JP7136790B2 - アルファ-シヌクレインに対する抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
本特許出願は、2017年2月17日出願の米国特許仮出願62/460,416の利益を請求する。該仮出願の全内容を、引用により本明細書に包含させる。
α-シヌクレイン(αSyn)はシナプス前末端で神経細胞に優先的に発現する140アミノ酸タンパク質であり、そこでシナプス伝達の制御に役割を有すると考えられている(Bendor et al., Neuron 2013;79:1044-66)。それはα-ヘリックスの折り畳まれていない単量体(Fauvet et al., JBC 2012;287:15345-64)および安定な四量体(Bartels et al., Nature 2011;477:107-10; Wang et al., PNAS 2011;108:17797-802)の両者として天然に存在するとの仮説が提案されており、いくつかの翻訳後修飾を受けることも示されている(Beyer and Ariza, Mol Neurobiol 2013;47:509-24)。詳しく調べられている一つの修飾は、アミノ酸残基セリン129(S129)でのαSynのリン酸化である。通常、S129で構成的にリン酸化される(pS129)αSynの割合はほんの僅かであるが、病理学的細胞内封入体にみられる圧倒的大部分のαSynは、pS129 αSynである(Oueslati, J Parkinsons Dis 2016;6:39-51)。これらの病理学的封入体は、誤って折り畳まれたαSynタンパク質の凝集した、不溶性蓄積物であり、包括的にシヌクレイン病として知られる一群の神経変性疾患に特有の特徴である(Galvin et al., Arch Neurol 2001;58:186-90)。
ここに提供されるのは、α-シヌクレインに特異的に結合し、望ましい機能的性質を有するモノクローナル抗体などの単離抗体である。これらの性質は、モノマーα-シヌクレインと比較してオリゴマーα-シヌクレインへの優先的結合およびインビトロおよびインビボでの可溶性または不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)産生を阻害する能力を含む。ここに記載する抗α-シヌクレイン抗体は、脳におけるレビー小体またはα-シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる一群の疾患であるシヌクレイン病の処置、重症度軽減、進行遅延、発症リスク低減、発症遅延および診断のために使用し得る。
(a)マウスおよびラットα-シヌクレインに結合する;
(b)ヒトβ-シヌクレインおよびヒトγ-シヌクレインに結合する;
(c)α-シヌクレインオリゴマーに対してα-シヌクレインモノマーを超える親和性を有する;
(d)α-シヌクレインオリゴマー誘導不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する;
(e)PFFおよび/または脳にα-シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから可溶性または不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる;
(f)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸123~128位の全てまたは一部に結合する;
(g)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸125~128位の全てまたは一部に結合する;
(h)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸130~139位の全てまたは一部に結合する;
(i)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸119~126位の全てまたは一部に結合する;および
(j)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸130~138位の全てまたは一部に結合する。
(a)それぞれ配列番号2~4を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号5~7を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(b)それぞれ配列番号22~24を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号25~27を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(c)それぞれ配列番号22~24を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号28~30を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(d)それぞれ配列番号37~39を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号40~42を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(e)それぞれ配列番号47~49を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号50~52を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(f)それぞれ配列番号57~59を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号60~62を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(g)それぞれ配列番号67~69を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号70~72を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(h)それぞれ配列番号77~79を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号80~82を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(i)それぞれ配列番号87~89を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号90~92を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(j)それぞれ配列番号87~89を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号93~95を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(k)それぞれ配列番号87~89を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号96~98を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;または
(l)それぞれ配列番号107~109を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号110~112を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3
を含む、α-シヌクレインに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
(a)対象からのサンプルと、ここに記載する抗α-シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を、抗体-抗原複合体が形成されるように接触させ;
(b)形成された複合体の量を測定し;そして
(c)サンプルにおける複合体の量と対照における量を比較することを含み、ここで、対照と比較してサンプルにおける複合体のレベルの上昇は、該対象がレビー小体またはα-シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を有することを示す、方法である。ある実施態様において、サンプルは脳脊髄液、脳組織抽出物、尿または血液である。
ここに記載されるのは、モノマーα-シヌクレインよりオリゴマーα-シヌクレインに優先的に結合する単離抗体、特にモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体であり。ある実施態様において、ここに記載される抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来するおよび/または特定のアミノ酸配列を含むCDR領域などの特定の構造的特徴を含む。ここに提供されるのは、単離抗体、このような抗体の製造方法、このような抗体を含む免疫複合体および二特異性分子および該抗体を含むように製剤された医薬組成物である。またここに提供されるのは、α-シヌクレインの不溶性凝集体産生を阻害するために該抗体を使用する方法である。従って、ここに記載するα-シヌクレイン抗体は、例えば、レビー小体病およびシヌクレイン病の処置を含む多様な治療適用ならびに診断アッセイに使用し得る。
本明細書がより容易に理解され得るように、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な記載を通して示される。
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(配列番号1;GenBank Accession No. P37840)
ここに記載するのは、特定の機能的特徴または性質により特徴づけられる抗体、例えば、単離抗体、例えば、完全ヒト単離抗体である。例えば、抗体は、ヒトα-シヌクレイン、すなわち、モノマーヒトα-シヌクレインおよびオリゴマーヒトα-シヌクレイン両者に特異的に結合する。さらに、抗体は、マウスまたはラットα-シヌクレインなどの1以上の非ヒト種からのα-シヌクレインまたはβ-シヌクレインおよびγ-シヌクレインなどのシヌクレインの種々のアイソフォームと交差反応する。
(a)マウスおよびラットα-シヌクレインに結合する;
(b)β-シヌクレインおよびγ-シヌクレインに結合する;
(c)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)にα-シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する;
(d)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)誘導可溶性または不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する;
(e)PFFおよび/または脳にα-シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから可溶性または不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる;
(f)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸123~128位の全てまたは一部に結合する;
(g)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸125~128位の全てまたは一部に結合する;
(h)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸130~139位の全てまたは一部に結合する;
(i)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸119~126位の全てまたは一部に結合する;および
(j)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸130~138位の全てまたは一部に結合する。
特定のここに記載する抗体は、実施例1に記載のとおり単離され、構造的に特徴づけられた、抗体7A10、7A10-T93A、11H11(11H11-1および11H11-2)、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8(23H8-1、23H8-2、23H8-3)および1E8のCDRおよび/または可変領域配列を有する抗体、例えば、モノクローナル抗体、ならびにそれらの可変領域またはCDR配列と少なくとも80%同一性(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%同一性)を有する抗体である。7A10、7A10-T93A、11H11(11H11-1および11H11-2)、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8および1E8のVHアミノ酸配列は、それぞれ配列番号8、18、31、43、53、63、73、83、99および113に示す。7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3および1E8のVLアミノ酸配列は、それぞれ配列番号9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102および114に示す。
(a)それぞれ配列番号8および9を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(b)それぞれ配列番号18および19を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(c)それぞれ配列番号31および32を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(d)それぞれ配列番号31および33を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(e)それぞれ配列番号43および44を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(f)それぞれ配列番号53および54を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(g)それぞれ配列番号63および64を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(h)それぞれ配列番号73および74を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(i)それぞれ配列番号83および84を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(j)それぞれ配列番号99および100を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(k)それぞれ配列番号99および101を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;
(l)それぞれ配列番号99および102を含む重鎖および軽鎖可変領域配列;または
(m)それぞれ配列番号113および114を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む単離抗体またはその抗原結合部分である。
(a)配列番号2、22、37、47、57、67、77、87および107からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)配列番号3、23、38、48、58、68、78、88および108からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)配列番号4、24、39、49、59、69、79、89および109からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)配列番号5、25、28、40、50、60、70、80、90、93、96および110からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)配列番号6、26、29、41、51、61、71、81、91、94、97および111からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2;および
