quando comparado com a amostra controle, é indicativo de doença de Parkinson na amostra de teste.

[092] Devido à interação conhecida entre tau e -sinucleína (Li, X., et al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304), o efeito do anticorpo monoclonal 2F11 sobre a formação de estrutura de folha- induzida por tau foi também examinado usando o ensaio de tioflavina. Como mostrado na figura 13, observou-se que 2F11 bloqueia fibrila de tau, formação de estrutura de folha- in vitro. Um sinal de fluorescência de fundo foi observado quando fibrila de tau isolada, ou monômero de tau isolado foram avaliados. Entretanto, uma mistura de monômero de Tau e fibrilas Tau resulta na produção de um sinal de fluorescência forte indicando formação de estrutura de folha-B ao longo do tempo. O progresso da reação de tau foi observado como sendo interrompido na presença de anticorpo monoclonal 2F11 quando 2F11 foi pré-incubado com a fibrila de tau antes do início da reação. O anticorpo monoclonal SMC-104 (monoclonal de camundongo para hsp70) teve pouco a nenhum efeito sobre a reação de tau. Quantidades mais altas do anticorpo 2F11 foram necessárias para bloquear fibrila Tau, formação de estrutura de folha- in vitro quando comparado com a quantidade adicionada para bloquear formação de estrutura de folha- de -sinucleína in vitro.

[093] Portanto, um método é fornecido para determinar a presença de agregação de tau em uma amostra. O método compreendendo:

i) pré-misturar uma porção da amostra com um anticorpo controle, seguido por adicionar monômero de tau para produzir um tratamento controle, ii) pré-misturar uma segunda porção da amostra com o anticorpo monoclonal 2F11, seguido por adicionar o monômero de tau para produzir um tratamento ativo, e iii) determinar a quantidade de formação de estrutura de folha- tanto no tratamento controle como tratamento ativo, em que uma diminuição na quantidade de formação de estrutura de folha- no tratamento ativo, quando comparado com o tratamento controle, é indicativo da presença da agregação de tau na amostra.

[094] Esses resultados mostram claramente que o anticorpo 2F11 liga um componente ou estrutura que é necessária para a agregação de -sinucleína e reação de fibrilização e a reação de tau prosseguir para formar a estrutura de folha-. O anticorpo 2F11 mostra, portanto, um efeito de neutralização sobre essa reação.

[095] Esses resultados sugerem que a ligação de 2F11 à forma virulenta de -sinucleína oligomérica a partir de amostras naturais pode ser usada para determinar a quantidade de oligômero de -sinucleína virulenta em lisado de cérebro humano originado de um cérebro com doença de Parkinson versus um cérebro sem doença de Parkinson, e identificar se quantidades mais altas de oligômero de -sinucleína virulenta em lisado de cérebro humano origina de um cérebro de doença de Parkinson.

[096] Esses resultados também sugerem que a ligação de 2F11 à forma fibrila de tau a partir de amostras podem ser usados para determinar a presença ou ausência, ou a quantidade, de agregado de tau em lisado de cérebro humano originado de um cérebro doente, por exemplo, doença de Alzheimer, versus um cérebro não doente, e identificar se quantidades mais altas de agregado de tau em lisado de cérebro humano estão presentes no tecido de cérebro doente.

[097] Ligação de epítopo de 2F11 foi caracterizada para uma série de peptídeos de -sinucleína de sobreposição cada com aprox. 30 aminoácidos em comprimento. O clone de 2F11 apresentou um padrão exclusivo de ligação de epítopo (figura 10), quando comparado com outros anticorpos monoclonais que foram também identificados como ligando a forma ativa de -sinucleína (por exemplo, 4F1, 3F8). Nessa análise, observou-se que 2F11 se liga a dois fragmentos C-terminais de -sinucleína, nas posições 61 a 90 e 101 a 130. Sem desejar ser limitado por teoria, as propriedades de ligação de epítopo de 2F11 permitem que o mesmo se ligue a e neutralize um componente de núcleo da agregação de alfa-sinucleína e reação de fibrilização.

[098] Também se observou que a injeção intraestriada de anticorpo 2F11 reduz a geração de patologia de Corpo de Lewy em células corticais de rato. A administração de fibrilas de -sinucleína em tecido cortical semeou a reação de -sinucleína como determinado usando anticorpo específico de -sinucleína pSer129. O número de sítios de agregado de -sinucleína localizados e o tamanho dos agregados foi reduzido por pré-incubação das fibrilas de - sinucleína com o anticorpo monoclonal 2F11. Seções de tecido cortical obtido de ratos tratados com fibrilas de -sinucleína em PBS revelaram fluorescência localizada indicando ligação do anticorpo de -sinucleína (pSer129) a fibrilas de -sinucleína e formação de agregado de -sinucleína (inclusões ou agregações perinucleares). Nenhuma fluorescência foi observada em ratos tratados com controle (PBS) (indicando nenhuma formação de agregado de -sinucleína). Fluorescência localizada foi também observada em células corticais de rato que foram tratadas com fibrilas de -sinucleína e o anticorpo 3D10, indicando ligação do anticorpo (pSer129) a fibrilas de -sinucleína e formação de agregado de - sinucleína. A quantidade de ligação localizada em células corticais recebendo fibrilas de -sinucleína e o anticorpo 3D10 foi similar àquela observada em fatias de tecido cortical obtido de ratos administrados com fibrila de -sinucleína isolada. Embora fluorescência localizada seja observada em células corticais obtidas de cérebro de rato tratadas com fibrilas de -sinucleína e anticorpo 2F11, tanto o número de sítios de ligação localizada (agregações perinucleares), como o tamanho dos sítios de ligação localizada, foram reduzidos quando comparado com o número e tamanho de sítios de ligação observados em células corticais quando tratadas com fibrila de -sinucleína isolada, ou fibrilas de - sinucleína e o anticorpo 3D10, demonstrando que tratamento de tecido de cérebro com o anticorpo 2F11 reduz a geração de patologia de Corpo de Lewy em células corticais de rato, in vivo. O tratamento usando 2F11 pode, portanto, obstruir ou retardar a formação de inclusões semelhantes a corpo de Lewy. Sem desejar ser limitado por teoria, o aumento da quantidade de 2F11 que é administrado às células corticais pode também obstruir adicionalmente, reduzir e/ou retardar a geração de patologia de Corpo de Lewy em células corticais de rato, in vivo.

[099] O anticorpo monoclonal pode ser usado para imunizar um indivíduo e reduzir ou inibir a reação de oligomerização de -sinucleína in vivo. Por exemplo, camundongos transgênicos (tg) -sin (modelo PD, Masliah et al., 2011) e camundongos não tg podem ser imunizados usando 2F11, e a resposta comportamental (recuperação da memória) tanto de camundongos transgênicos -sin (tg) como camundongos não tg é avaliada ao longo do tempo. Camundongos tg imunizados com 2F11 podem ter melhor recuperação de memória e podem ser capazes de completar suas tarefas em modo similar a camundongos não tg demonstrando, assim, que tratamento de anticorpo 2F11 reverte déficits de aprendizagem.

[0100] Como resultado, a presente invenção considera uma composição,

ou uma vacina, compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11, ou um anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11 (vide abaixo), em um veículo, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Além disso, um método para reduzir -sinucleína ativa, ou agregação de tau, em um indivíduo em necessidade do mesmo também é fornecido. O método compreendendo administrar uma quantidade da composição, ou vacina, ao indivíduo. A composição, ou a vacina, pode ser administrada ao indivíduo por via oral, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.

[0101] Também é revelada uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo descrito na presente invenção, por exemplo, 2F11, ou um anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, e um veículo (descrito abaixo), adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A administração do agente terapêutico, por exemplo, 2F11, ou o anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, pode ser realizada usando os vários mecanismos conhecidos na técnica, incluindo administração simples, ou pode ser administrado por injeção intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou vias orais ou injeção direta. O agente terapêutico pode ser também administrado como parte de uma composição farmacêutica ou preparado contendo veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos agentes terapêuticos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente.

[0102] Também é fornecido um método de induzir uma resposta imune em um indivíduo, que foi diagnosticado com uma sinucleinopatia, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer, doença de Alzheimer esporádica ou doença de Alzheimer familiar, uma taupatia, uma condição patológica caracterizada por emaranhados neurofibrilares, doença de Alzheimer, doença de Pick, Paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente, e taupatia glial globular, compreendendo administrar o anticorpo monoclonal 2F11, um anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, composição farmacêutica compreendendo o 2F11 monoclonal, uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo multiespecífico, triespecífico, ou biespecífico compreendendo 2F11, uma vacina compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11, ou uma vacina compreendendo o anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11 a um indivíduo.

[0103] Também é revelado o uso do anticorpo monoclonal 2F11, um anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, uma composição farmacêutica compreendendo 2F11, ou composição farmacêutica compreendendo um anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, para induzir uma resposta imune em um indivíduo diagnosticado com uma sinucleinopatia, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica, doença de Alzheimer familiar, uma taupatia, uma condição patológica caracterizada por emaranhados neurofibrilares, doença de Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente, e taupatia glial globular.

[0104] Também é revelado um método de tratar uma sinucleinopatia, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica ou doença de Alzheimer familiar, ou uma taupatia, uma condição patológica caracterizada por emaranhados neurofibrilares, doença de Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente e taupatia glial globular. O método compreendendo administrar o anticorpo monoclonal 2F11, um anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11 a um indivíduo. Também é revelado o uso do anticorpo monoclonal 2F11, um anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11, para tratar uma sinucleinopatia, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica ou doença de Alzheimer familiar em um indivíduo.

