KR20220044397A - α-SYN/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도 - Google Patents

α-SYN/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도 Download PDF

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송대해
엄재현
손용규
박경진
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정진원
이보라
윤혜수
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Abstract

본 명세서는 알파-시누클레인 및 IGF1R에 특이적으로 결합하는 이중 특이 항체, 및 상기 이중 특이 항체를 이용하여 알파-시누클레인 또는 이의 응집체와 관련된 질병인 시누클레인병의 예방, 치료 및/또는 진단 용도로 사용하고, α-syn 항체 또는 이의 항원결합단편을 혈액뇌 장벽을 통과할 수 있게 하여 뇌에서 그 작용을 발휘할 수 있도록 하며, 반감기를 연장하여 약효를 장기간 유지할 수 있도록 한다.

Description

α-SYN/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도{BISPECIFIC ANTIBODY AGAINST α-SYN/IGF1R AND USE THEREOF}
본 발명은 알파-시누클레인 및 IGF1R에 대한 이중 특이 항체, 상기 이중 특이 항체를 포함하는 시누클레인병 (α-synucleinopathies)의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 이중 특이 항체를 포함하는 알파-시누클레인 응집체 검출 또는 시누클레인병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
알파-시누클레인(α-Synuclein, α-syn)은 뉴론의 전 시냅스 말단에서 주로 발현되며, 정상 상태에서는 자연적으로 접히지 않은 상태의 단량체로 존재한다. 알파-시누클레인은 자발적 및 비자발적 운동의 시작과 정지를 제어하는 중요한 일종의 신경 전달 물질인 도파민의 방출을 규제하는 것을 돕는다. 특히 알파-시누클레인의 기능은 시냅스 활동의 증가 및 나이가 듦에 따라서 중요하며, 신경퇴화의 중요한 인자이다.
그러나, 병적인 상태에서 알파-시누클레인은 액적(droplet), 인지질 이중막 또는 지질막 등과의 결합 및 상호작용을 통해 구조적 변화를 일으켜 접힌 또는 폴딩된 alpha-헬리칼 형태의 2차 구조를 형성하여 이량체(dimer), 올리고머(oligomer) 및/또는 섬유상 형태의 분자를 포함하는 응집체를 형성하게 된다.
이러한 알파-시누클레인 응집체는 세포에 독성을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 파킨슨병 (Parkinson's disease, PD), 파킨슨질환성 치매(Parkinson's disease dementia, PDD), 다계통 위축증 (multiple system atrophy, MSA), 루이소체 치매 (dementia with Lewy bodies, DLB), 그 외 다양한 질환의 신경세포 내에서 발견되는 비정상적인 단백질 응집체인 루이소체의 주성분이다. 또한 알파-시누클레인의 인산화, 또는 유비퀴틴화와 같은 번역 후 변형도 알파-시누클레인의 응집 및 신경독성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 알파-시누클레인은 동물실험 및 세포실험에서도 도파민 신경세포를 사멸시키고 염증반응을 유발하며, 실험동물에서 파킨슨 병증과 유사한 운동증상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 알파-시누클레인 응집은 파킨슨 병, 파킨슨질환성 치매, 루이소체 치매, 다계통위축증 및 기타 다수의 신경축삭 질환을 포함하는 시누클레인병 (α-synucleinopathies)라고 불리는 일군의 신경퇴행성 질환의 병인과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
알파-시누클레인에 대한 항체 또는 그러한 항체를 유도하기 위한 알파-시누 클레인의 절편은 시누클레인병에 대한 면역 요법의 방법으로 제안되어왔다. 그러나 항체의 뇌 침투는 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 의해 제한될 수 있다.
또한, 고도-특이성인 BBB 운반체의 결핍은 뇌 종양 및 신경변성 질환을 포함한 뇌에서 기원하는 질환들을 위한 새로운 치료제 및 진단제의 개발을 지연시키고 있다. BBB의 생리학 및 항상성을 붕괴시키지 않으면서, 뇌에 약학적으로 효능있는 투여량으로 치료제 및 진단제 분자를 전달하기 위한 방법에 대한 필요성이 분명하게 존재한다.
본 발명의 일 예는 알파-시누클레인(α-syn)에 대한 항원 결합 부위 및 IGF1R에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 항체 또는 상기 항체의 제조 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
또 다른 예는 상기 α-syn 및 IGF1R에 대한 이중특이 항체와, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 알파-시누클레인병 (α-synucleinopathies)의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 이용한 알파-시누클레인병의 진단, 치료 또는 예방에 사용되는 약물을 뇌로 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예는 IGF1R (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor)을 특이적으로 인식하면서도, IGF1R 리간드의 결합에 영향이 없으며, IGF1R 수용체를 통한 신호전달을 억제하지 않으며 트랜스사이토시스가 가능한 항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고자 한다.
다른 양태에서 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 항원결합 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 양태에서 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 그 항원결합 단편을 포함하는 혈액뇌장벽 통과를 위한 생리활성물질의 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 항-IGF1R 항체 또는 항원 결합 단편이 생리활성물질, 예를 들면 뇌에서 작용하는 생리활성물질을 IGF1R 수용체를 통해 혈액 뇌 장벽(Blood Brain Barrier, BBB)을 통과하여 뇌로 전달할 수 있는, 혈액 뇌 장벽 전달체를 제공하고자 한다.
또 다른 구현예에서, 상기 항-IGF1R 항체 또는 항원 결합 단편이 생물학적 활성 분자, 예를 들면 뇌에서 작용하는 생리활성물질에 컨쥬게이션된 형태인, 혈액 뇌 장벽(Blood Brain Barrier, BBB)을 통과하여 뇌로 전달할 수 있는 단백질 복합체를 제공하고자 한다.
다른 양태에서 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 단계 및 상기 항-IGF1R 항체 또는 항원결합 단편을 IGF1R 발현 검출이 필요한 생물학적 시료와 접촉하는 단계를 포함하여 생물학적 시료에서 IGF1R을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 항원 결합 단편을 이용한 뇌질환의 진단, 치료 또는 예방에 사용되는 생리할성물질을 혈액 뇌 장벽을 통과하여 뇌 내부로 전달하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다. 본 명세서에서 "항체"는 임의의 아이소타입의 온전한 면역글로불린, 표적 항원에의 결합을 위해 완전한 항체와 경쟁을 할 수 있는 항원 결합 단편, 또는 이들의 조합을 의미한다. 예를 들면, 키메라, 인간화, 완전 인간 항체, 이들의 항원 결합 단편 및 이들의 조합을 포함한다. 항체는 그 자체로 항원 결합 단백질의 일종이기도 하다. 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하지만, 일부 경우에 항체가 단지 중쇄만을 포함할 수도 있다. 상기 항체는 하나의 타겟에 특이적으로 결합하는 단일특이 항체, 및 복수의 타겟들에 특이적으로 결합하는 다중특이 항체 (예를 들어, 이중특이 항체 및 삼중특이 항체)를 포함한다.
상기 항체는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체도 포함하며, 상기 모노클로날 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체인, IGF1R에 특이적으로 결합하는 분리된 항체일 수 있다. 상기 모노클로날 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 형인, IGF1R에 특이적으로 결합하는 분리된 항체이다.
본원에서 "경쇄"는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기에 충분한 가변영역 서열을 갖는 전장의 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변영역 도메인 VL, 및 불변영역 도메인 CL을 포함한다. 경쇄의 가변영역 도메인은 경쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재한다. 경쇄의 종류에는 카파 및 람다 사슬이 포함된다.
본 명세서에서, "상보성　결정 영역 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다.
본원에서 "중쇄"는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기에 충분한 가변영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 중쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하고, CH 도메인은 카복시 말단에 존재하며, CH3가 카복시-말단에 가장 가깝게 위치한다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 서브타입 포함), IgM 및 IgE의 아이소타입을 포함한다.
상기 항체는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)에서 선택된 것일 수 있다. 상기 IgG 형태의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 예컨대 IgG1 또는 IgG2 서브타입 형태일 수 있다. 상기 IgG 형태의 항체는 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄를 포함하고, 각각의 중쇄 및 경쇄는 다이설파이드 결합을 통하여 결합되어 두 개의 중쇄-경쇄 구조체(dimer)를 형성하고, 상기 형성된 두 개의 중쇄-경쇄는 중쇄의 Fc 부위에서 다이설파이드 결합을 통하여 연결된 형태를 갖는다. 상기 IgG 형태의 항체는 양쪽 중쇄-경쇄 구조체에 동일한 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하여 하나의 항원을 표적으로 하는 단일 표적 항체 또는 양쪽 중쇄-경쇄 구조체에 서로 다른 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하여 두 개의 항원을 표적으로 하는 이중 특이 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 이중특이적 항체, 완전 항체 (whole antibody), 미니바디, 도메인 항체, 항체 모방체(또는 합성 항체), 항체 융합체(또는 항체 접합체), 이의 단편 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 다양한 항체의 구조가 이하 본 발명에서 추가로 개시된다.
본 발명에서 예를 들면 항원 결합 단편, 단백질, 또는 항체와 같은 폴리펩타이드의 "변이체"는 다른 폴리펩타이드 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기에 삽입, 결실, 부가 및/또는 치환이 발생한 폴리펩타이드이며, 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들면, 항체의 일부는 상기 중쇄 또는 경쇄, 가변 영역 또는 CDR 서열의 하나 이상의 잔기에서 보존적(conservative) 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명에서 폴리펩타이드의 "유도체"는, 삽입, 결실, 부가 또는 치환 변이체와는 상이한, 다른 화학적 모이어티와의 컨쥬게이션을 통해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명에 따른 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여, 목적하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 mAb가 유전자도입 마우스, 예를 들면, 앞서 기술된 것들로부터 생성되고 선택될 수 있다. 이러한 항체는 적절한 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 클로닝되고 발현되거나, 또는 상기 항체는 배양된 하이브리도마 세포로부터 수확될 수 있다. 또한, 상기 항체는 파지-디스플레이 라이브러리(phage-display library)로부터 유래될 수 있다. 파지 디스플레이 기술은 필라멘트(filamentous) 박테리오파지의 표면 상에서 항체 레퍼토리를 디스플레이하여, 이로부터 목적하는 항원에 결합하는 파지를 선별하는 일종의 면역 선택(immune selection)을 모방한 방법이다. 이러한 한 가지 기술은 본 발명의 실시예 또는 PCT 공개공보 WO 99/10494호를 참조할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체는 파지 디스플레이 방법을 통해 선별된다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 오직 단일 원(source)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 키메라일 수 있다, 키메라 항체는 2 종류의 상이한 항체로부터 유래된 부분을 포함하며, 아래 보다 상세하게 기술된다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하이브리도마, 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 다른 언급이 없다면, 본원에서 용어 항체는 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체는 물론, 이들의 유도체, 변이체, 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편, 돌연변이체 및 이들의 조합를 포함하며, 예를 들어 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄 외에 1 개 또는 2 개의 scFv를 포함할 수 있고, 이들의 예는 아래 기술된 바와 같다.
본 명세서에 기재된 "항원 결합 단편"은 항원에 대한 특이적 결합능을 갖는 항체의 일부 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 예컨대, 항원결합단편은 항원(예컨대, 에피토프)과 상호작용하여, 항체에 항원에 대한 특이성 및/또는 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 일부 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄 내에 존재하는 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 일부 구현예에서, 단쇄 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 일부를 포함한다. 이러한 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 또는 예를 들면 온전한 항체를 효소적 또는 화학적 절단하여 생산될 수 있다.
면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편에는 이로 제한하는 것은 아니나, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 및 단쇄 항체 (예컨대, scFv, scFv-Fc 등)를 포함한다. 또한 이로 제한하는 것은 아니나, 인간, 마우스, 랫트, 카멜리드 또는 토끼를 포함하는 임의의 포유동물에서 유래될 수 있다. 본 명세서에 개시된 하나 이상의 CDR과 같은 항체의 기능적인 부분은 제2의 단백질 또는 저분자 화합물과 공유결합으로 연결되어 특정 표적에 대한 표적 치료제로서 사용될 수 있다.
본원에서 "단쇄 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변영역이 유연한 링커에 의해 연결된 항원 결합 영역의 단일 폴리펩타이드 사슬이다. 예컨대, 상기 단쇄 항체는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 단일 사슬 형태로 연결된 scFv, 중쇄가변영역, 경쇄가변영역, 및 Fc가 단일사슬 형태로 연결된 scFv-Fc 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 단쇄 항체는 예를 들면 미국 특허 제5,260,203호를 참조할 수 있다.　
본 명세서에서 "친화성 또는 친화도 (affinity)"는 항체 또는 이의 항원 결합단편과 항원 사이의 상호작용의 강도이며, 항체 또는 항원결합 단편의 CDR 서열, 및/또는 항체 또는 항원결합 단편의 물리화학적 특성 (친수성/소수성, 정전기적 특성 등), 항원의 크기, 모양, 및/또는 전하와 같은 항원의 특징 등에 의해 결정될 수 있다. 이러한 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 통상적으로 해리 상수 (dissociation constant, KD)로 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전장의 경쇄 및 중쇄에서, 가변영역 및 불변영역은 약 12개 이상의 아미노산 길이인 "J" 영역에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들면, Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press를 참조할 수 있다. 전형적으로 항체의 경쇄/중쇄 쌍의 가변영역이 항원 결합 부위를 형성한다.
본 발명의 일 예는 알파-시누클레인(α-syn)에 대한 항원 결합 부위 및 IGF1R에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 항체, 구체적으로는 알파-시누클레인(α-syn) 및 IGF1R에 대한 이중 특이 항체(이하, 항 α-syn/항 IGF1R 이중 특이 항체)에 관한 것이다. 이에, 본 발명에 따른 이중 특이 항체는, 알파-시누클레인과 IGF1R를 모두 항원으로 인식 및 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 항 α-syn/항 IGF1R 이중 특이 항체는, 상기 항 α-syn 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하며, 알파-시누클레인을 특이적으로 인식하고 결합할 수 있으며, 특히 알파-시누클레인의 C-말단 부위에 결합할 수 있으며, 알파-시누클레인 또는 이의 응집체와 관련된 질병인 시누클레인병의 예방, 치료 및/또는 진단 용도로 사용될 수 있다.
본원에서 "2가의 항원 결합 단백질" 또는 "2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 이러한 2가 항체에 포함된 2개의 항원 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖거나, 또는 각각 상이한 항원에 결합하는 이중특이적 항체일 수 있다. 본원에서 "다중 특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다중 특이적 항체"는 두 개 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다.
본원에서 "이특이적," "이중 특이적" 항원 결합 단백질 또는 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이러한 이특이적 항체는 다중 특이적 항원 결합 단백질 또는 다중 특이적 항체의 일종으로, 공지된 다양한 방법 예를 들면 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편 혹은 scFv 단편의 연결에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 1990, 79:315-321; Kostelny et al. J. Immunol. 1992, 148:1547-1553 등을 참조할 수 있다. 이특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 항원 결합 부위가 결합하는 2개의 서로 상이한 에피토프는 동일 또는 상이한 단백질 표적에 위치할 수 있다. 본원에 따른 일구현예에서 본원에 따른 항체는 혈액뇌장벽을 통과하여 전달되기 위해 전달체에 대한 결합을 추가로 포함하는 이중특이적 항체의 형태를 취할 수 있다. 혈액뇌장벽을 통하여 약물을 전달하기 위한 한 가지 방법은 세포에 내재된 글루코스 및 아미노산 전달체, 인슐린 또는 트랜스페린의 수용체 매개 트랜스사이토시스와 같은 전달 시스템의 사용을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "시누클레인병"은 병리학적 시뉴클레인 응집체를 특징으로 하는 모든 신경퇴행성 장애를 포함한다. 파킨슨병, 파킨슨질환성 치매(Parkinson's disease dementia, PDD), 루이소체 치매 (dementia with Lewy bodies, DLB), 루이소체병, 루이소체를 동반한 치매, 치매를 동반한 파킨슨 증후군, 다계통 위축증 (multiple system atrophy, MSA), 다발성 신경계 위축 및 뇌 철 침착 동반한 신경변성 I형(NBIA Type I)을 포함하는 몇 가지 신경퇴행성 장애는 시누클레인병으로서 집합적으로 그룹화된다. 또한, 알파-시누클레인 응집은 이차적으로 알츠하이머 질환에서도 발견된다(Kim et al. Alzheimer's Research & Therapy 2014, 6:73).
시누클레인병은 공통적인 병리학적 특성을 공유하는 신경퇴행성 장애의 다양한 그룹이다: 신경병리적 실험에서, 특유의 병변은 뉴런 (neuron) 및 희소돌기신경교 (oligodendrocyte)의 선택된 집단 내에서 알파-시누클레인 단백질의 비정상적 응집을 포함하며 감지될 수 있다. 알파-시누클레인 (처음에 PARKl 및 PARK4로 판명됨)은 신피질, 해마, 치상회, 후 신경구, 선조체, 시상 및 소뇌에서 광범위하게 발현되는 140개 아미노산의 단백질이다. 알파-시누클레인은 또한 B-, T-, 및 NK 세포를 비롯하여 단백구 및 혈소판을 포함하는 조혈세포에서 높게 발현된다. 이러한 세포 내에서 알파-시누클레인의 정확한 역할은 알려지지 않았으나, 거핵구 (혈소판 전구체)의 분화와 관련이 있는 것으로 여겨지고 있다.
본 발명에서 "알파-시누클레인 응집체와 관련된 질환"은 시누클레인병 이라고 불리는 일군의 신경퇴행성 질환으로, 뉴런 및 교세포 (glia) 집단을 포함하는 병소에서 알파-시누클레인 응집체가 발견되는 특징을 가진다. 이러한 질환에는 파킨슨 질환, 파킨슨질환성 치매, 루이소체 치매, 알츠하이머 루이소체 질환, 복합성 알츠하이머 및 파킨슨 병, 다계통위축증 및 기타 다수의 신경축삭 질환을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서, 본원에 따른 항체는 파킨슨 병의 치료에 효과적으로 사용된다.
또한, 본 발명에 따른 항-α-syn/항 IGF1R 이중 특이 항체는, 항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하여, 항 α-syn 항체 또는 이의 항원결합단편을 혈액뇌 장벽을 통과할 수 있게 하여 뇌에서 그 작용을 발휘할 수 있도록 하며, 반감기를 연장하여 약효를 장기간 유지할 수 있도록 한다.
더욱이, 본 발명에 따른 항 α-syn/항 IGF1R 이중 특이 항체는 세포 표면의 IGF1R에 결합하지만 리간드의 결합에 영향을 주지 않으며, IGF1R을 통한 신호전달 경로에는 영향을 미치지 않는 특성을 가진다. 이에 IGF1R와 이의 리간드 결합 및 IGF1R를 통한 신호전달을 억제하지 않으므로 혈액 뇌 장벽을 통과하는 셔틀 수단으로 사용될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 항원결합 단편은, IGF1R (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor)을 특이적으로 인식하며, IGF1R, 특히 인간 IGF1R, 마우스 IGF1R, 랫트 IGF1R, 및 원숭이 IGF1R에 인식 및 결합하며, IGF1R의 리간드인 IGF-1, IGF-2, 및/또는 인슐린이 IGF1R에 결합하는 것을 방해하지 않고, IGF1R을 통한 신호전달을 저해하지 않으며, 트랜스사이토시스에 사용될 수 있어 혈액 내 장벽 통과능을 가지며, ADCC(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)를 갖지 않아 동물에 반복 투여했을 경우에도 뇌의 IGF1R 수준을 감소시키지 않아, 독성을 가지지 않는다.
특히, 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체는, BBB를 구성하는 뇌 내피세포 (brain endothelial cell)의 표면에 존재하는 IGF1R에 결합하여 세포 내부로 내재화(Internalization)된다.
예를 들어, 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체는 scFv 형태를 가질 수 있고, 다양한 방식으로 치료용 항체에 결합하여 제작될 수 있다. 예를 들면, 항-IGF1R 항체의 scFv는 치료용 항체, 예를 들면 α-syn 항체의 C-말단에 두 개가 결합한 이중특이항체, 즉 2가 (bivalent) 형태 이중 항체로, 혹은 한 개가 결합한 이중특이항체, 즉 1가 (monovalent) 형태 이중특이항체로 제작될 수 있으며, 해당 이중특이항체들은 모두 IGF1R을 발현하는 세포 안으로 internalize된다. 세포 표면의 항원에 대한 IGF1R 항체의 높은 결합력이 internalization 효과를 높이며, 이는 BBB 통과능으로 이어질 수 있다. 해당 항체가 BBB 통과능을 가지면서 IGF1R의 시그널링에 간섭을 줄 경우 부작용을 야기할 수 있는데, 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체는 BBB shuttle로서 기능할 수 있는 결합력을 가지면서 동시에 IGF1R 시그널에 대한 non-blocking 항체이다.
상기 항-IGF1R 항체 또는 항원결합 단편은 우수한 개발 용이성을 가진다. 이와 관련하여 상기 항-IGF1R 항체의 CDR 영역에 발생하여 항체의 안정성과 효능을 감소시키는 번역 후 변형 (post-translational modification), 예를 들면 탈아미드화(deamidation)을 제거하고자 하였다.
대안적으로, 상기 항체의 deamidation site 양 옆에 위치하는 아미노산 중 적어도 하나를 치환할 수 있고, 바람직하게는 항체의 deamidation site의 C 말단쪽 바로 옆 아미노산을 치환할 수 있다. 예를 들어 항체의 deamidation site에 위치하는 Asn 의 옆에 위치한 G을 A로 또는 Asn 옆에 위치한 S을 V으로 치환함으로써, parental 항-IGF1R 항체와 유사한 결합력을 가짐과 동시에 우수한 안정성과 BBB 통과능을 가지는 탈아미드화 항체를 제조할 수 있다.
추가적으로, 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체는 뇌에서 작용하는 생리활성물질과 연결되었을 때, 상기 생리활성물질 단독에 비하여 향상된 BBB 통과능 및 효능을 유도할 수 있다.
본 발명의 일례에 따른 항-IGF1R 항체는, 다양한 치료용 제2항체를 포함하는 이중특이항체로 활용될 수 있으며, 인간 iPSC 유래 in vitro BBB 시스템의 통과 실험에서, 치료 항체로만 구성된 단독항체에 비해 약 15배 높은 BBB 통과능을 보인다. 상기 이중 특이 항체에서 상기 제2항체에 결합된 항-IGF1R 항체가 1가(monovalent) 혹은 2가 (bivalent) 형태로 결합된 것일 수 있다. 예를 들면, 항-IGF1R 항체가 1가 또는 2가인 이중 특이 항체를 정상 랫트에 단회 투여 후 혈중 항체량 및 CSF에서의 항체량을 분석하였을 때, 항-IGF1R 항체가 1가 또는 2가인 이중 특이 항체는, parental 항-IGF1R 항체(1564 클론) 대비 최대 5배 증가된 혈중 항체량과 최대 5배 증가된 CSF 항체량을 보였다. Parental 항-IGF1R 항체(1564 클론) 대비 약 3배 증가된 CSF 및 약 4.5 배 증가된 brain 통과량을 나타낸다. 따라서, 상기의 방법으로 개선된 항-IGF1R 항체의 이중 특이 항체는, 치료용 제2항체로만 구성되는 단독항체 대비 최대 약 15배의 CSF 및 약 23배의 Brain 통과능을 보일 것으로 기대된다.
본 발명에 따른 항 IGF1R 항체는 IGF1R, 특히 인간, 원숭이, 랫트, 및 마우스을 포함하는 포유동물의 IGF1R에 결합하는 것이 확인되어, 약물 개발을 위한 스크리닝, 임상 시험등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 항원결합 단편은, IGF1R (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor)을 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명에 따른 항 IGF1R 항체 또는 항원결합 단편은 해리 상수(dissociation constant, KD)가 ≤ 1x10-6 M의 친화도로 결합할 때, 항원과 같은 이의 표적에 "특이적으로 결합한다" 라고 일컬어진다. 항체는 KD가 ≤ 1x 10-8 M일 때 혹은 EC50 (effective concentration 50)이 2 nM 이하일 때, 높은 친화성으로 표적에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 KD ≤ 1x10-8 로 IGF1R 또는 인간 IGF1R에 결합할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체의 결합 부위는 IGF1R 단백질, 예를 들면 인간 IGF1R 단백질의 세포 외 도메인(extracellular domain)일 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체, 예를 들면 1564 클론 항체의 인간 IGF1R 단백질에 대한 결합 부위는, 인간 IGF1R 단백질에서, 결합부위 1은 Y775, P776, F778, R650, S791, L798 및 Glu779을 포함하고, 결합부위 2는 L641, H808, E809 및 L813을 포함하고, 결합부위3은 V397, D435, W434, Y460 및 C488을 포함한다. 이에, 본 발명에 따른 IGF1R 항체의 에피토프는 conformational epitope로서 상기의 3개 결합부위를 모두 혹은 일부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 항원결합 단편은, IGF1R의 리간드인 IGF-1, IGF-2, 및/또는 인슐린이 IGF1R에 결합하는 것을 방해하지 않는다. 구체적으로, 상기 항 IGF1R 항체 또는 항원결합 단편은 IGF1R을 발현하는 세포에서 IGF1R의 리간드가 세포막에 위치하는 상기 IGF1R에 결합하는 것을 방해하지 않고 IGF1R를 통한 신호전달을 억제하지 않으며, 또한 세포 표면의 IGF1R 발현에도 영향을 미치지 않는 장점이 있다. 이에, 본 발명에 따른 항 IGF1R 항체 또는 항원 결합 단편은, 트랜스사이토시스를 통해 혈액 뇌 장벽을 통과하는 데 효과적으로 사용될 수 있다. IGF1R은 현재까지 주로 사용되는 BBB 통과능 향상을 위한, 뇌의 내피세포에서 그 발현된다고 알려진 다른 트랜스사이토시스 표적과 비교하여 IGF1R의 발현은 뇌에 상대적으로 높은 발현양을 보이는 것으로 나타났다. 일 구현예에서, IGF1R은 치료 항체의 BBB 통과능 향상 용도로 현재 개발되고 있는 다른 표적, 예를 들면, transferrin receptor, insulin receptor 등과 비교하였을 때, peripheral tissue, 예를 들면 간, 폐, 대장 등에 상대적으로 낮은 발현양을 보이는 것으로 나타났다.