(f)配列番号7、27、30、42、52、62、72、82、92、95、98および112からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、単離抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、該抗体はヒトα-シヌクレインに特異的に結合する。
(a)配列番号2~4;
(b)配列番号22~24;
(c)配列番号37~39;
(d)配列番号47~49;
(e)配列番号57~59;
(f)配列番号67~69;
(g)配列番号77~79;
(h)配列番号87~89;または
(i)配列番号107~109
を含み、ここで、該抗体はヒトα-シヌクレインに特異的に結合する。
(a)配列番号5~7;
(b)配列番号25~27;
(c)配列番号28~30;
(d)配列番号40~42;
(e)配列番号50~52;
(f)配列番号60~62;
(g)配列番号70~72;
(h)配列番号80~82;
(i)配列番号90~92;
(j)配列番号93~92
(k)配列番号96~98;または
(l)配列番号110~112
を含み、ここで、該抗体はヒトα-シヌクレインに特異的に結合する。
(a)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号2~4を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号5~7を含む;
(b)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号22~24を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号25~27を含む;
(c)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号22~24を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号28~30を含む;
(d)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号37~39を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号40~42を含む;
(e)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号47~49を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号50~52を含む;
(f)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号57~59を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号60~62を含む;
(g)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号67~69を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号70~72を含む;
(h)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号77~79を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号80~82を含む;
(i)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号87~89を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号90~92を含む;
(j)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号87~89を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号93~95を含む;
(k)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号87~89を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号96~98を含む;または
(l)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号107~109を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれ配列番号110~112を含み、
ここで、該抗体はヒトα-シヌクレインに特異的に結合する。
(a)10および11、
(b)20および21、
(c)34および35、
(d)34および36、
(e)45および46、
(f)55および56、
(g)65および66、
(h)75および76、
(i)85および86、
(j)103および104、
(k)103および105、
(l)103および106および
(m)115および116
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
(a)マウスおよびラットα-シヌクレインに結合する;
(b)β-シヌクレインおよびγ-シヌクレインに結合する;
(c)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)にα-シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する;
(d)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)誘導不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する;
(e)PFFおよび/または脳にα-シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから可溶性または不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる;
(f)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸123~128位の全てまたは一部に結合する;
(g)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸125~128位の全てまたは一部に結合する;
(h)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸130~139位の全てまたは一部に結合する;
(i)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸119~126位の全てまたは一部に結合する;および
(j)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸130~138位の全てまたは一部に結合する。
EAYEMP(配列番号121)
に結合する。
YEMP(配列番号122)
に結合する。
EEGYQDYEPE(配列番号124)
に結合する。
DPDNEAYE(配列番号125)
に結合する。
EEGYQDYEP(配列番号123)
に結合する。
ある実施態様において、ここに記載する抗α-シヌクレイン抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および/または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
ここに包含されるのは、ここに記載する好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する抗α-シヌクレイン抗体であり、ここで、抗体は、ここに記載する抗α-シヌクレイン抗体の所望の機能的性質を保持する。
(a)重鎖可変領域は、配列番号8、18、31、43、53、63、73、83、99および113からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるまたは配列番号8、18、31、43、53、63、73、83、99および113からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25または1-50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む;
(b)軽鎖可変領域は、配列番号9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102および114からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるまたは配列番号9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102および114からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25または1-50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含む;
(c)抗体はα-シヌクレインに特異的に結合するおよび
(d)抗体は次の機能的性質の1以上を示す:
(1)マウスおよびラットα-シヌクレインに結合する;
(2)β-シヌクレインおよびγ-シヌクレインに結合する;
(3)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)にα-シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する;
(4)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)誘導不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する;
(5)PFFおよび/または脳にα-シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる;
(6)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸123~128位(配列番号121)の全てまたは一部に結合する;
(7)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸125~128位(配列番号122)の全てまたは一部に結合する;
(8)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸130~139(配列番号124)の全てまたは一部に結合する;
(9)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸119~126(配列番号125)の全てまたは一部に結合する;および
(10)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸130~138(配列番号123)の全てまたは一部に結合する。
(a)配列番号8および9;
(b)配列番号18および19;
(c)配列番号31および32;
(d)配列番号31および33;
(e)配列番号43および44;
(f)配列番号53および54;
(g)配列番号63および64;
(h)配列番号73および74;
(i)配列番号83および84;
(j)配列番号99および100;
(k)配列番号99および101;
(l)配列番号99および102;および
(m)配列番号113および114
からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はα-シヌクレインに結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号2のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号4のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号5のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号7のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号12のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号13のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号14のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号15のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号16のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号17のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号22のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号23のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号24のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号25のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号26のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号27のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号22のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号23のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号24のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号28のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号29のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号30のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号37のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号38のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号39のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号40のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号41のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号42のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号47のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号48のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号50のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号51のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号52のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号57のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号58のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号59のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号60のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号61のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号62のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号67のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号68のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号69のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号70のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号71のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号72のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号77のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号78のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号79のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号80のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号81のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号82のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号87のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号88のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号89のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号90のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号91のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号92のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号87のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号88のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号89のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号93のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号94のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号95のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号87のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号88のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号89のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号96のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号97のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号98のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
抗体の重鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号107のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号108のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号109のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
抗体の軽鎖可変領域は次のCDRを含み:
i. 配列番号110のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号111のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号112のアミノ酸配列を有するCDR3;そして
ここで、抗体はヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する。
(a)重鎖は、配列番号10、20、34、45、55、65、75、85、103および115からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかまたは配列番号10、20、34、45、55、65、75、85、103および115からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25または1-50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含み(但し、ある実施態様において、配列がエフェクターレス重鎖のものであるならば、重鎖をエフェクターレスとする変異は修飾されないアミノ酸配列を含む);
(b)軽鎖は、配列番号11、21、35、36、46、56、66、76、86、104、105、106および116からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかまたは配列番号11、21、35、36、46、56、66、76、86、104、105、106および116からなる群から選択されるアミノ酸配列に比して1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25または1-50アミノ酸変化(すなわち、アミノ酸置換、付加または欠失)を含むアミノ酸配列を含み;
(c)抗体はα-シヌクレインに特異的に結合する、そして
(d)抗体は次の機能的性質の1以上を示す:
(1)マウスおよびラットα-シヌクレインに結合する;
(2)β-シヌクレインおよびγ-シヌクレインに結合する;
(3)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)にα-シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する;
(4)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)誘導不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する;
(5)PFFおよび/または脳にα-シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる;
(6)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸123~128位(配列番号121)の全てまたは一部に結合する;
(7)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸125~128位(配列番号122)の全てまたは一部に結合する;
(8)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸130~139(配列番号124)の全てまたは一部に結合する;
(9)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸119~126(配列番号125)の全てまたは一部に結合する;および
(10)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸130~138(配列番号123)の全てまたは一部に結合する。
(a)配列番号10および11、
(b)配列番号20および21、
(c)配列番号34および35、
(d)配列番号34および36、
(e)配列番号45および46、
(f)配列番号55および56、
(g)配列番号65および66、
(h)配列番号75および76、
(i)配列番号85および86、
(j)配列番号103および104、
(k)配列番号103および105、
(l)配列番号103および106および
(m)配列番号115および116
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である重鎖および軽鎖配列を含む抗体またはその抗原結合部分であり、ここで、該抗体はα-シヌクレインに結合する。
抗α-シヌクレイン抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域およびCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み得て、ここで、これらCDR配列の1以上は、ここに記載する好ましい抗体またはその保存的修飾体に基づく特定したアミノ酸配列を含み、ここで、該抗体は、ここに記載する抗α-シヌクレイン抗体の所望の機能的性質を保持する。従って、単離抗α-シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域およびCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み得て、ここで、
(a)重鎖可変領域CDR3配列は、配列番号4、24、39、49、59、69、79、89および109ならびにその保存的修飾体、例えば、1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4または1-5保存的アミノ酸置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む;
(b)軽鎖可変領域CDR3配列は、配列番号7、27、30、42、52、62、72、82、92、95、98および102ならびにその保存的修飾体、例えば、1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4または1-5保存的アミノ酸置換体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む;
(c)抗体はα-シヌクレインに特異的に結合するおよび
(d)抗体は次の機能的性質の1以上を示す:
(1)マウスおよびラットα-シヌクレインに結合する;
(2)β-シヌクレインおよびγ-シヌクレインに結合する;
(3)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)にα-シヌクレインモノマーを超える大きな親和性を有する;
(4)α-シヌクレインオリゴマー(例えば、PFF)誘導不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)の産生を阻害する;
(5)PFFおよび/または脳にα-シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートから不溶性α-シヌクレイン凝集体(例えば、セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体)を産生する分子種を枯渇させる;
(6)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸123~128位(配列番号121)の全てまたは一部に結合する;
(7)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸125~128位(配列番号122)の全てまたは一部に結合する;
(8)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸130~139(配列番号124)の全てまたは一部に結合する;
(9)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸119~126(配列番号125)の全てまたは一部に結合する;および
(10)ヒトα-シヌクレインのアミノ酸130~138(配列番号123)の全てまたは一部に結合する。
VHおよびVL領域
また提供されるのは、修飾抗体を設計するために、出発物質としてここに開示するVHおよび/またはVL配列の1以上を有する抗体を使用して製造できる設計および修飾された抗体であり、該修飾抗体は、出発抗体から改変された性質を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域内(すなわち、VHおよび/またはVL)、例えば1以上のCDR領域内および/または1以上のフレームワーク領域内の1以上の残基の修飾により設計され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基を修飾することにより設計され得る。
ここに記載する抗α-シヌクレイン抗体可変領域は、Fc、例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc(これは、任意のアロタイプまたはイソアロタイプ、例えば、IgG1について:G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z);IgG2について:G2m、G2m23(n);IgG3について:G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v);およびKについて:Km、Km1、Km2、Km3であり得る)と連結(例えば、共有結合的連結または融合)させてよい(例えば、Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
ここに記載する他の態様は、ここに記載する抗α-シヌクレイン抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞ライセートまたは部分的に精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動法および当分野で周知のその他を含む標準技法により、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞性核酸(例えば、他の染色体DNA、例えば、本来単離DNAに連結している染色体DNA)またはタンパク質から精製して分離されたとき、単離されまたは実質的に純粋にされる。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。ここに記載する核酸は、例えば、DNAまたはRNAであってよく、イントロン配列を含んでも、含まなくてもよい。ある実施態様において、核酸はcDNA分子である。
ここに記載するモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)により記載の標準体細胞ハイブリダイゼーション技法などの多様な既知技法により産生され得る。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原則的に、モノクローナル抗体を産生する他の技法、例えば、Bリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技法も用い得る。