[0105] Também é revelado o uso do anticorpo monoclonal 2F11, ou um anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11 na fabricação de um medicamento para tratar uma sinucleinopatia, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica ou doença de Alzheimer familiar, ou para tratar uma taupatia, uma condição patológica caracterizada por emaranhados neurofibrilares, doença de

Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente, e taupatia glial globular. Também é revelado o anticorpo monoclonal 2F11, ou o anticorpo multiespecífico, triespecífico ou biespecífico compreendendo 2F11 para uso na fabricação de um medicamento para tratar uma sinucleinopatia, uma condição patológica caracterizada por corpos de Lewy, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica ou doença de Alzheimer familiar, ou para uso na fabricação de um medicamento para tratar uma taupatia, uma condição patológica caracterizada por emaranhados neurofibrilares, doença de Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente e taupatia glial globular.

[0106] O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. O anticorpo pode ser não humano, primatizado, humanizado ou totalmente humano. Métodos para humanizar ou primatizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica, por exemplo, por substituir regiões determinantes de complementaridade de roedor (CDRs) ou outros aminoácidos ou sequências por aqueles de um anticorpo humano (por exemplo, vide, Jones e outros, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994); cada um dos quais é aqui incorporado por referência na íntegra). Como usado na presente invenção, o termo “domínio de ligação ao antígeno” significa qualquer derivado de anticorpo ou fragmento que possua atividade de ligação a antígeno. Em alguns exemplos o domínio de ligação de antígeno compreende domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo (isto é, domínios VL e VH). Exemplos não limitantes de fragmentos de anticorpo e derivados são Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv (isto é, Fv de cadeia única), scFv-Fc, minicorpos, nanocorpos, diacorpos, tri(a)corpos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos triespecíficos, anticorpos biespecíficos e similares. Muitos outros fragmentos de anticorpo e derivados são conhecidos, diversos exemplos não limitantes dos quais são revelados em Deyev e Lebedenko (2008, BioEssays 30:904-918, incorporado por referência na íntegra). Em algumas modalidades dos métodos ou usos, o domínio de ligação de antígeno é um Fab, a Fab’, um F(ab’)2, um scFv, um scFv-Fc, um minicorpo, um nanocorpo, um diacorpo ou um tri(a)corpo.

[0107] Métodos para transportar anticorpos terapêuticos através da barreira hematoencefálica, usando anticorpos multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos ou triespecíficos, compreendendo uma ou mais de uma molécula carreadora, e uma ou mais de uma molécula de carga, através de uma via de transcitose mediada por receptor são conhecidos. Por exemplo, um anticorpo que se liga a receptor de transferrina (TfR) (e variantes do mesmo) pode ser usado como o carreador, e, quando fundido a uma molécula de carga, por exemplo, 2F11, produz um anticorpo biespecífico que é capaz de cruzar a barreira hematoencefálica (vide, por exemplo, Zuchero, Y. J, Y., et al., 2016, Neuron 89:70-82; Bien.Ly, N. et. al. 2014 J. Exp. Med. 211:233-244; US 2018/8002433; CA 3,000,560; que são incorporados aqui por referência). Alternativamente, um anticorpo que se liga a receptor fator de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF1R) pode ser usado como um veículo, e fundido com a molécula de carga 2F11, para produzir um anticorpo biespecífico que cruza a barreira hematoencefálica (vide, por exemplo, WO2015/131256; WO2015/131257; WO2015/131258; que são incorporados na presente invenção por referência). Um exemplo de um anticorpo biespecífico IGF1R bivalente ou monovalente compreendendo 2F11, capaz de transmigrar a barreira hematoencefálica é mostrado na figura 12. Anticorpo absoluto (vide URL: absoluteantibody.com/custom-services/antibody-engineering/) descreve a preparação de anticorpos multiespecíficos.

[0108] Portanto, a presente invenção também fornece um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo triespecífico ou biespecífico, para transmigrar a barreira hematoencefálica, o anticorpo biespecífico compreendendo uma molécula carreadora fixada ao anticorpo monoclonal 2F11. A molécula carreadora, por exemplo, do anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo monovalente-biespecífico ou um anticorpo bivalente-biespecífico. O anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo que se liga a receptor de transferrina (TfR), ou um anticorpo que se liga a receptor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina (IGF1R).

[0109] A presente invenção será adicionalmente ilustrada nos exemplos a seguir. Exemplo 1: Materiais e métodos Geração de imunógeno de -sinucleína

[0110] Monômeros e agregados de -sinucleína inativa humana foram feitos de acordo com Volpicelli-Daley et al., 2014 (que é incorporado na presente invenção por referência) com pequenas alterações. Frações contendo a forma monomérica de α-sinucleína foram agrupadas e submetidas ao procedimento de remoção de endotoxina usando Coluna de rotação para remoção de endotoxina de alta capacidade Pierce (Thermo Scientific, nº 88276) de acordo com o manual fornecido pelo fornecedor. O nível de endotoxina foi medido usando Kit de ensaio de Endotoxina ToxinSensor Chromogenic LAL (GenScript, nº L00350). O nível de endotoxina estava abaixo de 1 EU por g de proteína como determinado pelo ensaio LAL. Monômeros inativos foram usados para fazer os agregados inativos.

[0111] Agregados semeadores de -sinucleína de camundongo ativa (fibrilas pré-formadas-PFFs) e monômeros de -sinucleína ativa foram obtidos do Lee laboratory (Center for Neurodegenerative Disease Research, 3º andar, Maloney Building, 3600 Spruce Street, Filadélfia, PA 19104-4283, EUA). Lisado de cérebro de camundongo foi doado pela University of Victoria (3800 Finnerty Rd, Victoria, BC V8P 5C2, Canadá). Lisado de tecido integral de cérebro humano (5 mg/mL) foi obtido de Novus Biologicals, nº NB820-59177. Lisado de tecido integral de cérebro humano com doença de Parkinson (5 mg/mL) foi obtido de Novus Biologicals, nº NB820-59407. Lisado HeLa foi obtido de Rockland Immunochemicals Inc., nº W09-000-364. Ensaio de tioflavina

[0112] O ensaio de tioflavina foi baseado em Murray et al., 2003 (que é incorporado aqui por referência). Esse ensaio mede o teor de folha- ao longo do tempo. Um aumento em fluorescência é indicativo de um aumento na estrutura de folha- devido a um aumento de fibrilas agregadas durante uma reação semeada.

[0113] Material de tioflavina T (1 mM) foi diluído em PBS a 25 M na concentração final (diluição de 1:40). 95 L da tioflavina T diluída foram adicionados a cada poço de 384 poços, uma amostra (2,5 L) foi adicionada a cada poço, e a solução misturada. Para controles, 2,5 L de PBS isolado foi adicionado à tioflavina T diluída e 2,5 L de -sinucleína monomérica foi adicionada à tioflavina T diluída. As misturas foram incubadas em temperatura ambiente de 2 minutos a 1 hora, e a fluorescência de tioflavina T determinada em cada poço (excitação 450 nm, emissão 500 nm). Alterações no ensaio de tioflavina T descrito acima foram como a seguir: a fluorescência de tioflavina T foi determinada em cada poço (excitação 450 nm, emissão 485 nm) após incubação a 37°C de 1 hora até 88 horas.

[0114] Para estudos de pré-incubação, 30 g de anticorpo foram incubados com 10 nM de agregado de -sinucleína por 1 hora a 4°C com agitação. A mistura foi centrifugada a 10000 rpm por 5 minutos e enxaguada com 1 mL de PBS. Essa etapa foi repetida por 4 vezes adicionais. O sobrenadante foi removido e o agregado de -sinucleína (com anticorpo ligado) foi suspenso novamente em 10 L de PBS.

[0115] Para estudos de incubação em conjunto, 30 g de anticorpo foram adicionados a -sinucleína monomérica e agregados de -sinucleína pouco antes da adição da Tioflavina T. Geração de anticorpo monoclonal de camundongo

[0116] Anticorpos monoclonais de camundongo foram feitos em ImmunoPrecise Antibodies Ltd (IPA) localizada na Rua 4464 Markham nº 3204, Victoria, BC V8Z 7X8, Canadá usando sua tecnologia exclusiva RapidPrime. A RapidPrime incluiu a imunização de 5 camundongos BALB/c fêmeas. Triagem de hibridoma em um antígeno de fibrilas de -sinucleína por ELISA indireto

[0117] Condições de ELISA: Placas de ELISA Corning Costar foram revestidas com agregados de -sinucleína ativa ou monômeros de -sinucleína ativa a 0,1 g/poço em 100 L/poço CCB (pH 9,6) durante a noite a 4°C, bloqueado com pó de leite desnatado a 3% em PBS por 1 hora em temperatura ambiente.

[0118] Anticorpo primário: Hibridoma TC sup puro (gerado em IPA) a 100 L/poço incubado por 1 hora a 37°C com agitação; anticorpo secundário

1:10.000. IgG/IgM anti-camundongo de cabra (H+L)–HRP (Jackson ImmunoResearch, nº 115-035-068) a 100 L/poço em PBS-Tween por 1 hora a 37°C com agitação. Todas as etapas de lavagem foram realizadas por 30 min. com PBS-Tween. Substrato de TMB (BioFxt nº TMBW-1000-01) foi adicionado a 50 L/poço e a reação parada com volume igual HCl 1 M. Tempo de desenvolvimento: 8,5 minutos. A placa foi lida a 450 nm. Condições ELISA de retenção de anticorpo para isotipagem

[0119] Placa ELISA revestida com 1:10.000 IgG/IgM anti-camundongo de cabra (H&L; Jackson ImmunoResearch, nº 115-035-068) em tampão de revestimento de carbonato (pH 9,6) durante a noite a 4°C, sem bloqueio.