IGF1R은 혈액 뇌 장벽(Blood Brain Barrier, BBB)을 통과하여 유용한 물질을 뇌의 내부로 전달할 수 있는 RMT(Receptor Mediated Transcytosis)의 표적이 되고 있다. 하지만 혈액 뇌 장벽 통과를 위한 약물 전달 표적으로 사용되기 위해서는, 세포 표면의 IGF1R에 결합하지만 리간드의 결합에 영향을 주지 않으며, IGF1R을 통한 신호전달 경로에는 영향을 미치지 않는 특성을 가져야 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 및 이의 항원 결합 단편은, IGF1R와 이의 리간드 결합 및 IGF1R를 통한 신호전달을 억제하지 않으므로 혈액 뇌 장벽을 통과하는 셔틀 수단으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 그 항원 결합 단편은 트랜스사이토시스(transcytosis)가 가능하며, 뇌의 내피세포를 통과할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체는 마우스에 혈관 주사한 경우, 마우스의 뇌혈관과 동일 자리에 위치한다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 항체 또는 항원결합 단편이 혈액 뇌장벽을 통과하는 약물 전달체로서 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
따라서, 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 그 항원 결합 단편은, 뇌에서 작용하는 생리활성물질이 혈액 뇌장벽을 통과할 수 있게 한다. 본 발명에서 생물학적 장벽은 세포, 조직, 막 또는 생물학적 분자의 효과적인 통과, 확산 또는 전달을 막는 세포, 막, 또는 구조를 말한다. 이러한 생물학적 장벽은 신경세포/조직, 결합조직, 근육, 막 또는 상피(예를 들면 점막 또는 혈관)세포를 포함한다. 대표적인 예로 혈액뇌장벽을 들 수 있다.
본 발명에서 "혈액 뇌 장벽" 또는 BBB는 뇌 및 척추와 그 주변 순환계사이에 존재하는 뇌의 모세혈관 내피세포 막내에 타이트 결합(junction)에 의해 형성된 장벽이다. 이러한 장벽은 매우 견고해서 약 60Da 분자량의 저분자 물질이 뇌로 통과하는 것도 제한한다. 뇌의 혈액 뇌장벽, 척추의 혈관척수장벽 그리고 망막의 혈관망막장벽은 중추신경계내의 연속적인 모세혈관 장벽으로, 통상 BBB로 칭한다.
본 발명에서 "혈액 뇌 장벽 전달체"는 이러한 혈액 뇌장벽을 통과하여, 상기 뇌 작동인자 물질을 전달할 수 있으며, 상기 뇌 작동인자 물질은 예를 들면, 화합물, 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질, 핵산, 항체, 또는 저분자 화합물을 포함한다.
본 발명은 IGF1R에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그 항원결합 단편에 관한 것으로서, 상기 항체 또는 항원결합단편은 중쇄의 상보성 결정부위와 경쇄의 상보성 결정부위를 포함하여, IGF1R에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
구체적인 일 예는, 항-IGF1R 항체 및 이의 항원결합단편은,
(i) 표 1에 기재된 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(ii) 표 1에 기재된 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
추가적으로, 상기 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합에서, 상기 중쇄 가변 영역은 H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 프레임워크를 포함할 수 있으며, 상기 경쇄 가변영역은 L-FR1, L-FR2, L-FR3, 및 L-FR4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 프레임워크를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 항 IGF1R 항체 내 아미노산의 Deamidation 발생의 제거로, 항원인 IGF1R의 ECD에 대한 결합력에 변화가 없으면서 공정 개발, 보관 등에 불리한 항체의 분해 (degradation) 위험성이 감소된다. 항 IGF1R 항체에서 deamidation이 제거되는 아미노산 위치는, 예를 들어 1564 (IgG), 1564 (scFv), 또는 1564-3에서 경쇄 LCDR2의 N51D, N51Q, S52V, LCDR3의 N95aK, N95aH, N95aR, N95aD, G95bA 또는 중쇄의 HCDR2에서 N54D, N54Q 또는 G55A일 수 있다. deamidation 제거는 위에서 언급된 클론에만 한정되지 않으며 표 14에 기재된 방법에 따라 다른 클론들에 대해서도 가능하다.
항-IGF1R항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 CDR
clone ID/SEQ ID No. H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
1564 (IgG) 1 2 8 20 21 24
1564 (scFv) 1 2 8 20 21 24
1564-3 1 2 8 20 21 24
1564-DM 1 3 8 20 22 25
1564-DMP 1 3 8 20 22 25
VH5-DM 1 4 8 20 22 25
VH5-DMP 1 4 8 20 22 25
F06-DM 1 3 8 20 22 26
F06-DMP 1 3 8 20 22 26
F06 (de2)(StoP) 1 5 8 20 23 27
VH5(de2)(StoP) 1 6 9 20 23 28
VH16(de2)(StoP) 1 7 8 20 23 28
1564(de2)(StoP) 1 5 8 20 23 28
VH2 (scFv) 10 11 19 20 21 24
VH2-3 10 11 19 20 21 24
VH2-DM 10 12 19 20 22 25
VH2-DMP 10 12 19 20 22 25
VH5 (scFv) 1 13 9 20 21 24
VH5-3 1 13 9 20 21 24
VH7 (scFv) 10 14 8 20 21 24
VH7-3 10 14 8 20 21 24
VH7-DM 10 15 8 20 22 25
VH7-DMP 10 15 8 20 22 25
VH9 (scFv) 1 16 8 20 21 24
VH9-3 1 16 8 20 21 24
VH9-DM 1 17 8 20 22 25
VH9-DMP 1 17 8 20 22 25
VH16 (scFv) 1 11 8 20 21 24
VH16-3 1 11 8 20 21 24
VH16-DM 1 12 8 20 22 25
VH16-DMP 1 12 8 20 22 25
VH32 (scFv) 10 18 19 20 21 24
VH32-3 10 18 19 20 21 24
VH32-DM 10 3 19 20 22 25
VH32-DMP 10 3 19 20 22 25
VH35 (scFv) 1 14 9 20 21 24
VH35-3 1 14 9 20 21 24
VH35-DM 1 15 9 20 22 25
VH35-DMP 1 15 9 20 22 25
C04 (scFv) 1 18 8 20 21 29
C04-3 1 18 8 20 21 29
C04-DM 1 3 8 20 22 30
C04-DMP 1 3 8 20 22 30
F06 (scFv) 1 18 8 20 21 31
F06-3 1 18 8 20 21 31
주요 항-IGF1R항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 CDR 서열
clone ID H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
F06-DMP GFTFSSYDMS AISYDQGNTYYADSVKG GVLTTLMNWFDY TGSSSNIGSNDVS AQSNRPS GTWAGSLHGYV
SEQ ID NO 1 3 8 20 22 26
F06 (de2)(StoP) GFTFSSYDMS AISYDNANTYYADSVKG GVLTTLMNWFDY TGSSSNIGSNDVS ANVNRPS GTWAGSLNAYV
SEQ ID NO 1 5 8 20 23 27
VH16(de2)(StoP) GFTFSSYDMS AISGSNANTYYADSVKG GVLTTLMNWFDY TGSSSNIGSNDVS ANVNRPS GAWDDSLNAYV
SEQ ID NO 1 7 8 20 23 28
1564(de2)(StoP) GFTFSSYDMS AISYDNANTYYADSVKG GVLTTLMNWFDY TGSSSNIGSNDVS ANVNRPS GAWDDSLNAYV
SEQ ID NO 1 5 8 20 23 28
상기 항 IGF1R 항체는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하며, 상기 중쇄가변영역은, 서열번호 1 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (H-CDR1), 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 11 내지 18의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 중쇄 CDR2 (H-CDR2), 서열번호 8 내지 9 및 서열번호 19의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 중쇄 CDR3 (H-CDR3)를 포함하며,
상기 경쇄가변영역은, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (L-CDR1), 서열번호 21 내지 23의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 경쇄 CDR2 (L-CDR2), 및 서열번호 24 내지 28 및 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 경쇄 CDR3 (L-CDR3)를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 항 IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하며,
상기 중쇄가변영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (H-CDR1), 서열번호 3 및 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열중에서 선택된 하나를 포함하는 중쇄 CDR2 (H-CDR2), 및 서열번호 8 내지 9의 아미노산 서열중에서 선택된 하나를 포함하는 중쇄 CDR3 (H-CDR3)을 포함하며,
상기 경쇄가변영역은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (L-CDR1), 서열번호 22 및 23의 아미노산 서열중에서 선택된 하나를 포함하는 경쇄 CDR2 (L-CDR2), 및 서열번호 26 내지 28의 아미노산 서열중에서 선택된 하나를 포함하는 경쇄 CDR3 (L-CDR3)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 항 IGF1R 항체의 중쇄 가변 영역은 하기 표 1에 기재된 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하거나, 추가로 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 H-FR1, 서열번호 33 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 H-FR2, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 H-FR3, 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 H-FR4를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항 IGF1R 항체의 경쇄 가변 영역은 하기 표 1에 나타낸 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하거나, 추가로 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 L-FR1, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 L-FR2, 서열번호 39 또는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 L-FR3, 및 서열번호 41 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 L-FR4를 포함할 수 있으며, 구체적 예시는 표 3에 나타낸 L-FR1, L-FR2, L-FR3, 및 L-FR4의 경쇄 프레임워크를 포함할 수 있다.
상기 중쇄 또는 경쇄의 프레임워크 1 내지 4 중에서, 프레임워크 1(FR1)은 CDR1의 N-말단쪽에 위치하고, 프레임워크 2(FR2)은 CDR1과 CDR2 사이에 위치하고, 프레임워크 3(FR3)은 CDR2와 CDR3 사이에 위치하고, 프레임워크 4(FR4)는 CDR3의 C-말단에 위치한다.
구체적으로, 1564 (IgG) 클론의 중쇄 가변영역의 프레임워크 서열은 서열번호 32, 33, 35 및 36의 아미노산 서열을 포함하며, 표 1에 기재된 클론 중에서 1564 (IgG) 클론을 제외한 나머지 클론은 서열번호 32, 34, 35 및 36의 아미노산 서열을 포함한다.
구체적으로 본 발명에 따른 항-IGF1R항체의 경쇄 가변영역의 프레임워크 서열은 하기 표 3에 나타낸 것과 같다.
항-IGF1R항체의 경쇄 가변영역의 프레임워크 서열
clone ID L-FR1SEQ ID NO L-FR2SEQ ID NO L-FR3SEQ ID NO LFR4SEQ ID NO
1564 (IgG) 37 38 39 41
1564 (scFv) 37 38 40 42
1564-3 37 38 39 42
1564-DM 37 38 40 42
1564-DMP 37 38 39 42
VH05-DM 37 38 40 42
VH05-DMP 37 38 39 42
F06-DM 37 38 40 42
F06-DMP 37 38 39 42
F06(de2)(StoP) 37 38 39 42
VH5(de2)(StoP) 37 38 39 42
VH16(de2Stop) 37 38 39 42
1564(de2)(StoP) 37 38 39 42
VH2 (scFv) 37 38 40 42
VH2-3 37 38 39 42
VH2-DM 37 38 40 42
VH2-DMP 37 38 39 42
VH5 (scFv) 37 38 40 42
VH5-3 37 38 39 42
VH7 (scFv) 37 38 40 42
VH7-3 37 38 39 42
VH7-DM 37 38 40 42
VH7-DMP 37 38 39 42
VH9 (scFv) 37 38 40 42
VH9-3 37 38 39 42
VH9-DM 37 38 40 42
VH9-DMP 37 38 39 42
VH16 (scFv) 37 38 40 42
VH16-3 37 38 39 42
VH16-DM 37 38 40 42
VH16-DMP 37 38 39 42
VH32 (scFv) 37 38 40 42
VH32-3 37 38 39 42
VH32-DM 37 38 40 42
VH32-DMP 37 38 39 42
VH35 (scFv) 37 38 40 42
VH35-3 37 38 39 42
VH35-DM 37 38 40 42
VH35-DMP 37 38 39 42
C04 (scFv) 37 38 40 42
C04-3 37 38 39 42
C04-DM 37 38 40 42
C04-DMP 37 38 39 42
F06 (scFv) 37 38 40 42
F06-3 37 38 39 42
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체는, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체일 수 있으며, 본 명세서에 개시된 다양한 중쇄 및 경쇄 가변영역은 표 4와 표 5에 예시적으로 기재된다. 하기 표 4와 표 5에 기재된 상기 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역은 다양한 형태의 항체의 제조를 위해 자유롭게 조합될 수 있다. 이러한 각각의 가변영역은 온전한 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위해 상기 중쇄 및 경쇄 불변영역에 결합될 수 있다.
항-IGF1R항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역
clone ID/SEQ ID No VH VL clone ID/SEQ ID No VH VL
1564 (IgG) 43 88 VH9 (scFv) 66 111
1564 (scFv) 44 89 VH9-3 67 112
1564-3 45 90 VH9-DM 68 113
1564-DM 46 91 VH9-DMP 69 114
1564-DMP 47 92 VH16 (scFv) 70 115
VH05-DM 48 93 VH16-3 71 116
VH05-DMP 49 94 VH16-DM 72 117
F06-DM 50 95 VH16-DMP 73 118
F06-DMP 51 96 VH32 (scFv) 74 119
F06(de2)(StoP) 52 97 VH32-3 75 120
VH5(de2)(StoP) 53 98 VH32-DM 76 121
VH16(de2Stop) 54 99 VH32-DMP 77 122
1564(de2)(StoP) 55 100 VH35 (scFv) 78 123
VH2 (scFv) 56 101 VH35-3 79 124
VH2-3 57 102 VH35-DM 80 125
VH2-DM 58 103 VH35-DMP 81 126
VH2-DMP 59 104 C04 (scFv) 82 127
VH5 (scFv) 60 105 C04-3 83 128
VH5-3 61 106 C04-DM 84 129
VH7 (scFv) 62 107 C04-DMP 85 130
VH7-3 63 108 F06 (scFv) 86 131
VH7-DM 64 109 F06-3 87 132
VH7-DMP 65 110 ** ** **
주요 항-IGF1R항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역
clone ID VH VL
F06-DMP EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVSAISYDQGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVLTTLMNWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 51) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNDVSWYQQLPGTAPKLLIYAQSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWAGSLHGYVFGCGTKLTVL(SEQ ID NO: 96)
F06(de2)(StoP) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVSAISYDNANTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVLTTLMNWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 52) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNDVSWYQQLPGTAPKLLIYANVNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWAGSLNAYVFGCGTKLTVL(SEQ ID NO: 97)
VH16(de2Stop) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSNANTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVLTTLMNWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 54) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNDVSWYQQLPGTAPKLLIYANVNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDDSLNAYVFGCGTKLTVL(SEQ ID NO: 99)
1564(de2)(StoP) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKCLEWVSAISYDNANTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVLTTLMNWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 55) QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNDVSWYQQLPGTAPKLLIYANVNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDDSLNAYVFGCGTKLTVL(SEQ ID NO: 100)
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역은, 더욱 자세하게는 서열번호 43 내지 서열번호 87의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역은, 서열번호 88 내지 서열번호 132의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나를 포함할 수 있다. 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 예는 상기 표 4 및 표 5에 기재되어 있다. 상기 항 IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 174의 아미노산 서열을 갖는 사람의 IGF1R 단백질에서 Y775, P776, F778, R650, S791, L798, Glu779, L641, H808, E809, L813, V397, D435, W434, Y460 및 C488로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산을 특이적으로 인식하여 결합하는 것인 항 IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항 IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 인간 IGF1R 에 관한 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에서 결합 부위 1 내지 결합 부위 3으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 결합부위에 결합하는 것이며, 상기 결합부위 1은 Y775, P776, F778, R650, S791, L798 및 Glu779로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 결합부위 2는 L641, H808, E809 및 L813로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 결합부위 3은 V397, D435, W434, Y460 및 C488로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
상기 표 4 및 표 5에 기재된 중쇄 가변영역 및 경쇄 각 가변영역은 각각 별도의 도메인 항체로 사용되거나, 서로 자유롭게 조합되어 다양한 항체를 형성할 수 있고, 단일사슬 형태로 연결되어 scFv와 같은 단쇄 항체를 형성할 수도 있다.
본 발명에서 "도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 및/또는 경쇄의 가변 영역만을 포함하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다. 일 구현예에서는 2개 이상의 VH 영역이 펩타이드 링커에 의한 공유결합으로 연결되어, 2가의 도메인 항체를 형성한다. 이러한 2가 도메인 항체의 2개의 VH 영역은 동일 또는 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 항 IGF1R 항체의 항원 결합 단편은, 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디 및 디아바디 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 항원 결합 단편 중에서 Fab는 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 Fab는에서 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다. F(ab')2 항체는 2개의 Fab'가 Fab' 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 단쇄 Fv (single-chain variable fragment, scFv) 및 이중쇄 Fv(two-chain variable fragment)을 포함한다. 이중쇄 Fv는 비공유 결합으로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 연결될 수 있다. 단쇄 Fv는, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변 영역이 직접 또는 펩타이드 링커를 통하여 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 scFv 다이머와 같은 구조(di-scFv)를 이룰 수 있다. 본 발명에서 단쇄 Fv는 중쇄 및 경쇄 가변영역이 직접 또는 링커에 의해 연결된 항원 결합 영역의 단일 폴리펩타이드 사슬로서, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 단일 사슬 형태로 연결된 scFv, scFv 다이머와 같은 구조(di-scFv), 및 중쇄가변영역, 경쇄가변영역, 및 Fc가 단일사슬 형태로 연결된 scFv-Fc 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 펩타이드 링커는 앞서 설명한 바와 같을 수 있으며, 예컨대, 1 내지 100개, 예컨대 2 내지 50개 또는 5 내지 25개 아미노산 길이의 것일 수 있으며, 상기 펩타이드 링커는 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 상기 펩타이드 링커에 포함된 아미노산 종류는 예컨대, Gly, Ser 및 Leu으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 구성될 수 있으며, 구체적인 예로서, Gly과 Ser 잔기로 구성되거나, 류신(Leu)과 세린(Ser)로 구성될 수 있다. 구체적 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n일 수 있으며, 상기 n은 (G4S)의 반복수로서 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5, 특히 3또는 4의 정수로 표현되는 것일 수 있다. 상기 펩타이드 링커의 일 예는, 서열번호 133 또는 134의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 일 수 있다.
서열번호 133: GGGGSGGGGSGGGGS
서열번호 134: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
이러한 단쇄 Fv(scFv)는 2개의 가변 도메인 폴리펩타이드(VL 및 VH)를 코딩하는 DNA 사이에 펩타이드 링커를 코딩하는 DNA를 융합함으로써 제조될 수 있다. 제조된 폴리펩타이드는 접힘에 의해 항원-결합 단량체를 형성하거나, 또는 2개의 가변 도메인 사이에 유연성 링커의 길이에 따라, 다량체(예를 들면, 이량체, 삼량체 또는 사량체)를 형성할 수 있다. 상이한 VL과 VH을 포함하는 폴리펩타이드를 조합함으로써, 상이한 에피토프에 결합하는 다량체성 scFv를 형성할 수 있다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
본 발명에 개시된 단쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 도메인 조합을 포함하는 scFv, 또는 CDR을 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 조합이 포함되지만 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 항 IGF1R 항체의 항원결합단편는, 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 앞서 설명한 바와 같을 수 있다.
상기 이중 특이 항체에서, 항 IGF1R 항체 및 이의 항원결합단편은, 결합된 상이한 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 제2 항체 또는 이의 항원결합단편을 혈액 뇌 장벽을 통과시켜 뇌로 전달시키는 기능을 수행할 수 있다. 상기 제2항체는 뇌에서 효능을 발휘하는 항체일 수 있으나 특별히 한정되는 것은 아니나, 본 발명에 따른 항 알파-시누클레인 항체 또는 이의 결합 단편일 수 있다.
본 발명에 항 IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상이한 제2 항체와 특정 영역 또는 서열을 공유할 수 있다. 예를 들면 항 IGF1R 항체는 제2항체의 항체 또는 항원결합단편의 불변영역을 공유하거나, Fc 영역을 공유할 수 있다.
또한, 본 발명에서 이중 특이적 항체의 구조는, 완전한 면역글로불린의 2개 중쇄의 Fc영역, 예를 들면 중쇄의 말단에 직접 또는 링커를 매개로 각 Fc에 항 IGF1R 항체의 scFv가 연결된 형태인 bivalent form 이중항체와, 완전한 면역글로불린의 2개 중쇄중에서 1개 중쇄의 말단에만 직접 또는 링커를 매개로 항 IGF1R 항체의 scFv 가 연결된 형태인 monovalent 이중항체를 모두 포함하나, monovalent 이중항체가 바람직하다.
구체적으로, 본 발명의 일예에서 monovalent form의 클론이 bivalent form의 클론보다 반감기가 향상되는 경우가 있으며, 이 때 monovalent form 클론의 구조는 온전한 면역글로불린의 형태에서 1개의 중쇄 말단에만 링커로 IGF1R에 결합하는 도메인항체(scFv)가 연결된 형태이다. 예를 들어, 온전한 면역글로불린 형태에서 1개의 중쇄에는 C 말단에 링커가 포함된 IGF1R 항원에 결합하는 도메인항체가 연결되어 있으며, 나머지 1개의 중쇄에는 불변영역 C 말단 뒤에 어떠한 것도 연결되어 있지 않은 두 가지 서로 다른 중쇄를 포함한 Knob-In-hole 기법이 적용된 이종 이량체의 형태일 수 있다.
상기 이중 특이 항체에 있어서, 항 IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 상기 제2항체는, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 상기 제2항체는, 완전한 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 항체 모방체(또는 합성 항체), 항체 융합체(또는 항체 접합체), 및 이의 단편을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 상기 이중 특이 항체에 있어서, 항 IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합하는 상기 제2항체의 일 예는 본 발명에 따른 항-syn 항체 및 이의 항원결합 단편일 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 항-syn 항체 및 이의 항원결합 단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 제공되는 항체가 항원으로 인식하는 알파-시누클레인은 인간 알파-시누클레인, 원숭이 알파-시누클레인 (예컨대, Rhesus 알파-시누클레인), 마우스 알파-시누클레인, 래트 알파-시누클레인 등의 포유동물 알파-시누클레인 들 중에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 알파-시누클레인은 알파-시누클레인 (NCBI ID: NP_000336) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.　 본 명세서에 다르게 언급되지 않는 한, 알파-시누클레인은 인간 알파-시누클레인을 지칭하는 것일 수 있고, 본 명세서에서 제공되는 항체 또는 이의 항원결합단편은 인간 알파-시누클레인 뿐만 아니라 원숭이(예컨대, Rhesus), 래트, 및/또는 마우스 알파-시누클레인에도 특이적인 결합능을 갖는 것일 수 있다.
상기 항체 또는 이의 항원결합단편이 결합하는 알파-시누클레인의 C-말단 부위에 결합하며, 구체적으로 인간 알파-시누클레인 단백질은 서열번호 173의 아미노산 서열에서, C-말단 영역, 예를 들면 110번 잔기 내지 120번 잔기 또는 111번 잔기 내지 122번 잔기를 포함하는 연속하는 적어도 11개 또는 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 포함하는 C-말단 영역일 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원결합단편은, 상기 항원인식부위를 인식하여 알파-시누클레인 응집체에 대한 높은 친화도로 결합하는 것이 확인되었다.