α-シヌクレインに対する完全ヒト抗体を取得するために、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびWO98/24884に他の抗原について記載のとおり、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子導入または染色体導入マウス(例えば、HCo12、HCo7またはKMマウス)を、精製または富化調製物および/またはα-シヌクレインまたはそのフラグメントを発現する細胞で免疫化し得る。例えば、ある実施態様において、マウスを、組み換えヒトαSyn WTで免疫化する。他の実施態様において、マウスを、αSyn A53T-PFF変異体タンパク質で免疫化する。他の実施態様において、マウスを、αSyn WT-PFFで免疫化する。他の実施態様において、マウスを、架橋αSyn WTで免疫化する。他の実施態様において、マウスを、架橋A53T PFFで免疫化する。他の実施態様において、マウスを、αSyn WT-PFF、αSyn A53T-PFF、架橋αSyn WT-PFFおよび架橋αSyn A53T-PFFの混合物で免疫化する。あるいは、マウスを、ヒトα-シヌクレインまたはそのフラグメントをコードするDNAで免疫化し得る。好ましくは、マウスは、最初の注入時6~16週齢である。例えば、組み換えα-シヌクレイン抗原の精製または富化調製物(5~50μg)を使用して、HuMAbマウスを腹腔内免疫化し得る。精製または富化調製物を使用する免疫化が抗体を誘導しない場合には、マウスを、免疫応答を促進するために、α-シヌクレインを発現する細胞、例えば、細胞株で免疫化してよい。細胞株の例は、α-シヌクレイン過発現安定CHOおよびRaji細胞株を含む。
ここに記載するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得するために、免疫化マウスからの脾細胞および/またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株と融合し得る。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体産生についてスクリーニングし得る。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、Sp2/0非分泌型マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL 1581)に、50%PEGを用いて融合させ得る。細胞を、約2×105で平底マイクロタイタープレートに播種し、その後10%胎児クローン血清、18%“653”条件培地、5%origen(IGEN)、4mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM 2-メルカプトエタノール、50単位/mlペニシリン、50mg/ml ストレプトマイシン、50mg/mlゲンタマイシンおよび1×HAT(Sigma)含有選択培地で2週間インキュベーションさせる。約2週間後、細胞を、HATをHTに置き換えた培地で培養し得る。次いで個々のウェルを、ヒトモノクローナルIgMおよびIgG抗体についてELISAでスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が生じたら、培地を通常10~14日後に観察し得る。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、なおヒトIgGについて陽性であるならば、該モノクローナル抗体を少なくとも2回、限界希釈によりサブクローン化し得る。次いで安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培養培地で少量の抗体を産生させる。
抗体を、例えば、当分野で周知の組み換えDNA技法と遺伝子トランスフェクション方法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで産生させ得る(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
ここに記載する抗体を、実施例に記載のような標準技法を使用して、例えば、標準ELISAにより、α-シヌクレインへの結合について試験し得る。
ここに記載する抗体を、サンプル試験およびインビボ造影を含む診断目的で使用でき、この目的のために、抗体(またはその結合フラグメント)を、免疫複合体を形成するための適切な検出可能な薬剤とコンジュゲートさせ得る。診断目的で、適切な薬剤は、全身造影のための放射性同位体ならびにサンプル試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の適当な抗体タグを含む、検出可能標識である。
ここに記載する抗体は、二特異性分子の形成に使用し得る。抗α-シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分を、他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)と誘導体化または連結して、少なくとも2個の異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性分子を産生し得る。例えば、抗α-シヌクレイン抗体を、ここに記載するタンパク質などの、組み合わせ処置の潜在的標的として使用し得る任意のタンパク質と特異的に結合する抗体またはscFvと連結できる。ここに記載する抗体は、実際1を超える他の機能的分子と誘導体化または連結させて、2を超える異なる結合部位および/または標的分子と結合する多特異的分子を産生し得る;このような多特異的分子は、ここで使用する用語「二特異性分子」に包含されることも意図する。ここに記載する二特異性分子を創製するために、ここに記載する抗体を、二特異性分子がもたらされるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣体などの1以上の他の結合分子と機能的に連結(例えば、化学カップリング、遺伝的融合、非共有結合性結合またはその他)させ得る。
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と製剤された、ここに記載する一つのもしくは組み合わせた抗α-シヌクレイン抗体または他の標的への抗体もしくはその抗原結合部分との組み合わせを含む、組成物、例えば、医薬組成物である。このような組成物は、ここに記載する抗体または免疫複合体または二特異性分子を1個または組み合わせ(例えば、2以上の異なる)で含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するまたは相補性活性を有する抗体の組み合わせ(または免疫複合体または二特異性)を含み得る。
また提供されるのは、所望により、単一バイアルまたは容器に含まれ、例えば、脳におけるレビー小体またはα-シヌクレインの凝集体の存在と関係する疾患の処置または診断における使用指示を含む、ここに開示する抗α-シヌクレイン抗体、二特異性抗体または免疫複合体を含むキットである。キットは、キットの中身の意図する用途を示すラベルを含み得る。用語ラベルは、キット上にまたはキットと共に提供されるまたは他の方法でキットに付随するあらゆる書面、販売資料または記録媒体を含む。このようなキットは、単一用量バイアルまたは単一用量充填済シリンジなどの単位投与量形態で抗体、二特異性抗体または免疫複合体を含み得る。
ここに提供されるのは、脳におけるレビー小体またはα-シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を有する対象(例えば、ヒト患者)を処置する方法ならびにこれらの疾患を予防する方法である。
(a)対象からのサンプルとここに記載する抗体またはその抗原結合部分を、抗体-抗原複合体が形成されるように接触させ;
(b)形成された複合体の量を決定し;そして
(c)サンプルにおける複合体の量と対照における量を比較することを含み、ここで、対照と比較してサンプルにおける複合体のレベルの上昇は、該対象がレビー小体またはα-シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を有することを示す、方法である。ある実施態様において、サンプルは脳脊髄液、脳組織抽出物、尿または血液である。ある実施態様において、対照は、疾患症状を示さず、該疾患(例えば、シヌクレイン病)の遺伝的素因がない健常対象の集団である。
1. Α-シヌクレインに結合し、次の性質の1以上を示す、単離抗体またはその抗原結合部分:
(a)マウスおよびラットα-シヌクレインに結合する;
(b)ヒトβ-シヌクレインおよびヒトγ-シヌクレインに結合する;
(c)α-シヌクレインオリゴマーに対してα-シヌクレインモノマーを超える親和性を有する;
(d)α-シヌクレインオリゴマー誘導不溶性セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体の産生を阻害する;
(e)PFFおよび/または脳にα-シヌクレインの病理学的凝集体を有する患者から調製した脳ライセートからセリン-129リン酸化により特徴づけられる可溶性および不溶性α-シヌクレイン凝集体を産生する分子種を枯渇させる;
(f)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸123~128位の全てまたは一部に結合する;
(g)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸125~128位の全てまたは一部に結合する;
(h)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸130~139位の全てまたは一部に結合する;
(i)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸119~126位の全てまたは一部に結合する;および
(j)ヒトα-シヌクレイン(配列番号1)のアミノ酸130~138位の全てまたは一部に結合する。
(a)配列番号8および9;
(b)配列番号18および19;
(c)配列番号20および21;
(d)配列番号31および32;
(e)配列番号31および33;
(f)配列番号43および44;
(g)配列番号53および54;
(h)配列番号63および64;
(i)配列番号73および74;
(j)配列番号83および84;
(k)配列番号99および100;
(l)配列番号99および101;
(m)配列番号99および102;および
(n)配列番号113および114。
(a)それぞれ配列番号2~4を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号5~7を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(b)それぞれ配列番号12~14を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号15~17を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(c)それぞれ配列番号22~24を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号25~27を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(d)それぞれ配列番号22~24を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号28~30を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(e)それぞれ配列番号37~39を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号40~42を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(f)それぞれ配列番号47~49を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号50~52を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(g)それぞれ配列番号57~59を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号60~62を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(h)それぞれ配列番号67~69を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号70~72を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(i)それぞれ配列番号77~79を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号80~82を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(j)それぞれ配列番号87~89を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号90~92を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(k)それぞれ配列番号87~89を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号93~95を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;
(l)それぞれ配列番号87~89を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号96~98を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3;または
(m)それぞれ配列番号107~109を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3およびそれぞれ配列番号110~112を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3
を含む、α-シヌクレインに結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
(a)配列番号8および9;
(b)配列番号18および19;
(c)配列番号31および32;
(d)配列番号31および33;
(e)配列番号43および44;
(f)配列番号53および54;
(g)配列番号63および64;
(h)配列番号73および74;
(i)配列番号83および84;
(j)配列番号99および100;
(k)配列番号99および101;
(l)配列番号99および102;および
(m)配列番号113および114。
(n)配列番号10および11、
(o)配列番号20および21、
(p)配列番号34および35、
(q)配列番号34および36、
(r)配列番号45および46、
(s)配列番号55および56、
(t)配列番号65および66、
(u)配列番号75および76、
(v)配列番号85および86、
(w)配列番号103および104、
(x)配列番号103および105、
(y)配列番号103および106および
(z)配列番号115および116。
(a)対象からのサンプルと実施態様1~43、47および48の何れかに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二特異性抗体または免疫複合体を、抗体-抗原複合体が形成されるように接触させ;
(b)形成された複合体の量を測定し;そして
(c)サンプルにおける複合体の量と対照における量を比較することを含み、ここで、対照と比較してサンプルにおける複合体のレベルの上昇は、該対象がレビー小体またはα-シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられる疾患を有することを示す、方法。
この実施例は、αSynモノマーよりも、ヒト組み換え野生型αSynからなる予め形成された原線維(PFF)に優先的に結合する完全ヒト抗αSynモノクローナル抗体(mAb)の取得を記載する。