[0120] Anticorpo primário: sobrenadante de cultura de tecido de hibridoma (puro; o mesmo anticorpo descrito para ELISA Indireto delineado acima) em placas a 100 L/poço por 1 hora em temp. ambiente com agitação. Anti- camundongo de cabra 1:5000 anticorpo secundário IgGY-HRP (mistura em partes iguais de 5 anticorpos específicos de subisotipo, Jackson ImmunoResearch, nº 115-035-205, 115-035-206, 115-035-207, 115-035-208, 115-035-209) ou anticorpo de cabra 1:10,000 IgMµ-HRP (Thermo Scientific, nº 31440) a 100uL/poço em PBS-Tween por 1 hora em temp. ambiente com agitação. Todas as etapas de lavagem realizadas por 30 min. com PBS-Tween. Substrato de TMB foi adicionado a 50µL/poço e a reação parada com HCl 1 M a volume igual. Tempo de desenvolvimento: 5,5 minutos. A placa foi lida a 450 nm. Teste de hibridomas de anti--sinucleína de camundongo em um monômero ativo de -sinucleína, agregados ativos de -sinucleína (ou fibrilas pré-formadas; PFFs), monômero inativo de -sinucleína, e antígenos de agregado inativo de -sinucleína por ELISA indireto

[0121] Condições de ELISA: Placas de ELISA Corning Costar revestidas com: a) Monômero ativo de -sinucleína a 0,1 g/poço em 100 L/poço CCB

(Tampão de revestimento de carbonato) pH 9,6 durante a noite a 4°C; b) Agregado ativo de -sinucleína (PFFs) a 0,1 g/poço em 100 l/poço CCB (pH 9,6) durante a noite a 4°C; c) Monômero inativo de -sinucleína a 0,1 g/poço em 100 L/poço CCB (pH 9,6) durante a noite a 4°C; ou d) Agregado inativo de -sinucleína a 0,1 g/poço em 100 L/poço CCB (pH 9,6) durante a noite a 4°C; e bloqueado com leite em pó desnatado a 3% em PBS por 1 hora em temperatura ambiente.

[0122] Anticorpo primário: Sobrenadante de cultura de tecido de hibridoma (puro) foram cultivados em meio completo DMEM mais 5% FBS baixo em IgG até extinção (>90% células mortas). Culturas foram colhidas e centrifugadas a 400xg e sobrenadante transferido para novos tubos estéreis. Sobrenadantes de cultura de tecido foram adicionados (100 L/poço) e incubados por 1 hora a 37°C com agitação. Anticorpo secundário 1:10.000 anti- camundongo de cabra IgG/IgM (H+L)-HRP a 100uL/poço em PBS-Tween por 1 hora a 37°C com agitação. Todas as etapas de lavagem realizadas por 30 min. com PBS-Tween. O substrato TMB foi adicionado a 50 L/poço e a reação foi parada com HCl 1 M a volume igual. Tempo de desenvolvimento: 1 minuto. As placas foram lidas a 450 nm. Western blotting

[0123] Géis foram passados sob condições desnaturantes (SDS) e não desnaturantes (nativas) como observado nos exemplos abaixo, antes do blotting e sondagem com vários anticorpos.

[0124] Para as figuras 3A a 3D, anticorpo primário (sobrenadantes com anti--sinucleína como definido na seção anterior) foi usado a uma diluição de 1:2 em solução salina de tris-borato (TBS); temperatura de incubação 4°C, tempo de incubação : 18 horas. Anticorpo secundário era anti-camundongo de cabra: HRP conjugado, diluição: 1:2.000. Tampão de bloqueio (leite desnatado a 5% TBST), temperatura de incubação: temperatura ambiente; tempo de incubação: 1h. Solução de desenvolvimento: substrato de Amersham ECL (GE, nº RPN2232), tempo de desenvolvimento: 6 minutos. Lisados: 20 g de lisado de cérebro de camundongo, ou lisado de HeLa, por faixa. Tampão de amostra LaemmLi 5X foi adicionado à amostra e foi incubado por 10 minutos a 90°C antes de ser carregado sobre o gel Visualizado em Licor C-Digit, ou GE ImageQuant LAS 500.

[0125] Para a figura 7 (e Westerns de peptídeo), anticorpos primários eram sobrenadantes purificados de proteína G anti--sinucleína (GE, nº 29-0485-81); diluído 1:1000 em TBS, temperatura de incubação: temperatura ambiente; tempo de incubação: 1 h. Anticorpo secundário era conjugado HRP:anti- camundongo-cabra, diluição 1:2000. Tampão de bloqueio (leite desnatado 5% TBST), temperatura de incubação: temperatura ambiente; tempo de incubação: 1 h. Solução de desenvolvimento: Substrato quimiluminescente Supersignal West Pico (ThermoFisher Scientific, nº 34080), tempo de desenvolvimento: 6 minutos. Tampão de amostra LaemmLi 5X foi adicionado às amostras e incubado por 10 minutos a 90°C antes de ser carregado sobre o gel. Para amostras nativas, glicerol a 5% foi adicionado antes de ser carregado sobre o gel ao invés de tampão de amostra LaemmLi 5X. Visualizado em GE ImageQuant LAS 500.

[0126] Para análise de dot blot, 5 L (0,1 mg/mL) de cada peptídeo foi adicionado a nitrocelulose (ABM, nº B500) e deixado secar em temperatura ambiente por 15 minutos. Os dot blots foram então tratados como um Western blot padrão (delineado acima com referência à figura 7). Experimentos de células primárias (figuras 2A e 9D)

[0127] Células corticais primárias Sprague-Dawley foram obtidas por dissecação do cérebro de filhotes de rato. Após dissecação, o cérebro foi mecanicamente seccionado com tesouras cirúrgicas e dissociado usando uma solução de tripsina a 0,25%. A tripsinização foi realizada durante 45 minutos e uma suspensão de células foi obtida. A tripsina foi lavada em 2 turnos de centrifugação (20 min. a 750 rpm) e a suspensão de células revestida em uma placa de cultura de células de 60 mm pré-incubado com laminina e cheio de DMEM + 10% FBS + Pen/Strep e foi deixada assentar por 24 horas. No dia seguinte, o sobrenadante do prato de cultura de célula de 60 mm (contendo neurônios) foi recuperado, suspenso novamente no mesmo meio de crescimento (DMEM, 10% FBS, Pen/Strep) e lavado 2 vezes por centrifugação (20 min. a 500 rpm). Neurônios suspensos foram revestidos em lamínulas de 22 x 22 cm (tratados previamente com NaOH e etanol a 95%) pré-incubadas com laminina. Lamínulas foram colocadas em pares em placas de cultura de célula de 60 mm (2 lamínulas por placa) ou individualmente em placas de cultura de célula de 35 mm e esses foram cheios de DMEM + 0,5% FBS + Pen/Strep. Neurônios foram deixados assentar e crescer por 2 dias e então seu condicionamento experimental específico foi iniciado. Após as células estarem prontas, o meio de cultura de células foi substituído com o meio de condicionamento. Com referência à figura 9D o meio de condicionamento era como a seguir: - experimentos controle: DMEM + 0,5% FBS + Pen/Strep + volume equivalente de DPBS sonicado + volume equivalente de DPBS; - adição de -sinucleína ativa somente: DMEM + 0,5% FBS + Pen/Strep + 4 g/mL de fibrilas de -sin ativa sonicadas + quantidade equivalente de BPBS; - neurônios tratados com 2F11: DMEM + 0,5% FBS + Pen/Strep + 4 g/mL de fibrilas de -sin ativa sonicadas + 10 L de anticorpo 2F11 diluído 1:400 em DPBS (quantidade de anticorpo 2F11 igual a 10 g).

[0128] Grupos-controle foram incubados com DPBS, grupos de adição de -sinucleína ativa somente foram incubados com fibrilas de -sinucleína ativa e grupos 2F11 foram incubados em conjunto com fibrilas de -sinucleína ativa e o anticorpo 2F11. 50% do meio foram substituídos por meios frescos (DMEM + 0,5% FBS + Pen/Strep) uma vez por semana.

[0129] Após 14 dias de incubação com meios de condicionamento, as células foram fixadas em PFA a 2% por 40 min., permeabilizadas em 0,05% Triton-X por 10 min. e bloqueadas com PBS-BSA 2% por 24 h. As células foram marcadas durante a noite com o anticorpo primário policlonal de coelho de StressMarq contra α-Syn-pSer129 (SPC-742) a 1:100, e o anticorpo secundário era anti-coelho de cabra Alexa-488 (verde) para α-Syn-pSer129. Incubação foi de 2 h. Todas as amostras foram contra-coradas com DAPI. Síntese de peptídeo para mapeamento de epítopo (figura 10)

[0130] Os seguintes peptídeos (Atlantic Peptides, EUA) foram gerados em um sintetizador Rainin Symphony (números de resíduo à direita), refletindo sequências de sobreposição de -sinucleína humana (Uni Prot P37840) usando química Fmoc e HCTU como ativador. Os N-terminais foram conjugados com um espaçador C-6 (Ahx), que por sua vez foi conjugado com um resíduo de cisteína no N-terminal. Peptídeos foram purificados por HPLC de fase inversa sobre uma coluna C-18. A análise foi realizada usando uma eletro-pulverização para massa e um LC analítico para pureza. O BSA usado foi o produto da Fischers Scientific 77110 e a conjugação usada seguiu o protocolo fornecido com o produto.

[0131] AA 1-30: MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA (SEQ ID NO: 3);

[0132] AA 21-50: KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH (SEQ ID NO: 4);

[0133] AA 41-70: GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV (SEQ ID NO: 5);

[0134] AA 61-90: EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA (SEQ ID NO:

6);

[0135] AA 81-110: TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE (SEQ ID NO: 7);

[0136] AA 101-130: GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE (SEQ ID NO: 8);

[0137] AA 121-140: DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (SEQ ID NO: 9).