본 명세서에서, "알파-시누클레인 단백질 또는 알파-시누클레인 응집체에 특이적 결합한다"함은 알파-시누클레인 단백질 또는 알파-시누클레인 응집체에 대한 친화도가 다른 항원과 비교하여 상대적으로 높은 것을 의미하는 것으로, 예컨대, 알파-시누클레인 응집체, 구체적으로, 아밀로이드 피브릴(amyloid fibrils), 프로토피브릴(protofibrils) 및 올리고머(oligomers), 특히 아밀로이드 피브릴에 대해 친화도가 Octet 및 SPR 분석에서 각각 해리 상수(KD) 0.1 x 10-10 M 내지 2 x 10-10 M, 또는 0.05 x 10-10 M 내지 0.3x10-9 M이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일예에 따른 경쇄 및 중쇄를 포함하는 인간화 알파-시누클레인 항체, 예를 들면 Hu11F11(ver.2)의 경우, 키메릭 알파-시누클레인항체에 비하여 높은 식세포 작용 촉진 활성을 나타낸다. Hu11F11(ver.1), Hu11F11(ver.2), Hu11F11(ver.3), Hu11F11(ver.4), ABL2-4의 경우, 키메릭 알파-시누클레인 항체에 비하여 피브릴의 신경세포막 결합에 대한 높은 억제능을 보이며, Hu11F11(ver.2), Hu11F11(ver.4), ABL2-4의 경우, 키메릭 알파-시누클레인 항체 대비, 알파-시누클레인 과발현 세포로부터 분비된 알파-시누클레인의 다른 신경세포로의 전파에 대한 높은 억제능을 나타낸다. 알파-시누클레인 응집체에 대한 결합력, 예를 들면 cell-based assay에서는 측정한 결합력은 키메릭 알파-시누클레인 항체와 유사하거나 우수한 활성을 갖는다.
본 발명에 따른 알파-시누클레인 항체는 적용 대상(subject)의 신경계에서 신경세포 밖으로 분비된 알파-시누클레인 응집체가 세포 외 공간(extracellular space)에서 다른 정상 세포로 이동하여 해당 신경세포를 일종의 감염시키는 작용을 억제하며 (inhibit cell-to-cell transmission of aggregates), 또한, 미세교세포가 세포 외 공간에 위치하는 알파-시누클레인 응집체에 대한 식세포 작용 촉진능을 가진다. 알파-시누클레인 응집체는 프리온처럼 한 세포에서 다른 세포로 전파되면서 해당 정상 세포 내에도 알파-시누클레인, 특히 알파-시누클레인 응집체가 뇌 전반으로 퍼져나가면서 시누클레인병을 초래한다. 따라서, 알파-시누클레인 응집체는 뇌 신경세포에 독성이 있으며, 뇌 신경세포 사멸 (neurodegeneration), 뇌염증 반응 (neuroinflammation)을 일으키는 것으로 잘 알려져있다. 따라서 알파-시누클레인 응집체가 뇌의 여러 부위에 퍼져나가면서 뇌세포 사멸과 뇌염증 반응이 증가할 것이며, 이로 인하여 시누클레인병, 예를 들면 파킨슨 병이 진행되면서 확인되는 뇌세포 사멸 및 이로 인한 행동, 인지 기능의 장애가 나타난다.
이에, 본 발명의 알파-시누클레인 항체는 알파-시누클레인 또는 알파-시누클레인 응집체의 신경세포간 이동을 억제하여 알파-시누클레인 응집체가 뇌의 다양한 영역으로 퍼져나가는 현상을 방지할 수 있으며, 또한, 미세교세포의 식세포 작용을 촉진하여, 대상 신경계에서 신경세포 외부에 존재하는 알파-시누클레인 응집체 자체의 감소 또는 제거를 통해 시누클레인병의 중요한 원인인 알파-시누클레인 응집체의 수준을 감소시켜, 뇌 신경세포 사멸 및 뇌 염증 반응을 줄이고 나아가서 시누클레인병, 예컨대 파킨슨 병의 증상 및 병의 진행을 개선, 경감 또는 예방하는 효과를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 알파-시누클레인 항체는 (i) 알파-시누클레인 또는 알파-시누클레인 응집체의 신경세포간 이동을 억제, 및 (ii) 미세교세포의 식세포 작용을 촉진을 통한 뇌 신경계의 알파-시누클레인 응집체의 수준 감소와 관련하여 두 가지 기능을 모두 수행할 수 있는 점에서 우수한 활성을 가진다. 특히, 현재까지 임상 시험이 진행중이거나 논문에 공개된 알파-시누클레인 항체들은 상기 (i) 및 (ii) 활성 중에서 한 가지 활성을 가지므로, 이는 본원의 알파-시누클레인 항체는 알려진 알파-시누클레인 항체에 비해 우수한 시누클레인병의 예방 또는 치료에 장점이 있음을 나타낸다. 따라서, 본원 발명에 따른 알파-시누클레인 항체는 알파-시누클레인 응집체의 제거 및 감소와, 병인으로서의 작용을 억제하는 효능이 더욱 우수하고, 따라서 시누클레인병 또는 이와 관련한 증상적 질병 (예, 인지 장애 등)에 더욱 효과적이다.
알파-시누클레인 응집체에 대한 높은 친화도를 갖는 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 알파-시누클레인 응집체 형성을 감소시킬 수 있어 뇌의 응집체의 농도를 낮출 수 있다. 또한 알파-시누클레인 응집체에 대한 높은 친화도를 갖는 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 중추신경계 바깥에서의 알파-시누클레인 응집체 형성을 감소시킬 수 있어, 결국 뇌혈관장벽을 경계로한 알파-시누클레인 형태들 간의 평형상태를 변경시켜, 중추신경계 내의 응집체의 농도를 낮추는 효과를 가져올 수 있다. 이는 항체를, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 보다 간편한 피하주사와 같은 방식으로 투여해도 충분한 효능을 얻을 수 있기 때문에, 임상에서 큰 장점이 있다.
본원에 따른 항체 또는 항원 결합단편은 단량체의 제거를 통한 응집체 형성 억제, 또는 단량체와 응집체를 모두 제거할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 알파-시누클레인 단백질 또는 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편은 자연적으로 생산된 것이 아닐 수 있다 (non-natyurally ocurring; 예컨대, 화학적 합성 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다). 상기와 같은 재조합 기술은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명에 따른 알파-시누클레인 항체 또는 이를 포함하는 이중특이항체는 α-synucleinopathy의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 α-synucleinopathy는 파킨슨 질환(Parkinson's disease, PD), 파킨슨질환성 치매(Parkinson's disease dementia, PDD), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies, DLB), 알츠하이머 루이소체 질환(Lewy body variant of Alzheimer's disease (LBV)), 복합성 알츠하이머 및 파킨슨 병(Combined Alzheimer's and Parkinson disease), 또는 다계통위축증(multiple system atrophy, MSA)를 포함하는 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 알파-시누클레인 또는 이의 응집체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 단편은, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 상보성 결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은 하기 CDR 서열을 포함할 수 있다:
서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (H-CDR1),
서열번호 136 또는 137의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (H-CDR2),
서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (H-CDR3),
서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (L-CDR1),
서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 (L-CDR2), 및
서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (L-CDR3).
상기 중쇄 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열과 경쇄 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열을 표 6 및 표 7에 정리하였다. 표 7에 나타낸 Hu11F11-VLv3 4c 및 Hu11F11-VL4의 경쇄는 CDR 1 내지 CDR3의 아미노산 서열은 동일하나, 프레임워크 서열이 상이하다.
항α-syn항체의 중쇄 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열
Clone SEQ ID VH_CDR1 SEQ ID VH_CDR2 SEQ ID VH_CDR3
Hu11F11-VH-v1 135 GFTFSDFYME 136 ASRNKANDYTTEYSASVKG 138 DAHGKPFAY
Hu11F11-VH-v2 135 GFTFSDFYME 136 ASRNKANDYTTEYSASVKG 138 DAHGKPFAY
Hu11F11-VH-v3 135 GFTFSDFYME 136 ASRNKANDYTTEYSASVKG 138 DAHGKPFAY
Hu11F11-VH-v4 135 GFTFSDFYME 136 ASRNKANDYTTEYSASVKG 138 DAHGKPFAY
Hu11F11-VH2 135 GFTFSDFYME 137 AIRNKANDYTTEYAASVKG 138 DAHGKPFAY
항α-syn항체의 경쇄 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열
Clone SEQ ID NO VL_CDR1 SEQ ID NO VL_CDR2 SEQ ID NO VL_CDR3
Hu11F11-VLv3 4c 139 KSSQSLLYSSNQKNYLA 140 WASTRES 141 QQYYSYPWT
Hu11F11-VL4 139 KSSQSLLYSSNQKNYLA 140 WASTRES 141 QQYYSYPWT
본 명세서에 개시된 다양한 중쇄 및 경쇄 가변영역은 온전한 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위해 상기 중쇄 및 경쇄 불변영역에 결합될 수 있다. 또한, 이렇게 생성된 각각의 중쇄 및 경쇄 서열은 또한 완전한 항체 구조를 형성하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항-알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은, 서열번호 142 내지 서열번호 146의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 147 내지 서열번호 148의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄가변영역과 경쇄가변영역의 예시적인 서열을 하기 표 8에 나타낸다.
항 α-syn 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역
clone Chain SEQ ID NO Amino acid sequence
Hu11F11-VH-v1 VH 142 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFAYWGQGTTVTVSS
Hu11F11-VH-v2 VH 143 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTVSRDDSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFAYWGQGTTVTVSS
Hu11F11-VH-v3 VH 144 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTISRDTSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFAYWGQGTTVTVSS
Hu11F11-VH-v4 VH 145 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFTVSRDTSKSSLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDAHGKPFAYWGQGTTVTVSS
Hu11F11-VH2 VH 146 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIAAIRNKANDYTTEYAASVKGRFTISRDTSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAHGKPFAYWGQGTLVTVSS
Hu11F11-VLv3 4c VL 147 DIVMTQSPSSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDVAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK
Hu11F11-VL4 VL 148 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPWTFGQGTKVEIK
또한, 일 구현예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 조합을 통한 예시적인 항체를 표 9에 기재하였다.
본 발명의 예시적 항 α-syn 항체
클론명 각 클론을 구성하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 SEQ ID NO
hu11F11(ver.1) Hu11F11-VH-v1 142
Hu11F11-VLv3 4c 147
hu11F11(ver.2) Hu11F11-VH-v2 143
Hu11F11-VLv3 4c 147
hu11F11(ver.3) Hu11F11-VH-v3 144
Hu11F11-VLv3 4c 147
hu11F11(ver.4) Hu11F11-VH-v4 145
Hu11F11-VLv3 4c 147
hu11F11(H2L4) Hu11F11-VH2 146
Hu11F11-VL4 148
다른 구현예에서, 항-알파-시누클레인 항체는 상기 기재된 경쇄 또는 중쇄만으로 이루어진 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 항-알파-시누클레인 항체는 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역만으로 이루어진 것일 수 있다. 또 다른 구현예에서 상기 표 8에 개시된 중쇄 가변영역 및 경쇄 각 가변영역은 조합되어 다양한 항체를 형성할 수 있고, 단일사슬 형태로 연결되어 scFv와 같은 단쇄 항체를 형성할 수도 있다.
본 명세서에 개시된 항체는 본 명세서에 개시된 다른 항체와 특정 영역 또는 서열을 공유한다. 일 구현예에서는 항체 또는 항원결합단편의 불변영역을 공유할 수 있다. 다른 구현예에서는 Fc 영역을 공유할 수 있다.
상기 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄 및 상기 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 중쇄 불변영역및 경쇄 불변영역에 결합될 수 있으며, 상기 중쇄 및 경쇄 서열은 또한 온전한 항체 구조를 형성하기 위해 조합될 수 있다.
본 발명에 따른 가변 영역과 조합될 수 있는 이러한 불변 영역 서열은 예시적이며, 상기 불변영역은 면역글로불린 (예컨대, 인간 면역글로불린)의 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역에서 적절히 선택될 수 있다. 예컨대, 중쇄 불변영역은 IgG1 중쇄 불변영역, IgG3 중쇄 불변영역, 또는 IgG4 중쇄 불변영역일 수 있고, 경쇄 불변영역은 카파 불변영역 또는 람다 경쇄 불변영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에 따른 항 α-syn 항체 또는 항원 결합 단편의 가변영역 및 불변영역을 포함하는 예시적인 항체로서, 항-알파-시누클레인 항체 hu11F11(ver.2) 클론은 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 150의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 항체일 수 있다,
본원에 따른 항 알파-시누클레인 항체는 치료항체로서 단독으로 사용하기도 하지만, 혈액 뇌 장벽을 통과시켜 뇌로 전달시키는 기능을 수행할 수 있는 다른 항체와 조합하여 이중 특이 항체로 사용될 수 있다. 상기 혈액 뇌 장벽을 통과시켜 뇌로 전달시키는 기능을 수행할 수 있는 항체의 일 예는 항 IGF1R 항체 및 이의 항원결합단편일 수 있다. 이중 특이 항체를 제조할 수 있는, 항 IGF1R 항체 및 이의 항원결합단편은, 상술한 항 IGF1R 항체 및 이의 항원 결합 단편을 모두 포함할 수 있으며, 예를 들면 완전한 항체일 수 있고, 상기 항원결합 단편은 도메인 항체, scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 항 IGF1R 항체의 항원결합단편은, 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 앞서 설명한 바와 같을 수 있다.
본 발명에 따른 항 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이중 특이 항체의 제조에 이용될 수 있으며, 이중 특이 항체의 제조를 위한 중쇄 조합물의 제조에 사용되는 항 알파-시누클레인 항체의 중쇄의 예시는, 항 알파-시누클레인 항체 hu11F11(ver.2)에 관한 것으로서, 서열번호 149의 아미노산 서열을 갖는 hu11F11(ver.2) (IGG), 서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 hu11F11(ver.2)(IGG) WITH HOLE MUTATION AT FC 을 포함할 수 있다.
상술한 항 알파-시누클레인 항체 hu11F11(ver.2)을 포함하여 이중 특이 항체의 제조를 위한 중쇄 조합물의 제조에 사용되는 항 알파-시누클레인 항체의 중쇄의 예시는 하기 표 10에 기재되어 있으며, 이들 중쇄 서열은 서열번호 151 내지 서열번호 172에 표시하였으며, 이에 한정되지 않는 의도이다. 또한, 상기 항 알파-시누클레인 항체의 중쇄를 이용한 중쇄 조합물과 경쇄를 조합한 이중 특이항체 클론의 구체적 성분을 하기 표 10에 나타낸다. 아래 제시된 이중항체는 예시적으로 기재된 것으로, 서열번호로 표시되지 않은 경우라도 이중항체 중쇄조합물의 설명으로부터 구성이 명확하다. 예시적 이중 특이 항체은 하기 표 10에 구체적으로 나타낸다.
이중항체 클론명 이중항체 경쇄 이중항체 중쇄조합물 SEQ ID 이중항체 중쇄조합물 구성설명
hu11F11(ver.2)-1564 (scFv) monovalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)-1564-2 monovalent (HC 1, -hole) 158 hu11F11(ver.2 (IGG) WITH HOLE MUTATION AT FC,
(G4S)3,
1564 (scFv) VL,
(G4S)4,
1564 (scFv) VH
hu11F11(ver.2)-1564 monovalent (HC 2, -knob) 152 hu11F11(ver.2 (IGG) WITH KNOB MUTATION
hu11F11(ver.2)-VH5 bivalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)-VH5 bivalent (HC) * hu11F11(ver.2 (IGG),
(G4S)3,
VH5 VL,
(G4S)4,
VH5 VH
hu11F11(ver.2)-VH16 bivalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)-VH16 bivalent (HC) * hu11F11(ver.2 (IGG),
(G4S)3,
VH16 VL,
(G4S)4,
VH16 VH
hu11F11(ver.2)-F06-DM monovalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)(M428L)-F06-DM monovalent (HC 1, -hole) 165 hu11F11(ver.2 (IGG), M428L, HOLE MUTATION,
(G4S)3,
F06-DMP VL,
(G4S)4,
F06-DMP VH
hu11F11(ver.2)(M428L)-F06 monovalent (HC 2, -knob) 155 hu11F11(ver.2 (IGG),M428L MUTATION, KNOB MUTATION
hu11F11(ver.2)-F06-DMP monovalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2) -F06-DMP monovalent (HC 1, -hole) * hu11F11(ver.2 (IGG), HOLE MUTATION,
(G4S)3,
F06-DMP VL,
(G4S)4,
F06-DMP VH
hu11F11(ver.2) -F06 monovalent (HC 2, -knob) * hu11F11(ver.2 (IGG), KNOB MUTATION
hu11F11(ver.2)(M428L)-F06-DMP monovalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)(M428L)-F06-DMP monovalent (HC 1, -hole) 164 hu11F11(ver.2 (IGG), M428L, HOLE MUTATION,
(G4S)3,
F06-DMP VL,
(G4S)4,
F06-DMP VH
hu11F11(ver.2)(M428L)-F06 monovalent (HC 2, -knob) 155 hu11F11(ver.2 (IGG),M428L MUTATION, KNOB MUTATION
hu11F11(ver.2)(M428L)-F06-DM monovalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)(M428L)-F06-DM monovalent (HC 1, -hole) 165 hu11F11(ver.2 (IGG), M428L, HOLE MUTATION,
(G4S)3,
F06-DM VL,
(G4S)4,
F06-DM VH
hu11F11(ver.2)(M428L)-F06 monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -knob) 155 hu11F11(ver.2 (IGG),M428L MUTATION, KNOB MUTATION
hu11F11(ver.2)-F06(de2)(StoP) monovalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)-F06(de2)(StoP)-(monovalent, deamidated, S->P(HC 1, -hole) 166 hu11F11(ver.2)(IGG)HOLE MUTATION
(G4S)3
F06(de2)(StoP)VL
(G4S)4
F06(de2)(StoP)VH
hu11F11(ver.2)- F06(de2)(StoP)-(de2) monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -knob) 152 hu11F11(ver.2 (IGG), KNOB MUTATION
hu11F11(ver.2)-VH5(de2)(StoP)bivalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)-VH5(de2)(StoP) deamidated, S->P bivalent(HC) 167 hu11F11(ver.2 (IGG)
(G4S)3,
VH5(de2)(StoP)VL
(G4S)4
VH5(de2)(StoP)VH
hu11F11(ver.2)-VH16(de2)(StoP)bivalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)-VH16(de2)(StoP) deamidated, S->P bivalent(HC) 168 hu11F11(ver.2 (IGG)
(G4S)3,
VH16(de2)(StoP)VL
(G4S)4
VH16(de2)(StoP)VH
hu11F11(ver.2)(M428L)-F06(de2)(StoP) monovalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)(M428L)-F06(de2)(StoP)-(monovalent, deamidated, S->P(HC 1, -hole) 169 hu11F11(ver.2)(IGG) M428L,HOLE MUTATION
(G4S)3
F06(de2)(StoP)VL
(G4S)4
F06(de2)(StoP)VH
hu11F11(ver.2)(M428L)- F06(de2)(StoP)-(de2) monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -knob) 155 hu11F11(ver.2 (IGG),M428L MUTATION, KNOB MUTATION
hu11F11(ver.2)-F06(de2)(StoP) bivalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)-F06(de2)(StoP) deamidated,S->Pbivalent(HC) * hu11F11(ver.2) (IGG)
(G4S)3,
F06(de2)(StoP)VL
(G4S)4
F06(de2)(StoP)VH
hu11F11(ver.2)(M428L)-F06(de2)(StoP) bivalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)(M428L)-F06(de2)(StoP) deamidated,S->Pbivalent(HC) * hu11F11(ver.2 (IGG) M428L mutated
(G4S)3,
F06(de2)(StoP)VL
(G4S)4
F06(de2)(StoP)VH
hu11F11(ver.2)-1564 (de2)(StoP) monovalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)-1564(de2)(StoP)-monovalent, deamidated,S->P(HC1,-hole) * hu11F11(ver.2)(IGG)HOLEMUTATION
(G4S)3
1564(de2)(StoP) VL
(G4S)4
1564(de2)(StoP) VH
hu11F11(ver.2)-1564(de2)(StoP)-(de2) monovalent, deamidated,S->P(HC2,-knob) * hu11F11(ver.2) (IGG) WITH KNOB MUTATION
hu11F11(ver.2)(M428L)-VH5(de2)(StoP)bivalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)(M428L)-VH5(de2)(StoP) deamidated, S->P bivalent(HC) 170 hu11F11(ver.2 (IGG) M428L mutation
(G4S)3,
VH5(de2)(StoP)VL
(G4S)4
VH5(de2)(StoP)VH
hu11F11(ver.2)(M428L)-VH16(de2)(StoP)bivalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)(M428L)-VH16(de2)(StoP) deamidated, S->P bivalent(HC) 171 hu11F11(ver.2 (IGG) M428L mutation
(G4S)3,
VH16(de2)(StoP)VL
(G4S)4
VH16(de2)(StoP)VH
hu11F11(ver.2)(M428L)-1564(de2)(StoP) monovalent Hu11F11-VLv3 4c hu11F11(ver.2)(M428L)-1564(de2)(StoP)-monovalent, deamidated, S->P(HC 1, -hole) 172 hu11F11(ver.2)(IGG) M428L,HOLE MUTATION
(G4S)3
1564(de2)(StoP) VL
(G4S)4
1564(de2)(StoP)VH
hu11F11(ver.2)(M428L)- 1564(de2)(StoP)-(de2) monovalent, deamidated, S->P (HC 2, -knob) 155 Hu11F11(ver2)(M428L)-knob
본 발명에 따른 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합 단편, 또는 이를 포함하는 이중특이항체를 포함하는 알파-시누클레인병의 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 약학적으로 유효량으로 알파-시누클레인 항체 또는 이중 특이 항체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "치료"는 질병 또는 질병 증상을 감소, 완화, 경감, 또는 제거하거나, 질병의 증상 또는 병적 상태를 보다 잘 견딜 수 있는 상태로 만들어 주는 것, 또는 질병의 증상 또는 병적 상태의 악화 속도를 늦추는 것 등을 포함하는, 질병 또는 질병의 증상 또는 병적 상태의 경감 또는 제거와 관련된 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 “대상” 또는 "환자"는 인간 또는 인간 환자를 포함한다.
항체의 치료적 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물도 또한 제공된다. 또한, 예를 들면, 이러한 약학적 조성물을 투여함으로써 알파-시누클레인와 연관된 환자를 치료하는 방법이 포함된다. 생체내 투여에 사용되는 약학적 조성물은 전형적으로 무균 제제로서 제공된다. 일단 약학적 조성물이 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 결정, 또는 탈수되거나 동결건조된 분말로서 무균 바이알 내에 저장될 수 있다. 이러한 제형은 즉시 사용가능한 형태, 또는 투여 직전에 재구성되는 형태(예를 들면, 동결건조됨)로 저장될 수 있다.
약학적 조성물의 투여 경로는 공지된 방법, 예를 들면, 경구; 정맥내, 복막내, 뇌내(실질내), 뇌실내, 근육내, 안구내, 동맥내, 문맥내, 또는 병소내 경로를 통한 주사; 지속 방출 시스템 또는 이식 장치가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 볼루스 주사에 의해, 또는 주입 또는 이식 장치에 의해 연속적으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 본 발명에 따른 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합 단편, 또는 이를 포함하는 이중특이항체는 알파-시누클레인과 관련된 질환 및/또는 증상을 검출, 진단, 또는 모니터링하기 위한 진단 목적에 사용될 수 있다. 진단 용도를 위해 항체는 전형적으로 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다.
본 발명의 일예에서 제조된 항체는 IGF1R에 brain endothelial의 transcytosis에 최적화된 결합력으로 IGF1R 특이적으로 결합하며, 낮은 혈액뇌장벽 통과능으로 치료 효능이 제한적이었던 퇴행성 뇌질환 및 뇌암 치료항체의 전달에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명에 개시된 항체는 리간드인 IGF-1, IGF-2 및 그 homolog인 insulin이 IGF1R에 결합하는 것에 영향을 미치지 않으며, IGF1R 수용체를 통한 신호전달을 억제하지 않는 등의 효과를 나타내므로, 혈액뇌장벽 통과와 관련하여 유용성을 지닌다. 본원에 개시된 항체는 알파-시누클레인 응집체를 효과적으로 제거하거나 분해를 촉할 수 있고, 알파-시누클레인의 세포간 전달을 억제할 수 있어, 알파-시누클레인의 응집체 축적과 관련된 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 알파-시누클레인 항체 또는 이를 포함하는 이중 특이항체는 α-synucleinopathy의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일예에서 제조된 항α-syn 키메릭 항체와 인간화 11F11 항체의 친화도를 ELISA로 측정한 결과이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일예에서 제조된 항α-syn 키메릭 항체와 인간화 11F11 항체가 알파-시누클레인 응집체에 대한 선호적 결합 특이성 및 친화도를 BIAcore로 분석한 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 본원의 일예에서 제조된 항-IGF1R 항체의 IGF1R 단백질에 대한 결합 데이터이다.
도 4a, 도 4b 및 도 4c는 본원의 일예에서 제조된 항-IGF1R 항체의 IGF1R 발현 세포주들에 대한 결합 데이터이다.
도 5a, 도 5b, 및 도 5c은 본원의 일예에서 제조된 항-IGF1R 항체의 IGF1R 발현 세포주들로의 internalization 및 cell 안에서의 fate 관련 데이터이다
도 6a, 도 6b, 및 도 6c은 본원의 일예에서 제조된 항-IGF1R 항체가 IGF1 혹은 insulin에 의한 IGF1R signaling에 영향을 주지 않는다는 데이터이다.
도 7a, 7b, 7c, 7d, 7e, 및 7f은 항-IGF1R 항체와 치료 항체의 이중특이항체 및 항-IGF1R 항체가 in vivo BBB를 치료 항체로만 구성된 단독항체 대비 더 잘 통과한다는 것을 나타낸다.