ヒト抗αSynモノクローナル抗体は、HuMAb(登録商標)遺伝子導入マウスのHCo42系統(「HuMAb」はMedarex, Inc., Princeton, New Jerseyの商標である)およびKMマウス(KMマウス(登録商標)系統はPCT公報WO02/43478に記載のとおりSC20導入染色体を有する)で取得した。
実施例1に記載する抗αSyn抗体のエピトープ結合部位を、一連の重複αSynペプチドを使用して決定した。
ヒトαSyn配列の10アミノ酸の一連の重複ペプチドを、N末端ビオチン基およびPEG4リンカーおよびC末端CONH2を伴い取得した(表1)。ペプチドを1mg/mlでDPBSに可溶化した。マッピング試験のため、100μLのDPBS中0.25μg/ml α-シヌクレインペプチドを、ニュートラアビジン被覆高容量96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)に加え、RTで2時間(または一夜、4℃で)インキュベートした。プレートを約300μLの洗浄緩衝液(DPBS中0.05%Tween)で3回洗浄した。次いでプレートを150μlのDPBS中3%BSA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で、RTで約2時間(または一夜、4℃)遮断した。サンプル緩衝液(50ml緩衝液中0.1%BSA/0.05%Tween/dPBS、2ペレットのプロテアーゼ阻害剤(Roche complete, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))で希釈した100μLの試験サンプルを、プレート上でRTで2時間インキュベートした。プレートを3回洗浄した。PBSTB(1%BSA/0.2%Tween/DPBS)で1:1000希釈した100μLの二次抗体を加え、RTで1時間インキュベートした。プレートを各洗浄5~10分で3回洗浄した。100μLのAP基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を加え、RTで30分展開させた。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader, PerkinElmer, Waltham, MA)で読んだ。プレートをアッセイ中一定振盪下(Titer plate shaker)に置いた。使用した二次抗体はアルカリホスファターゼ-affinipureロバ抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、アルカリホスファターゼ-affinipureロバ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、アルカリホスファターゼ-affinipureロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を含んだ。全二次抗体を50%グリセロール最終濃度に希釈した。
この実施例は、抗αSyn抗体が、αSynモノマーを超えてαSyn-PFFに優先的に結合することを示す。
組み換え野生型ヒトαSyn(rPeptide, Bogart, GA)およびA53T変異を含むヒトαSyn(rPeptide, Bogart, GA)を、20mM Tris/HCl、100mM NaCl、PH7.4に1mg/mlで再構成した。PFFを標準プロトコールを使用して調製した(Luk et al., PNAS 2007;106:20051-6)。簡潔には、モノマーを、2ml セーフロックエッペンドルフチューブ(約1ml/バイアル)中、37℃で一定振盪下(Titer plate shaker)4日間インキュベートし、次いで100,000gでRTで20分間遠心分離した。ペレットを、1mg/mlの最終PFF濃度でPBSに再懸濁した。
a M/P=モノマー/PFF結合比(比が低いほど、PFFへの高い優先性を意味する)
b 抗体1および抗体2は対照抗体である
この実施例は、抗αSyn抗体のサブセットの脱免疫化がαSynモノマーおよびαSyn PFFへの結合に有する効果を決定する。
ヒト化における免疫原性ホットスポットの可能性を排除するために、7A10の重鎖および軽鎖配列を免疫原性について分析した。世界人口での27の一般的に見られるHLAのアレルへの結合および非生殖系列セグメントの同定のための7A10の分析を、免疫原性ホットスポットの可能性を排除するために実施した。
同族ペプチドのMHC-IIアレル(樹状細胞による生物学的物質のエンドサイトーシスおよび分解の副産物として形成)への結合と、その後の樹状細胞の表面への提示は、適応免疫応答に重要である。MHC-IIアレルへの結合に加えて、しかしながら、提示ペプチドは、CD4+T細胞受容体に結合し(T細胞認識)、そうして活性化およびT細胞伝播に至るために、CD4+T細胞受容体に非常在性(非自己)ではければならない。これらの効果をコンピューター的に模倣し、多様なドナーの効果をモデル化するために、抗体をまずN末端から開始し、1度に1アミノ酸で系統的にC末端に向かい、15量体ペプチドに破壊する。得られた15量体ペプチドの各々を、(i)世界人口で27の一般的に見られるHLAの各々への結合および(ii)ヒト免疫グロブリン生殖系列配列への完全配列マッチについて評価する。完全生殖系列マッチの場合、15量体ペプチドは「自己」と見なされ、それ故に抗原性ではないと考えられる。他方で、「非自己」(パーフェクト生殖系列マッチなし)の場合、27アレルの一部と十分な親和性で結合するならば、潜在的に抗原性と見なされる。
7A10の重鎖および軽鎖の免疫原性分析を図4に示す。分析結果は、軽鎖(VK)が大部分非免疫原性と予想され、唯一のホットスポットがエピトープ結合に一般に関与するCDR3に存在することを示す。重鎖(VH)は、大きな領域、すなわち、CDR2(残基49~65)およびFW3-CDR3(残基90~98)に広がるホットスポットを示す、2領域を有する。8未満のストレッチ長のホットスポットを無視して、VH鎖における2領域のみ(49~65、90~98)が変異誘導を介してリスク回避のために考慮された。
この実施例は、実施例4に記載する7A10の脱免疫化バージョン、ならびに21A3の脱免疫化バージョン、すなわち、21A3-V82LのαSynモノマーおよびαSyn PFFへの結合の、実施例3に記載するELISAによる評価を示す。
表3に示すとおり、7A10-T93Aおよび21A3-V82L復帰変異は、親抗体で測定された能力の2倍以内のPFF結合能を示した;モノマー結合値は、これらの比較的弱い能力のために正確な濃度-応答曲線を作成するのが困難であったため、より可変性であった。K58Y-T93A復帰変異は、7A10親と比較してPFF結合が>10倍弱く、一方R56S-T93AおよびR56S-K58N-T93AのPFF結合能は7A10の2×以内であった。
a 示すデータは示すFc不活性ヒトアイソタイプIgG1.3についてである
b 許容される対照シグナル検出に必要な抗体の濃度
種交差反応性を評価するために、抗αSyn抗体を、ラット、マウスおよびヒトαSynのアミノ酸111~140(表4)を表すペプチドへの結合について試験した。121~122位でαSyn配列はヒト、ラットおよびマウスで異なる。結合アッセイは、実施例3に記載のとおり実施した。
この実施例において、抗αSyn抗体を、実施例3に記載するELISAによりヒトβSynおよびヒトγSynへの結合および交差反応性について試験した。
図7に示すとおり、抗体はヒトαSyn、βSynまたはγSynを区別しなかった。PFFへの結合を陽性対照として包含させた。
表6に示す全3つの7A10抗体の同一性は、インタクト質量分析(MS)分析により評価した。分析は、ACQUITY UPLC/Waters Synapt G2 Mass Spectrometerを使用した。サンプルを1mg/mLのDTT(100mM)で還元した。UPLC/MS条件:1μgサンプル注入をBEH C4 RPカラム、2.1×150mm、300Å、1.7mm粒子に、60℃、20分勾配:10%~38%(移動相B)を10分、LC流速200μL/分、陽MSイオンモード。この方法を同様にグリコシル化プロファイル分析に使用した。
全3つの7A10抗体の同一性を、測定質量とアミノ酸配列から理論的に予想される質量の一致に基づき、インタクト質量分析(MS)分析により確認した。さらに、グリコシル化プロファイルを決定し、mAbがN297でグリコシル化されるのが典型的であると判明した。
抗体の均一性を、次の条件を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によってもプローブした:Tosoh TSKgel Butyl NPRカラム、移動相A:0.1M リン酸ナトリウムpH7.0、2M硫酸アンモニウム、移動相B:0.1M リン酸ナトリウムpH7.0、流速:1.0mL/分。表6に示すとおり、全3抗体は、100%を主ピークとして示した。
抗体が凝集するかまたはトランケートされるかを評価するために、分析的SECを次の条件で実施した:Shodex K403-4Fカラム、緩衝液=100mM リン酸ナトリウム150mM 塩化ナトリウム、pH7.3、流速=0.3mL/分。表6に示すとおり、7A10の全バージョンは、検出可能HMW種を示さなかった。
抗体をまた10mg/mlの最終抗体濃度で同一ヒスチジン緩衝液に透析し、40℃で4週間インキュベートして、あらゆる潜在的化学的または物理的分解をさせた。表7に示すとおり、試験した3つの7A10抗体の何れもHMW種増加を示さなかった。少量のLMW種(2.5~5%)が出現した。
この実施例は、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用する7A10のαSyn結合行動を記載する。
図8は、表面に捕捉した抗体および野生型モノマーαSynの溶液中の結合行動を示す。この形式は、単価親和性の測定を可能とする。野生型αSynは極めて低くかつ弱い結合を示す。対照的に、PFFを溶液検体として試験したとき、αSynのはるかに大きな質量が結合することが観察された。これは、多価PFFの二価アビディティーによる堅固さの増加に一致する。対照抗ヒトαSyn抗体1も試験した。図8に示すとおり、抗体1は、モノマーおよびPFF αSynに類似の会合速度および解離速度で結合し、この抗体との二価性/アビディティーによる検出可能な結合増強はないことが示唆された。
次に、SPRアッセイの形式を、結合アビディティーの推定を容易にするために促進した。PFFは多量体であり、7A10は通常の二価モノクローナル抗体であることに注意すべきである。それ故に、結合データは、アビディティー効果による結合親和性の増強を反映する(図8参照)。
図9に示すとおり、7A10および7A10-T93Aは、表面に固定化したPFFに同等なアビディティーで結合する(7A10:ka(1/Ms):5.811E+7、kd(1/s):0.009834、KD:1.692E-10M;7A10-T93A:ka(1/Ms):8.946E+7、kd(1/s):0.03873、KD:4.329E-10M)。両者の会合動力学は極めて迅速であることが判明した。それにも関わらず、2つのデータセットを、このアッセイ形式でアビディティーに識別可能な差異があるか否かを決定するために、1:1結合モデルんい対して可能な限り厳密に分析した。カーブフィッティングに基づき、抗体は、表面に固定したPFFに4倍以内であるアビディティーで結合するように見える。
この実施例は、インビトロで、PFFまたはMSA脳ライセートにより誘導されるαSynの細胞内、界面活性剤不溶性、リン酸化(pS129)凝集体の産生を、抗αSyn抗体が遮断する能力を記載する。
αSynの細胞内、界面活性剤不溶性、リン酸化(pS129)凝集体は、培養細胞でPFFまたはMSA脳ライセートでの処理後誘導され得る(Prusiner et al., PNAS 2015:112:E5308-17; Luk et al., PNAS 2007;106:20051-6)。類似の系が、ヒトA53T αSynを過発現するラット海馬神経細胞を使用し、細胞をPFFまたはMSA脳ライセートサンプルに11日間曝した後、不溶性pS129 αSynの誘導を測定することにより開発された。
a. PFFの調製および線維化の分析
PFFを、実施例3に記載する方法を使用して調製し、分析した。
皮質脳サンプルを、Banner Health Research Institute(Sun City, AZ)から得た。患者12-18、01-03および04-51からのMSA脳組織を免疫枯渇実験に使用した。脳サンプルを、濾過PBS(1ml PBS/100mg 組織湿重量)中、KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(出力40、チューン50)で2×10秒間超音波処理した。サンプルを2ml エッペンドルフチューブに入れ、チューブを超音波処理の間湿氷上に維持した。脳ライセートを、3,000g、4℃で5分間遠心分離した。上清アリコートを液体窒素で凍結させ、-80℃で保存した。αSyn ELISA(総&pS129)を含むQCアッセイを実施した。高速回転ペレットを単離するために、PBS中100mg/mlで先に調製した脳ホモジネートを氷冷PBSで33.3mg/mlに3倍希釈し、その後100,000×gで30分間、4℃で遠心分離した。上清を除去し、廃棄した。ペレットを、出発サンプルと同一体積の氷冷PBSに再懸濁した。
初代ラット海馬神経細胞培養物を、製造業者の指示に従い(Worthington Biochemical)Papain Dissociation Systemを使用して、胎齢19日目(E19)に約7リットルから毎週調製した。ラット海馬細胞を、、1×B-27(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)を添加したNeural Basal Medium(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)および0.5mM GlutaMax(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)を含む神経細胞培養培地中30,000/ウェルでPDL被覆96ウェルBD造影プレート(約16プレート/週)に播種した。
予め調製した脳ホモジネート(100mg/ml)を、完全Neurobasal Medium(NBM)(pen/strep、GlutamaxおよびB-27サプリメント含有Neurobasal Medium)(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)で150倍希釈した。シヌクレイン抗体の濃度応答関数を、抗体の試験濃度を希釈脳ホモジネートに添加することにより試験した。サンプルを、4℃で2時間、回転インキュベーションでインキュベートし、その後洗浄かつ遮断したプロテインA/Gアガロースビーズスラリーを1:10希釈でサンプルに加え、その後、一夜、4℃で回転インキュベーションでインキュベーションした。プロテインA/Gアガロースビーズ(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)は、PBS+0.05%tween-20で1回、PBSで3回洗浄し、次いで2時間、4℃でPBS+1%BSAで遮断した;各工程2ビーズ体積;最終ビーズサンプルスラリーは、PBS:ビーズペレット1:1であった。インキュベーション後、サンプルを1500gで2分間遠心分離し、ビーズをペレット化させた。枯渇上清を除去し、免疫蛍光アッセイでの処理に使用した。