[0138] Condições de ELISA para mapeamento de epítopo: Placas ELISA de 98 poços Nunc® MaxiSorp foram revestidas com peptídeo conjugado com BSA a 0,1 g/poço em 100 L/poço CCB (pH 9,6) durante a noite a 4°C. As placas foram então bloqueadas com leite em pó desnatado a 3% em PBS por 3 horas em temperatura ambiente. 100 L/poço anticorpo (1 g/mL) foi adicionado e incubado por 1 hora a 37°C. Anticorpo secundário 1:10.000 anti-camundongo de cabra IgG/IgM (H+L)-HRP a 100 L/poço em PBS-Tween por 1 hora em temperatura ambiente. Todas as etapas de lavagem foram realizadas por 30 min. com PBS-Tween. Substrato TMB foi adicionado a 100 L/poço e a reação foi parada com HCl 1 M a volume igual. Tempo de desenvolvimento: 15 minutos. As placas foram lidas a 450 nm. Imunoprecipitação, e análise de fluxo direto (figuras 5A e 5B)

[0139] 1,2 mg de 2F11 foram acoplados a Sefarose ativado com brometo de cianogênio (Sigma, nº C9142-1G) usando o protocolo do fabricante. 2 mg de lisado de cérebro de camundongo foram incubados com a resina a 4°C por 48 horas com agitação. A coluna foi lavada com PBS e então eluída com 0,1 M glicina, pH 2,7. Microscopia eletrônica (figuras 2C, 8C)

[0140] Uma alíquota de 160 L sonicada de fibrilas de -sin foi suspensa novamente em DMEM + FBS a 10% até um volume final de 1 mL. A ressuspensão foi então separada em 2 tubos de microcentrífuga até um volume final de 0,5 mL da ressuspensão original em cada tubo e centrifugada por 40 minutos a 17.000 rpm. 80% do sobrenadante foram descartados e o volume restante suspenso novamente em um volume final de 0,5 mL de DMEM + FBS a 10% + 2F11 em uma diluição de 1:400 (1,25 g de anticorpo) ou DMEM + FBS a 10% + volume equivalente de DPBS. A incubação com o anticorpo primário (ou apenas DPBS para o controle negativo) foi deixada por 24 h. No dia seguinte, os dois tubos foram centrifugados por 40 minutos a 17.000 rpm, e 80% do sobrenadante foram separados e o resto do volume suspenso novamente em 0,5 mL de DMEM + FBS a 10% e lavado e centrifugado a 17.000 rpm por 40 minutos. 80% do sobrenadante foram separados e o resto do volume foi suspenso novamente em DMEM + FBS a 10% + IgG anti-camundongo de cabra conjugado com partículas de ouro de 18 nm nos dois tubos. A incubação de anticorpo secundário foi de 2 h, então os tubos foram centrifugados por 40 min. a 17.000 rpm. 80% do sobrenadante foram separados e o resto do volume foi suspenso novamente em DMEM + 10% FBS. A ressuspensão foi lavada por centrifugação por 40 min. a

17.000 rpm. Finalmente, 80% do volume foram mantidos de lado e aproximadamente 4 L do resto do volume (aprox. 100 L) foram colocados no topo de uma grade metálica de microscopia eletrônica de transmissão e marcados com acetato de uranila. Exemplo 2: Geração de agregados e monômeros de -sinucleína inativa e ativa

[0141] Agregados e monômeros de -sinucleína inativa e ativa foram obtidos como delineado no Exemplo 1. Para avaliar se os monômeros solúveis e agregados insolúveis eram ativos (semelhantes a príon) e capazes de semear, ou ser semeado pelo processo de agregação de -sinucleína, os dois conjuntos de monômeros e agregados foram testados em combinações usando o ensaio de tioflavina descrito no exemplo 1 e incubado por 1 hora ou 24 horas a 37°C.

Ambos os agregados ativo e inativo, bem como monômeros foram ensaiados. Os controles incluíram tioflavina isolada, PBS isolado e monômeros inativos. Os resultados são fornecidos na figura 2A. Nesse ensaio, a agregação aumentada de -sinucleína resulta em um aumento correspondente em formação de estrutura de folha-. Tioflavina se liga à estrutura de folha-, e nessa configuração tioflavina fluoresce (a 485 nm) quando excitada a 450 nm. A quantidade de fluorescência a 485 nm é dependente da quantidade de ligação de tioflavina, e a quantidade de ligação é correlacionada com a quantidade de formação de estrutura de folha-. Como resultado, um aumento em fluorescência de tioflavina é indicativo de um aumento na formação de estrutura de folha-.

[0142] Após incubar por 1 ou 37 horas, nenhum aumento em fluorescência, indicativa de formação de estrutura de folha-, foi observado com monômeros inativos ou agregados inativos. Entretanto, monômeros ativos foram capazes de se auto-semear e gerar estruturas de folha- durante o período de 24 h. Agregados ativos (PFFs) também resultaram em um aumento em fluorescência após 1 hora e 24 horas, porém esse aumento teve platô na ausência de blocos de construção monoméricos necessários para gerar folhas-.

[0143] A combinação de agregados inativos e monômeros inativos não resultou em aumento de fluorescência, sugerindo que os agregados inativos poderiam não semear os monômeros inativos, e também que auto-semeadura pelos monômeros inativos poderia não ocorrer. A combinação de monômero inativo e agregados ativos (PFFs) produz um nível similar de fluorescência como visto que adicionar PFFs (agregados ativos) isolados uma vez que os monômeros inativos não poderiam funcionar como blocos de construção para gerar estruturas de folhas-. Entretanto, quando monômeros ativos foram combinados com agregados inativos, um aumento grande em fluorescência foi observado durante 24 horas. Isso é compatível com o resultado demonstrando que monômeros ativos poderiam auto-semear. Finalmente, quando tanto monômeros ativos como agregados eram usados juntos, um aumento grande em leitura de fluorescência foi gerado após tanto 1 hora como 24 horas, indicando agregação pelo processo de semeadura por PFFs (agregados ativos) em monômeros ativos. Análise de dicroísmo circular de -sinucleína

[0144] Dicroísmo circular foi feito por Alliance Protein Laboratories, San Diego, USA usando um espectropolarímetro Jasco- J-1500, célula de 0,1 cm para UV distante. A estrutura secundária foi calculada de acordo com: CDNN versão

2.1, Guid223; Bohm, G., Muhr, G., e Jaenicke, R (1992) Quantitative analysis of protein far UV circular dichroism spectra by neural networks. Protein Eng. 5, 191- 195).

[0145] Monômeros não ativos ou inativos, feitos como descrito no Exemplo 1, parecem ter estruturas secundárias similares a monômeros ativos. Agregados de -sinucleína ativa por outro lado parecem ter mais teor de folha- e menos -hélice do que agregados inativos como determinado por medir estrutura secundária usando medições de dicroísmo circular (Tabela 1). Tabela 1: Teor de estrutura secundária de monômeros ativos e inativos e agregados ativos ou inativos usando medições de dicroísmo circular Folha- β Folha paralela, α-Hélice, % Alça, % Aleatório, % antiparalela, % % Monômero 6 33 4 25 38 ativo Monômero 6 29 4 30 40 inativo Agregado 13 29 6 17 34 inativo Agregado ativo 7 36 5 21 36 Agregados ativos semeiam agregação de -sinucleína in vivo

[0146] Como mostrado na figura 2B, usar anticorpo específico fosforilado na serina 129 para a detecção da patologia de Corpo de Lewy (método descrito no Exemplo 1), agregados inativos que foram feitos com monômeros de - sinucleína na ausência de endotoxina não exibem nenhuma marcação pSer 129 (agregado inativo – pSer 129), indicando que agregados inativos não semeiam agregação de -sinucleína endógena em células corticais primárias de rato. Entretanto, agregados ativos feitos na presença de endotoxina semeiam efetivamente agregação de -sinucleína como evidenciado por marcação de pSer 129 de células que foram tratadas previamente com agregados de - sinucleína ativa (vide agregado ativo – pSer129).

[0147] Para averiguar adicionalmente as diferenças entre agregados inativos e ativos, ambos eram tipos vistos sob microscopia eletrônica. As fibrilas de -sinucleína inativas formaram filamentos mais finos do que os filamentos de -sinucleína ativos e as fibrilas de -sinucleína inativas eram menos firmemente acondicionadas. Além disso, as fibrilas de -sinucleína inativas eram consideravelmente mais longas, atingindo vários micrometros em comprimento. As fibrilas de -sinucleína ativa por outro lado tinham aproximadamente 55 a 75 nm em comprimento por aproximadamente 6 a 8 nm em largura (vide a figura 2C).

[0148] Esses resultados demonstram que há duas populações de monômeros e agregados de -sinucleína: uma população de -sinucleína ativa e uma população de -sinucleína inativa. Exemplo 3: Geração de anticorpos monoclonais contra populações de - sinucleína ativa

[0149] Anticorpos monoclonais de camundongo foram preparados para os agregados de -sinucleína ativa e monômeros de -sinucleína ativa (Exemplo 1) usando a tecnologia RapidPrime como descrito no Exemplo 1. Experimentos de triagem iniciais no primeiro turno de clones foram realizados em monômeros ativos ou agregados ativos (PFFs), usando ELISA indireto (onde o antígeno é revestido sobre uma placa, o anticorpo sendo triado podendo se ligar ao mesmo e então essa ligação detectada por adicionar um anticorpo secundário com especificidade a um anticorpo monoclonal de camundongo porém também ligado a peroxidase de rábano silvestre para catalisar uma reação de cor de detecção com TMB; Exemplo 1), para identificar clones positivos. Hibridomas que secretam anticorpos selecionados foram identificados por seus títulos de anticorpo e então isotipados como descrito no Exemplo 1. Hibridomas que secretam anticorpos na forma ativa do monômero de -sinucleína, porém não a versão inativa, foram selecionados. Em geral 20 anticorpos monoclonais foram identificados que se ligaram à forma ativa do monômero de -sinucleína.