도 8은 항-IGF1R 항체의 탈아미드화 위치를 확인한 결과이다.
도 9는 항-IGF1R 항체의 에피토프 맵핑 결과이다.
도 10a 및 도 10b는 본원의 일예에서 제조된 이중특이항체의 각 항원에 대한 결합력을 측정하기 위해 ELISA를 수행한 결과이다.
도 10c 및 도 10d는 키메릭 항체와 인간화한 항체의 각 항원에 대한 결합력을 비교하기 위해 ELISA를 수행한 결과이다.
도 10e는 본원의 일예에서 제조된 이중특이항체에 대하여 microglia의 식세포 작용에 대한 활성을 평가한 결과이다.
도 11a 내지 11e는 본원의 일예에서 제조된 이중특이항체에 대하여 단독항체 대비 마우스 동물모델에서의 효능을 평가한 결과이다.
도 12는 본원의 일예에서 제조된 이중특이항체에 대하여 Fc engineering을 수행하여 반감기 증대 및 BBB 통과 향상을 확인한 결과이다.
도 13는 본원의 일예에서 제조된 이중특이항체에 대하여 마우스 동물모델에서의 α-syn 감소능을 평가한 결과이다.
도 14a, 14b, 및 14c는 각각 본원의 일예에서 제조된 탈아미드화 항-IGF1R 항체들과 대조군 항체들의 항원 결합력을 ELISA로 비교 분석한 결과이다.
도 15a 내지 도 15c는 본원의 일예에서 제조된 탈아미드화 이중특이항체의 IGF1R 특이적 결합력을 FACS로 분석한 결과이다.
도 16는 본원의 일예에서 제조된 탈아미드화 이중특이항체와 대조군 항체들의 in vivo BBB 통과능을 비교 분석한 결과이다.
도 17은 본원의 일예에서 제조된 탈아미드화 이중특이항체와 대조군 항체들의 in vivo BBB 통과능을 비교 분석한 결과이다.
본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. 마우스 알파-시누클레인 항체의 제조
1-1: 면역화 및 하이브리도마 생산
항원으로는 전장 (140 잔기) 또는 C-말단 21개 잔기가 절단된 알파-시누클레인 단량체를 37℃ 온도 thermomixer C에 넣고 14일 동안 1050 rpm으로 흔들어 응집화 시켰으며 소니케이션 하여 사용하였다. 상기 제조된 1 mg/ml 농도의 140개 및 119개 잔기의 알파-시누클레인 피브릴 각각을 아주번트(adjuvant)와 1:1(vol: vol)로 혼합하여 잘 섞어 주었다. 사람 알파-시누클레인 (Homo sapiens alpha-synuclein)의 아미노산 서열을 서열번호 173에 나타낸다.
이어, 상기 준비한 혼합물 200 μL를 5~7주령 BALB/c 암컷 마우스의 피하에 주사하였고, 2주 후에 동일한 방법으로 제조한 혼합물 200 μL를 추가로 피하주사 하여 부스팅시켰다. 부스팅 1주일 후에 혈액을 채취하여 투여항원을 붙인 ELISA 방법을 사용하여 면역화 적정(immunization titeration)을 수행하였다. 이어 3차 부스팅은 항원만을 피하주사 하였다.
이어 상기와 같이 면역이 완료된 마우스의 비장을 제거하여, 이로부터 세포를 확보하였다. 이어 비장 세포를 10% FBS가 첨가된 Hybridoma-SFM 배지(Thermo Fisher Scientific, USA)에 현탁시켰다. 하이브리도마를 제조하기 위해 뮤린 골수종 세포인 SP2/0-Ag14와 비장 세포를 혈청이 포함되지 않은 Hybridoma-SFM 배지에서 혼합한 후 원심분리를 하여 배지를 제거하였다. 이어 세포 펠렛에 PEG를 첨가한 후 37 ℃에서 1분간 배양하여 세포 융합을 유도하였다.
1-2: 단세포 클로닝 및 항체 정제
융합 2주 후에, 세포 배양 배지를 이용하여 마우스에 투여한 항원을 붙인 ELISA 방법을 사용하여 항체를 생산하는 마우스 B 세포와의 융합을 확인하였다. 이어 하이브리도마를 이용하여 단세포 클로닝을 수행하여 단클론항체를 생산하는 하이브리도마를 총 16개 선별하였다. 전장(140 잔기) 알파-시누클레인 응집체를 항원으로 이용하여 9B11 (각각 IgG1 kappa) 클론을 수득하였고, C-말단 21개 잔기가 절단된 알파-시누클레인 응집체를 항원으로 이용하여 3A9및 11F11 (각각 IgG2b kappa, IgG2b kappa)의 클론을 수득하였다.
상기 항체의 정제를 위해서, 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에서 각 하이브리도마를 배양하다 항체 생산을 위해 serum이 없는 SFM 배지로 배양 배지를 교체한 후 4일 정도 배양한다. 세포 배양 상층액을 분리하여 원심분리한 후 0.22 μm 필터로 거른 후 IgG1 타입은 protein G column으로 나머지 항체들은 protein A column으로 정제하였다.
1-3: 가변영역 서열 결정
가변영역 및 CDR 서열은 Ahn et al, Mol. Cells 2004, 18(2):237-241 논문을 참조하여 결정하였다. 하이브리도마를 배양한 후 원심분리하여 세포만을 분리하였다. 분리된 하이브리도마에 트라이졸을 넣어 RNA를 분리하였으며 이를 템플릿으로 하여 cDNA를 합성한 후 염기서열 분석을 통해 가변영역 및 CDR 서열을 확인하였다.
실시예 2. 키메릭 항 알파-시누클레인 항체의 제조
2-1: 항체 클로닝 및 발현
확보한 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 항체 nucleotide 서열을 이용하여, 짧은 단편의 nucleotide인 gblock(m.biotech)을 합성하였고, 이를 이용하여 동물세포 배양용 벡터 (pcDNA3.4)에 클로닝하였다. 가변영역 앞뒤에 중첩된 nucleotide를 약 20 bp 정도 포함하여 gblock을 합성하였고, pcDNA3.4 vector의 가변영역을 제외한 부분을 PCR로 증폭 후 준비하여, Gibson assembly 방법으로 클로닝하였다.
상기 클로닝된 항체를 Transfection 및 발현하기 위해서, 상기 제조된 벡터를 maxi-prep(Qiagen) 하여, 다량의 plasmid DNA를 확보 후, 다음과 같이 세포에 도입하였다. 형질주입 전날, ExpiCHO(상표명) (Gibco, Cat: A29127)세포를 ExpiCHO?? expression medium (Gibco, Cat: A29100-01) 배지에 3 x 10E6 ~ 4 x 10E6 viable cells/mL 농도를 맞춘 후, 8% CO2, 37℃ 120 rpm에서 1일 동안 배양하였다. DNA 형질주입 당일 7 x 10E6 ~ 10 x 10E6 viable cells/mL, 생존율은 95% 이상으로 자란 세포를 신선한 배지를 이용하여 6 Х 106 viable cells/mL로 희석하여 준비하였다.
준비된 모세포에 형질주입을 위해 ExpiFectamine(상표명) CHO transfection kit(Gibco, Cat: A29129)를 사용하여, ExpiFectamine(상표명) CHO & plasmid DNA 복합체를 준비하였다. 차가운 OptiPRO(상표명)SFM®(Gibco, Cat: 12309019) 배지를 각각 분주하여, 적정농도로 준비한 DNA 및 ExpiFectamine (상표명) CHO 시약을 각각 접종 후, mix 하여 상온에서 5분간 정치하고, 모세포에 접종하여 형질주입 후 배양을 시작하였다. 형질주입 다음날에는 ExpiFectamine(상표명) CHO transfection kit에 포함된 enhancer 및 feed를 형질주입 세포에 접종하였고, 5일 후에는 feed를 추가 접종 후, 8% CO2, 37℃, 120 rpm 조건에서 10일간 배양하여 생산을 완료하였다.
생산이 완료된 배양액의 수득을 위해 원심분리용 병에 배양액을 옮기고 4 ℃ 6500 rpm 에서 30분간 원심분리 후, 0.2 μm 의 크기인 필터로 필터링을 진행하여, 부유물을 제외한 배양액을 확보하여 이후 정제과정을 진행하였다.
2-2: 항체의 정제 및 서열확인
HiTrap MabSelectSure (GE Healthcare, 11-0034-94)을 사용하여 배양액을 정제하였다. 평형화 버퍼(50 mM Tris-HCl pH7.2, 100 mM NaCl)을 사용하여 평형화 시킨 후, 회수된 배양액을 컬럼에 로딩하였다. 로딩이 완료되면 50 mM Sodium Citrate pH 5.0으로 중간세척 후, 50 mM Sodium Citrate pH 3.4를 이용하여 용출을 하였다. 용출액에 1M Tris-HCl pH 9.0을 첨가하여 pH 6.0이 되도록 중화하였다. 이후 용출액을 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 버퍼교환 및 농축하여 사용시까지 4 ℃에 보관하였다.
추가 정제가 필요할 경우, HiLoad 26/600 superdex 200 컬럼에 1X PBS를 버퍼로 1차 정제분을 통과시켜 용출 시료의 크기를 바탕으로 2차 정제를 수행하였다. 상기 정제된 항체의 아미노산 서열을 질량분석방법으로 분석하였으며, mouse 유래 단일클론항체의 가변영역과 일치함을 확인하였다.
상기 방법으로 확인된 3A9, 9B11, 11F11 항체들의 가변영역을 인간 IgG1 아이소타입의 backbone 가변영역 부분에 치환하여 키메릭 형태의 인간 IgG1 항체를 제작하였다. 상기 얻어진 키메릭 항체 중에서, 특히 Ch11F11 항체는 IgG 형태의 항체로서 서열번호 176의 중쇄 가변영역 서열(ch11F11-VH)과 서열번호 176의 경쇄 가변영역 서열 (ch11F11-VL)의 조합을 포함한다. 하기 표 11에서 굵게 밑줄로 표시된 부분이 CDR 서열이다.
Name Amino acid sequence SEQ IDNO
ch11F11-VH EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCATS GFTFSDFYME WVRQPPGKRLEWIA ASRNKANDYTTEYSASVKG RFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCAR DAHGKPFAY WGQGTLVTVSA 175
ch11F11-VL DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSC KSSQSLLYSSNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQ QYYSYPWT FGGGTKLEIK 176
실시예 3. 인간화 항체의 제조
3-1: 라이브러리 파아지(Library phage) 준비
키메릭 항체의 CDR1, CDR2, CDR3 residue에 human framework을 결합시키면서 각 CDR residue에 mouse 혹은 인간 유래 sequence가 도입된 mini 라이브러리를 제작하였다. 해당 라이브러리의 competent cell을 클로람페니콜 (Sigma, C0857) 34 μg/ml, 2% 글루코스 (Sigma, G5400) 및 5 mM MgCl2 (Sigma, M2393)이 포함된 2X YT [Tryptone (CONDA,1612.00) 17g, 이스트 추출물 (CONDA, 1702.00) 10g, NaCl (Sigma, S7653) 5g] 배지에 접종 후, 37℃에서 3시간 정도 배양하여 OD600 값이 0.5에서 0.7이 되도록 한 후, 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시킨 후, 클로람페니콜 34 μg/ml, 5 mM MgCl2, 카나마이신 (Sigma, K1876) 70 μg/ml, 1 mM IPTG (ELPISBIO, IPTG025)를 첨가한 2X YT 배지에서 30℃, 16시간 동안 배양하여 파아지 패킹을 유도하였다. 이어 배양액을 4500 rpm, 4 ℃조건에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액에 4% PEG 6000 (Fluka, 81253)과 3% NaCl (Sigma, S7653)을 첨가하여 잘 녹인 후, 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 다시 4 ℃ 조건에서 8000 rpm, 20분간 원심분리한 후, 펠렛을 PBS로 현탁한 후, 다시 4 ℃ 조건에서 12000 rpm, 10분간 원심분리 하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 수득하여 새 튜브에 넣어 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
3-2: 파아지 디스플레이 패닝(panning)
구체적으로 면역시험관(immunotube, maxisorp 444202)에 10㎍/㎖ 농도의 재조합 알파-시누클레인 응집체를 PBS에 첨가하여 4 ℃에서 밤새 시험관 표면에 단백질을 흡착시킨 후 우혈청 알부민(BSA, Bovine serum albumin) 3% 용액을 시험관에 첨가하여 알파-시누클레인 응집체가 흡착되지 않은 표면을 보호하였다. 시험관을 비운 후 BSA 3% 용액에 분산된 1 x 1012 cfu 항체 파지 라이브러리를 알파-시누클레인 단량체 단백질이 흡착되어 있는 면역시험관에 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다 (네거티브 선별). 알파-시누클레인 단량체에 비결합된 파지들을 회수하여 알파-시누클레인 응집체가 부착된 면역시험관에 상온에서 2시간 결합시켰다. 이어 비특이적으로 결합한 파지를 PBS-T(0.05% Tween 20)용액으로 5회~30회 씻어낸 후 남아있는 항원 특이적 파지항체를 100mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 회수하였다. 회수된 파지를 1M 트리스 버퍼(pH 7.4)로 중화시킨 후 ER2537 대장균에 37℃에서 1시간 감염시키고 감염된 대장균을 카베니실린을 함유하는 2X YT 한천배지에 도말하여 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 4㎖의 2X YT 카베니실린 배양액에 현탁하고 15% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80 ℃에 보관하고 나머지는 다음 라운드의 패닝을 위해 파아지를 제조하였다. 이러한 과정을 총 3라운드 반복하여 항원 특이적인 항체를 증폭시켰다. 패닝 라운드가 진행될수록 PBS-T를 이용한 세척회수를 증가시켜 항원특이적 파지를 증폭 및 농축하였다.
3-3: 단일클론 파아지 항체 선별(single clone screening)
상기 패닝을 통해 수득한 파아지 풀(phage pool)로부터 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
농축된 풀로부터 단일클론을 분리하기 위해, LB-테트라사이클린/카베니실린 한천배지에 상기 파아지 풀을 도말한 후 배양하여 단일 콜로니를 확보하였다. 이어 단일 클론을 웰당 400㎕의 2 X YT-테트라사이클린/카베니실린 배지가 들어간 96 깊은 웰 플레이트에 접종하여 밤새 키운 후, 배양액 10㎕를 새로운 390㎕의 2 X YT-테트라사이클린/카베니실린 배지가 포함된 96 깊은 웰 플레이트에 넣어 37℃에서 4시간 배양했다. 상기 배양액에 1mM IPTG 되게 넣어 주고 30℃에서 밤새 배양했다. 밤새 배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하였다.
이어 ELISA 방법을 사용하여 알파-시누클레인 응집체와 결합하는 단일클론 가용성 scFv를 발현하는 클론을 선택하였다. 구체적으로 96 웰 플레이트에 실시예 1-1에서 선별된 7B7 항체를 넣고, 4℃에서 밤새 코팅하였다. 3% BSA를 각 웰당 200μL씩 넣어 37℃에서 2시간 블록킹하였다. 이어 알파-시누클레인 응집체와 단량체를 100ng/well의 농도로 각각 로딩 한 후 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이어 PBS-T 300μL로 5회 세척하였다. 상기 준비된 단일 클론 상등액은 3% BSA와 1:1(vol:vol)로 섞은 후 상기 혼합액을 상기 응집체 및 단량체와 결합시킨 플레이트에 100μL씩 로딩한 뒤 37 ℃에서 2시간 반응시켰다. 이어 PBS-T 300μL로 5회 세척한 후, 항-HA HRP 결합 항체를 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 5회 세척하였다. TMB(Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100μL를 넣어 발색한 후, 1N H2SO4 50μL를 넣어 반응을 정지한 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도가 0.5 이상인 클론들을 결합에 의한 양성반응으로 간주하였으며 BSA 비특이적으로 결합하는 클론들은 배제시켰다.
라이브러리에서 발견된 클론의 CDR residue들은 in silico 방식으로 분석을 병행하여 framework과의 결합에 심각한 문제가 생기거나 CDR을 제외한 framework 부분에 T-cell epitope, B cell epitope 및 MHCII epitope이 존재하지 않는 클론을 선별하였다.
이후 상기 선별된 클론의 가변영역을 인간 IgG1 아이소타입의 backbone 가변영역 부분에 치환하여 IgG1 backbone의 인간화 항체를 제작하였다. 구체적으로, hu11F11(H2L4)는 IgG 형태의 항체로서, 서열번호 146의 Hu11F11-VH2와 서열번호 148의 Hu11F11-VL4 조합이며, Hu11F11_(ver.1)는 서열번호 142의 Hu11F11-VH-v1와 서열번호 147의 Hu11F11-VLv3 4c)의 조합을 포함하는 IgG 형태의 항체이며, Hu11F11_(ver.2)은 서열번호 143의 Hu11F11-VH-v2와 서열번호 147의 Hu11F11-VLv3 4c의 조합을 포함하는 IgG 형태의 항체이며, Hu11F11_(ver.3)는 144의 Hu11F11-VH-v3와 서열번호 147의 Hu11F11-VLv3 4c의 조합을 포함하는 IgG 형태의 항체이며, Hu11F11(ver.4)은 서열번호 145의 Hu11F11-VH-v4와 서열번호 147의 Hu11F11-VLv3 4c의 조합한 IgG 형태의 항체임을 확인하였다.
실시예 4. 항-알파-시누클레인 항체의 ELISA 분석시험
실시예 2에서 얻어진 키메릭 항체(Ch11F11) 및 실시예 3에서 얻어진 인간화 항체들(Hu11F11)의 결합력을 정량적으로 분석하기 위하여 sandwich ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 각각 항체들을 0.04 내지 400 nM의 농도로 1/10씩 희석하여 96웰 플레이트에 코팅한 뒤, 여기에 2000 ng/ml의 응집체를 각 웰에 처리하였다. 1XPBS로 세척 후 이어 바이오틴이 결합된 capture 항체 및 HRP가 결합된 스트렙타빈을 처리한 뒤 기질로서 TMB와 반응시킨 뒤 그 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 7에 기재되어 있다.
도 1에 나타낸 것과 같이, 본 발명에 따른 인간화된 항체들, 특히 키메릭 11F11에서 유래된 인간화 항체(인간화 11F11 항체)들은 키메릭 11F11 클론과 동등한 결합력을 보이는 것으로 확인되었다. 인간화 항체들, 특히 11F11 유래 variant들인, hu11F11(ver.1), 즉 Hu11F11-VH-v1 와 Hu11F11-VLv3 4c의 조합, hu11F11(ver.2), 즉 Hu11F11-VH-v2 와 Hu11F11-VLv3 4c의 조합, hu11F11(ver.3), 즉 Hu11F11-VH-v3 와 Hu11F11-VLv3 4c의 조합, hu11F11(ver.4), 즉 Hu11F11-VH-v4 와 Hu11F11-VLv3 4c 은 키메릭 11F11 클론과 유사한 결합력을 보이는 것으로 확인되었으며, 그 EC50는 11.5 ~ 15.1 nM로, 키메릭 11F11 항체의 EC50인 12.5 nM와 유사한 값을 보였다.
실시예 5: 항 알파-시누클레인 항체를 이용한 BIAcore 분석
실시예 2에서 얻어진 키메릭 항체 및 실시예 3에서 얻어진 인간화 항체들의 결합력을 BIAcore를 사용하여 정량적으로 분석하였다.
분석에 사용된 기기는 T200 (GEHealthcare, S/N: 1565888)을 사용하였다. Chip은 Protein A를 사용하였으며 (GE Healthcare, Cat. 29-1275-56), Regeneration buffer는 10 mM Glycine-HCl pH1.5 (GE Healthcare, Cat. BR-1003-54), Running buffer와 analyte 희석, 샘플 희석 완충액으로는 HBS-EP를 사용하였다. 실시예 2 및 실시예 3에서 제조된 항체들은 1X HBS-EP (GE Healthcare, Cat. BR-1006-69)로 희석하였으며, α-syn 단량체 (1 mg/ml) 또는 피브릴 단백질 (3 mg/ml) (analyte)은 2배씩 순차적으로 희석하여, 0 nM 포함 총 6개 농도 (0, 0.39, 1.56, 6.25, 25, 100nM)에서 분석하였다. 캡처의 경우 단량체는 표적 RU를 800 (theoretical)으로, 피브릴은 표적 RU를 100 (theoretical)으로 하고, 캡처 phase를 contact time을 60초, flow rate을 30 μl/min으로, stabilization period를 180초로 진행하였다. association phase에서는 association time을 120초로, flow rate를 30 μl/min으로 하였으며, dissociation phase에서는 dissociation time을 360초로, flow rate를 30 μl/min으로 하였다. Regeneration phase에서는, flow rate을 30 μl/min으로 하여 regeneration time을 240초(1차), 60초(2차), 두 번에 걸쳐 진행하였다. 1:1 binding model을 사용하여 fitting 하였으며, evaluation software는 BIACore T200 Evaluation software를 사용하였다 (GE healthcare).
상기 분석 결과를 도 2a 내지 도 2c, 및 하기 표에 나타낸다.
클론명 KD(nM)
Ch11F11 0.02472
Hu11F11(ver.2) 0.0596
Hu11F11(ver.3) 0.0316
Hu11F11(ver.4) 0.0204
그 결과, 본원에 기재된 인간화 항체들, 특히 11F11의 variant들, 즉, hu11F11(ver.2), hu11F11(ver.3) 및 hu11F11(ver.4) 은 키메릭 11F11 클론과 유사한 KD 값을 보이는 것으로 확인되었으며, 그 결합 정도로는 인간화 클론들이 0.02~0.06 X 10-9 M의 KD, 키메릭 11F11 클론이 0.02 X 10-9 M의 낮은 KD 값, 즉 응집체에 대한 높은 결합력을 보였다.
실시예 6. IGF1R 항체 제조 (scFV)
6-1: IGF1R 항체(scFV)의 제조
파아지 디스플레이/패닝 기술을 이용하여 단일클론항체를 제조하였다.
구체적으로, 항-IGF1R 항체 제조를 위한 파지 디스플레이 패닝 수행 및 기타 분석에 사용되는 항원을 다음과 같은 단백질을 사용하였다. 인간 IGF1R의 세포외 도메인(ECD)에서 신호서열이 제거된 서열번호 174의 아미노산 잔기의 31번에서 932번의 아미노산 서열의 C-말단에 히스티딘-태그(His tag)가 결합된 것을 사용하였다 (R&D Systems, USA, 391-GR).
또한 종간 교차반응성을 확인하기 위해 C 말단에 His tag 이 융합된 원숭이 IGF1R (National Research Council Canada), 마우스 IGF1R (R&D systems, 6630-GR/CF), 및 래트 IGF1R (National Research Council Canada)의 단백질을 항원으로 사용하였다.
다양성을 가진 인간 유래 ScFv (Single-chain variable fragment) 라이브러리 세포(OPAL library, 이화여대 심현보 교수 제작) 1 X 1010개를 클로람페니콜 (Sigma, C0857) 34 ug/ml, 2% 글루코스 (Sigma, G5400) 및 5 mM MgCl2 (Sigma,M2393)이 포함된 2X YT [Tryptone (CONDA,1612.00) 17 g, 이스트 추출물 (CONDA, 1702.00) 10 g, NaCl (Sigma, S7653) 5 g] 배지에 접종 후, 37 ℃에서 3시간 정도 배양하여 OD600 값이 0.5에서 0.7이 되도록 한 후, 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시킨 후, 클로람페니콜 34 ug/ml, 5 mM MgCl2, 카나마이신 (Sigma, K1876) 70 ug/ml, 1 mM IPTG (ELPISBIO, IPTG025)를 첨가한 2X YT 배지에서 30 ℃에서 16시간 동안 배양하여 파아지 패킹을 유도하였다. 이어 배양액을 4500 rpm, 4℃조건에서 15분 동안 원심분리한 후, 상등액에 4% PEG 6000 (Fluka, 81253)과 3% NaCl (Sigma, S7653)을 첨가하여 잘 녹인 후, 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 다시 4℃조건에서 8000 rpm, 20분간 원심분리한 후, 펠렛을 PBS로 현탁한 후, 다시 4℃조건에서 12000 rpm, 10분간 원심분리 하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 수득하여 새 튜브에 넣어 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
6-2: 파아지 디스플레이 패닝(panning)
인간 IGF1R 항체를 스크리닝 하기 위해 다음과 같은 방법으로 총 3회 패닝을 수행하였다. 본 발명에 사용된 파지 라이브러리는 합성 사람 scFv 라이브러리이며 파아지 디스플레이 패닝 과정 및 결과는 다음 표와 같다.