インビトロ日(DIV)4日目、ラット海馬神経細胞を、A53T変異を担持するヒトαSynについてのcDNAを含むアデノ随伴ウイルスベクター、AAV1(GeneDetect, Bradenton, Florida)で3,000のMOIで形質導入した。DIV7日目細胞を試験サンプルで処理した(6ウェル/処理)。全処理を、半培地交換により行った。各プレートは陰性対照(処理条件なし)、陽性対照(10nM PFF)および非枯渇誘導因子対照を含んだ。DIV18日目(処置11日後)、細胞を固定し、不溶性αSynについて染色した。固定化のために、4%パラホルムアルデヒドおよび4%スクロースおよび1%トリトンを含む溶液を15分間加えた。固定化後、細胞をDPBSと0.05%tweenを含む洗浄緩衝液で3回洗浄した。次いで細胞を3%BSAおよび0.3%トリトンのDPBSで1~2時間遮断し、非特異的シグナルを遮断した。遮断工程後、細胞を、遮断緩衝液中、一夜一次抗体で処理した。使用した一次抗体は、抗αSynおよびベータシヌクレイン(EP1646Y、Millipore/Abcam;Cambridge, UK;N末端ウサギモノクローナル、1:100希釈)、抗αSyn、ホスホS129(81A、Covance/Biolegend, Bogart、GAマウスモノクローナル、1:1000希釈)および抗MAP2(ab5392、Abcam;Cambridge, UK;ニワトリポリクローナル、1:10,000希釈)であった。次の日、プレートを0.05%tween含有DPBSで3回洗浄し、その後蛍光コンジュゲート二次抗体と1時間インキュベーションした。使用した二次抗体は、Alexa Fluor 647ヤギ抗マウスIgG、1:500希釈;Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギIgG、1:500希釈、Alexa Fluor 568ヤギ抗ニワトリIgG、1:500希釈およびHoechst、1:800希釈であった。全二次抗体をInvitrogenから得た。次いでプレートを、各15分、DPBSと0.05%tweenで3回洗浄し、最終洗浄はDPBS単独であった。
ArrayScanTM VTi全自動顕微鏡および画像分析システム(Cellomics Inc., Pittsburgh, PA)で×10対物レンズで画像を得た。造影プレートをHigh Content Studio 3.0 software package(Cellomics, USA)で神経細胞プロファイリング適用を使用して分析した。細胞をを核領域を規定するHoechst蛍光により同定し、神経突起をMAP2染色により同定した。細胞体を重複核およびMAP2染色により同定した。総不溶性αSynおよびS129での総リン酸化αSyn(pS129)を、さらに2チャネルの蛍光強度により同定した。誘導を、神経突起と共存する総pS129スポット強度により定量した。誘導倍率は、陰性対照ウェルの平均に対して正規化することにより決定した。毒性指数は、正規化核数、正規化神経細胞数および正規化神経突起長を乗算し、各ウェルは陰性対照ウェルの各平均値に対して正規化されている。0.6未満の毒性スコアのウェルを分析から除外した。各抗体試験濃度の誘導倍率値を、非枯渇誘導因子処理ウェルの平均に対して正規化した。濃度応答曲線を、式Y=底+(頂上-底)/(1+10^((X-LogIC50)))を使用してPrism(GraphPad)で最小二乗フィットにより作成し、IC50を各実験について計算した。
図10Aに示すとおり、AAV-hA53T-αSynを使用するA53T αSynの過発現は、ハイコンテンツ免疫蛍光分析で測定して、PFF誘導pS129シグナルの力強い増加を示した。PFF誘導pS129シグナルは用量依存的であり、300nMまでの種々の濃度のhA53T-αSynモノマーで誘導できなかった(図10B)。さらに、9の異なるMSA脳ライセートサンプルでの処理もpS129シグナルを誘導した(図10C);しかしながら、誘導は対照脳ライセートでは観察されなかった(図10D)。PS129シグナルのPFF依存的増加はMAP2陽性神経細胞の分岐点の減少と相関した(図10E)。MSAライセートの誘導活性は、高速遠心分離により単離され(図10F)、これらのサンプルにおける誘導因子は、高分子量凝集体であることが示唆された。さらに、pS129シグナルの時間依存的増加がMSAペレットでの処理後にみられた(7日間インキュベーション:0.22±0.06の10nM PFF、n=6;14日間インキュベーション:0.32±0.05の10nM PFF、n=6;18日間インキュベーション:0.52±0.08の10nM PFF、n=6)(図10G)。最後に、hA53T-αSyn PFFでみられる誘導病理に類似して、分岐点の減少もMSA脳ライセートサンプルでの処理後観察された(10nM PFF:0.50±0.16、n=4300;MSA:0.58±0.17、n=1842;図10H)。
a 7A10または21A3親に対するおよび対応のあるt検定に基づく統計。ns:p>0.05;* p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。t検定結果は特に断らない限りnsである
この実施例は、抗αSyn抗体がマウスモデルでαSyn病理の拡散および伝達を阻止する能力を試験する。
a. マウス
本試験に使用したマウスは、マウスSncaノックアウトバックグラウンドでヒトA53T変異を担持する2~3か月齢、雄および雌[PAC-Tg(SNCAA53T)+/+;Snca-/-](PAC-A53T)マウス(Kuo et al, Human Molecular Genetics 2010:19:1633-50)であり、インビボ有効性試験に使用した。マウスを、餌および水は自由に摂取できる温度制御室で4匹の群で飼育した。。
約40μl血液を、雄および雌PAC-A53Tマウスのサブセットから後眼窩採血により集め、抗体および抗薬物-抗体(ADA)レベルのベースラインを設定した。マウスのコホート全体を対照および処置群の2群に分けた。対照群のマウスに腹腔内(i.p)食塩水注射を与え、その後PBS注射を線条体にし、さらに4回毎週食塩水注射を実験完了まで与えた(n=8)。マウスの第2群を、食塩水(n=11)、抗体1(n=12)、7A10(n=12)、11AH11(n=12)、15A5(n=11)、21A3(n=11)、36A3(n=11)、44B11(n=12)および抗体3(n=5)の9下位処置群に分けた。第二群の全マウスに、食塩水または選択抗体を最初にi.p.投与し、続いて組み換えA53T-PFFを接種した。対照群と同様、処置群は、さらに4回毎週食塩水または選択抗体のi.p.注射を受けた。全処置群の抗体用量は10mg/kgであった。抗体用量の選択は、抗体3抗体がPAC-A53TマウスにおけるpSer129病理を効果的に減少させた研究Iの結果に基づいた。毎週抗体処置の前に、全処置群で薬物動態(PK)および可能性があるADAレベルを評価するために、マウスのサブセットで後眼窩採血を行った。マウスをA53T-PFF接種30日後かつ最後の抗体処置24時間後に屠殺した。
マウスを、A53T-PFF注射30日後病理評価のため屠殺した。組織学的試験のため、脳を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で48時間、その後24時間15%スクロース、次いで48時間(または使用するまで)30%スクロース溶液で固定した。冠状40μm連続脳切片を、スライド式ミクロトーム(Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL)で調製し、IHC分析まで凍結保護物質に入れた。IHC手順は次の工程を含んだ:脳切片を染色皿に移し、リン酸緩衝化食塩水(PBS、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)で3回濯いだ(5分/濯ぎ)。次いで切片を10分間、3.7%ホルムアルデヒド(PBS中)で後固定した。次いでPBSで2回濯いだ(10分/濯ぎ)。次に、切片を新鮮3%H2O2、PBS中10%メタノールで30分間インキュベートして、内在性ペルオキシダーゼ活性を除去した。切片をPBS(10分/濯ぎ)で3回濯ぎ、その後1時間、室温でPBS中10%標準血清(二次抗体の種からの血清を使用)と0.3%Triton X-100で遮断工程を行った。次いで切片をPBS(10分/濯ぎ)で3回濯いだ。脳切片を一夜、一次抗体[1:100,000希釈の抗アルファ-syn pSer129(Abcam, Cambridge, UK;ab51253)]で、4℃でマイクロタイタープレートシェーカーで、穏やかであるが、なお切片を均一に撹拌する速度でインキュベートした。IHCの2日目、脳切片をPBS(10分/濯ぎ)で4回濯ぎ、次いでビオチニル化二次抗体(PBS中1:500ヤギ抗ウサギ、Vector BA-1000)と60分間インキュベートした。次いで切片をPBS(4回、10分/濯ぎ)で濯ぎ、その後PBS中で製造したABC複合体と60分間、室温でインキュベートした(Elite ABC kit, Vector laboratories, Burlingame, CA)。PBS(4回、10分/濯ぎ)で濯いだ後、切片を10分間、ペルオキシダーゼ基質(Vector Cat. # SK-4100, Vector laboratories, Burlingame, CA)とインキュベートした。最後に、脳切片をPBS(4回、10分/濯ぎ)で濯ぎ、Superfrost Plus Micro Slides (VWR, Randor, PA)にマウントした。スライドを空気乾燥させ、その後ヘマトキシリンおよびScott's blue溶液で対比染色し、その後一連のエタノール濯ぎを行った。スライドを最後にパーマウントおよびマイクロカバーガラス(VWR, Randor, PA)を使用してカバーガラスで覆い、スキャニングおよびIHC定量分析のために乾燥させた。
ELISAプレート(Costar 3925)を、PBS(GIBCO cat#14190)で希釈した100μlの1μg/ml PFF(α-シヌクレインWT、PROTEOSから調製)で、2時間、室温(RT)で被覆した。PFFを、コーティング前に毎秒休止しながら15秒間超音波処理した。プレートをダルベッコPBS(Life Technologies, #14040-117)中0.05%Tweenで4回洗浄し、150μlのDPBS中3%BSA(ウシ血清アルブミン、プロテアーゼフリー、Fraction V, Roch Diagnostic #03117332001)で2~3時間、RTまたは一夜、4℃で遮断した。標準、血漿および脳サンプルを、Rocheプロテアーゼ阻害剤(Roche 11836145001、1ペレット/25ml)含有1%BSA/0.05%Tween/DPBSで希釈した。100μL/ウェルのサンプル(3~4希釈)をデュプリケートで乗せ、約2時間、RTでインキュベートした。0.05%Tween/DPBSで4回プレートを洗浄後、1%BSA/0.2%Tween/DPBSで1:1000希釈した100μlの二次抗体(アルカリホスファターゼ-affinipureロバ抗ヒトIgG、JacksonImmuno #709-055-149、50%グリセロール含有)を加え、1時間、RTでインキュベートした。4回の洗浄後、プレートを100μLのアルカリホスファターゼ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II, T-2214, Life Technologies)で30分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。プレートをアッセイ中一定の振盪(Titer plate shaker、速度3)に維持した。
非定量的免疫原性アッセイを、抗体1、7A10、11AH11、15A5、21A3、36A3、44B11および抗体3で処置したマウスにおける抗体1、抗7A10抗体、抗11AH11抗体、抗15A5抗体、抗21A3抗体、抗36A3抗体、抗44B11抗体および抗体3の可能性がある進展を検出するために開発した。この酵素結合免疫吸着法において、抗体1、7A10、11AH11、15A5、21A3、36A3、44B11および抗体3をMaxisorp平底96ウェルプレートに、一夜、4℃で被覆させた。1:100希釈した血清サンプルを一夜、室温でインキュベートして、潜在的抗薬物抗体(ADA)を捕捉した。捕捉抗体をヤギ抗マウス免疫グロブリンG(IgG)および免疫グロブリンM(IgM)ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素(HRP)コンジュゲート抗体で検出した。ヤギ抗ヒト免疫グロブリンG(IgG)および免疫グロブリンM(IgM)ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素(HRP)コンジュゲート抗体を陽性対照として使用した。テトラメチルベンジジン(TMB)を、血清サンプルに存在する抗体1、抗7A10抗体、抗11AH11抗体、抗15A5抗体、抗21A抗体3、抗36A3抗体、抗44B11抗体および抗体3の量に比例して光学密度(OD450)を生じるHRPの発色基質として加えた。
簡潔には、ELISAプレート(Costar 3925)を、BupH炭酸-重炭酸緩衝液、pH9.4(Thermo Fisher Scientific # 28382)で希釈した100μlの各捕捉抗体で、一夜、4℃で被覆した。捕捉抗体MJFR1(Abcam ab138501)を
0.1μg/ml(総α-シヌクレインアッセイ)または0.35μg/ml(pS129アッセイ)、MJFR14-6-4-2(Abcam ab209538)を0.1μg/mlおよび1E8(BMS 5446.1E8.10)を0.3μg/mlの濃度で使用した。プレートををダルベッコPBS(Thermo Fisher Scientific, #14040-117)で4回洗浄し、DPBS中の3%BSA(ウシ血清アルブミン、プロテアーゼフリー、Fraction V, Thermo Fisher Scientific)で2~3時間、室温(RT)または一夜、4℃で遮断した。標準、脳サンプルおよびQCサンプルを、Rocheプロテアーゼ阻害剤(Thermo Fisher Scientific、1ペレット/25ml)およびホスファターゼ阻害剤2&3(Sigma Aldrich, P5726 & P0044、1:100)含有1%BSA/0.05%Tween/DPBSで希釈した。標準は、α-シヌクレインWT(rPeptide S-1001)、pS129(aa89-140, AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHH-CONH2;配列番号129)またはPFF(α-シヌクレインWT、PROTEOSから調製)であった。サンプル50μL/ウェルをデュプリケートで乗せ、一夜、4℃でインキュベートした。プレートをRTに平衡化後、1%BSA/0.1%Tween/DPBSで1:4000希釈した50μl検出抗体を加え、サンプルとRTで約2時間共インキュベートした。検出抗体(4B12はBioLegend SIG39730から, MBJR13はAbcam ab168381, 2E2および23H8から)をアルカリホスファターゼ(Novus Biologicals #702-0010からのAPキット)とプレコンジュゲートした。次いでプレートを0.05%Tween/PBSで4回洗浄し、100μLのアルカリホスファターゼ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、T-2214、Thermo Fisher Scientific)で30分間展開した。発光カウントを、Perkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。プレートををアッセイ中一定の振盪(Titer plate shaker、速度3)に維持した。
PFF接種マウスに、PBS(n=11)または抗体1(n=12)、7A10(n=12)、11AH11(n=12)、15A5(n=11)、21A3(n=11)、36A3(n=11)、44B11(n=12)および抗体3(n=5)を4週間毎週IP注射により投与した。PBS接種マウスに、陰性対照としてPBS(n=8)をIP注射により投与した。全抗体を10mg/kgで投与した。毎週抗体処置の前に、薬物動態(PK)および可能性があるADAレベルを評価するためにマウスのサブセットで後眼窩採血を行った。マウスを、接種30日後かつ最後の抗体処置24時間後に屠殺した。抗体レベルを、マウスのサブセットからの脳組織で測定した。pS129 αSyn病理を、免疫組織化学により選択脳領域で検定した。
血漿抗体暴露を図18に概説する。血漿暴露は、抗体間で約100倍変わり、1μg/ml~100μg/mlの範囲であった。一部抗体(例えば21A3および抗体1)の低暴露は、ADAによる可能性があった。抗体3対照抗体の血漿濃度は、最初の処置試験で観察されたレベルに類似した。脳組織抽出物の抗体レベルを図19に示す。脳暴露は抗体間で約10倍代わり、約25ng/ml~250ng/mlの範囲であった。類似する抗体レベルが、脳半球の注射部位に対して同側性および対側性で観察された。ADAを血漿サンプルで測定した(表13および14)。ADAは、抗体3(n=3)、抗体1(n=6)、7A10(n=1)、21A3(n=7)、15A5(n=1)、36A3(n=1)および44B11(n=1)について一部動物で観察された。ADAは抗体11H11-1では観察されなかった。低血漿抗体レベルは、抗体1および21A3処置についてはADAと関連した(図20)。対照的に、血漿抗体レベルは、抗体3、7A10、15A5および44B11についてADA存在下で不利に影響しなかった。