[0150] Caracterização adicional de anticorpos monoclonais selecionados foi realizada usando análise de Western blot de amostras de cérebro de camundongo desnaturado e lisado de HeLA. Um anticorpo (2F11) foi identificado que resultou em um padrão de formação de banda exclusivo quando comparado com os outros clones de anticorpo anti-alfa-sinucleína. A sequência de 2F11 é fornecida em SEQ ID NOs: 10 a 13; figuras 11A e B).

[0151] Como mostrado na figura 3A, 2F11 identificou uma banda com alto peso molecular (>150 kDa) em oposição a uma banda de 15 kDa normalmente associada à -sinucleína monomérica. Outros anticorpos monoclonais de - sinucleína, incluindo 4F1 (figura 3B) e 3F8 (figura 3C) foram observados para identificar a banda de 15 kDa. Os clones 4F1 e 3F8 foram aleatoriamente selecionados de um grupo de aproximadamente 20 anticorpos monoclonais, todos mostrando a mesma especificidade. Além disso, 2F11 identificou uma banda com alto peso molecular (>150 kDa) em lisado de HeLA (figura 3D), conhecida por produzir -sinucleína, vide URL:

proteinatlas.org/ENSG00000145335-SNCA/cell).

[0152] O sinal positivo forte identificado por 2F11 em Western blot não pareceu ser um resultado de altos níveis de proteína, uma vez que o nível de proteína estava abaixo do nível de detecção usando marcação Ponceau, ou coração de Coomassie blue. Sem desejar ser limitado por teoria, esse resultado sugere que a proteína identificada por 2F11 pode ser um oligômero, compreendendo muitas moléculas de alfa-sinucleína (o peso molecular sugerindo pelo menos dez), que poderia fornecer múltiplos sítios de ligação para o anticorpo monoclonal e produzir uma resposta de western blot alta apesar de ser baixo em concentração.

[0153] A sequência de aminoácidos e ácido nucleico das cadeias pesada e leve de 2F11 é fornecida na figura 11.

[0154] O pI do anticorpo 2F11 foi determinado como tendo duas bandas IgG1 com pIs aparentes de 7,23 e 7,27 (determinado usando Biorad ReadyStrip system, analisado com Focus Proteomics, EUA).

[0155] Espectrometria de massa do anticorpo 2F11 mostrou que tinha cadeias leves com massa 24.139 e cadeias pesadas com massa 50.155 (análise realizada na University of Victoria Proteomics Centre, Victoria, Canadá). Imunoprecipitação usando 2F11

[0156] Dado o fato de que 2F11 mostrou pouca ou nenhuma afinidade para a proteína alfa-sinucleína monomérica em Western blot, 2F11 foi usado para imunoprecipitar o lisado de cérebro de camundongo em condições nativas como descrito no exemplo 1. O precipitado e a fração de fluxo direto foram obtidos e reexaminados usando análise de Western blot (proteínas foram removidas do anticorpo antes de realizar western blot por eluição das mesmas da resina enquanto o anticorpo permaneceu covalentemente ligado à resina). Os resultados são mostrados nas figuras 5A e 5B.

[0157] Se o anticorpo 2F11 somente se ligasse a oligômeros de -sinucleína no lisado nativo, então é previsto que a análise western do precipitado imune revelaria um oligômero estabilizado e nenhum monômero, e isso é o que foi observado (figura 5A). como mostrado na figura 5A, 2F11 identificou um oligômero de 60 a 70 kDa de -sinucleína em lisados de cérebro de camundongo imunoprecipitados.

[0158] Espécies monoméricas da proteína seriam esperadas estar presentes nos materiais levados a partir dos oligômeros imunoprecipitados (fração de fluxo direto), e isso foi observado (figura 5B). com referência à figura 5B, observou-se que 2F11 se liga a três frações: um monômero de -sinucleína (aprox. 15 kDa), um trímero de -sinucleína putativo (aprox. 40 kDa) e o oligômero de -sinucleína (60 a 70 kDa). 2F11 não se liga a monômero de -sinucleína ativa

[0159] Para avaliar a ligação do 2F11 in vivo, células microgliais BV-2 foram tratadas com oligômeros de -sinucleína ativa ou monômeros de -sinucleína ativa que tinham sido pré-incubadas com o anticorpo 2F11.

[0160] Células BV-2 microgliais de camundongo foram semeadas a 100.000 células/poço por 24 h em placas com 24 poços em lamínulas de vidro revestidas com poli-L-lisina. 50 g/mL de oligômeros de -sinucleína ativa foram pré- incubados com 5 g/mL de anticorpo monoclonal contra -sinucleína (2F11), ou IgG controle em DMEM isento de soro por 1 h em um agitador em RT. 50 g/mL de monômeros de -sinucleína ativa foram pré-incubados com 5 g/mL de anticorpo de anticorpo monoclonal contra -sinucleína (2F11) em DMEM isento de soro por 1 h em um agitador a RT. 250 L de meio contendo imunocomplexos de alfa-sinucleína foram adicionados aos poços indicados e incubados por 1 h a 37°C. Após tratamentos, as células foram fixadas com formalina tamponada neutra a 10% e submetidas a imunocitoquímica dupla (ICC). O anticorpo 2F11 no imunocomplexo de alfa-sinucleína foi detectado usando um anticorpo IgG de anti-camundongo conjugado com Alexa 488. A via de internalização foi detectada usando LAMP-1 policlonal de coelho (ab24170, 1:200); detecção de LAMP-1 foi obtida usando IgG anti-coelho conjugado com Cy5. Os núcleos foram contra-corados usando Hoechst 33258.

[0161] O 2F11 ligado a oligômero foi prontamente detectado e verificou-se que está localizado principalmente na superfície da célula. Entretanto, 2F11 não formou um imunocomplexo com monômeros de alfa-sinucleína (dados não mostrados).

[0162] Esses resultados indicam que 2F11 liga oligômeros de alfa- sinucleína, porém não monômeros em condições nativas a partir de amostras nativas, e que em condições de desnaturação (usadas durante análise de Western blot) tanto oligômeros estabilizados como -sinucleína monomérica são identificados por 2F11. Exemplo 4: Anticorpo monoclonal de camundongo liga -sinucleína humana

[0163] A similaridade entre -sinucleína humana e de camundongo é 95% (vide a figura 6). A -sinucleína que foi usada para imunizar camundongos era de origem de camundongo. Para determinar se 2F11 identifica oligômeros de - sinucleína com alto peso molecular em amostras humanas, lisados de cérebro humano, lisados de cérebro humano a partir de um paciente com Parkinson, e lisado de um cérebro de camundongo foram comparados usando análise Western blot em condições de desnaturação (figura 7) e em condições nativas (figuras 8A e 8B).

[0164] Com referência à figura 7, o anticorpo 2F11 mostrou que tinha pelo menos especificidade dual de camundongo e humana ligando oligômeros com peso molecular alto e médio. A banda de 150 kD foi levemente mais prevalente no lisado do cérebro com Parkinson do que em lisado de cérebro humano, porém menor que no lisado de cérebro de camundongo. O mesmo anticorpo também identificou a banda de -sinucleína monomérica em condições de desnaturação em amostras tanto humanas como de camundongos.

[0165] Com referência à figura 8A, a ligação do anticorpo 2F11 em condições nativas (não redutoras) foi examinada. Um gel nativo foi blotted e sondado com o anticorpo 2F11, e o anticorpo 4F1 (figura 8B). Os resultados mostraram que 2F11 se ligou a oligômeros com alto peso molecular através de lisados de cérebro humano, incluindo lisado de cérebro com Parkinson, e lisado de cérebro de camundongo, de aprox. 60 kD a aproximadamente 250 kD, dependendo da amostra. Também se observou que 2F11 se liga a monômeros ou agregados de -sinucleína patogênicos ativos purificados em condições nativas. Também se observou que o anticorpo 4F1 se liga a oligômeros com peso molecular mais alto em condições nativas. Entretanto, 4F1 não reconheceu agregados ou monômeros de -sinucleína patogênicos ativos purificados.

[0166] Os resultados mostram que em um sistema nativo 2F11 pode ligar tanto amostras humanas como de camundongos. Além disso, o anticorpo 2F11 (e o anticorpo 4F1) não ligou monômero de alfa-sinucleína ativa em condições nativas. Sem desejar ser limitado por teoria, 2F11 pode ter um padrão de ligação exclusivo para agregados de -sinucleína ativa que permite que liguem as espécies patogênicas de oligômeros de -sinucleína ativa, ou um oligômero ativo diretamente envolvido na via para criar a patologia de Corpo de Lewy.

[0167] Os resultados mostram que o lisado de cérebro com Parkinson tem -sinucleína oligomérica presente. Também mostra que os anticorpos não são específicos a camundongo, porém estendem sua reatividade de espécie a ser humano. 2F11 que se liga a agregados de -sinucleína ativa humana

[0168] A especificidade do anticorpo 2F11 que se liga a agregados de - sinucleína ativa e agregados de -sinucleína inativa humana foi examinada por dot blot. Nesse ensaio, tipos de sinucleína ativa e inativa foram colocados sobre nitrocelulose e sondados usando o 2F11. Também testamos a capacidade de anticorpo A11, que tem uma especificidade positiva para oligômeros A prefibrilares (Kayed. R, et al. 2007. Molecular Neurodegeneration 2007, 2:18 doi:10.1186/1750-1326-2-18) em espécie de fibrila/oligômero de α-sinucleína ativa e inativa. Os resultados são mostrados na figura 8C e indicam que o anticorpo 2F11 somente se liga a agregados de α-sinucleína ativa. O anticorpo A11 mostrado por Kayed et al. (2007) para ligar oligômeros de α-sinucleína somente se liga à espécie de fibrila/oligomérica inativa.