구분 패닝
1 round 2 round 3 round
Antigen IGF1R ECD(biotinylated) IGF1R ECD(biotinylated) MCF-7 cell
Coating method IndirectImmobilization IndirectImmobilization _
Input 7.0 x 1012 6.0 x 1012 5.0 x 1012
Output IGF1R or MCF-7 4.9 x 108 3.3 x 105 1.2 x 105
washing PBS-T** 5 times 10 times 10 times
PBS 2 times 2 times 2 times
구체적으로 면역 시험관 (immunotube, maxisorp 444202)에 5 ug/ml 농도의 재조합 인간 IGF1R 단백질 (R&D Systems, USA, 391-GR 혹은 Sino Biological Life Technologies, USA, 10164-H08H-50R)을 1ml 첨가하여 4℃에서 16시간 동안 시험관 표면에 코팅한 후, 상등액을 제거하고 BSA (Bovine serum albumin) 3%가 포함된 PBS용액을 4 ml 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 IGF1R가 흡착되지 않은 표면에 BSA를 결합시킴으로써 비특이적인 결합을 차단하였다. 이어 상등액을 제거한 후, 실시예 11-1에서 준비한 파지 라이브러리를 BSA 1.5% 용액과 섞어 상기 면역시험관에 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 IGF1R 특이적인 파지가 항원에 결합하도록 하였다. 이어 PBS-T (phosphate buffered saline-0.05% Tween 20) 용액으로 1회 씻어내어, 비특이적으로 결합된 파지를 제거한 후, 100 mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 IGF1R에 결합한 파지를 회수하였다. 회수된 파지를 1M Tris 완충액 (pH 7.4)으로 중화시킨 후, E.Coli K12 ER2738 대장균에 37℃에서 1시간 감염시킨 후, 상기 대장균을 테트라사이클린과 카베니실린을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하여 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 테트라사이클린과 카베니실린을 함유한 5 ml의 SB(superbroth) 배지에 현탁하고 동일 부피의 50% 글리세롤을 첨가하여 일부는 80℃에 보관하고 나머지 중 50 ul를 40 ml의 SB-테트라사이클린/카베니실린 배지에 현탁한 후 1012PFU의 VCSM13 헬퍼파지(helper phage)를 넣고 천천히 교반하며 37℃에서 1시간 배양하였다. 이후 배양액에 카나마이신을 첨가 후, 30℃에서 약 16시간 동안 배양하여 헬퍼파지가 감염된 대장균만이 배양되도록 하였다.
다음날 배양액을 원심분리한 후, 상등액을 취하여 4% PEG8000, 3% 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 버퍼를 첨가하여 4℃에서 약 1시간 동안 반응시켜 파지를 침전시키고 원심분리하였다. 이어 상등액을 제거하고 침전된 파이지를 1% BSA가 포함된 PBS 버퍼로 재현탁하여 이를 다음 라운드의 패닝에 사용하였다. 위와 같은 과정을 4번 반복하고, 패닝 라운드가 진행될수록 PBS-T를 이용한 세척회수를 증가시켜 항원특이적 파지를 증폭 및 농축하였다.
6-3: 단일클론 파아지 항체 선별(single clone screening)
인간 IGF1R의 ECD(extracellular domain)에 대한 결합력 (protein binding) 뿐 아니라 IGF1R 발현 세포주인 MCF-7에 대한 결합력을 보이는 (cell binding) 클론을 선별하였다.
구체적으로, 실시예을 통해 수득한 파아지 풀(Phage pool)로부터 IGF1R에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
농축된 풀로부터 단일클론을 분리하기 위해, LB-테트라사이클린/카베니실린 한천배지에 수득한 파아지 풀을 도말, 배양하여 단일 콜로니를 확보하였다. 이 콜로니들을 96-deep 웰 plate에 접종하여 밤새 배양한 후, 배양액 10 ul를 같은 방법으로 96-deep 웰 plate에 재접종하여 37℃에서 약 4시간 배양하여 적정 OD (0.5~0.7)가 되도록 하였다. 상기 배양액에 20 MOI helper phage를 넣은 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이후, 배양액에 카나마이신을 넣어주고, 30℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하여 IGF1R 특이적 파지를 선별하기위한 ELISA를 수행하였다(Steinberger. Rader and Barbas III. 2000. Phage display vectors. In : Phage Display Laboratory Manual. 1 sted. ColdSpringHarborLaboratoryPress. NY. USA. pp.11.9-11.12).
ELISA plate에 재조합 IGF1R를 각 웰당 100 ng 넣고, 4℃에서 약 15시간 반응시켜 항원을 plate상에 코팅하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 3% BSA가 포함된 PBS 버퍼를 웰당 200 ul씩 첨가한 후, 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 상등액을 버렸다.
상기 준비한 단일클론 파지가 포함된 100 ul의 용액을 각 웰에 넣어 37 ℃에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T 300 ul로 3회 세척하였다. IGF1R 항원에 결합이 된 phage를 검출하기 위해 3% BSA가 포함된 PBS 버퍼에 항-HA HRP를 1:5000으로 희석한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. PBS-T 300 ul를 이용한 세척과정을 3회 수행한 후, TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 ul를 넣어 발색 시킨 후, 1N H2SO4 50 ul를 넣어 반응을 종료하였다. 이를 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 대조군인 BSA 대비 흡광도가 높은 클론을 항원 특이적 항체 클론으로 선별하였다. 2번의 스크리닝에 걸쳐 1564 등 클론을 선별하였다.
실시예 7. IGF1R 항체의 변이체(affinity variant)의 제조
리간드 결합력 및 BBB 통과능을 평가하여 선별된 클론에 대하여 affinity variation을 수행하여 항체를 최적화하였다. 1차 시도에서는 1564 scFv를 기반으로 하여 heavy chain의 CDR2와 light chain의 CDR3 를 randomization 하기 위한 NNS hand-mix primer를 제작하였으며, PCR 기법을 이용하여 randomization 서열이 포함된 1564 scFv 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 유전자는 pComb3x vector에 삽입함으로써 phage display에 적합한 라이브러리 형태로 만들었으며, library panning 및 ELISA screening을 통해 IGF1R에 결합하는 다수의 scFv 클론들을 선별해 낼 수 있었다. 선별된 클론들은 유전자 시퀀싱을 통해 가변부위의 아미노산 서열을 확인하였다.
두번째 시도에서는 CDR1, CDR2, CDR3에 각각 germline backmutation을 도입한 heavy, light chain에 대한 2개의 mini library를 제작하였다. 해당 클론들의 생산성 및 항원 결합력을 바탕으로 변이체(affinity variant)를 선별하여 최종적으로 클론을 확보하였다.
실시예 8. Deamidation residue 변이 항체 제조
8-1: Deamidation residue 확인
탈아미드화 반응은 예를 들어 아스파라긴의 곁사이 펩티드 결합을 공격하여 대칭구조의 석시니마이드 중간산물을 만드는 것을 의미하며, 이 중간산물은 가수분해로 인해 아스파라산 혹은 이소아스파라긴산 중 하나로 변하게 된다. 특히 CDR에 deamidation이 발생하면 항체가 분해되면서 항원에의 결합이 약해져 효능 저하 및 sample heterogeneity가 유발될 수 있으며, Sample heterogeneity는 향후 임상 승인 등에서 그 identification 때문에 복잡성을 유발한다. 따라서 in silico 분석 및 peptide mapping을 통하여 deamidation이 발생하는 위치를 확인하고, 탈아미드화를 방지하여 안정성을 확보함과 동시에, 우수한 물성 및 효능을 얻고자 하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, parental인 1564 클론의 in silico 분석과 peptide mapping으로 실제 deamidation이 일어나는 것을 확인하였다. 이 때 시료를 4 ℃ 혹은 40 ℃에 1주일 보관한 이후 분석을 수행하였으며, LCDR2, LCDR3, HCDR2에서 deamidation이 발생함을 확인하였다. 실시예 7에 기재된 affinity variant들에 대해서도 분석을 수행하여 deamidation 발생 위치를 확인하였다.
8-2: 변이 항체 제조
Deamidation residue를 제거하기 위해 아래와 같이 residue를 치환한 mutant를 생산하였다.
1)아미노산 서열에서 Asn을 Asn과 유사한 D 혹은 Q로 바꾸었다. 결합력에 변화가 없는 것으로 확인되면 해당 residue들은 모두 Q로 치환한다.
2) LCDR3의 deamidation 발생 residue인 N95a는 positive charge를 띠는 H, R, K로 치환하였다. 이러한 탈아미드화 공정이 적용된 클론은 (de)(StoP) 탈아미드화 클론으로도 지칭된다.
3) deamidation이 발생하는 CDR의 바로 다음에 위치한 residue들을 치환하였다. 이들 residue들은 비교적 크기가 작으며, charge가 크지 않은 residue들이다 (예: glycine 혹은 serine). 따라서, 해당 residue들을, 역시 상대적으로 크기가 크지 않으며 hydrophobic한 다른 residue로 치환함으로써 (예: valine 혹은 alanine), parental 항체(residue가 치환되기 전의 클론)와의 결합력 차이를 최소화하려 하였다(표 21). 이러한 탈아미드화 공정이 적용된 클론은 (de2)(StoP) 탈아미드화 클론으로도 지칭된다. deadmidation이 발생하는 residue 옆의 residue를 치환하는 방법을 하기 표에 나타낸다.
Figure pat00001
이탤릭체: deamidation 발생 residue;
밑줄 친 굵은 글씨: 치환될 residue
실시예 9. 다양한 형태의 항-IGF1R 항체의 제조
9-1: 항-IGF1R minibody 형태의 항체 제조
실시예 6 내지 8에서 확보한 IGF1R 특이적 단일클론 파지 항체의 scFv 전체를 Fc의 C-말단에 연결하여 미니바디를 제조하였다. 이를 위해 본원에 개시된 scFV의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제조하고, 이 서열을 제한효소로 절단하여, Fc를 코딩하는 핵산을 포함하는 pcDNA 기반의 발현벡터에 클로닝 하였다.
9-2: 항-IGF1R bivalent 형태의 항체 제조
실시예 6 내지 8에서 확보한 IGF1R 특이적 단일클론 파지 항체의 scFv 전체를, 치료항체 IgG 형태의 C-말단 각각에 두 개를 연결한 bivalent 형태를 제작하였다. 이를 위해 본원에 개시된 scFV의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 제조하고, 이 서열을 제한효소로 절단하여, 치료 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 pcDNA 기반의 발현벡터에 클로닝 하였다.
9-3: 항-IGF1R IgG (Full-IgG) 형태의 항체 제조
실시예 6 및 7에서 확보한 IGF1R 특이적 단일클론 파지 항체 중에서 1564 항체 및 F06 항체의 서열을 전체 IgG1 (Full IgG) 형태로 변환하기 위해, 중쇄와 경쇄 영역의 유전자 서열을 합성하였다(제노텍). 합성한 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현벡터에 클로닝하였다.
9-4: 항-IGF1R scFv monovalent 형태의 항체 제조
실시예 9-2이 중쇄 두 개의 Fc의 C-말단 각각에 항-IGF1R 항체가 scFv 형태로 결합한 bivalent 형태라면, 본 실시예에서는 중쇄 중 한 곳의 Fc C-말단에만 scFv 한 개가 결합한 monovalent 형태로 항체를 제조하였다. 이를 위해 실시예 6 내지 8에서 확보한 IGF1R 특이적 단일클론 파지 항체 중 1564, F06, C04, VH5, VH16, VH35, VH9, VH2, VH7, VH32을 Fc C-말단 중 한 곳에만 결합시킨 벡터, C-말단에 항-IGF1R 항체가 결합되지 않은 벡터를 제작하였다. 해당 Fc들 안에는 knob-into-hole mutation을 도입하여 세포에서 항체 생산 시 heteromeric 형태가 제작되도록 하였다. 항체 생산을 위하여 CHO-S 세포에 transfection 시에는, 치료 항체의 Fc C-말단에 항-IGF1R 항체가 결합된 중쇄에 대한 벡터, 치료 항체의 C-말단에 항-IGF1R 항체가 결합되지 않은 중쇄에 대한 벡터, 치료 항체의 경쇄에 대한 벡터, 총 3개의 벡터를 주입하였다.
9-5: 다양한 항-IGF1R 항체의 발현 및 정제
실시예 9-1 내지 9-4에서 제조된 벡터를 다음과 같이 세포에 도입하였다.
구체적으로, CHO-S 세포를 CD-CHO (Gibco, 10743) 배지에 1.5 Ｘ 106 cells/ml로 농도를 맞춘 후, 8% CO2, 37℃에서 1일 동안 배양하였다. DNA 형질주입 당일 2.5 내지 3 Ｘ 106 cells/ml로 자란 세포를 1% DMSO가 포함되어 있는 CD-CHO 배지를 이용하여 2.1 Ｘ 106 cells/ml의 농도로 준비한 후 8% CO2, 37℃에서 3 hr (Polysciences, 23966, stock 농도 : 1 mg/ml)는 배양 배지 ml당 8 ㎍ 희석하였다. DNA 및 PEI 혼합물을 섞어 상온에서 10 min 동안 정치한 후 세포가 포함된 플라스크에 넣은 후, 5% CO2, 37℃ 100 rpm으로 4 hr 배양한 후, 배양 볼륨의 동일한 볼륨의 CD-CHO 배지를 넣어준 후, 8% CO2, 37℃ 110 rpm 에서 4일 동안 배양하였다.
상기 얻어진 배양액을, 평형화 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM NaCl)을 통과시켜 평형화한 Mab selectsure (GE healthcare, 5mL)에 통과시켜 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, 50mM Na-citrate (pH 3.4), 100 mM NaCl 용액으로 용출시킨 후, 1M Tris-HCl (pH 9.0)을 이용하여 중화시켜 최종 pH가 7.2 가 되게 하였다. 이후 완충액을 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 교환하여 순도가 높은 경우 제형 후 -20 ℃에 냉동보관 하였으며, 추가 정제가 필요한 경우 추가 정제 시까지 4℃에 보관하였다.
추가 정제가 필요한 경우, Hiload superdex 200 (GE Healthcare, Cat. No. 28-9893-36)을 사용하여 정제했으며, 다양한 다른 size exclusion chromatography를 사용하여 정제할 수 있다. 평형화 버퍼(1x Phosphate buffered saline pH 7.4, Gibco, Cat. No. 10010-023)을 사용하여 평형화 시킨 후, 1차 정제가 완료된 시료를 컬럼에 로딩하였다. 정제 완료된 시료는 제형 후 -20 ℃에 냉동보관 하였다.
실시예 10. 이중 특이 항체의 제조
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체를 링커 (서열번호 134)를 사용하여 중쇄가변영역과 경쇄가변영역을 연결하여 scFv로 제조하고, 항 α-syn 항체의 완전한 형태의 IgG 항체의 중쇄 불변영역의 C 말단에 링커 (서열번호 133)를 통해 연결하여 이중 항체를 제조하였다. 또한 이중 항체의 포맷으로서, 항 α-syn 항체의 완전한 형태의 IgG 항체 1분자당 항 IGF1R 항체의 scFv 한 개 분자를 연결하여 제조한 monovalent 항체와. 항 IGF1R 항체의 scFv 2 개 분자를 연결하여 제조한 bivalent 항체를 각각 제조하였다.
본 실시예에서 이중 항체 제조를 위해 사용한 항 α-syn 항체의 서열 및 이건 발명에 따라 제조한 이중 항체의 조합서열의 예시는 표 10에 기재된 바와 같다. bivalent 이중항체 및 monovalent 이중항체의 구체적인 제조방법은 아래와 같다.
10-1: Bivalent 이중항체 클로닝
Bivalent 이중항체 발현 벡터를 제작하기 위해, pcDNA3.4(invitrogen) 벡터의 MCS(Multi cloning site) 내에 signal sequence를 포함한 항체 nucleotide 서열을 삽입하였다. 이중항체 발현벡터는 모노시스트로닉 벡터로써, 중쇄 발현 벡터 및 경쇄 발현 벡터를 각각 제작하였다.
중쇄 발현 벡터에 삽입된 중쇄 서열의 경우 항 α-syn 항체를 코딩하는 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역이 연결된 이뮤노글로불린 C 말단에 항 IGF1R scFv가 링커로 연결된 형태이다. 경쇄 발현 벡터에 삽입된 경쇄 서열의 경우 항 α-syn 항체를 코딩하는 경쇄가변영역 및 인간 경쇄불변영역이 연결된 형태이다.
10-2: Monovalent 이중항체 클로닝
Monovalent 이중항체는 항 IGF1R scFv가 C terminal에 링커로 접합되어 있는 항 α-syn 이뮤노글로불린 중쇄(hole)와 scFv가 연결되어 있지 않은 항 α-syn 이뮤노글로불린 중쇄(knob)가 결합한 이종 이량체에 항체 경쇄가 접합된 형태이다.
중쇄 이종이량체의 접합 효율을 높이기 위해, Knob-in-hole 기법이 이용되었다. 즉, Hole type의 중쇄 coding 서열은 CH3 부분에서 T366S, L368A, Y406V 로 치환하였고, knob type의 중쇄 coding 서열은 CH3 부분에서 T366W로 amino acid로 치환하였다.
10-3: Transient expression
상기 제조된 벡터를 maxi-prep (Qiagen) 하여, 다량의 plasmid DNA를 확보 후, 다음과 같이 세포에 도입하였다. BsAb를 생산하기 위해서 중쇄 발현 벡터 DNA 및 경쇄 발현벡터 DNA를 1:1의 비율로 형질도입 하였다. monovalent BsAb를 생산하기 위해서는 hole type 중쇄 발현 벡터 DNA, knob type 중쇄 발현 벡터 DNA 및 경쇄 발현 벡터 DNA를 0.5 : 0.5 : 1의 비율로 형질도입 하였다.
형질주입 전날, ExpiCHO?? (Gibco, Cat: A29127)세포를 ExpiCHO expression medium (Gibco, Cat: A29100-01) 배지에 3 x 106 내지 4 x 106 viable cells/mL 농도를 맞춘 후, 8% CO2, 37 ℃ 120 rpm에서 1일 동안 배양하였다. DNA 형질주입 당일 7 x 106 ~ 10 x 106 viable cells/mL, 생존율은 95% 이상으로 자란 세포를 신선한 배지를 이용하여 6 Х 106 viable cells/mL로 희석하여 준비하였다.
준비된 모세포에 형질주입을 위해 ExpiFectamineTM CHO transfection kit(Gibco, Cat: A29129)를 사용하여, ExpiFectamineTM CHO & plasmid DNA 복합체를 준비하였다. 차가운 OptiPRO (상표명) SFM®(Gibco, Cat: 12309019) 배지를 각각 분주하여, 적정농도로 준비한 DNA 및 ExpiFectamine(상표명) CHO 시약을 각각 접종 후, mix 하여 상온에서 5분간 정치하고, 모세포에 접종하여 형질주입 후 배양을 시작하였다. 형질주입 다음날에는 ExpiFectamine(상표명) CHO transfection kit에 포함된 enhancer 및 feed를 형질주입 세포에 접종하였고, 5일 후에는 feed 를 추가 접종 후, 8% CO2, 37 ℃ 120 rpm 조건에서 10일간 배양하여 생산을 완료하였다.
10-4: Medium harvest
생산이 완료된 배양액의 수득을 위해 원심분리용 병에 배양액을 옮기고 4 ℃ 6500 rpm 에서 30분간 원심분리 후, 0.2 μm 의 크기인 필터로 필터링을 진행하여, 부유물을 제외한 배양액을 확보하여 이후 정제과정을 진행하였다.
실시예 11. 항-IGF1R 항체의 IGF1R 특이적 결합력 분석
11-1: Minibody 형태 항-IGF1R 항체의 IGF1R에 대한 결합력 분석(ELISA)
실시예 9-1에서 제작한 996, 1226, 1564, MKJP2 클론의 minibody 형태가 재조합 IGF1R에 대한 결합력 및 농도 의존적으로 결합하는지 여부를 확인하고자 ELISA 분석을 수행하였다.
구체적으로, 항체 결합 대상인 인간 재조합 IGF1R은 extracellular domain(ECD)로서, R&D systems에서 구매하였다 (6630-GR/CF). 96-웰 ELISA plate에 (Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester,NY) 인간 IGF1R을 PBS 버퍼에 1 ug/ml로 희석하여 웰당 100 ul 넣은 뒤, 4 ℃에서 16시간 동안 반응하여 코팅 후, 상등액을 제거하였다. 3% BSA (bovine serum albumin)가 포함된 PBS 버퍼를 웰당 200 ul 넣고 로 2시간 동안 반응시켜 비 특이적인 결합을 차단시켰다.
실시예 9-1에서 제조한 996, 1226, 1564, MKJP2 클론의 minibody 항체를 최고 농도 20 nM을 기준으로 3배씩 희석하여 12 포인트를 만든 뒤, 각 웰에 100 μl 씩 옮긴 후, 상온에서 1시간 처리 후에, Tween20이 0.05% 함유된 PBS 버퍼를 이용하여 4회 세척하고, minibody에 존재하는 human Fc를 인지하는 항-human HRP를 블로킹 buffer에 1:5000으로 희석하여 각 웰에 100 ul씩 옮겨 1.5시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다시 PBS-T(Tween20 0.05%) 300 ul를 이용하여 4회 세척한 이후, TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440)를 사용하여 발색 시켰다. 효소반응을 0.5 mol/L의 황산에 의해서 중지시키고, 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 기록 및 분석하였다.
minibody 4종 클론이 인간 IGF1R 재조합 단백질에 농도 의존적으로 결합하고, 구체적으로, MKJP2가 가장 우수한 결합력을, 그 다음에 996과 1564가 비슷한 결합력을 보임을 확인하였으며, 1226은 그보다 약간 떨어지는 결합력을 보임을 확인하였다.
11-2: IGF1R 항체의 종간 교차 반응성의 ELISA 분석
실시예 9-2의 방법에 따라 제작한 1564 항-IGF1R 항체와 실시예 6-3에서 확보한 항-IGF1R 항체들의 종간 교차 결합 여부를 ELISA 기법을 통해 분석하였다. 이를 위해, 우선, 인간, 원숭이, 마우스 및 렛트 IGF1R 항원을 1 ug/ml로 희석하여 각 웰에 100 ul씩 넣고, 4 ℃에서 15시간 반응하여 플레이트 바닥에 코팅되게 하였다. 상등액을 제거한 후, 3% BSA가 포함된 PBS 버퍼 200 ul를 각 웰에 처리하여 비특이적인 결합을 차단하였다. 항-IGF1R 항체를 최고 농도 400 nM로 하여, PBSB (BSA 3% in PBS)에 5배씩 희석하여 상기 각 웰에 처리한 후, 37 ℃에서 1시간 반응하였다. 이어 PBS 버퍼를 이용하여 5회 세척한 후, 결합된 항체의 Fab 부분을 인지하는 항-인간 Fab HRP를 1:20000으로 희석하여 각 웰에 100 ul처리한 후 37 ℃에서 1시간 반응시켰다, 이어 PBS 버퍼로 5회 세척하여 TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440)를 사용하여 제조자의 방법대로 발색시켰다. 효소반응을 0.5 mol/L의 황산에 의해서 중지시키고, 마이크로 플레이트 리더기(Molecular device)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 수행 시 샘플이 많은 경우는 플레이트를 2개로 나누어 진행하였으며, 실험결과는 다음 표 15에 나타냈다.
구체적으로, 표 15에서 인간 IGF1R에 대한 이중특이항체들의 ELISA 결과, 1564 IgG와 이중특이항체들의 인간 IGF1R에 대한 ELISA 결과, 마우스 IGF1R에 대한 이중특이항체들의 ELISA 결과, 래트 IGF1R에 대한 이중특이항체들의 ELISA 결과, 원숭이 IGF1R에 대한 이중특이항체들의 ELISA 결과를 하기 표에 정리하였다.
아래 실험결과는 다양한 종의 동물모델을 이용하여 효능을 평가할 수 있는 장점을 보여주는 것으로, 본원발명에 따른 항체를 이용하여 다양한 종의 질환모델을 통한 치료제를 효능 평가가 가능함을 알 수 있다.
다양한 종의 IGF1R에 대한 항체 결합력의 ELISA 분석결과
실험구분 항체 클론 Ec50(nM)
인간 IGF1R에 대한 ELISA ch11F11-1564 0.914
ch11F11-48G5 1.21
ch11F11-54H4 2.88
ch11F11-60H6 10
ch11F11-B11 7.13
인간 IGF1R에 대한 ELISA 1564 IgG 0.0823
ch11F11-1564 0.379
마우스 IGF1R에 대한 ELISA ch11F11 N/A*
ch11F11-1564 3.02
ch11F11 N/A*
ch11F11-48G5 6.2
ch11F11-54H4 N/A
ch11F11-60H6 18.6
ch11F11-B11 148
래트 IGF1R에 대한 EKISA ch11F11 N/A*
ch11F11-1564 1.05
ch11F11-48G5 2.44
ch11F11-54H4 14.2
ch11F11-201** N/A*
ch11F11-1564 0.874
ch11F11-60H6 38
ch11F11-B11 35.1
원숭이 IGF1R에 대한 ELISA ch11F11 N/A*
ch11F11-1564 2.48
ch11F11-48G5 6.69
ch11F11-54H4 8.83
ch11F11-201** N/A*
ch11F11-1564 2.21
ch11F11-60H6 N/A
ch11F11-B11 180
*: not available**201: scFv form of Herceptin biosimilar
11-3: Affinity variant의 IGF1R에 대한 결합력 분석(FACS)
실시예 7에서 제작된 affinity variant들의 결합력을 IGF1R 단백질의 ECD에 대한 ELISA 수행 및 MCF-7에 대한 결합력을 FACS로 분석하였다.