a 顕著なADA活性があるサンプルのみを示す。ADAは11H11-1では観察されなかった
b ID#は、サンプル採取週(wk1、wk2、wk3またはwk4)および動物ID#を示す
c 光学密度は450nmの発色基質で測定した。
d カットオフは媒体対照サンプルの平均ODの2×に基づいた。カットオフ限界を上回るOD値は有意と見なされる。各アッセイプレートについて計算されたカットオフを示す。
a 顕著なADA活性があるサンプルのみを示す。
b ID#は、サンプル採取週(wk1、wk2、wk3またはwk4)および動物ID#を示す
c 光学密度は450nmの発色基質で測定した。
d カットオフは媒体対照サンプルの平均ODの2×に基づいた。カットオフ限界を上回るOD値は有意と見なされる。各アッセイプレートについて計算されたカットオフが示される。
纏めると、抗αSyn抗体7A10、11H11-1、15A5、21A3、36A3および44B11はインビボでαSyn病理の伝達の遮断に有効である。
本実施例は、ヒト脳ライセートおよびCSFでαSynオリゴマーレベルを測定するためのオリゴマー特異的ELISAの開発を記載する。
a. エピトープマッピング
エピトープマッピング試験用αSynペプチドをInnoPep(San Diego, CA)から購入した。ヒトαSyn配列の2セットの重複ペプチドを、N末端ビオチン基およびPEG4リンカーおよびC末端を伴い産生した。ペプチドを1mg/mlでPBSに可溶化した。マッピング試験のために、100μLのPBS中0.25μg/ml α-シヌクレインペプチドをニュートラアビジン被覆高容量96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific)に加え、室温(RT)で2時間(または4℃で一夜(O/N))インキュベートした。プレートを約300μLの洗浄緩衝液(PBS中0.05%Tween)で3回洗浄した。次いでプレートを150μlのPBS中3%BSAでRTで約2時間(または4℃でO/N)遮断した。サンプル緩衝液(0.1%BSA/0.05%Tween/PBS、2ペレットのRocheプロテアーゼ阻害剤-50ml緩衝液中)で希釈した100μLの試験サンプルを、プレート上でRTで2時間インキュベートした。次いでプレートを3回洗浄した。PBSTB(1%BSA/0.2%Tween/DPBS)で1:1000希釈した100μLの二次抗体を加え、RTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄あたり5~10分で3回洗浄した。100μLのAP基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、Applied Biosystems; Cat #T-2214)を加え、RTで30分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で読んだ。プレートをアッセイ中一定振盪下(Titer plate shaker、速度3)に置いた。使用した二次抗体はルカリホスファターゼ-affinipureロバ抗ヒトIgG(JacksonImmuno #709-055-149)、アルカリホスファターゼ-affinipureロバ抗ウサギIgG(JacksonImmuno #711-055-152)、アルカリホスファターゼ-affinipureロバ抗マウスIgG(JacksonImmuno #715-055-151)を含んだ。全二次抗体を50%グリセロール最終濃度に希釈した。
PFFを、実施例3に記載する方法を使用して調製し、分析した。
抗体を、ヒトαSynモノマー、ヒトβSynモノマー、ヒトγSynモノマー、ヒトαSynから取得したPFF、ヒトA53T αSynから取得したPFFならびにヒト、ラットおよびマウス配列を含むαSynペプチドアミノ酸111~140への結合について試験した。ヒト、ラットおよびマウス配列を含むαSynペプチドアミノ酸111~140はInnoPep(San Diego, CA)から購入した。ヒトαSynモノマー、ヒトβSynモノマーおよびヒトγSynモノマーは、rPeptide (Bogart, GA)から購入した。
結合アッセイのために、96ウェルプレート(Costa #3925、高結合マイクロプレート)を、100μLのPBS中1μg/ml αSyn WT PFFでRTで2時間(または4℃でO/N)被覆した。プレートをを約300μLの洗浄緩衝液(DPBS中0.05%Tween)で3回洗浄した。プレートを150μlの3%BSA/PBSでRTで2時間(または4℃でO/N)遮断した。PFF(2μg/mlから開始)およびα-syn WTモノマー(20μg/mlから開始)の3倍連続希釈をサンプル緩衝液(0.1%BSA/0.05%Tween/PBS、2ペレットのRoche完全プロテアーゼ阻害剤-50ml緩衝液中)中で調製した。抗体インキュベーションのために、等体積の2倍アッセイ濃度のαSyn PFFまたはモノマーを、BDファルコン低結合プレート中2倍アッセイ抗体の濃度と混合し、RTで約2時間インキュベートした。100μLの抗体とPFFまたはモノマーの混合物をPFF被覆プレートに加え、RTで10分間インキュベートした。プレートを3回洗浄した。PBSTB(1%BSA/0.2%Tween/dPBS)で1:1000希釈した100μLのロバ抗ヒトIgG(JacksoImmuno #709-055-149、50%グリセロール含有)を加え、プレートRTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄あたり5~10分で3回洗浄した。100μLのAP基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、Applied Biosystems)を加え、プレートRTで30分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。PFFを、15回1秒間パルスで超音波処理し、その後抗体でコーティングまたは混合した。プレートをアッセイ中一定振盪下(Titer plate shaker、速度3)に置いた。
ELISAプレート(Costar)を、BupH炭酸-重炭酸緩衝液、pH9.4(Thermo Fisher Scientific)で希釈した100μlの各捕捉抗体で一夜、4℃で被覆した。捕捉抗体MJFR1(Abcam)を0.1μg/ml(総α-シヌクレインアッセイ)または0.35μg/ml(pS129アッセイ)、MJFR14642(Abcam)を0.1μg/mlおよび1E8を0.3μg/mlの濃度で使用した。プレートをダルベッコPBS(Thermo Fisher Scientific)で4回洗浄し、PBS中3%BSA(ウシ血清アルブミン、プロテアーゼフリー、Fraction V)で2~3時間、RTまたは一夜、4℃で遮断した。標準、脳サンプルおよびQCサンプルを、Roche完全プロテアーゼ阻害剤(1ペレット/25ml)およびホスファターゼ阻害剤2&3(Sigma Aldrich、1:100)含有1%BSA/0.05%Tween/PBSで希釈した。標準はα-シヌクレインWT(rPeptide)、pS129(aa89-140,AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHH-CONH2;配列番号129)またはPFFであった。PFFおよびモノマーの超音波処理を、KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(出力40、チューン50)を使用して行った。サンプルを15回1秒/バルスで超音波処理した。サンプル50μL/ウェルをデュプリケートで乗せ、O/N、4℃でインキュベートした。プレートをRTに平衡化後、1%BSA/0.1%Tween/DPBSで1:4000希釈した50μl検出抗体を加え、サンプルとRTで約2時間共インキュベートした。検出抗体(4B12はCovanceから, MBJR13はAbcam, 2E2および23H8から)をアルカリホスファターゼ(Novus BiologicalsからのAPキット)とプレコンジュゲートした。次いでプレートを0.05%Tween/PBSで4回洗浄し、100μLのアルカリホスファターゼ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II、T-2214、Thermo Fisher Scientific)で30分間展開した。発光カウントを、Perkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。プレートををアッセイ中一定の振盪(Titer plate shaker、速度3)に維持した。データをGraphPad Prismを使用して分析した。
脳サンプルwを、濾過PBS(Gibco, #70011、1ml PBS/100mg 組織湿重量)中、KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(出力40、チューン50)で2×10秒/パルスで超音波処理した。サンプルを2ml エッペンドルフチューブに入れ、チューブを超音波処理の間、湿氷上に維持した。脳ライセートを3,000g、4℃で5分間遠沈させた。上清アリコートを液体窒素で凍結させ、-80℃で保存した。αSyn ELISA(総&pS129)を含むQCアッセイおよびBCAを実施した。
高速回転ペレットを単離するために、1×PBS中100mg/mlで予め調製した脳ホモジネートを、氷冷1×PBSで3倍の33.3mg/mlに希釈し、その後100,000×gで30分間、4℃で遠心分離した。上清を除去し、廃棄した。ペレットを、出発サンプルと同一体積の氷冷1×PBSに再懸濁した。
プールしたヒト脳抽出物を、次のサンプルを等比率で合わせることにより調製した:PD(PD1、PD3およびPD5)、MSA(12-18、01-03および14-49)およびDLB(13-37、05-31および08-26)。プールしたサンプルをPBSTB緩衝液(1%BSA+0.05%Tween+PBS)で100倍希釈した。免疫沈降のために、脳抽出物を、抗体と4℃で2時間上下回転させながらインキュベートした。次いでプロテインA/Gアガロースビーズ(Thermo Fisher Scientific)を加え、サンプルを一夜、4℃でインキュベートした。プロテインA/Gビーズ調製のために、1.2mlビーズスラリーを1000×gで2分間、4℃で遠心分離した。貯蔵緩衝液を除去し、ビーズを0.05%tween-20含有0.6ml PBSで1回洗浄し、上記のとおり遠心分離し、ビーズを0.6ml PBSで3回洗浄した。最終回転後、ビーズを0.6ml PBS中1%BSAを加え、4℃で2時間回転インキュベーションして遮断した。遮断後、ビーズを遠心分離により単離し、1.2mlの最終体積まで0.6ml PBSに再懸濁した。ビーズスラリーを、1:10(vol:vol)希釈で各脳抽出物に加えた。一夜免疫沈降後、サンプルを遠心分離してビーズを除去し、枯渇脳サンプルを単離し、ELISAにより評価した。次の抗体を免疫沈降に使用した:26D6(ヒトAベータに特異的なマウスIgG対照抗体(アミノ酸1~12)、MJFR-14642(Abcam)、LB509(Covance)、クローン42(BD)、7A10および1E8。
初代ラット海馬神経細胞を実施例10に記載のとおり調製した。
免疫蛍光を実施例10に記載のとおり実施した。
ハイコンテンツ免疫蛍光アッセイを実施例10に記載のとおり実施した。
MSAおよびPD脳組織からの脳ホモジネートを上記のとおり取得した。200μlの各脳ホモジネートを、PBS(Thermo Fisher Scientific)の添加により400μlの総体積とした。希釈サンプルを100,000×gで30分間、4℃で遠心分離して、高分子量凝集体を単離した。ペレットを200μl PBSに再懸濁した。50μlの4×NuPAGEローディング・ダイ(Thermo Fisher Scientific)および20μlのNuPAGE 10×還元剤(Thermo Fisher Scientific)を130μlのペレットホモジネートに加えた。サンプルを95℃で5分間インキュベーションすることにより変性させ、次いで10μlのサンプルを、4~12%NuPAGE Bis-Trisゲルで1×MESランニング緩衝液(Thermo Fisher Scientific)で分画した。ゲルを、200Vで50分間流し、その後0.4μm ニトロセルロース(Thermo Fisher Scientific)に30Vで1時間移した。次いでブロットをTBST(0.1%Tween-20含有TBS(Promega))中5%ミルクで遮断した。次いでブロットを一夜、4℃で振盪しながら、TBST中1%BSA(BioRad)で1:5000希釈した次の抗体でプローブした:4B12(BioLegend)、4D6(BioLegend)、Syn-303(BioLegend)、81A(BioLegend)、EP1536Y(Abcam)、LB509(BioLegend)、マウスIgG(Thermo Fisher Scientific)、抗アクチン(Sigma)。全抗体を、BioRad EZ-linkコンジュゲーションキットを使用してHRPにコンジュゲートした。一夜インキュベーション後、ブロットをTBSTで洗浄した。HRP標識抗体をSupersignal West Femto Maximum(Thermo Fisher Scientific)検出試薬を知央して検出し、画像をGE AI600 CCDカメラを使用して撮った。
100μlのMSA脳ホモジネート11-46および対照脳ホモジネート11-49を400μlのPBSに加え、サンプルを100,000×gで30分間、4℃で遠心分離した。上清(sup)を保存し、残存ペレットを120μl PBSに再懸濁した。サイズ排除クロマトグラフィーのために、100μlのsupまたはペレットをAgilent 1100 HPLCのBioSec-5 300Å SECカラム(7.8mm直径×300mm、Agilent)に注入した。1mlフラクションを、20mlランタイムをとおして採取した。使用した移動相はPBSであった。カラを、1ml/分および37℃カラム温度で流した。SECフラクションを濃縮するために、サンプルをWaters Oasis SPE HLBカートリッジを使用する固相抽出(SPE)に付した。1mlの各SECフラクションを1000μl 4%リン酸で希釈した。SPEカラムを1ml メタノールで条件付けし、次いで1ml H2Oで平衡化した。次いで酸化サンプルを加えた。充填カラムを1ml 5%メタノールで洗浄し、サンプルを1ml 100%メタノールで溶出した。溶離液を、speed vacで一夜乾燥させた。SPE精製SEC-HPLCフラクションを、SDS-PAGE/免疫ブロット分析まで-20℃で乾燥で保存した。
a. 抗体の特徴づけ
この使用に使用した抗体の概要を表15に記載する。
a 実施例2に記載の方法に準じてエピトープマップ;図1参照。
b ベンダーにより提供されたエピトープ
c J Duda, et al., Ann Neurol 2002; H Tran, et al., Cell Reports, 2014
d M Baba, et al., Am J Path 1998; R Jakes, et al., Neurosci Letts 1999
e Waxman and B Giasson, J Neuropath Exp Neurol 2008
上記モノマーおよびPFF結合データに基づき、種々の抗体ペア組み合わせを開発し、αSynモノマーおよびαSyn PFF/オリゴマーの検出のためのサンドイッチELISAで評価した;同定された最適ELISAペアの概要およびこれらのアッセイの特異性を表17に示す。
a 検出抗体をアルカリホスファターゼ(AP)とコンジュゲートした
b LLQ(定量下限)を、アッセイ背景の2倍と定義する。モノマーLLQは超音波処理モノマーの結果に基づく;同等な結果が非超音波処理モノマーで得られた。PFF LLQは超音波処理PFFに基づく。pS129 ELISA(MJFR1+MJFR13)のLLQは2pg/ml(pS129ペプチド)である。