[0169] Para demonstrar adicionalmente que o anticorpo 2F11 se ligou a fibrilas de α-sinucleína oligomérica, microscopia eletrônica foi usada. O anticorpo 2F11 foi conjugado com partículas de nano-ouro e permitido ligar com agregados de α-sinucleína ativa. Como mostrado na figura 8D, o anticorpo 2F11 se ligou a agregados de α-sinucleína ativa humana.

[0170] Coletivamente, esses resultados demonstram que o anticorpo 2F11 é específico para agregados de α-sinucleína ativa, e que as duas espécies de agregados (isto é, agregados de α-sinucleína ativa e inativa) são diferentes. Exemplo 5: 2F11 bloqueia formação de estrutura de folha- in vitro Formação de estrutura de folha- de α-sinucleína

[0171] O ensaio in vitro de tioflavina foi usado para medir o progresso da reação de α-sinucleína na presença de vários anticorpos. A cinética de tempo de uma reação de α-sinucleína típica é mostrada na figura 9A. na presença de um agregado de α-sinucleína ativo e um monômero de α-sinucleína ativa (linha superior), o monômero de α-sinucleína ativa é “semeado” e alterações a partir de uma estrutura alfa-helicoidal para folha-beta ao longo do tempo com um aumento correspondente em fluorescência de tioflavina (similar ao resultado observado na figura 2A; exemplo 2).

[0172] Monômeros de α-sinucleína ativa e agregados de α-sinucleína necessitam estar presentes para a formação de estrutura de folha-, e um aumento em fluorescência de tioflavina. Agregados de α-sinucleína ativa resultaram em um leve aumento em fluorescência de tioflavina (segundo a partir da linha superior) ao longo do tempo, porém a quantidade de formação de estrutura de folha- é menor que aquela da mistura de um agregado de α- sinucleína ativa + um monômero de α-sinucleína ativa (linha superior). Similarmente aos resultados mostrados na figura 2, monômeros de α-sinucleína ativa podem lentamente auto-semear ao longo do tempo (terceira linha a partir do topo).

[0173] Esse ensaio foi usado para determinar o efeito dos anticorpos 2F11, 4F1 e 3F8, todos os mesmos anticorpos de isotipo (IgG1 kappa), e um anticorpo controle de isotipo aleatório: monoclonal de camundongo para hsp70, Stressmarq, código de cat. nº SMC-104) na cinética de reação de fluorescência de tioflavina na presença de agregado de α-sinucleína ativa e um monômero de α-sinucleína ativa. Os resultados são mostrados na figura 9B (anticorpos adicionados no início da reação) e a figura 9C (anticorpos pré=incubados antes do início da reação).

[0174] Para o ensaio mostrado na figura 9B, 30 g de anticorpo foram adicionados a 100 M de monômeros de α-sinucleína ativa juntamente com 10 nM de agregado de α-sinucleína ativa. Na ausência do anticorpo adicionado, a cinética de curso de tempo de formação de estrutura de folha- na presença de agregado de α-sinucleína ativa e um monômero de α-sinucleína ativa (linha superior), agregado ativo (terceira linha a partir da parte inferior) ou monômero ativo (segunda linha a partir da parte inferior) é similar àquela observada na figura 9A. Quando SMC-104 (segunda a partir da linha superior), 4F1 (terceira a partir da linha superior) ou 3F8 (quarta a partir da linha superior) foram adicionados à mistura reacional, uma diminuição em fluorescência de tioflavina total foi observada, entretanto, um aumento significativo em formação de estrutura de folha- foi ainda observado. Fluorescência de tioflavina foi muito reduzida na presença de 2F11 (quarta linha a partir da parte inferior), mostrando formação de estrutura de folha- reduzida na presença do anticorpo 2F11.

[0175] A adição do anticorpo 2F11 é altamente disruptiva e reduz a taxa de formação de estrutura de folha- durante os primeiros 1000 minutos (16 horas). Entretanto, a taxa de reação observada com agregado de α-sinucleína ativa + monômero de α-sinucleína ativa (linha superior), foi similar à taxa de reação dos substratos ativos na presença de 4F1 ou 3F8, ou o anticorpo controle, SMC-104.

[0176] Para o ensaio mostrado na figura 9C, 30 g de anticorpo foi adicionado a 10 nM de agregado de α-sinucleína ativa por 60 minutos e a mistura lavada para remover qualquer anticorpo não ligado antes da adição de 100 M de monômero de α-sinucleína ativa para iniciar a reação. Na ausência de anticorpo adicionado, a cinética de curso de tempo de formação de estrutura de folha- na presença de agregado de α-sinucleína ativa e um monômero de α- sinucleína ativa (linha superior), agregado ativo (quarta linha a partir da parte inferior) ou monômero ativo (segunda linha a partir da parte inferior) é similar àquela observada na figura 9A.

[0177] A pré-incubação de anticorpos com os agregados antes de iniciar a reação resultou no anticorpo 2F11 inibindo totalmente a atividade de agregação (terceira linha a partir da parte inferior) em um modo similar ao monômero de α-sinucleína ativa isolada (segunda linha a partir da parte inferior), ou agregado de α-sinucleína isolada (quarta linha a partir da parte inferior). A taxa de aumento em fluorescência durante os primeiros 1000 minutos na presença de mistura de reação de 2F11 foi também muito reduzida em comparação com agregado de α-sinucleína ativa e um monômero de α-sinucleína ativa (linha superior) e novamente se aproximou da cinética observada com monômero de α-sinucleína ativa ou agregado de α-sinucleína.

[0178] A pré-incubação dos agregados de α-sinucleína ativa antes do início da reação com 3F8 e 4F1 não alterou a taxa de aumento em fluorescência durante os primeiros 1000 minutos e resultou em diferença somente leve de fluorescência total, quando comparado com a pré-incubação com o anticorpo controle de isotipo (SMC-104).

[0179] Esses resultados mostram claramente que o anticorpo 2F11 se liga a um componente ou estrutura que é necessária para a agregação de α- sinucleína e reação de fibrilização prosseguir para formar a estrutura de folha-. O anticorpo 2F11 mostra, portanto, um efeito de neutralização sobre essa reação. Formação de estrutura de folha- de tau

[0180] Devido à interação conhecida entre tau e α-sinucleína (Li, X, et al., 2016, J. Mol. Neurosci. 60:298-304), o efeito do anticorpo monoclonal 2F11 sobre a formação de estrutura de folha- induzida por tau foi examinado usando o ensaio de tioflavina. Fibrilas de tau foram preparadas usando o método como descrito em Li W, Lee VM. (2006, Biochemistry. 45(51):15692–15701. doi:

10.1021/bi061422+).

[0181] O anticorpo (60 g de 2F11 ou SMC-104) foi incubado com 10 nM de fibrila de tau por 1 hora a 4°C com agitação. A mistura foi centrifugada a 10000 rpm por 5 minutos e enxaguada com 1 mL de PBS. Essa etapa foi repetida 4 vezes adicionais. O sobrenadante foi removido e a fibrila de tau (com anticorpo ligado) foi ressuspenso em 10 L de PBS antes da adição de 25 M de monômero de tau para iniciar a reação. O material de tioflavina T foi adicionado a uma concentração final de 25 M. A fluorescência de tioflavina T foi determinada em cada poço (excitação 450 nm, emissão 485 nm) após incubação a 37°C a partir de 1 hora até 48 horas com agitação. Os resultados são mostrados na figura 13.

[0182] Um sinal de fluorescência de fundo foi observado quando fibrila de tau isolada, ou monômero de tau isolado foi ensaiado. Entretanto, uma mistura de monômero de tau e fibrilas de tau resulta na produção de um sinal de fluorescência forte indicando formação de estrutura de folha-. Observou-se que o progresso da reação de tau foi interrompido quando o anticorpo monoclonal 2F11 foi pré-incubado com monômero de tau e fibrila de tau antes do início da reação. O anticorpo monoclonal SMC-104 (monoclonal de camundongo a hsp70) teve pouco ou nenhum efeito sobre a reação de tau.

[0183] Esses resultados mostram que o anticorpo monoclonal 2F11 bloqueia fibrila de Tau e formação de estrutura de folha- in vitro. Exemplo 6: 2F11 inibe patologia de Corpo de Lewy induzida por fibrila de - sinucleína ativa in vivo

[0184] Dado o fato, como mostrado no exemplo 5, de que 2F11 mostrou a capacidade de inibir a agregação de -sinucleína in vitro, a capacidade do anticorpo 2F11 inibir agregação de -sinucleína em células corticais primárias colhidas de cérebros de embrião de rato Sprague-Dawley foi examinada.

[0185] Como mostrado na figura 9D, a amostra controle, tratada com DAPI e sondado com anticorpo de alfa-sinucleína pSer129 (painel esquerdo superior) mostra somente núcleos marcados com DAPI. A adição de fibrilas de -sinucleína ativa as células primárias de cérebro seguido por marcação com DAPI e sondagem com anticorpo de alfa-sinucleína pSer129 mostra tanto núcleos marcados com DAPI como células marcadas com o anticorpo pSer129 (painel direito superior) e indica ligação de pSer129 a anticorpo de -sinucleína, e patologia induzida por -sinucleína nas células do cérebro. Quando fibrilas de -

sinucleína ativa e 2F11 foram adicionadas às células primárias de cérebro e expostas a DAPI e sondadas com anticorpo de alfa-sinucleína pSer129, núcleos marcados com DAPI com níveis menores fundo de marcação com pSer129 foram observados (painel inferior). A adição de agregados de -sinucleína induziu, portanto, a patologia de Corpo de Lewy em células corticais primárias (painel direito superior), entretanto, quando o anticorpo 2F11 foi adicionado juntamente com os agregados de -sinucleína, a patologia de corpo de Lewy foi inibida (painel inferior).