1차 클론들에 대한 분석으로, 표 16은 1차 선별된 해당 클론들의 이중특이항체 형태에서의 IGF1R ECD 단백질에 대한 결합 ELISA 분석 결과이며, 표 17은 MCF-7 세포주에 결합을 FACS로 분석한 결과이다.
1차 선별된 해당 클론들의 이중특이항체 형태에서의 IGF1R ECD 단백질에 대한 결합 ELISA
항체 클론 Ec50(nM)
ch11F11-1564 0.442
ch11F11-A06 1.19
ch11F11-A07 1.2
ch11F11-B02 0.919
ch11F11-B09 1.08
ch11F11-1564 0.49
ch11F11-D03 0.666
ch11F11-E06 0.668
ch11F11-F06 0.467
ch11F11-H04(G) 0.67
Hu3A9-1564 0.144
Hu3A9-A02 0.13
Hu3A9-A07 0.125
Hu3A9-B10 0.156
Hu3A9-B01 0.145
Hu3A9-C04 0.107
Hu3A9-E09 0.159
MCF-7 세포주에 대한 결합을 FACS로 분석한 결과
Samples GEOmean
2nd Ab only 2.92
1564 parental 4.09
F06 5.02
A07 5.06
B02 4.54
B09 4.29
D03 4.09
E06 4.24
F06 6.33
C04 3.88
그 결과, F06이 가장 parental 클론 (1564 클론) 대비 세포 결합에서 가장 높은 결합력을 가진 클론으로 선정되었고 (affinity matured), C04는 parental (1564 클론) 보다 세포 결합력이 가장 떨어지는 클론으로 선정되었다(affinity reduced).2차 클론들에 대한 분석으로, 표 18은 2차 제작 방법에서 만들어진 클론들의 이중특이항체 형태에서의 IGF1R ECD 단백질에 대한 결합 ELISA이다.
2차 선별 클론의 IGF1R ECD 단백질에 대한 ELISA 결과
항체 클론 Ec50(nM)
Hu11F11(ver.2)-1564 0.259
ch11F11-1564 monovalent 0.347
Hu11F11(ver.2)-C04 0.15
Hu11F11(ver.2)-F06 0.147
Hu11F11(ver.2)-1564 0.864
ch11F11-F06 0.857
Hu11F11(ver.2)-VH2 135
Hu11F11(ver.2)-VH5 0.366
Hu11F11(ver.2)-1564 0.157
Hu11F11(ver.2)-VH7 402
Hu11F11(ver.2)-VH9 6.06
Hu11F11(ver.2)-VH16 0.236
Hu11F11(ver.2)-1564 0.149
Hu11F11(ver.2)-VH32 121
Hu11F11(ver.2)-VH35 0.167
Hu11F11(ver.2)-VH27 N/A*
2차 제작된 클론들 중 생산성 및 물성이 떨어지는 클론들을 제외한 뒤 FACS 분석을 수행할 클론들을 표 19와 같이 선정하였다.
FACS 분석을 수행할 클론들
결합력 category 항체 클론 비고
Parental 1564와 유사한 결합력을 가짐 C04 FACS 및 in vivo 분석 진행
F06 FACS 및 in vivo 분석 진행
VH5 FACS 및 in vivo 분석 진행
VH16 FACS 및 in vivo 분석 진행
VH35 FACS 및 in vivo 분석 진행
결합력이 50배 감소 VH9 FACS 및 in vivo 분석 진행
C12 물성이 좋지 않음
결합력이 100배 이상 감소 VH2 FACS 및 in vivo 분석 진행
VH6 물성이 좋지 않음
VH7 FACS 및 in vivo 분석 진행
VH27 물성이 좋지 않음
VH32 FACS 및 in vivo 분석 진행
도 4c는 해당 클론들의 MCF-7 세포주에의 결합을 FACS로 분석한 결과이며, 분석 클론들 모두 parental 클론인 1564 대비 MCF-7에 대한 결합력이 떨어졌다. 해당 결과는, ELISA에서 결합력 저하를 보인 클론들이 FACS에서도 결합력 저하를 보임을 보여준다. 선별된 항체 클론은 F06, C04, VH2, VH5, VH7, VH9, VH16, VH32이며, 이들 항체에 대한 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 대한 아미노산 서열은 상기 표 4 및 표 5에 나타냈다.
항체 클론 중, VH5, VH16, F06 variant 내에 존재하는 deamidation hot spot을 실시예 8-2의, 표 21에 따라 제거하여 mutant를 제조하고, 해당 variant들을 실시예 10에 따라 이중특이항체로 준비하였다. VH5, VH16의 경우 hu11F11(ver.2)와의 bivalent 이중특이항체로 제작하고, F06의 경우 hu11F11(ver.2)와의 monovalent 이중특이항체로 제작하였다. 준비한 이중특이항체를 이용하여, VH5, VH16, F06 의 3가지 variants(즉, 이중항체로 hu11f11-F06, hu11f11-VH5, hu11F11-VH16) 및 탈아미드화한 mutants(즉, 이중항체로 hu11f11-F06(de2)(StoP), hu11f11-VH5(de2)(StoP), hu11F11-VH16(de2)(StoP))의 MCF-7에 대한 결합력을 상기의 FACS 분석법에 따라 분석하였다. 상기 구체적 이중 항체의 구성성분은 상기 표 10에 기재되어 있으며, 이들 항체의 deamidation 자리 치환에 대해서는 상기 실시예 8-2의 표 14에 기재되어 있다.
상기 FACS 분석 결과를 다음 표 20에 나타내었다. 3가지 탈아미드화한 mutants (hu11f11-F06(de2)(StoP), hu11f11-VH5(de2)(StoP), hu11F11-VH16(de2)(StoP))는 모두 parental 항체(VH5, VH16, F06)대비 결합력이 감소하지 않은 것을 확인하였다.
Variant WT (de2)(StoP)
MFI MFI WT 결합력에 대한 결합력 %
F06 (de2)(StoP) 9.61 8.61 89.59
VH5(de2)(StoP) 6.44 8.03 124.69
VH16 (de2)(StoP) 6.13 6.42 104.73
* MFI = mean fluorescence intensity
Negative control (2ndary Ab only)'s MFI: 2.29
상기에서 준비된 이중특이항체를 이용하여, VH5, VH16, F06 의 3가지 variant와 탈아미드화한 mutant의 인간 IGF1R 단백질에 대한 결합력을 실시예 15-2의 방법에 따라 ELISA로 분석한 결과이다. 그 결과를 다음 표에 나타내었다. 3가지 Mutant들은 모두 parental 항체 대비 결합력이 감소하지 않은 것을 확인하였다.
Variant WT (de2)(StoP)
EC50 (nM) EC50 (nM) % WT
F06 (de2)(StoP) 0.112 0.0575 195
VH5 (de2)(StoP) 0.125 0.0561 222.81
VH16 (de2)(StoP) 0.143 0.122 117.21
11-4: Human IGF1R에 대한 BIAcore 분석
본 발명에 따른 항체와 인간 IGF1R간의 결합력을 분석하고자 하였다.
1564 클론의 IgG 형태에 대해서 SPR 분석으로 인간 IGF1R 에 대한 결합 정도를 분석하였다. 항원인 인간 IGF1R ECD에 결합된 His tag에 대한 항-his 항체를 acetate pH4.0 buffer에 20μg/ml 로 희석한 뒤, CM4 chip에 amine coupling 방법으로 reference/ analytic channel에 target RU를 10,000 RU로 immobilize 하였다. Capture 동안, running buffer로는 PBS를 사용하였다. Flow rate은 30 μL/min을 유지하였다. Association/dissociation 동안 flow rate는 40 μL/min, running buffer로는 PBS를 사용하였다. association/disssociation은 각각 5분, 20분 이었다. 분석은, baseline 1, activation (EDC+NHS), 인간 IGF1R loading, quenching (1 M Ethanolamine), baseline 2, association, dissociation 순으로 이루어졌다. Evaluation은 bivalent 모델을 사용하였으며, Biacore T200 Evaluation software (version 1.0, S/N: 04Y15X11-0149)를 사용하여 분석하였다.
분석 결과, 1564 IgG항체의 KD는 2.5305 X 10-9 nM으로, F06 IgG 항체는 4.7802 X 10-7 nM으로 확인되어, 모두 인간 IGF1R에 높은 결합력을 보임을 확인하였다. 분석의 결과는 도 3b 이다. 특히 1564 클론을 IgG 형태로 제작하였을 때 인간 IGF1R에 2.5305 X 10-9 nM의 해리 상수를 보임을 확인하여, 1564는 그 형태에 따라 결합력에 큰 변함이 없음을 확인하였다.
실시예 12. 항-IGF1R 항체의 인간 IGF1R를 발현하는 세포주 및 뇌 내피세포(brain endothelial cell)에 대한 결합력 분석
12-1: MCF-7에 대한 FACS 분석
실시예 9-1에서 제조한 996, 1226, 및 1564 클론의 minibody 형태가, 세포 표면의 endogenous 한 IGF1R에 결합하는지 확인하기 위하여, 인간 IGF1R를 발현하는 세포주 및 뇌내피세포(brain endothelial cell)에 대한 결합력 분석을 FACS로 수행하였다. Periplasmic extract와 IGF1R이 과발현한다고 알려진 MCF-7, 유방암 세포주와의 결합 정도를 FACS로 확인하였다.
구체적으로, 샘플 당 0.43 x 106 의 MCF-7 세포주에, 상기 3종의 minibody를 각각 20 ug/ml로 희석 후, 처리하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. PBS 버퍼를 이용하여 2회 세척 후, 항-human FITC를 1:500으로 희석하여 처리, 4 ℃에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS 버퍼를 이용해 2회 세척 후, FACSCalibur 기기를 이용하여 항-IGF1R minibody가 결합된 정도를 측정하였다. 대조군으로 secondary antibody 만 처리한 MCF-7 세포를 사용하였다. 상기 실험결과를 도 4a에 나타냈다.
실시예 7 및 실시예 9-2로 제작된 A02, A06, A07, B01, B02, B09, B10, C04, D03, E06, F06, H04(Gly), H04(Val), VH2, VH5, VH7, VH9, VH16, VH32, VH35를 상기와 동일한 방법으로 MCF-7에 대한 결합력을 분석하였다. 1564 클론을 실시예 14-2 방법으로 제작하고 parental 클론으로 비교하였으며, secondary antibody 만 처리한 MCF-7 세포를 대조군으로 사용하였다. 분석 결과는 도 4c에 나타냈다.
상기 실험 결과에 따라, 해당 샘플의 MFI(Mean Fluorescence Intensity)로 나타냈고, 테스트한 3종의 minibody 내의 scFv 및 이중특이항체 형태의 affinity variant 및 parental 클론 (1564 클론)이 세포 표면에 발현되는 endogenous IGF1R에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 해당 결과는 상기 예에서 확보된 클론들이 체내에 실제로 존재하는 형태의 IGF1R 에 결합하여 의도한 목적으로 사용될 수 있음을 보여주는 결과이다.
12-2: JIMT-1 및 BT474에 대한 FACS 분석
실시예 12-1에서 사용한 MCF-7 세포주를 대신하여, JIMT-1 및 BT474 유방암 세포주를 사용한 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 방법으로 실시예 14-1에서 제조한 996, 1226, 및 1564 클론의 minibody 형태가, 세포 표면의 endogenous 한 IGF1R에 결합하는지 확인하였다. 상기 실험결과를 도 4a에 나타냈다.
상기 실험 결과에 따라, 해당 샘플의 MFI(Mean Fluorescence Intensity)로 나타냈고, 테스트한 3종의 minibody 내의 scFv가 IGF1R 발현 다양한 세포주 표면의 endogenous IGF1R에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
12-3: 마우스 뇌 내피세포에 대한 FACS 분석
실시예 9-2 방법으로 제작한 1564 클론의 이중특이항체 형태와 실시예 14-3방법으로 제작한 1564 클론의 IgG 형태가 마우스의 뇌 내피세포인 bEND.3에 결합하는지를 분석하였다. 이 때 secondary 항체만 처리 그룹 및 치료 항체 단독 IgG (CH11F11) 처리 그룹을 음성대조군으로 사용하였다. FACS 분석법은 실시예 12-1 및 12-2와 동일하게 수행하였다. 분석 결과는 도 4b에 나타냈다.
시험한 테스트 클론 모두 음성 대조군을 제외하고 bEND.3에 결합력을 나타냈다. 해당 결과를 통해 다양한 형태의 1564 클론이 뇌 내피세포 표면에 발현하는 IGF1R에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 13. 항-IGF1R 항체의 intracellular internalization 분석
13-1: MCF-7 internalization assay - 1564, 996, 1226, MKJP2 (minibody)
실시예 9-1에서 제조한 996, 1226, 1564 및 MKJP2 클론의 minibody 형태가, IGF1R를 발현하는 세포주에서 intracellular internalization 되며, 세포내로 도입된 항체는 분해되지 않고 RMT Pathway을 거치는지를 확인하고자 하였다. 항-IGF1R 항체가 BBB 통과능을 향상시키는 셔틀로 사용되기 위해서는 해당 항체가 BBB를 구성하는 brain endothelial cell 내로 internalize 됨이 선행되어야 한다.
IGF1R을 발현하는 MCF-7 세포주를 이용하여 발명에 따른 항체들이 세포 내로 internalize 되는지를 분석하였다. 구체적으로, 8-well slide chamber 내에 30,000개의 MCF-7 세포주를 plating 한 뒤, 1일간 배양하였다. 실시예 9-1에서 제조한 996, 1226, 1564 및 MKJP2 클론의 minibody 항체를 각각 5 μg/ml씩 4 ℃에서 각 well에 2시간 동안 처리하고 차가운 DMEM 배양액으로 3번 세척하고, Alexa488-conjugated anti-human Fc 항체를 역시 4℃에서 1시간 처리하였다.
항체 complex의 internalization을 테스트하기 위하여 해당 plate를 CO2 incubator로 옮겨 37 ℃에서 30분간 incubation하였다. 100% 메탄올을 넣어 culture를 고정함과 동시에 반응을 종료하였다. 고정 후에는 PBS로 3번 세척하였다. 형광 현미경 상에서 항체의 internalized 정도를 green filter 영역(Alexa488)에서 이미징하였다. 이미징 시에, DAPI를 이용하여 세포 내 핵을 염색하여 각 세포의 위치를 확인하였다. 상기 실험결과를 도 5a에 나타냈다.
상기 실험 결과로부터, MCF-7 세포주를 이용한 실험에서도 테스트한 4종 항체 모두 internalization이 잘 일어남을 볼 수 있었으며, 특히 MKJP2와 1564의 internalization이 다른 클론에 비해 많이 일어나는 것을 알 수 있었다.
13-2: MCF-7 internalization assay - C04, F06, VH5, VH16, VH35, VH9, VH2, VH7, VH32
IGF1R에 대한 결합력을 변화시킨 1564 variant 들의 세포 표면 IGF1R 결합을분석하기 위해 IGF1R을 발현하는 MCF-7 세포주를 이용하여 FACS 분석을 하였다. scFv 형태의 이중항체로 제작된 IGF1R 항체를 10 ug/mL 농도로 2 X 10E5 의 MCF7 세포에 30분간 처리하였다. 1% BSA가 첨가된 PBS 버퍼로 세척한 후 인간 항체를 detection 하는 FITC가 결합된 2차 항체를 1시간 동안 처리하였다. PBS 버퍼로 세척한 후 FACS 분석을 통해 결합력이 변화 다양한 variant 들의 세포외 결합 및 internalization 을 확인하였다.
하기 표 22의 결과처럼 1564 IGF1R 항체가 포함된 이중항체는 냉장 조건보다 37℃ 조건에서 internalization 이 증가하여 intensity가 증가됨을 확인하였으며 세포 결합 정도가 높았던 F06 클론 또한 internalization이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 1564 variant 들이 세포에 잘 결합하여 결합 의존적으로 세포내로 internalization 됨을 시사하는 것이다.
Sample GeoMean
Internalization at 37℃
Not Treated 1.88
2nd Ab only 2.86
hu3A9 WT 3.4
hu3A9x1564 WT 7.72
hu11F11 WT 3.18
hu11F11x1564 WT 7.34
hu3A9x1564_C04 7.23
hu3A9x1564_F06 19.8
hu11F11x1564_VH5 6.1
hu11F11x1564_VH16 5.83
hu11F11x1564_VH35 7.28
hu11F11x1564_VH9 5.01
hu11F11x1564_VH2 3.19
hu11F11x1564_VH7 3.84
hu11F11x1564_VH32 3.24
13-3: 인간 brain endothelial cell에 대한 internalization 분석
실시예 9-2 및 9-4에서 제작한 1564 클론의 bivalent 및 monovalent 형태가 인간 유래 brain endothelial 세포 (primary human microvascular brain endothelial cell (HMBEC))로 internalize 되는지 분석하였다. 치료 항체 IgG (11F11)를 음성대조군으로 사용하였다.
HMBEC (Cell Systems, cat#: ACBRI376)을 12 웰 플레이트에 90% confluency로 플레이팅한 뒤 테스트 항체를 투여하였다. 그 다음 날 4% 파라포름알데히드로 고정 후 PBS 린스 후에 3% BSA와 TritonX가 포함된 solution을 50분간 사용하여 blocking 및 permeabilize하였다. PBS로 린스 후 인간 Fc에 대한 항체 (Goat anti-human 항체)를 2시간 30분간 투여하고 PBS 린스 후, 해당 primary 항체에 대한 secondary 항체를 1시간 동안 투여하였다. PBS 린스 후, 핵 염색을 위하여 1:1000으로 희석된 농도로 Hoechst를 10분간 staining하였다. 결과물은 LSM 780 NLO EC Plan-Neofluar 100X / 1.3 Oil 조건으로 공초점 현미경으로 분석하였다. 상기 실험결과를 도 5b에 나타냈다.
1564 클론의 bivalent 및 monovalent 형태는 음성대조군인 치료 항체 (11F11) 대비 증가된 internalization을 보여주었다. 이 결과는, 상기에 기술된 항-IGF1R 항체가 치료 항체와 연결된 다양한 형태의 이중특이항체로서, BBB를 구성하는 brain endothelial cell 안으로 해당 치료 항체를 효과적으로 internalize 시킬 수 있음을, 따라서 궁극적으로 해당 치료 항체의 BBB 통과능을 증대시킴을 시사한다.
13-4: 인간 brain endothelial cell 내에서 cellular fate의 분석
만일, 해당 항체가 internalize 된 후 세포 내의 리소좀 관련 마커와 colocalize한다면 해당 항체는 brain endothelial cell 내에서 분해되어 버리기 때문에 BBB를 통과하지 못한다. 이와 반대로, exocytosis 와 관련된 early endosome 혹은 BBB 통과와 관련되었다고 알려진 마커와 colocalize 한다면, 해당 항체는 brain endothelial cell로 internalize된 후 뇌 쪽으로 빠져나가는 receptor-mediated transcytosis에 의해 BBB를 통과할 것으로 예상된다.
실시예 13-2에서 테스트된 항체 중 1564 bivalent형태를 동일한 방식으로 HMBEC에 처리한 뒤 세포 내에서 해당 항체들이 어느 cellular component와 colocalize하는지 분석하였다. 다만, blocking 및 permeabilization 후 투여 항체를 detection하는 Goat anti-human 항체와 함께, 다음의 항체들을 각각 동시에 투여하였다.
*Anti-Cathepsin D: 리소좀 마커
*Anti-Caveolin-1: caveolin-mediated transcytosis 마커 (BBB 통과의 주요 메커니즘으로 생각됨)
*Anti-EEA1: early endosome 마커
나머지 방법들은 실시예 13-2와 동일하되, 상기의 마커에 대한 secondary 항체들을 각각 처리하였다.
분석 결과는 도 5c에 나타냈다. 1564 클론은 이중특이항체 형태에서 모두 Cathepsin D와 colocalize하지 않았으며, 대신 caveolin-1 및 EEA1과 세포막 및 세포 내부에서 colocalize하였다. 이 결과는, 1564 클론이 internalize 된 후 세포 내의 분해 메커니즘을 거치지 않고 RMT를 통해 BBB를 통과할 수 있음을 나타낸다.
실시예 14. 항-IGF1R 항체의 IGF1R 신호전달에 미치는 영향 분석
14-1: MCF-7 세포주의 IGF1R에 의한 proliferation assay
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체가 IGF1R (IGF1 수용체)와 그 리간드인 IGF1 간의 결합을 방해하는지 여부를, IGF1에 의한 세포 증식 효능을 이용하여 확인하였다.
실시예 9-1에서 제조한 996, 1226, 1564 및 MKJP2 클론의 minibody 항체를 각각 400 nM부터 5배씩 희석하여 희석 샘플을 제작 후, 20 ng/ml 농도의 25 μl IGF1에 각 25 μl 씩 처리하였다. IGF1R을 발현하는 MCF-7 세포주를 배양하고, 실험 당일 배지를 제거하고 계대하고, IGF1과 테스트 항체가 분주되어 있는 96 well plate의 각 well 당 20,000개씩(50 μl에 해당) 처리하였다.
3일간 적절한 온도 및 습도에서 배양하다가 세포 생장 정도를 측정하기 위하여 CCK-8 reagent를 10 μl씩 처리하고 CO2 incubator에서 4-5 시간 incubation하였다. 그 뒤 꺼내어 spectrophotomer의 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실험결과를 도 6a에 나타냈다.
상기 실험 결과로부터, 본 발명에 따른 항체는, IGF1의 IGF1R에 대한 signaling에 의한 MCF-7의 세포 증식을 저해하지 않는 것으로 확인되었다. 대조군으로 사용한 Imclone사의 항-IGF1R 항체는 IGF1에 의한 MCF-7의 세포 증식을 처리 농도에 비례하여 저해하였다. 따라서, 본 발명의 항체는 BBB를 구성하는 endothelial cell에 발현하는 IGF1R에 결합하여 BBB 통과능을 가지나, 동시에 체내 IGF1에 의한 signaling을 저해하지 않는 항체이므로, 본 발명에 따른 항체는 BBB 셔틀로 사용될 수 있음을 확인하였다.
14-2: MCF-7 세포주의 IGF1R에 의한 signaling component의 저해 분석
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체가, IGF1R 발현 세포와 결합하는 IGF1이 signaling을 세포 내로 전달할 때 그 signaling의 receptor 및 downstream signaling component에 관여하는지 여부를 확인하고자 실험하였다. 즉, IGF1R을 발현하는 MCF-7 세포주에 항-IGF1R 항체를 투여하고, 이에 의한 세포 내의 전체 IGF1R, 인산화된 IGF1R, IGF1R의 downstream factor인 전체 Akt, 인산화된 Akt 양을 분석하였다.
MCF-7 cell을 배양하다가, 항-IGF1R 항체를 처리 20시간 전에 그 배양액을 serum이 불포함된 배양액으로 변경하였다. 실시예 9-1에서 제조한 996, 1226, 1564 및 MKJP2 클론의 minibody 항체를 각각 100 nM를 상기 MCF-7 세포주에 처리 후 1시간 뒤에 200 ng/ml의 IGF1을 처리하였다. 20분 뒤, PBS로 세포를 씻은 뒤 protease와 phosphatase inhibitor cocktail이 첨가된 M-PER로 세포를 용해하였다. BCA assay kit를 사용하여 단백질 농도를 측정한 뒤 12.5 μg의 단백질을 SDS-PAGE gel에 로딩하여 electrophoresis 시킨 뒤, PVDF membrane에 transfer하였다. 블로킹은 5%의 BSA가 포함된 PBST (0.1% Tween 20)와 함께 1시간 동안 gentle shaking으로 상온에서 수행하였으며, 그 뒤에 IGF1R 혹은 Akt에 대한 primary antibody를 4 ℃에서 천천히 흔들면서 하룻밤 동안 처리하였다. beta actin antibody는 loading control로 사용되었다. 세척한 후에 secondary antibody를 1시간 동안 상온에서 천천히 흔들면서 처리한 뒤 세척하고, ECL solution을 첨가하고, Image Quant Las 4000를 이용하여 시그널을 확인하였다. 상기 실험결과를 도 6b에 나타냈다.