ELISAを使用して、対照および疾患組織(AD、PSP、MSA、PD、DLB)から取得した脳抽出物におけるオリゴマー、pS129および総αSynレベルを測定した。脳抽出物ELISAシグナル特異性は、希釈直線性および免疫枯渇試験により確認された。図30に示すとおり、他の神経変性疾患(AD、PSP)および対照からの抽出物と比較して、強固なレベルのαSynオリゴマー(1E8+2E2およびMJFR14642+23H8)が、PD脳抽出物で検出された。PD抽出物の平均オリゴマーレベルは、1E8+2E2 ELISAで36ng/mg総タンパク質およびMJFR14642+23H8.G2 ELISAで40ng/mg総タンパク質であった(表18)。オリゴマーレベルは、AD、PSPおよび対照抽出物の大部分で<LLQであった。オリゴマー結果と対照的に、類似するレベルの総αSynが、MJFR1+4B12アッセイを使用して測定して、全抽出物にわたり観察された(図30;表18)。pS129 αSynは全抽出物で検出されたが、レベルはPDで増加し、対照と比較して有意に高かった(図30;表18)。
a データは総タンパク質に対して正規化し、モノマー当量(pg/mg総タンパク質)またはpS129ペプチド当量(pg/mg総タンパク質)として表す。総タンパク質レベルはmg/mlとして表す
a データは総タンパク質に対して正規化し、モノマー当量(pg/mg総タンパク質)またはpS129ペプチド当量(pg/mg総タンパク質)として表す。総タンパク質レベルはmg/mlとして表す。
高速遠心分離を使用してαSyn PFFを精製でき、脳抽出物からのタウタンパク質の高分子量凝集体の単離に使用されている。類似戦略を使用して、シヌクレイン病脳抽出物に存在するαSyn凝集体を単離し、特徴づけした。対照、MSA、DLBおよびPD脳抽出物を高速遠心分離に付し、可溶性(supe)および不溶性(ペレット)物質を単離し、オリゴマーELISAにより分離した。図35に示すとおり、オリゴマーは、対照脳組織から取得した抽出物を含む脳抽出物ペレットで検出された。これらのELISAシグナルの特異性は、希釈直線性により確認された。同等な結果が両オリゴマーELISAで得られた。出発抽出物のレベルに相対的なペレットにおけるオリゴマーの全体的回収は、20~80%の範囲であった(図35)。対照的に、オリゴマーは脳抽出物の何れの上清でも検出されなかった。これらの発見は、オリゴマーが高分子量凝集体として存在することを示し、またオリゴマーが対照脳抽出物に存在するが、疾患抽出物より低レベルであることも示唆する。
複数種が、60~100kDa分子量範囲で検出された(図39)。約60kDa(Syn303、4B12、4D6)および約80~100kDa(4B12、LB509、4D6)の潜在的αSyn凝集体が検出された。全体として、種々のαSyn抗体で観察された免疫反応性パターンは、全脳抽出物ペレットにわたり類似した。
αSyn PFFおよびシヌクレイン病患者脳組織から単離した抽出物は、培養中の初代神経細胞に加えたとき、αSynの不溶性、高度にリン酸化した凝集体の形成を誘導した。さらに、誘導は、脳抽出物に存在するαSynの高分子量種に依存した。これらの発見は、αSyn病理がプリオン様方式で伝播され得るとの考えを支持し、伝達性種がαSynの凝集体であることを示唆する。対照、MSA、DLBおよびPD抽出物のペレットフラクションから単離された高分子量凝集体の、ヒトA53T αSynを過発現する初代神経細胞における不溶性、pS1290 αSyn誘導について評価した。不溶性pS129の強固な誘導が、MSA脳抽出物ペレット処置後11日間観察された;対照的に、PDおよびDLB抽出物ペレットで10倍低レベルの誘導が観察され、対照抽出物ペレットでは背景シグナルしか観察されなかった(図40)。誘導はペレット単離体に存在するオリゴマーのレベルと関連しなかった。これらの結果は、MSA抽出物ペレットで観察された強固な誘導が、PD、DLBおよび対照と比較してMS高分子量種の高次構造および/または修飾の差異と関連し得て、これらの差異がおそらくレシピエント細胞内の取り込みおよび/または鋳型凝集開始の能力に影響する可能性があることを示唆する。
αSynオリゴマーELISA 1E8+2E2およびMJFR14642+23H8を使用して、MSAシヌクレイン病患者および対照からのCSFを評価した;総αSyn ELISA MJFR1+4B12も比較のため包含させた。希釈直線性および添加回収率分析を使用して、ヒトCSFについてアッセイを検証し、最適希釈を同定した。図41に示すとおり、オリゴマーレベルは、MSA、進行性核上性麻痺(PSP)および対照を含むコホート1の全CSFサンプルで<LLQであった。同等な結果が1E8+2E2およびMJFR14642+23H8 ELISAの両者で得られた。対照的に、約1000pg/mlの総αSynレベルがMJFR1+4B12アッセイで観察され、レベルはMSA、PSPおよび対照間で類似した。MSAおよび対照CSFサンプルの第二コホートを分析した(図42)。コホート1で観察されたとおり、大部分のサンプルのオリゴマーレベルは<LLQであった;しかしながら、定量化可能オリゴマーレベルが1E8+2E2 ELISAの7つのCSFサンプル(6つのMSAおよび1つの対照)で検出された。コホート1での結果に一致して、MJFR1+4B12で測定した総αSynレベルはMSAと対照CSFサンプルで類似し、約1000pg/mlであった。
当業者は、日常的なレベルを超える実験を実施せずに、ここに開示する特定の実施態様の多くの均等物を認識し、または確認できる。このような均等物は、次の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
Claims (39)
- 次のCDRを含む重鎖可変領域:
i. 配列番号12のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号13のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号14のアミノ酸配列を有するCDR3;および
次のCDRを含む軽鎖可変領域:
i. 配列番号15のアミノ酸配列を有するCDR1;
ii. 配列番号16のアミノ酸配列を有するCDR2;および
iii.配列番号17のアミノ酸配列を有するCDR3;
を含む単離抗体またはその抗原結合部分であって、抗体またはその抗原結合部分がヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する、単離抗体またはその抗原結合部分。 - 抗体またはその抗原結合部分が配列番号1のアミノ酸残基123~128の少なくとも1以上に結合する、請求項1に記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
- 抗体またはその抗原結合部分がそれぞれ配列番号18および19に示すアミノ酸配列と少なくとも95%同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、請求項1または2に記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号18に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号19に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合部分であって、抗体またはその抗原結合部分がヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する、単離抗体またはその抗原結合部分。
- 抗体またはその抗原結合部分がそれぞれ配列番号20および21に示すアミノ酸配列と少なくとも95%同一である重鎖および軽鎖配列を含む、請求項1~4の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号20に示すアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号21に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を含む単離抗体またはその抗原結合部分であって、抗体またはその抗原結合部分がヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する、単離抗体またはその抗原結合部分。
- 2つの重鎖および2つの軽鎖を含む単離抗体であって、重鎖のそれぞれが配列番号20に示すアミノ酸配列を含み、軽鎖のそれぞれが配列番号21に示すアミノ酸配列を含み、抗体がヒトα-シヌクレイン(配列番号1)に結合する、単離抗体。
- 抗体またはその抗原結合部分がIgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項1~2の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
- 抗体またはその抗原結合部分が配列番号119に示すアミノ酸配列を含むFcドメインを含む、請求項1~8の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
- 抗体またはその抗原結合部分がキメラ、ヒト化またはヒト抗体である、請求項1~2の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1~2の何れかに記載の単離抗体を含む、単離二特異性抗体。
- 請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域をコードする、核酸分子。
- 第1のベクターおよび第2のベクターからなる2つの別々のベクターを含む組成物であって、該第1のベクターは重鎖遺伝子を含み、該第2のベクターは軽鎖遺伝子を含み、該重鎖遺伝子および該軽鎖遺伝子は、請求項1~11の何れかに記載の単離抗体の重鎖および軽鎖をコードする、組成物。
- 請求項12に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項14に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
- 部分と連結された、請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体であって、該部分は、結合部分、標識部分、生物学的活性部分および治療剤からなる群から選択される、免疫複合体。
- 請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- 抗α-シヌクレイン抗体またはその抗原結合部分を製造する方法であって、
請求項14に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、ここで該抗体またはその抗原結合部分が発現され;そして
該抗体またはその抗原結合部分を該細胞から単離すること
を含む、方法。 - 細胞における不溶性セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体の産生を阻害するための組成物であって、有効量の請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分、請求項16に記載の免疫複合体または請求項17に記載の組成物を含む、組成物。
- 細胞における不溶性セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体の産生を阻害するインビトロでの方法であって、細胞と有効量の請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分、請求項16に記載の免疫複合体または請求項17に記載の組成物を接触させることを含む、インビトロでの方法。
- 神経細胞および/またはグリア細胞におけるレビー小体またはα-シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられるヒト対象における疾患を処置するまたは重症度を低減するための組成物であって、有効量の請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分、請求項16に記載の免疫複合体または請求項17に記載の組成物を含む、組成物。
- 疾患がパーキンソン病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、レビー小体病、多系統萎縮症または純粋自律神経失調症である、請求項21に記載の組成物。
- 1以上の付加的治療剤をさらに含む、請求項21または22に記載の組成物。
- 神経細胞および/またはグリア細胞におけるレビー小体またはα-シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられるヒト対象における疾患を処置するまたは重症度を低減するための医薬の製造のための、請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分、請求項16に記載の免疫複合体または請求項17に記載の組成物の使用。
- 疾患がパーキンソン病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、レビー小体病、多系統萎縮症または純粋自律神経失調症である、請求項24に記載の使用。
- 1以上の付加的治療剤をさらに含む、請求項24または25に記載の使用。
- ヒト対象からのサンプルにおけるα-シヌクレインを検出する方法であって、サンプルと請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分または請求項16に記載の免疫複合体を、該単離抗体またはその抗原結合部分または免疫複合体とα-シヌクレインで複合体の形成をさせる条件下で接触させ、該複合体の形成を検出することを含む、方法。
- 細胞における不溶性または可溶性α-シヌクレイン凝集体の産生を阻害するための組成物であって、有効量の請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分、請求項16に記載の免疫複合体または請求項17に記載の組成物を含む、組成物。
- 細胞における不溶性または可溶性α-シヌクレイン凝集体の産生を阻害するインビトロでの方法であって、細胞と有効量の請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分、請求項16に記載の免疫複合体または請求項17に記載の組成物を接触させることを含む、インビトロでの方法。
- ヒト対象におけるシヌクレイン病を処置するまたは重症度を低減するための組成物であって、有効量の請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分、請求項16に記載の免疫複合体または請求項17に記載の組成物を含む、組成物。
- ヒト対象におけるシヌクレイン病を処置するまたは重症度を低減するための医薬の製造のための、請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分、請求項16に記載の免疫複合体または請求項17に記載の組成物の使用。
- 請求項1~11の何れかに記載の単離抗体またはその抗原結合部分、請求項16に記載の免疫複合体または請求項17に記載の組成物および使用のための指示書を含むキット。
- 細胞における不溶性セリン-129リン酸化α-シヌクレイン凝集体の産生を阻害するための、請求項32に記載のキット。
- 神経細胞および/またはグリア細胞におけるレビー小体またはα-シヌクレインの病理学的凝集体の存在により特徴づけられるヒト対象における疾患を処置するまたは重症度を低減するための、請求項32に記載のキット。
- 疾患がパーキンソン病、パーキンソン病認知症、レビー小体型認知症、レビー小体病、多系統萎縮症または純粋自律神経失調症である、請求項34に記載のキット。
- 1以上の付加的治療剤をさらに含む、請求項34または35に記載のキット。
- ヒト対象からのサンプルにおけるα-シヌクレインを検出するための、請求項32に記載のキット。
- 細胞における不溶性または可溶性α-シヌクレイン凝集体の産生を阻害するための、請求項32に記載のキット。
- ヒト対象におけるシヌクレイン病を処置するまたは重症度を低減するための、請求項32に記載のキット。
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