[0186] Esses resultados demonstram que 2F11 inibe patologia de Corpo de Lewy induzida por fibrila de -sinucleína ativa em células primárias de cérebro. Injeção intraestriada de anticorpo 2F11 reduz a geração de patologia de Corpo de Lewy em células corticais primárias de ratos

[0187] A capacidade do anticorpo 2F11 de neutralizar a geração de patologia de Corpo de Lewy em células corticais de rato, in vivo também foi examinada. Os ratos foram submetidos à eutanásia 30 dias após a injeção (dpi). Ratos Long Evans machos com quatro meses de idade foram randomizados e divididos em quatro grupos. Receberam injeção intraestriada em 1 sítio de PBS estéril (Controle, 4 L PBS), fibrilas de -sin. pré-formadas sonicadas (PFF, 4,2 g total) ou PFF mais anticorpo quando aplicável (2 g). Dois anticorpos (2 g de anticorpo) foram testados em relação à sua capacidade de neutralizar formação de patologia de Corpo de Lewy; 2F11 conhecido por neutralizar a patologia in vitro e 3D10, outro anticorpo de -sinucleína que é incapaz de neutralizar a geração de patologia in vitro.

[0188] Antes da injeção intraestriada, PFF armazenado a -80°C foi descongelado e sonicado em temperatura ambiente usando um Sonic Dismembrator modelo 100 (Fischer Scientific) com 60 pulsos em uma potência de 10% (total de 30 segundos, 0,5 s ligado, 0,5 s desligado). Ratos anestesiados

(isoflurano inalado) foram colocados em um dispositivo estereotáxico. O crânio foi exposto ao fazer uma incisão de linha média usando uma lâmina de bisturi, e a superfície do crânio seca para identificiar o bregma. Um furo com 1 mm de diâmetro é perfurado até a dura. PBS estéril, PFF ou PFF com anticorpo quando apropriado foi injetado no estriato dorsal direito em um sítio até um volume total de 4 L por minuto usando uma seringa Hamilton de 5 L. Após cada injeção, a seringa foi deixada no local por 2 minutos e então lentamente retirada. Os animais foram monitorados após cirurgia e sacrificados 30 dias após injeção (dpi).

[0189] Os animais foram perfundidos por modo transcardial com 200 mL de 0,1 M de solução salina de tampão de fosfato (PBS) heparinizada seguido por 200 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) diluído em 0,1 M PBS. Após perfusão, os cérebros foram dissecados e fixados por imersão na mesma solução de fixação (PFA a 4% em 0,1 M PBS) durante a noite a 4°C. Usando um Vibratome (Leica VT1000S), cérebros foram fatiados em PBS frio em seções de 50 micrômetros. Uma em cada seis fatias foi mantida no mesmo poço. Um poço por animal foi usado para realizar a marcação de imunofluorescência. As seções foram separadas em poços de uma placa de 12 poços e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente em 3 mL de albumina de soro bovino a 2% (BSA) e 0,2% Triton-100X em PBS a 0,1 M. Após as amostras serem bloqueadas e permeabilizadas, as fatias foram lavadas por 10 minutos em 2% BSA-PBS para um total de três lavagens. Uma diluição de 1:500 de StressMarq SPC-742 (anticorpo de -sinucleína específico fosforilado na serina 129) foi preparada em 2% BSA-PBS e adicionada a cada poço. As fatias foram incubadas com agitação durante a noite a 4°C com um volume total de 3 mL por poço. As amostras foram lavadas por 10 minutos em 2% BSA-PBS por um total de três lavagens. Uma diluição de 1:400 de anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugado com

Alexa Fluor 488 em 2% BSA-PBS foi preparada e adicionada a cada poço. As fatias foram incubadas com agitação por duas horas em temperatura ambiente com um volume total de 3 mL por poço. As amostras foram lavadas por 10 minutos em 2% BSA-PBS duas vezes e então contra-corados com DAPI por 10 minutos e lavadas em PBS por 10 minutos. As fatias foram montadas, deixadas secar por aproximadamente 40 minutos e uma lamínula foi adicionada com Fluoromont- G (ThermoFisher Scientific, Catálogo nº 00-4958-02). Imagens foram feitas usando um microscópio confocal Olympus BX51 e software Fluoview FV1000. DAPI foi excitado com um laser a 405 nm e Alexa-488 foi excitado com um laser a 461 nm. Todos os parâmetros de aquisição (por exemplo, potência laser, HV, ganho, etapa-z) foram mantidos constantes entre amostras.

[0190] Seções de tecido cortical obtido de ratos tratados com fibrilas de - sinucleína em PBS revelaram fluorescência localizada indicando ligação do anticorpo de -sinucleína (pSer129) a fibrilas de -sinucleína e formação de agregado de -sinucleína. Entretanto, nos ratos tratados com PBS (controle), nenhuma fluorescência foi observada, indicando nenhuma formação de agregado de -sinucleína. Fluorescência localizada foi também observada em células corticais de ratos que foram tratados com fibrilas de -sinucleína e o anticorpo 3D10, indicando ligação do anticorpo (pSer129) a fibrilas de - sinucleína e formação de agregado de -sinucleína. A quantidade de ligação localizada em células corticais recebendo fibrilas de -sinucleína e o anticorpo 3D10, foi similar àquela observada em fatias de tecido cortical obtido de ratos administrados com apenas fibrila de -sinucleína. Embora fluorescência localizada fosse observada em células corticais obtidas de cérebro de rato tratado com fibrilas de -sinucleína e o anticorpo 2F11, tanto o número de sítios de ligação localizada, como o tamanho dos sítios de ligação localizada, foram reduzidos quando comparado com o número e tamanho de sítios de ligação observados em células corticais quando tratadas com fibrila de -sinucleína isolada, ou fibrilas de -sinucleína e o anticorpo 3D10.

[0191] Os resultados acima demonstram que tratamento de tecido de cérebro com o anticorpo 2F11 reduz a geração de patologia de Corpo de Lewy em células corticais de rato, in vivo. 2F11 reduz efeito citotóxico de -sinucleína

[0192] -sinucleína é conhecida por ter efeito citotóxico, portanto, a capacidade do anticorpo 2F11 reduzir citotoxicidade em células SHSY-5Y foi examinada.

[0193] Células SHSY-5Y humanas foram semeadas em 20.000 células/poço em uma placa com 96 poços e diferenciadas na presença de 10 M RA por 5 dias. As células foram lavadas com PBS 1x e a capacidade do anticorpo de -sinucleína (2F11) neutralizar os efeitos tóxicos de oligômeros de -sinucleína foi testado. Oligômeros de -sinucleína ativa, oligômeros de -sinucleína inativa, e monômeros de -sinucleína ativa (a 25 g/mL ou 50 g/mL) foram pré- incubados com 5 g/mL monoclonal 2F11 em DMEM isento de soro por 2 h em um agitador em RT. O meio foi removido e 100 L de meio contendo agregados de -sinucleína ativa + anticorpo 2F11 foi adicionado aos poços relevantes e incubado durante a noite a 37°C. Após tratamento, as células foram imediatamente fixadas com formalina tamponada neutra a 10% e imunomarcada usando anticorpo tubulina -III (tubulina -III é usado como um marcador de célula neuronal). A morte celular foi expressa como percentagem de total de células ou percentagem de neurônios positivos -III. Os resultados são mostrados na figura 9E.

[0194] A adição de oligômeros de -sinucleína ativa a células SHSY-5Y humanas seguida pela adição de agregados de -sinucleína ativa resultou em níveis mais altos de morte celular quando comparado com células controle (não tratadas), células expostas a oligômeros de -sinucleína ativa inativa, ou células expostas a monômeros de -sinucleína ativa. Esse resultado demonstra que oligômeros de -sinucleína ativa podem ser recrutados por agregados de - sinucleína ativa, e a reação resulta em um aumento em morte celular em comparação com oligômeros de -sinucleína inativa.

[0195] A adição de oligômeros de -sinucleína a células SHSY-5Y humanas seguida pela adição de agregados de -sinucleína ativa + anticorpo 2F11 reduziu morte celular (aprox. 2,5 vezes) a níveis observados em células expostas a oligômeros de -sinucleína ativa inativa, ou monômeros de -sinucleína ativa. Esses resultados indicam que 2F11 bloqueia ou neutraliza os efeitos tóxicos de oligômeros de -sinucleína in vivo. Exemplo 7: Mapeamento de epítopo

[0196] A ligação de epítopo do 2F11, e vários outros anticorpos incluindo 4F1, 3F8 (e outros que foram preparados como descrito no exemplo 3) foi avaliada por ligação com peptídeos de -sinucleína de aprox. 30 aminoácidos em comprimento, cada peptídeo de -sinucleína sobrepondo com aproximadamente 10 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos adjacente (descrita acima: “Síntese de peptídeo para mapeamento de epítopo”).

[0197] A série de peptídeos de sobreposição foi ligada a BSA antes da análise usando ELISA, dot blot (DB) ou western blots (WB).

[0198] Como descrito no exemplo 3, aprox. 20 anticorpos foram selecionados como ligantes de monômeros de -sinucleína ativa, entretanto, apresentaram ligação diferencial sob condições nativas ou desnaturadas. Portanto, três métodos foram selecionados para incluir tanto condições de ligação desnaturada como nativa para a análise de mapeamento. Esses métodos envolveram: western blot (em condições de desnaturação), dot blots (em condições não de desnaturação (usando um sistema de saída similar a western blots, porém sem desnaturar a amostra com detergentes iônicos como sulfato de dodecil sódio, agentes redutores e temperaturas em ebulição) e ELISA (em condições de não desnaturação). Os resultados da análise de ligação de 15 dos anticorpos inicialmente selecionados no Exemplo 3 são mostrados na figura 10.