상기 실험 결과로부터, 본 발명에 따른 항체는 세포 내의 전체 IGF1R, 인산화된 IGF1R, IGF1R의 downstream factor인 전체 Akt, 인산화된 Akt 양에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
14-3: 마우스 뇌내피세포의 IGF1R에 의한 signaling component의 저해 분석
본 발명에 따른 항-IGF1R 항체가, 마우스 유래 brain endothelial 세포에 IGF1이 signaling을 세포 내로 전달할 때 그 signaling의 receptor 및 downstream signaling component에 관여하는지 여부를 확인하고자 실험하였다. 즉, IGF1R을 발현하는 것으로 확인된 bEND3 세포주에 실시예 9-2의 방법으로 제작된 11F11-1564, 3A9-1564 (CH11F11 와 ch3A9, 항 α-syn 단독항체로서 대한민국 공개특허 2018-0081465에 기재된 것) 및 실시예 9-3의 방법으로 제작된 1564 클론의 IgG 형태를 투여하고, 이에 의한 세포 내의 전체 IGF1R, 인산화된 IGF1R, IGF1R의 downstream factor인 전체 Akt, 인산화된 Akt 양을 분석하였다.
bEND3 cell을 배양하다가, 항-IGF1R 항체를 처리 20시간 전에 그 배양액을 serum이 불포함된 배양액으로 변경하였다. 실시예 9-2의 1564 및 MKJP2 클론의 이중특이항체를 각각 100 nM을 상기 bEND 세포주에 처리 후 1시간 뒤에 200 ng/ml의 IGF1을 처리하였다. 20분 뒤, PBS로 세포를 씻은 뒤 protease와 phosphatase inhibitor cocktail이 첨가된 M-PER로 세포를 용해하였다. BCA assay kit를 사용하여 단백질 농도를 측정한 뒤 12.5 μg의 단백질을 SDS-PAGE gel에 로딩하여 electrophoresis 시킨 뒤, PVDF membrane에 transfer하였다. 블로킹은 5%의 BSA가 포함된 PBST (0.1% Tween 20)와 함께 1시간 동안 gentle shaking으로 상온에서 수행하였으며, 그 뒤에 IGF1R 혹은 Akt에 대한 primary antibody를 4 ℃에서 천천히 흔들면서 하룻밤 동안 처리하였다. beta actin antibody는 loading control로 사용되었다. 세척한 후에 secondary antibody를 1시간 동안 상온에서 천천히 흔들면서 처리한 뒤 세척하고, ECL solution을 첨가하고, Image Quant Las 4000를 이용하여 시그널을 확인하였다. 상기 실험결과를 도 6c에 나타냈다.
상기 실험 결과로부터, 본 발명에 따른 항체는 세포 내의 전체 IGF1R, 인산화된 IGF1R, IGF1R의 downstream factor인 전체 Akt, 인산화된 Akt 양에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
실시예 15. 항-IGF1R 항체의 in vivo BBB 통과능 분석 (co-localization assay)
15-1. minibody의 brain vessel과의 colocalization
본 발명의 항-IGF1R 항체들이 in vivo에서 brain vasculature를 따라 분포하는지를 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.
구체적으로, 6-8주령 BALB/c mouse 수컷의 꼬리 정맥에 PBS buffer 혹은 10 mg/kg의 IgG control 및 실시예 9-1에서 제조한 996, 1226 및 1564 클론의 minibody 항체를 각각 단회 투여하였다. 4시간 뒤 mouse brain을 충분한 양의 0.9 % NaCl 용액 및 4% paraformaldehyde로 intracardially perfuse하였다. 고정된 brain은 적출하여 20 μm으로 section 후, 뇌 혈관과 IGF1R 테스트의 colocalization을 확인하기 위하여 혈관 마커인 anti-mouse CD31 및 anti-human Fc antibody로 co-staining 하였다. CD31은 Alexa 488이 conjugate된 secondary antibody로, human Fc는 Alexa 594가 conjugate된 secondary antibody를 이용하여, 형광 현미경 하에서 이미징하였다. 상기 실험결과는 도 7a에 나타냈다.
상기 실험 결과로부터, 본 발명에 따른 리간드 결합 비저해 클론(non-blocking antibodies)들은 우수한 BBB통과능을 가짐을 확인하였으며, 항체가 뇌혈관과 colocalization하는 정도를 면역염색으로 분석하는 방법(Neuron (2016) Yu-Zuchero et al.)에 따라, 뇌조직을 혈관 마커(anti-CD31, 초록색)과 인간항체(anti-human Fc, 붉은색)로 염색한 결과, 본원의 일예에 따른 리간드 결합 비저해 클론들은 IgG 대조군에 비해 높은 colocalization정도를 보였다.
15-2. 이중특이항체의 in vivo BBB 통과능 분석
본원 항-IGF1R 항체의 in vivo BBB 통과능을 normal rat에서 확인하려 하였다. SD rat에 10 mg/kg 혹은 30 mg/kg 의 파킨슨 병 치료 단독항체 (11F11) 혹은 1564 클론이 bivalent 형태로 결합된 이중특이항체 (11F11-1564)를 미정맥에 단회 투여 후 24시간 째에 그 CSF 및 brain에서의 항체량을 질량 분석으로 분석하였다. 질량 분석 방법은 구체적 질량 분석 방법은, Sv-ARBEC을 permeable membrane 위에 단일층으로 플레이팅하고 해당 BBB 시스템의 저항값 (TEER) 및 sucrose 통과 정도를 바탕으로 해당 시스템의 integrity를 미리 평가하였다. 이 때 sv-ARBEC은 해당 시스템의 integrity에 도움을 주는 것으로 확인된 래트 astrocyte 배양 medium (RAS-CM)을 처리하였다. 테스트항체인 1564, 48G5, 54H4, 60H6, B11의 bivalent 이중특이항체를 membrane 위에 처리한 뒤 90분 후 bottom chamber에서의 항체량을 질량 분석으로 분석하였다. 질량 분석을 위해서 각 항체 Fc 및 scFv에서의 signature peptide가 분석된 후 사용되었다. 이 때 파킨슨 병 치료항체 단독 (11F11) 및 해당 항체에 Herceptin의 바이오시밀러의 scFv 형태를 결합시킨 이중특이항체를 음성대조군으로 사용하였다. 해당 시스템에는 BBB 를 통과하지 않는 것으로 알려진 A20.1 항체 (national research council 제작)를 통과시켜 해당 시스템의 검량한계선을 정하였다. 질량분석에서 도출된 결과값을 선행문헌에서 알려진 공식에 대입하여 Papp 값을 결정하였으며, 이 값은 in vitro에서의 BBB 통과능 정도를 나타낸다.
분석 결과, 1564 클론이 결합된 이중특이항체는 항IGF1R 항체가 결합하지 않은 치료 항체 대비 높은 CSF, brain 통과능을 보였으며 해당 효능을 10, 30 mg/kg dose 모두에서 확인되었다. 이중특이항체는 30 mg/kg dose에서 단독항체 대비 최대 약 4.5배 이상의 brain으로의 통과능을 보였다.
1564 클론을 실시예 9-2 및 9-4에 따라 bivalent 및 monovalent 형태로 제작한 뒤 상기와 동일한 방식으로 30 mg/kg 혹은 60 mg/kg으로 투여 후 24시간 째에 CSF와 brain에서의 항체량을 분석하였다. 1564 클론이 결합된 두 가지 형태의 이중특이항체는 단독항체 대비 높은 CSF, brain 통과능을 보였다. 특히 bivalent 형태는 monovalent 형태 대비 높은 BBB 통과능을 보였으며, 이는 최대 약 5배의 brain 통과능 증대였다.
도 7b 및 도 7c의 결과는, 1564 클론이 다양한 형태로 치료 항체에 결합되었을 때에도 해당 치료 항체의 체내 BBB 통과능을 향상시킴을 나타낸다.
실시예 2에 따라 제작된 1564 클론의 affinity variant들은 parental 클론 대비 serum PK의 증대가 예상되었다. 따라서 serum 내에 장기간 잔존하여 계속적으로 BBB 유입량을 유지함으로써 그 BBB 통과능이 향상될 것으로 기대되었다. 실시예 9-2에 따라 bivalent 형태 혹은 9-4에 따라 monovalent 형태로 제작된 affinity variant들을 SD rat에 30 mg/kg으로 미정맥 투여한 뒤 0, 24, 48 시간 째에 혈액을 안구정맥총에서 채취하였다. 테스트 항체들은 치료 항체의 backbone이 키메릭 혹은 인간화된 항체인가에 따라 두 가지 실험으로 나뉘었으며, 실험에 사용된 해당 variant들의 이중특이항체는 하기 표와 같다.
in vivo BBB 통과능 분석에 사용된 이중특이항체
Chimeric backbone clones Humanized Backbone clones
Ch11F11-1564 bivalent Hu11F11(ver.2)-1564 bivalent
Ch11F11-1564 monovalent Hu11F11(ver.2)-VH5 bivalent
Ch11F11-C04 monovalent Hu11F11(ver.2)-VH16 bivalent
Ch11F11-F06 bivalent Hu11F11(ver.2)-VH35 bivalent
Ch11F11-F06 monovalent Hu11F11(ver.2)-VH9 bivalent
** Hu11F11(ver.2)-VH2 bivalent
** Hu11F11(ver.2)-VH7 bivalent
** Hu11F11(ver.2)-VH32 bivalent
혈액 내 항체량은 ELISA로 분석하였다. 96 웰 플레이트에 goat anti-human Fc 항체를 코팅한 뒤, 적당량 희석된 시료를 처리 후 anti-human Fab HRP conjugated 항체로 detection하였다. 분석 결과는 도 7d 및 도 7e에 나타냈다. 그 결과, 1차 시험군에서는 1564의 monovalent, F06의 monovalent, C04의 monovalent가 parental 1564 클론의 bivalent 대비 길어진 serum PK를 보였다. 2차 시험군에서는 VH35 bivalent 군을 제외하고 VH2, VH5, VH7, VH9, VH16, VH32의 bivale nt 형태들이 parental 1564 bivalent 대비 증대된 serum PK를 보였다.
해당 그룹들의 BBB 통과능을 분석하기 위하여 48 시간 째에 해당 래트에서 CSF를 추출하여 동일한 ELISA로 분석하였다. 분석 결과는 도 7f에 나타냈다.
1차 시험군에서는 증대된 serum PK를 보였던 1564 monovalent, F06 monovalent, C04 monovalent 형태가 parental 1564 bivalent 대비 증대된 CSF 항체량을 보였다. 2차 시험군에서도 역시 증대된 serum PK를 보인 VH2, VH5, VH7, VH9, VH16, VH32의 bivalent 들이 parental 1564 bivalent 대비 증대된 CSF 항체량을 보였다. VH35는 parental 1564 bivalent 대비 짧아진 serum PK 및 CSF 항체량을 보였다.
도 7d, 도 7e 및 도 7f의 결과는 serum 에서의 PK가 지속적인 항체의 BBB 유입으로 인하여 항체의 BBB 통과능에 있어 중요한 요소이며, BBB 셔틀을 가지며 serum PK가 증대된 이중특이항체의 BBB 통과능이 증가함을 보여준다. 특히 CSF 항체량이 가장 높은 F06 monovalent 형태의 경우, parental 1564 bivalent 대비 약 5배 정도 높은 CSF 통과능을 보였다. 1564 bivalent 항체가 CSF에서 단독항체 대비 약 3배 증가된 CSF 통과능을 보인 바 있으므로, F06 monovalent 형태는 단독항체 대비 최대 약 15배 증가된 BBB 통과능을 보일 것으로 예상된다.
실시예 16. 항-IGF1R 항체의 에피토프 맵핑
16-1. 항-IGF1R 항체와 boiled, native IGF1R 단백질의 ELISA
본 발명에 따른 이중항체가 포함하는 항-IGF1R 항체 클론들이 선형 혹은 conformational epitope을 인식하는지 확인하고자 하였다. 1564, 48G5, 54H4, 60H6, B11의 bivalent 이중특이항체과 native 인간 IGF1R ECD 단백질 혹은 해당 단백질에 열을 가한 단백질 (boiled IGF1R)과 대한 ELISA를 수행하였다. ELISA 방법은 실시예 11에 나타난 방법과 동일하였다. 분석 결과는 하기 표에 나타냈다.
클론명 Native IGF1R에 대한 EC50(nM) Boiled IGF1R에 대한 EC50(nM)
ch11F11-1564 0.914 N/A*
ch11F11-48G5 1.21 N/A
ch11F11-54H4 2.88 N/A
ch11F11-60H6 10 N/A
ch11F11-B11 7.13 410
*N/A: Not available상기 클론들은 native 인간 IGF1R ECD에 실시예 15에서의 결과와 유사한 결합력을 보인 반면, 열을 가해서 3차 구조를 파괴한 boiled 인간 IGF1R ECD에는 모두 결합하지 않았다. 이는 본원의 항-IGF1R 항체가 선형이 아닌 conformational epitope에 결합함을 의미한다.
16-2. 항-IGF1R 항체의 에피토프 맵핑
1564 클론의 Conformational epitope을 분석하기 위하여 다음과 같이 alanine scanning을 수행하였다. IGF1R발현도가 낮은 것으로 확인된 난소암 세포주인 OVCAR3 세포에 N-말단에는 eGFP tag이 융합되고 C-말단 kinase domain은 제거된 IGF1R 라이브러리를 발현시켰다. IGF1R 라이브러리는 IGF1R 표면의 잔기들이 alanine으로 치환된 돌연변이들을 포함한다. 준비된 라이브러리를 OVCAR3 세포에 transfection하였다. IGF1R의 발현이 확인된 세포들에 대해서 1564 항체를 처리하였으며 이후 DyLight650가 표지된 이차항체를 처리하여 형광표지하였다. 표지된 세포들을 IGF1R 발현 유무와 IGF1R의 발현과 1564 결합유무에 따라 분류한 후 이들에 대해 일루미나 HiSeq기법으로 RNA deep sequencing을 수행하여 해당 세포군에서의 각 alanine 돌연변이의 빈도를 분석하였다. 해당 빈도수는 wilde type IGF1R을 발현한 세포에 대한 결과로 정규화 한 후 상대 빈도를 계산하여 1564가 표지된 세포군에서 그 숫자가 감소한 돌연변이들을 선별해 내었다.
이러한 관찰을 토대로, 이러한 관찰을 토대로, 1564의 에피토프는 FN2 도메인에 위치함을 알아냈으며 이에 속하는 잔기는 Y775, P776, F778, R650, S791, L798임을 알아내었다. 해당 결과 및 1564 클론이 인식하는 시퀀스는 도 9에 나타냈다. 이 잔기들은 선행 문헌에 따르면 IGF1의 결합에 관여하지 않으므로 해당 결과는 실시예 16-1 에서 1564가 보이는 성질을 충실하게 설명하고 있다.
실시예 17. 단독항체 및 이중항체의 항원 결합력 비교
17-1: α-syn 항원에 대한 단독항체 및 이중항체의 결합력
IGF1R 항체가 scFv 형태로 IgG 형태의 α-syn 항체와 연결시켰을 때 α-syn 항체의 결합력에 대한 영향을 분석하였다.
1 ug/ml 농도로 96웰 플레이드에 18시간 동안 α-syn aggregate를 coating 하였으며 세척 후 각 항체는 400 nM 에서 5배씩 희석하여 결합시켰다. 결합된 항체는 항-인간 Fc-HRP를 결합시킨 후 TMB 용액을 첨가하여 발색시켜 항체의 결합 정도를 확인하였다.
도 10a의 결과처럼 α-syn aggregate에 대한 결합력은 단독항체나 이중항체에서 동일함을 확인하였다.
17-2: IGF1R 항원에 대한 단독항체 및 이중항체의 결합력
IGF1R 항원에 대한 α-syn 단독항체와 이중항체의 결합 정도를 비교하기 위해 이전과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
도 10b의 결과처럼 IGF1R scFv 항체를 갖고 있는 이중항체는 농도의존적으로 잘 결합하였으나 IGF1R 항체 부위가 없는 단독항체는 결합하지 않음을 확인하였다.
17-3: α-syn 인간화 항체들의 결합력 분석
실시예 17-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 키메릭 이중항체와 인간화 이중항체간의 결합력 차이를 분석하였다.
도 10c의 결과처럼 인간화 이중항체들(Hu11F11 ver2, 3, 또는 4와 1564의 조합)은 키메릭 이중항체와 유사한 수준으로 α-syn 응집체와의 결합력을 보유하고 있으며 IGF1R scFv가 하나인 monovalent 이중항체도 키메릭 항체와 유사한 결합력을 보임을 확인하였다.
실시예 17-2 와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 키메릭 이중항체와 인간화 이중항체간의 IGF1R 결합력을 분석한 결과 도 10d처럼 모든 이중항체 (Hu11F11 ver2, 3, 또는 4와 1564의 조합)가 동일한 결합력을 보였으며 IGF1R scFv 가 없는 단독항체는 결합하지 않음을 확인하였다.
이러한 결과는 인체내에서 면역원으로 작용할 수 있는 마우스항체 부위를 교체하기 위해 인간화 하였을 때 α-syn 응집체 및 IGF1R에 대한 결합력에 변화가 없었음을 시사하는 것으로 동일한 활성을 보유하고 있음을 의미하는 것이다.
17-4: 단독항체와 이중항체의 식세포작용 비교
식세포작용은 대식세포의 다양한 수용체들이 관여하여 세포외 불필요한 물질들을 제거하는 작용을 의미한다. 다양한 단백질 응집체들은 면역반응이나 염증반응을 유도하여 인체에 악영향을 주게 되는데 특히 α-syn 응집체의 제거를 위해 항체를 투여하였을 때 항체의 Fc 부위와 세포 표면의 FcrR 와의 상호작용을 통해 촉진되는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 단독항체와 IGF1R scFv가 연결된 이중항체의 식세포작용에 대한 활성을 비교하였다.
단독항체와 이중항체의 식세포작용을 비교하기 위해 마우스에서 유래한 BV-2 미세아교세포를 이용하였다. BV-2 세포는 RPMI1640 배지로 배양하였으며 2 X 106 cells/ml로 준비하여 U-bottom 96well plate에 100 uL씩 분주하였다. 10 ug/ml의 α-syn 응집체와 25 ug/ml 항체는 RPMI1640 배지로 희석하여 섞어준 후 상온에서 20분간 방치하였다. α-syn 응집체와 항체 혼합물을 BV-2 세포에 처리한 후 15분간 방치하였다. 1200 rpm 으로 원심분리하여 상층액의 α-syn 응집체를 제거하였으며 세포표면에 결합된 응집체 또는 항체를 제거하기 위해 PBS, pH2.5 버퍼로 3회 세척하였다. 세포는 4% paraformaldehyde로 고정시킨 후 PBS 버퍼로 세척하였다. 세포내로 phagocytosis된 응집체와 항체를 확인하기 위해 0.5% triton X-100을 첨하여 세포막을 느슨하게 만들었으며 PBS 버퍼로 세척 후 pan-α-syn 항체를 1시간 동안 처리하였다. 결합된 pan-α-syn 항체는 anti-rabbit-alexa-488 항체를 1시간 처리한 후 FACS 분석을 통해 대식작용에 의해 세포내로 들어간 응집체를 확인하였다.
도 10e의 결과처럼, normal human IgG는 대식작용에 영향을 주지 않았으며 α-syn 항체를 처리하였을 때 α-syn 응집체의 대식작용이 증가함을 확인할 수 있었다. 단독항체와 이중항체를 비교하였을 때 유사한 수준으로 대식작용이 일어남을 확인하여 IgG C-말단 부위에 결합된 scFv 형태의 IGF1R 항체가 α-syn 항체의 작용에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
실시예 18. 이중특이항체의 효능 평가
실시예 10에 따라 키메릭 11F11 항체와 1564 클론 scFv의 bivalent 이중특이항체를 제작하고 인간 알파-시누클레인을 과발현하는 형질전환 생쥐(mThy-1 human α-synuclein, UC San Diego)에서 이중특이항체와 알파-시누클레인 항체의 인비보에서 효과를 비교, 분석하였다. 2.5 mg/kg의 단독 항체 또는 인간 IgG 또는 동일 몰 수의 bivalent 이중특이항체를 3개월 동안 매주 복강 투여하였다. 그룹 당 5마리의 생쥐를 사용하였으며, 비형질전환 생쥐(non-transgenic littermate)를 대조군으로 사용하였다. 이어 관류를 다음과 같이 수행하였다.
마지막 투여가 완료된 후 뇌 내의 병리 분석을 위하여, 인도적 규정에 의하여 해당 동물들은 chloral hydrate로 마취된 뒤, 0.9 %의 생리식염수로 심장 관류되었다. 이어 관류된 뇌의 반쪽(saggital section)은 인산완충액 중의 4% 파라포름알데하이드 (pH7.4, 4℃에 분석 시점까지 보관하였으며, 다른 반쪽은 바로 냉동 상태로 보관하였다 (-70℃).
병리학적 분석은 다음과 같이 이루어졌다. 파라포름알데하이드에 고정된 뇌 반쪽은 Vibratome을 이용하여 free-floating 방식으로 40 μm 두께의 연속절편으로 잘라내었다. 각 투여군의 뇌 내 알파-시누클레인 의 발현 정도를 확인하기 위해, cortex, hippocampus, striatum을 포함한 절편을 알파-시누클레인 항체 (응집체의 마커인 p129 α-syn 항체, abcam, ab59264 또는 총 알파-시누클레인 항체, Cell Signaling Technology, #2642)와 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 또는 성상세포(astrocyte)의 활성 정도를 분석하기 위하여 상기 절편을 GFAP(glial fibrillary acidic protein)(AB5804, millipore) 혹은 뇌염증(neuroinflammation) 정도를 확인하기 위해, IL-1 β에 대한 항체(ab9722, abcam)를 각각 처리하였다. 또는 hippocampus의 신경세포 사멸 정도를 분석하기 위하여 NeuN (Chemicon, #MAB377)에 대한 항체를 처리하였다. 1차 항체와의 배양 후에 바이오틴이 결합된 goat anti-rabbit IgG (1:100, Vector Laboratories) 및 Avidin D-horseradish peroxidase (1:200, ABC Elite, Vector Laboratories)를 처리하고 DAB(diaminobenzidine)로 검출하였다. 면역염색된 각 절편은 명시야 현미경으로 관찰하여 광학밀도를 측정하였다. 결과는 도 11a 내지 도 11e에 개시되어 있다.
18-1. 키메릭 항체와 이중특이항체의 알파-시누클레인 감소능 분석
도 11a는 키메릭 11F11 항체 및 해당 키메릭 항체와 1564 클론의 bivalent 이중특이항체가 인간 α-Syn을 과발현하는 마우스 동물모델(TG)에서 알파-시누클레인 응집체를 제거할 수 있는 지를, 마우스에 항체 투여 후 p-129 α-Syn 항체를 이용하여 마우스 뇌 조직 중 cortex, hippomcapus를 염색하여 측정한 결과이다. p-129 α-syn은 129번째 잔기가 인산화된 형태의 응집체의 마커로 염색된 조직에서 짙은 갈색 점 혹은 응집체 형태로 나타난다.
도 11a에 따르면 IgG 처리군은 non-tg 대조군 대비 높은 p-129 의 염색정도를 보여주었다 (#: one way ANOVA, p < 0.01). 이와 반대로, 단독항체 혹은 이중특이항체를 처리한 그룹에서는 p-129 α-syn 혹은 응집체의 염색 정도가 현저히 감소하였다. 특히 hippocampus에서는 이중특이항체 처리군의 감소 정도가 키메릭 11F11 항체 대비 뛰어났다 (*: one way ANOVA, p < 0.05). 도 11b는 도 11a와 동일한 실험이나, 마커로서, 총 알파-시누클레인 항체로 염색한 결과이다. 총 알파-시누클레인 검출은 본원에 따른 항체가 알파-시누클레인 자체의 제거능(clearing) 및 항체의 세포 간 전달(cell to cell transmission) 억제능이 있음을 나타내는 것이다. 또한 다른 측면에서 단량체의 응집체로의 형성의 억제, 또는 단량체를 모두 제거할 수 있는 것으로 해석될 수 있다. TG mouse에서 증가한 인간 알파-시누클레인은 단독항체 및 이중특이항체 투여에 의해 IgG 투여군 대비 감소하였으며, 특히 hippocampus에서는 이중특이항체의 단독항체 대비 효능이 더 뛰어났다.
해당 결과는 키메릭 11F11 항체 및 이중특이항체가 2.5 mg/kg의 낮은 용량으로도 파킨슨 질환 동물 모델에서 효과적으로 알파-시누클레인 및 그 응집체 레벨을 감소시킴을 나타낸다. 특히 이중특이항체가 단독항체 대비 효능이 뛰어났는데, 이는 이중특이항체가 향상된 BBB 통과능을 바탕으로 단독항체 대비 뇌에 더 많이 도달하여 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 시사한다.
18-2. 키메릭 항체와 이중특이항체의 astroglosis 및 inflammatory cytokine 레벨 감소능 분석
글리오시스(gliosis)는 BBB의 손상, TGF-베타 또는 인터류킨과 같은 물질에 의해 촉발되는, 중추신경계에 손상이 있는 경우 이에 대한 반응으로 교세포(glial cell)에서 일어나는 비특이적 반응이다. 대표적인 것으로, Astrogliosis를 포함하며 GFAP 단백질이 마커로 사용된다. 이에 키메릭 11F11 항체 및 키메릭 항체와 1564 클론의 이중특이항체를 마우스에 투여하여 Astrogliosis 감소 및 이를 촉발하는 염증성 사이토카인 방출 감소에 미치는 영향을 분석하였다. 분석 결과는 도 21c 및 21d에 개시되어 있다.
도 11c는 본 발명의 일예에서 제조된 키메릭 11F11 항체 혹은 해당 항체와 1564 클론의 이중특이항체가 in vivo에서 astrogliosis를 감소시킬 수 있는지를, 마우스에 항체 투여 후 마커로서 GFAP (astrogliosis) 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을 염색으로 측정한 결과이다. 단독항체 및 이중특이항체는 IgG 대조군 대비 astrogliosis를 억제하였으며, 특히 striatum에서는 이중특이항체의 효능이 단독항체 대비 뛰어남을 확인할 수 있었다.