[0199] A partir dos resultados mostrados na figura 10, o clone 2F11 apresentou um mapa de epítopo exclusivo, sendo o único clone a se ligar especificamente apenas aos aminoácidos 61 a 90 e aminoácidos 101 a 130 (como determinado usando ELISA). Os anticorpos restantes ligaram uma combinação diferente de regiões. Por exemplo, o clone 3F8 também apresentou ligação forte à seção C-terminal (aminoácidos 101 a 130 e 121 a 140; usando métodos tanto de desnaturação como de não desnaturação). O clone 3F8 também se ligou aos aminoácidos 41 a 70.

[0200] Esses resultados indicam ainda a natureza exclusiva do anticorpo 2F11. A capacidade de ligação exclusiva de 2F11 permite que o mesmo se ligue e neutralize um componente de núcleo da agregação de alfa-sinucleína e reação de fibrilização. Exemplo 8: ELISA para medir -sinucleína oligomérica virulenta

[0201] Um teste de ELISA tipo sanduíche é preparado usando 2F11. Para tratamentos controle, anticorpos 4F1 e 3F8 podem ser usados. Sementes de - sinucleína recombinantes, ou um agregado de -sinucleína ativa, podem ser usados como padrão. O ensaio ELISA pode ser usado para seletivamente medir -sinucleína oligomérica virulenta. O ensaio não identifica -sinucleína agregada inativa ou monomérica inativa. Exemplo 9: Imunização de camundongo

[0202] Camundongos transgênicos (tg) alfa-sin (modelo PD; vide URL: jax.org/strain/004479; Masliah et al., 2011) e camundongos não tg são separadamente imunizados usando anticorpos 2F11, 3F8 e 4F1 por 6 meses de injeções intraperitoneais semanais como definido em Masliah et al., 2011. Resposta comportamental

[0203] A resposta comportamental tanto de camundongos transgênicos (tg) -sin. como camundongos não tg é avaliada usando testes de labirinto de água, teste de Poste e Rotarod após 6 meses de injeções intraperitoneais semanais como descrito em Masliah et al. 2011. Os resultados determinarão se camundongos tg imunizados têm melhor recuperação de memória e foram capazes de concluir suas tarefas em modo similar a camundongos não tg e determinarão se o tratamento com anticorpo reverte déficits de aprendizagem. Níveis de plasma

[0204] O título dos anticorpos 2F11, 3F8, 4F1 em plasma de camundongo e fluido cérebro-espinhal é determinado durante um período de 6 meses. O aumento de título no cérebro mostrará que os anticorpos são capazes de cruzar a barreira hematoencefálica. Imunoistoquímica

[0205] Após 6 meses, os animais são sacrificados e amostras de seu hipocampo e neocórtex são analisadas por meio imunoistoquímico (como descrito por Masliah et al. 2011). Os resultados podem mostrar que camundongos tg imunizados têm níveis alterados de -sinucleína em seu hipocampo e neocórtex.

[0206] Todas as citações são pela presente incorporadas por referência.

[0207] A presente invenção foi descrita com relação a uma ou mais modalidades. Entretanto, será evidente para pessoas versadas na técnica que diversas variações e modificações podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção como definido nas reivindicações. Referências

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Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal 2F11, caracterizado pelo fato de ser como depositado sob ATCC PTA-124174.

2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal 2F11 definido na reivindicação 1, em um carreador, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

3. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal 2F11 definido na reivindicação 1, em um carreador, adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

4. Método para reduzir α-sinucleína ativa ou formação fibrilar de tau em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade da composição definida na reivindicação 2 ao indivíduo.

5. Método para reduzir α-sinucleína ativa ou formação fibrilar de tau em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade da vacina definida na reivindicação 3 ao indivíduo.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ao indivíduo por via oral, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a vacina é administrada ao indivíduo por via oral, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que, antes da etapa de administração, um nível de α-sinucleína ativa ou fibrilas de tau no indivíduo é determinado e, após um período de tempo depois da etapa de administração, um segundo nível de α-sinucleína ativa ou fibrilas de tau é determinado.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que, antes da etapa de administração, um nível de α-sinucleína ativa ou fibrilas de tau no indivíduo é determinado e, após um período de tempo depois da etapa de administração, um segundo nível de α-sinucleína ativa ou fibrilas de tau é determinado.

10. Método para determinar a presença de α-sinucleína oligomérica ativa em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: i) pré-misturar uma porção da amostra com um anticorpo controle, seguido por adicionar o monômero de -sinucleína ativa recombinante para produzir um tratamento controle, ii) pré-misturar uma segunda porção da amostra com o anticorpo monoclonal 2F11 definido na reivindicação 1, seguido por adicionar o monômero de -sinucleína ativa recombinante para produzir um tratamento ativo, iii) determinar a quantidade de formação de estrutura de folha-β tanto no tratamento controle como no tratamento ativo usando um ensaio de tioflavina, em que uma diminuição em fluorescência de tioflavina no tratamento ativo, quando comparado com o tratamento controle, é indicativo da presença da - sinucleína oligomérica ativa na amostra.

11. Método para determinar a presença de -sinucleína oligomérica ativa ou fibrilas de tau em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende expor a amostra ao anticorpo monoclonal 2F11 definido na reivindicação 1 e determinar se o anticorpo monoclonal 2F11 se liga à proteína na amostra, em que a ligação é indicativa da presença da -sinucleína oligomérica ativa ou fibrilas de tau.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a amostra é separada usando eletroforese de não desnaturação antes da etapa de exposição e a proteína separada é sondada usando o anticorpo monoclonal 2F11 através de análise western, em que a ligação de uma ou mais proteína(s) de alto peso molecular é indicativa da presença da -sinucleína oligomérica ativa ou fibrilas de tau na amostra.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que um dot blot da amostra é sondado usando o anticorpo monoclonal 2F11 e a ligação do anticorpo monoclonal 2F11 à amostra é indicativa da presença da - sinucleína oligomérica ativa ou das fibrilas de tau.

14. Método para induzir uma resposta imune em um indivíduo que foi diagnosticado com uma sinucleinopatia, uma condição patológica que tem corpos de Lewy como característica , doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer, doença de Alzheimer esporádica ou doença de Alzheimer familiar, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo monoclonal 2F11 definido na reivindicação 1 ou composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11 a um indivíduo.

15. Método para tratar uma sinucleinopatia, uma condição patológica que tem corpos de Lewy como característica, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia sistêmica múltipla, doença de Alzheimer esporádica ou doença de Alzheimer familiar, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo monoclonal 2F11 definido na reivindicação 1 ou composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11 a um indivíduo.

16. Método para determinar a presença, concentração, ou ambas presença e concentração, de uma -sinucleína oligomérica ativa ou uma fibrila de tau em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar uma amostra a uma superfície que foi preparada usando o anticorpo monoclonal 2F11 definido na reivindicação 1 e determinar uma ocorrência, uma quantidade, ou uma ocorrência e uma quantidade, de agregado de -sinucleína ativa, ou agregado de tau, que está ligada ao anticorpo monoclonal, desse modo determinando a presença, concentração, ou ambas presença e concentração, de agregado de -sinucleína ativa ou agregado de tau na amostra.

17. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NOs: 14 a 19, a sequência de aminoácidos codificando CDRs do anticorpo monoclonal.

18. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos é codificada por uma sequência de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequência(s) de nucleotídeos definida(s) por SEQ ID NOs: 20 a 25.

19. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal se liga a um agregado de -sinucleína ativa, uma fibrila de tau ou uma combinação dos mesmos.

20. Anticorpo multiespecífico para transmigrar a barreira hematoencefálica, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais de uma molécula carreadora fixada no anticorpo monoclonal definido na reivindicação 1.

21. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo biespecífico, e o anticorpo biespecífico é um anticorpo monovalente-biespecífico ou um anticorpo bivalente-biespecífico.

22. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que uma ou mais molécula(s) carreadora(s) do anticorpo biespecífico é/são derivada(s) de um anticorpo que se liga ao receptor de transferrina (TfR) ou de um anticorpo que se liga ao receptor de fator de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF1R).

23. Método para determinar a presença de agregação de tau em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: i) pré-misturar uma porção da amostra com um anticorpo controle, seguido por adicionar monômero de tau para produzir um tratamento controle, ii) pré-misturar uma segunda porção da amostra com o anticorpo monoclonal 2F11, seguido por adicionar o monômero de tau para produzir um tratamento ativo, e iii) determinar a quantidade de formação de estrutura de folha-β tanto no tratamento controle como no tratamento ativo, em que uma diminuição na quantidade de formação de estrutura de folha- no tratamento ativo, quando comparado com o tratamento controle, é indicativo da presença da agregação de tau na amostra.

24. Método para induzir uma resposta imune em um indivíduo que foi diagnosticado com uma taupatia, uma condição patológica que tem emaranhados neurofibrilares como característica, doença de Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente ou uma taupatia glial globular, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo monoclonal 2F11 definido na reivindicação 1, ou composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11 a um indivíduo.

25. Método para tratar uma taupatia, uma condição patológica que tem emaranhados neurofibrilares como característica, doença de Alzheimer, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, demência frontotemporal, doença por grãos argirofílicos, taupatia primária relacionada à idade, demência de emaranhado neurofibrilar somente ou uma taupatia glial globular, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo monocolonal 2F11 definido na reivindicação 1 ou composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal 2F11 a um indivíduo.