도 11d는 본 발명의 일예에서 제조된 키메릭 11F11 항체 혹은 해당 항체와 1564 클론의 이중특이항체가 in vivo에서 염증성 사이토카인을 감소시킬 수 있는지를, 마우스에 항체 투여 후 마커로서 IL-1베타 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을 염색으로 측정한 결과이다. IL-1 베타는 염증을 유발하여 다양한 신경세포의 사멸 및 염증 반응을 유도하게 된다. 본원에 따른 항체를 투여한 쥐의 hippocampus에서 IgG 대조군 대비 단독항체 및 이중특이항체 투여군에서 IL-1 베타가 감소하였으며, 특히 이중특이항체의 감소능이 단독항체 대비 유의미하게 뛰어났다 (##: One-way ANOVA, p < 0.005; *: one way ANOVA, p < 0.05).
상기 도면에 나타난 바와 같이 본원에 따른 항체는 대조군과 비교하여, Astrogliosis를 감소시키며, 이를 촉발하는 염증성 사이토카인 IL-1beta 의 방출을 감소시키는 것으로 나타났다.
18-3. 키메릭 항체와 이중특이항체의 neurodegeneration 감소능 분석
알파 시누클레인의 신경 독성 및 염증 반응으로 인하여 뇌세포의 사멸이 발생함을 선행문헌에서 확인되어 왔다. 본원의 단독항체 및 이중특이항체가 알파-시누클레인으로 인한 in vivo에서의 뇌세포 사멸을 억제할 수 있는지 분석하였다.
cortex 및 hippocampus에서 뉴런의 마커인 NeuN으로 염색한 결과, 단독항체 및 이중특이항체 모두 IgG 대조군 대비 뇌세포 사멸 정도가 감소하는 것으로 나타났다. 특히 cortex에서는 이중특이항체의 뇌세포 사멸 억제능이 단독항체 대비 뛰어난 것으로 확인되었다. 해당 결과는 도 11e에 나타냈다.
실시예 19. Fc engineering을 통한 반감기 증대 및 이를 통한 BBB 통과능 향상
FcRn은 혈관내에서 항체가 순환할 때 용해되지 않도록 세포 안으로 항체를 끌어들여 순환시킴으로 해서 반감기를 증가시키는 세포막의 중요한 수용체이다. BBB 통과능은 트렌스사이토시스 항체의 활성도 중요하지만 혈관내에서의 농도에 의존하여 BBB를 통과한다는 것은 잘 알려진 사실이다. 이러한 이유로 이중항체의 반감기를 증가시키고자 Fc 부위의 428번째 아미노산을 메사이오닌 (Met)을 류신 (Leu) 으로 변화시켜 FcRn 과의 결합력을 증대시킨 이중항체를 제작하였다. Human FcRn을 발현하는 tg mouse 에 10 mg/kg 농도로 WT 이중항체와 M428L 이중항체를 투여하여 비교한 결과 도 11처럼 약 50% 정도의 반감기 증대 효과를 확인하였다. 반감기 증가를 재확인하기 위해 원숭이에 WT 이중항체(hu11F11(ver.2)-1564), bivalent M428L 이중항체(hu11F11(ver.2)(M428L)-1564 bivalent), monovalent M428L 이중항체((hu11F11(ver.2)(M428L)-1564 monovalent)를 투여하여 PK profile을 분석하였다. 도 12a에 나타낸 바와 같이, WT 이중항체의 경우 168시간 이후부터 급격하게 혈액내 농도가 낮아지는 반면 FcRn과의 결합력이 높은 M428L 이중항체들은 WT 대비 향상된 혈액내 농도를 유지하였다. 반감기는 WT 이중항체에 비해 M428L 이중항체에서 1.5일 정도 증가하는 결과를 확인하였다. 특히 clearance 측면에서는 monovalent M428L 이중항체가 가장 우수하였으며 WT 이중항체가 가장 빠른 clearance를 보였다(도 12b).
반감기 증가 효과에 의한 BBB 통과 향상을 검증하기 위해 항체 투여 24시간 후에 CSF를 추출하여 CSF 내의 항체량을 분석하였다. 100 ng/ml 의 IGF1R 을 18시간 동안 냉장상태로 coating 한 후 CSF를 첨가하여 IGF1R 과 결합한 항체를 detection 하였다. 도 12c에서 확인되는 바와 같이, 혈액내 항체량이 많았던 M428L 이중항체의 BBB 통과량이 많음을 확인하였으며 monovalent M428L 이중항체는 우수한 BBB 통과능과 결합되어 bivalent M428L 이중항체보다 향상된 통과능을 보였다.
실시예 20. 탈아미드화된 Affinity variant 기반 이중특이항체의 효능 평가
실시예 10에 따라 인간화 11F11 항체인 hu11F11(ver.2)와 1564 클론의 affinity variant인 F06 scFv의 monovalent 이중특이항체, 특히 탈아미드화를 위하여 CDR 내 일부 residue를 변형한 mutant를 이용한 이중항체(hu11F11(ver.2)-F06(de2)(StoP) monovalent를 포함한다)를 제작하여, 인간 알파-시누클레인을 과발현하는 형질전환 생쥐(mThy-1 human α-synuclein, UC San Diego)에서 상기 제작된 이중특이항체와 알파-시누클레인 단독항체의 인비보(in vivo) 효능을 비교, 분석하였다.
구체적으로, 4개월령의 형질전환 생쥐에 IgG 및 hu11F11(ver.2)는 20 mg/kg, 이중특이항체는 동일 몰수에 해당하는 23.4 mg/kg를 8일 동안, 0, 72, 144, 192 시간 째에 복강 투여하였다. 마지막 투여 후 24시간 뒤, 해당 동물들은 chloral hydrate로 마취된 뒤, 0.9 %의 생리식염수로 심장 관류되었다. 뇌는 분리되어 분석 시기까지 -70 ℃에서 snap frozen되었다. 뇌조직을 갈아 centrifugation 하여 debri를 제거한 뒤 상등액을 수득하고, α-syn 에 대한 ELISA로 해당 brain lysate 내의 α-syn 양을 정량하였다 (Invitrogen #KHB0061). 그 결과는 도 13과 같다.
도 13에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일예에서 제조된 인간화 11F11(ver.2) 항체 및 탈아미드화된 F06 variant 기반 이중특이항체는 IgG 대조군 대비 뇌 내의 α-syn을 감소시킴을 보여준다. 특히 이중특이항체는 α-syn 단독항체 대비 뛰어난 뇌 내 α-syn 감소능을 보였다.
실시예 21. (de2)(StoP) 탈아미드화 항-IGF1R 항체를 포함하는 이중항체의 IGF1R-특이적 항원 결합력 분석 (ELISA)
본 실시예에서는, 실시예 8에 따라 탈아미드화된 항-IGF1R 항체를 포함하는 이중항체가 정상적인 항원 결합력을 가지는지 여부를 확인하는 동시에, 다양한 항-IGF1R 클론 및 이중항체 포맷 내에서의 탈아미드화 IGF1R 항체의 항원 결합력을 다각도로 분석하고자 하였다. 이를 위해 항-IGF1R 클론인 F06, VH5 및 VH16를 기반으로 탈아미드화 되지 않은 항체 (wild type), (de)(StoP) 탈아미드화 항체 및 (de2)(StoP) 탈아미드화 항체를 각각 포함하는 monovalent 이중항체 또는 bivalent 이중항체를 제조하고, sandwich ELISA를 통해 재조합 IGF1R에 대한 결합력 및 농도의존적 결합 여부를 정량적으로 분석 및 비교하였다. 항-알파-시누클레인 항체로는 hu11F11(ver.2) 클론을 사용하였다.
항체 결합 대상 항원인 인간 재조합 IGF1R은 extracellular domain(ECD)로서, Sino biological에서 구매하였다 (10164-H08H). 96-웰 ELISA plate에 (Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY) 인간 IGF1R을 PBS 버퍼에 1 ug/ml로 희석하여 웰당 100 ul 씩 넣은 뒤, 4℃에서 16시간 동안 반응하여 코팅 후, 상등액을 제거하였다. 1% BSA (bovine serum albumin)가 포함된 PBS 버퍼를 웰당 200 ul 넣고 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켜 비 특이적인 결합을 차단시켰다.
앞서 제조한 이중항체 및 각각의 대조군 항체 (wild type 및 (de)(StoP) 탈아미드화 항체)를 최고 농도 400 nM을 기준으로 5배씩 희석하여 8 포인트를 만든 뒤, 각 웰에 100 μl씩 처리 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 코팅된 항원에 항체를 결합시켰다. 반응 종료 후, Tween20이 0.05% 함유된 PBS 버퍼 300 ul를 이용하여 4회 세척하고, 이중항체에 존재하는 human Fc를 인지하는 항-human Fc-HRP를 블로킹 buffer에 1:2000으로 희석하여 각 웰에 100 ul씩 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 PBS-T(Tween20 0.05%) 300 ul를 이용하여 4회 세척한 이후, TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440)를 사용하여 발색 시켰다. 효소반응을 0.5 mol/L의 황산에 의해서 중지시키고, 마이크로 플레이트 리더기(molecular device)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 기록 및 분석하였다. 상기 실험결과를 도 14a 내지 도 14c 및 표 25에 나타내었다. 도 14a는 F06 monovalent 항체, F06(Stop) monovalent 항체, 및 F06(de2)(Stop)항체에 관한 실험결과이고, 도 14b는 VH5 항체, VH5(de)(Stop) 항체 및 VH5(de2)(Stop) 항체에 관한 실험결과이고, 도 14c는 VH16 항체, VH16(de)(Stop) 항체 및 VH16(de2)(Stop)항체에 관한 실험결과이다.
도 14a, 14b, 및 14c에 따르면, 항-IGF1R 클론의 종류 및 monovalent/bivalent 포맷에 상관없이, (de2)(StoP) 탈아미드화 항체는 탈아미드화되지 않은 wild type 수준의 항원 결합력을 유지하였다. 또한, (de)(StoP) 탈아미드화 항체와 비교하여서도 우수한 항원 결합력을 나타내었다. 하기 표 25에서, F06, VH5 및 VH16를 기반으로 탈아미드화 되지 않은 항체 (wild type), (de)(StoP) 탈아미드화 항체 및 (de2)(StoP) 탈아미드화 항체에 관한 실험결과를 나타낸다.
Clones (de)(StOP) (de2)(StoP)
EC50 (nM) % WT EC50 (nM) % WT
F06 mono 4.24 2.64 0.0575 195.00
VH5 bi 1.19 10.50 0.0561 222.81
VH16 bi 1.25 11.44 0.122 117.21
표 25는 (de)(StoP) 탈아미드화 항체와 (de2)(StoP) 탈아미드화 항체의 sandwich ELISA 결과를 수치화하여 비교한 것이다. 표 25에 따르면, 항-IGF1R 항체 클론의 종류나 monovalent/bivalent 포맷에 상관없이, (de2)(StoP) 탈아미드화 항체는 (de)(StoP) 탈아미드화 항체에 비하여 현저히 우수한 항원 결합력을 가지는 것으로 확인되었다.
실시예 22. (de2)(StoP) 탈아미드화 항-IGF1R 항체를 포함하는 이중항체의 세포표면 IGF1R-특이적 항원 결합력 분석 (FACS)
실시예 21에서 시험한 (de2)(StoP) 탈아미드화 이중항체들, 그리고 대조군으로 이들의 wild type 항체 및 (de)(StoP) 탈아미드화 이중항체들을 이용하여 세포표면 IGF1R-특이적 항원 결합력을 FACS 분석하였다. 분석에는 IGF1R를 과발현하는 MCF7 세포를 사용하였다.
구체적으로, 상기 이중항체들을 각각 10 ug/ml로 희석 후, 샘플 당 0.5 x 106의 MCF-7 세포주에 처리하여 4℃에서 2시간 반응시켰다. PBS 버퍼를 이용하여 2회 세척 후, 항-human FITC를 1:1000으로 희석하여 처리하고, 4℃에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS 버퍼를 이용해 2회 세척 후, FACSCalibur 기기를 이용하여 항-IGF1R BsAb가 결합된 정도를 측정하였다. 대조군으로는 2차항체만 처리한 MCF-7 세포를 사용하였으며, 상기 실험결과를 도 15a 내지 15c에 나타내었다.
실험 결과, 실시예 21에서 확인된 결과와 유사하게, 항-IGF1R 클론의 종류 및 monovalent/bivalent 포맷에 상관없이 (de2)(StoP) 탈아미드화 항체는 탈아미드화되지 않은 wild type 항체와 동등한 수준의 항원 결합력을 유지하였으며, (de)(StoP) 탈아미드화 항체와 비교하여 우수한 항원 결합력을 나타내었다.
실시예 23. (de2)(StoP) 탈아미드화 항-IGF1R 항체 기반 이중항체의 in vivo BBB 통과능 분석
실시예 8에 따라 탈아미드화된 항-IGF1R 항체를 포함하는 이중항체의 in vivo BBB 통과능을 SD (Sprague-Dawley) 랫트에서 확인하고자 하였다. 실험군 및 투여 용량은 아래 표에 정리되어 있다.
클론명 용량
hu11F11(ver.2) 30 mg/kg
hu11F11(ver2)-1564 monovalent 35.46 mg/kg
hu11F11(ver2)-F06 monovalent(de)(StoP) 35.46 mg/kg
hu11F11(ver2)-F06 monovalent(de2)(StoP) 35.46 mg/kg
상기 표 26에 기재된 것과 같은 α-syn 단독항체 또는 α-syn/IGF1R 이중항체를 랫트의 미정맥에 단회 투여 후 24시간 째에 그 혈청 (serum) 및 뇌척수액 (CSF)에서의 항체량을 질량 분석으로 분석하였다. 구체적 질량 분석 방법은 실시예 15와 실질적으로 동일하게 수행하고, 분석 결과는 도 16에 나타나 있다.도 16에서 혈청 내 농도는 투여 24 시간 후의 혈액내 항체 농도를 의미하는 것으로, (de)(StoP) 탈아미드화 항체와 (de2)(StoP) 탈아미드화 항체에서 유사하게 관찰되었다. 반면 항체의 brain delivery를 대변하는 뇌척수액 내 농도의 경우 (de2)(StoP) 탈아미드화 항체에서 가장 높게 나타났다. 이는 본 발명의 이중항체가 탈아미드화 항-IGF1R 항체에 의해 우수한 BBB 통과능을 나타낸다는 사실을 보여주는 것이다.
본 발명의 이중항체의 효능을 보다 장기간 관찰하기 위하여, 표 26에 나타낸 항 알파-시누클레인 단독항체인 hu11F11(ver.2)와 (de2)(StoP) 탈아미드화 이중항체인 hu11F11(ver2)-F06 monovalent(de2)(StoP)을 랫트의 미정맥에 단회 투여한 후 168 시간까지의 혈청, 뇌척수액 및 뇌에서의 항체량을 질량 분석으로 분석하였다. 질량 분석 방법은 상기 실시예 15의 방법과 실질적으로 동일하게 수행하였다. 분석 결과는 도 17에 나타나 있다.
도 17에 따르면 항체의 혈청 내 농도는 단독항체와 (de2)(StoP) 탈아미드화 이중항체에서 유사하게 관찰되었으나, 항체의 brain delivery를 대변하는 뇌척수액 내 농도의 경우 단독항체에 비해 (de2)(StoP) 탈아미드화 이중항체에서 곡선하면적 (AUC)이 약 5.8배 증가하였으며, 24 시간째의 뇌척수액 내 농도는 (de2)(StoP) 탈아미드화 이중항체에서 약 10 배 이상으로 확인되었다. 또한, 뇌 내 농도 역시 단독항체에 비해 (de2)(StoP) 탈아미드화 이중항체에서 곡선하면적 (AUC)이 약 7.9배 증가하였다. 이로부터, 본 발명의 이중항체는 (de2)(StoP) 탈아미드화 IGR1R 항체를 포함함으로써 우수한 BBB 통과능을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
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Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 151 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)(IGG) WITH HOLE MUTATION AT FC <400> 151 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 152 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2) (IGG) WITH KNOB MUTATION for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 152 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 153 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2) (IGG), M428L MUTATION for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 153 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 154 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2) (IGG) M428L, HOLE MUTATION for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 154 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 155 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2 (IGG), M428L, KNOB MUTATION for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 155 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 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Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 156 <211> 716 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)-1564-3 bivalent (HC) for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 156 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly 465 470 475 480 Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser 485 490 495 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 500 505 510 Leu Ile Tyr Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 515 520 525 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 530 535 540 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser 545 550 555 560 Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 565 570 575 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 595 600 605 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 610 615 620 Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu 625 630 635 640 Glu Trp Val Ser 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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly 465 470 475 480 Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser 485 490 495 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 500 505 510 Leu Ile Tyr Ala Asn Ser Asn 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Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)-1564-3 monovalent (HC 1, -hole) for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 158 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly 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<400> 161 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn 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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu 625 630 635 640 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Gln Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala 645 650 655 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 660 665 670 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 675 680 685 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Val Leu Thr Thr Leu Met Asn Trp Phe Asp 690 695 700 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 715 <210> 162 <211> 716 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)(M428L)-1564-DMP monovalent (HC 1, -hole for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 162 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly 465 470 475 480 Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser 485 490 495 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 500 505 510 Leu Ile Tyr Ala Gln Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 515 520 525 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 530 535 540 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser 545 550 555 560 Leu His Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 565 570 575 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 595 600 605 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 610 615 620 Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu 625 630 635 640 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Gln Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala 645 650 655 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 660 665 670 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 675 680 685 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Val Leu Thr Thr Leu Met Asn Trp Phe Asp 690 695 700 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 715 <210> 163 <211> 716 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)(M428L)-1564-DM monovalent, (HC 1, -hole) for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 163 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 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570 575 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 595 600 605 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 610 615 620 Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu 625 630 635 640 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Gln Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala 645 650 655 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 660 665 670 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 675 680 685 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Val Leu Thr Thr Leu Met Asn Trp Phe Asp 690 695 700 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 715 <210> 164 <211> 716 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)(M428L)-F06-DMP monovalent (HC 1, -hole) for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 164 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 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Ser Leu His 515 520 525 Gly Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 530 535 540 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 565 570 575 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 580 585 590 Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp 595 600 605 Val Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Gln Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 610 615 620 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 625 630 635 640 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 645 650 655 Cys Ala Lys Gly Val Leu Thr Thr Leu Met Asn Trp Phe Asp Tyr Trp 660 665 670 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 675 680 <210> 166 <211> 716 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)-F06(de2)(StoP)-(monovalent, deamidated, S->P (HC 1, -hole) for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 166 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly 465 470 475 480 Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser 485 490 495 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 500 505 510 Leu Ile Tyr Ala Asn Val Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 515 520 525 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 530 535 540 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Ala Gly Ser 545 550 555 560 Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 565 570 575 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 595 600 605 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 610 615 620 Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu 625 630 635 640 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala 645 650 655 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 660 665 670 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 675 680 685 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Val Leu Thr Thr Leu Met Asn Trp Phe Asp 690 695 700 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 715 <210> 167 <211> 716 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)-VH5(de2)(StoP) deamidated, S->P bivalent(HC) for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 167 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr 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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly 465 470 475 480 Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser 485 490 495 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 500 505 510 Leu Ile Tyr Ala Asn Val Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 515 520 525 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 530 535 540 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser 545 550 555 560 Leu Asn Ala Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 565 570 575 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 595 600 605 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 610 615 620 Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu 625 630 635 640 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Asp Asn Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala 645 650 655 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 660 665 670 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 675 680 685 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Val Leu Thr Thr Leu Met Asn Trp Phe Asp 690 695 700 Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 715 <210> 168 <211> 716 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)-VH16(de2)(StoP) deamidated, S->P bivalent(HC) for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 168 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 595 600 605 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 610 615 620 Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu 625 630 635 640 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala 645 650 655 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 660 665 670 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 675 680 685 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Val Leu Thr Thr Leu Met Asn Trp Phe Asp 690 695 700 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 715 <210> 169 <211> 716 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)(M428L)-F06(de2)(StoP)-(monovalent, deamidated, S->P (HC 1, -hole) for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 169 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser 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Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of hu11F11(ver.2)(M428L)-VH16(de2)(StoP) deamidated, S->P bivalent(HC) for the heavy chain combination of the bispecific antibody <400> 171 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 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140 <210> 174 <211> 1367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1R <400> 174 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110 Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile 115 120 125 Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu 130 135 140 Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190 Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205 Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255 Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala 275 280 285 Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510 Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys 515 520 525 Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys 530 535 540 Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys 545 550 555 560 Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln 565 570 575 Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp 580 585 590 His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala 595 600 605 Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser 610 615 620 Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn 625 630 635 640 Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr 645 650 655 Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys 660 665 670 Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys 675 680 685 Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys 690 695 700 Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys 705 710 715 720 Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu 725 730 735 Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser 740 745 750 Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn 770 775 780 Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg 785 790 795 800 Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser 805 810 815 Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp 820 825 830 Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile 835 840 845 Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met 850 855 860 Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val 865 870 875 880 Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu 885 890 895 Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly 900 905 910 Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr 915 920 925 Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val 930 935 940 Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg 945 950 955 960 Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val 965 970 975 Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp 980 985 990 Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly 995 1000 1005 Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys Asp 1010 1015 1020 Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala Ala Ser 1025 1030 1035 1040 Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Glu 1045 1050 1055 Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Gln Gly 1060 1065 1070 Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr Arg Gly Asp Leu Lys 1075 1080 1085 Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met Glu Asn Asn Pro Val Leu 1090 1095 1100 Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala 1105 1110 1115 1120 Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu 1125 1130 1135 Ala Ala Arg Asn Cys Met Val Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly 1140 1145 1150 Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys 1155 1160 1165 Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu 1170 1175 1180 Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val 1185 1190 1195 1200 Val Leu Trp Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu 1205 1210 1215 Ser Asn Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp 1220 1225 1230 Lys Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys 1235 1240 1245 Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile Ser 1250 1255 1260 Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser Phe Tyr 1265 1270 1275 1280 Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu Asp Leu Glu 1285 1290 1295 Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser Ala Ser Ser Ser 1300 1305 1310 Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His Lys Ala Glu Asn Gly 1315 1320 1325 Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala Ser Phe Asp Glu Arg Gln 1330 1335 1340 Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro 1345 1350 1355 1360 Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys 1365 <210> 175 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of ch11F11-VH <400> 175 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Ala His Gly Lys Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 176 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of ch11F11-VH <400> 176 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 177 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 177 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 178 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 178 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20

Claims (7)

  1. 항-IGF1R 항체 또는 이의 항원결합단편으로서,
    상기 항-IGF1R 항체는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하며,
    상기 중쇄가변영역은, 서열번호 1 및 서열번호 10의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 중쇄 CDR1 (H-CDR1), 서열번호 2 내지 7 및 서열번호 11 내지 18의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 중쇄 CDR2 (H-CDR2), 및 서열번호 8 내지 9 및 서열번호 19의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 중쇄 CDR3 (H-CDR3)를 포함하며,
    상기 경쇄가변영역은, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (L-CDR1), 서열번호 21 내지 23의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 경쇄 CDR2 (L-CDR2), 및 서열번호 24 내지 28 및 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 경쇄 CDR3 (L-CDR3)를 포함하는,
    항-IGF1R 항체 또는 이의 항원결합단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-IGF1R 항체 또는 이의 항원결합단편은 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에서 Y775, P776, F778, R650, S791, L798, Glu779, L641, H808, E809, L813, V397, D435, W434, Y460 및 C488로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산을 특이적으로 인식하여 결합하는 것인, 항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항-IGF1R 항체 또는 이의 항원결합단편은 서열번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에서 결합 부위 1 내지 결합 부위 3으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 결합부위를 인식 및 결합하는 것이며,
    상기 결합부위 1은 Y775, P776, F778, R650, S791, L798 및 Glu779로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 포함하고, 상기 결합부위 2는 L641, H808, E809 및 L813로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 포함하고, 상기 결합부위 3은 V397, D435, W434, Y460 및 C488로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인,
    항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-IGF1R 항체는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하며,
    상기 중쇄가변영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (H-CDR1), 서열번호 3 및 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 중쇄 CDR2 (H-CDR2), 및 서열번호 8 내지 9의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 중쇄 CDR3 (H-CDR3)을 포함하며,
    상기 경쇄가변영역은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (L-CDR1), 서열번호 22 및 23의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 경쇄 CDR2 (L-CDR2), 및 서열번호 26 내지 28의 아미노산 서열 중에서 선택된 하나를 포함하는 경쇄 CDR3 (L-CDR3)을 포함하는 것인,
    항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄가변영역은,
    서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크 1 (H-FR1),
    서열번호 33 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크 2 (H-FR2),
    서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크 3 (H-FR3), 및
    서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크 4 (H-FR4)를 포함하고,
    상기 경쇄가변영역은,
    서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 1 (L-FR1),
    서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 2 (L-FR2),
    서열번호 39 또는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 3 (L-FR3), 및
    서열번호 41 또는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 4 (L-FR4)를 포함하는 것인,
    항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항-IGF1R 항체의 중쇄가변영역은 서열번호 43 내지 서열번호 87의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나를 포함하고,
    상기 경쇄가변영역은 서열번호 88 내지 서열번호 132의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나를 포함하는 것인,
    항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항-IGF1R 항체의 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2 로 이루어지는 군에서 선택된 것인,
    항-IGF1R 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
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