JP5432710B2

JP5432710B2 - Ａβ及びシヌクレイン凝集の阻害剤

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Publication number: JP5432710B2
Application number: JP2009518170A
Authority: JP
Inventors: オール−アベド、ユウセフ
Original assignee: Feinstein Institutes for Medical Research
Current assignee: Feinstein Institutes for Medical Research
Priority date: 2006-06-23
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2027-06-22
Also published as: WO2008002465A2; US20110201686A1; EP2041078A2; CA2655632A1; EP2041078A4; AU2007265631A1; US20180098950A1; WO2008002465A3; AU2007265631B2; JP2009541483A

Description

本発明は概して、タンパク質の凝集を伴う疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は、或る特定の化合物を用いて、これらのタンパク質の凝集及びこのようなタンパク質凝集体の蓄積を阻害する方法に関する。

［関連出願の相互参照］
本願は、２００６年６月２３日に提出された米国特許仮出願第６０／８１６，１３２号明細書の利益を主張する。

過去２０年にわたって、多くの研究によって、アルツハイマー病（ＡＤ）の進行における約４ｋＤａのアミロイドβタンパク質（Ａβ）の影響が研究されている。ＡＤ患者の脳において、Ａβがアミロイドとして老人斑及び脳血管壁で、並びにより広範性の免疫反応性沈着で蓄積する。この蓄積は病理学的カスケードをもたらし、最終的に神経機能障害及び細胞死を引き起こすと考えられる（非特許文献１、非特許文献２）。様々なアミノ末端及びカルボキシル末端を有する複数のＡβ種が、β−セクレターゼ及びγ−セクレターゼによる連続的なタンパク質分解切断によって、アミロイドβタンパク質前駆体（ＡＰＰ）から生成される（非特許文献３）。４０アミノ酸型（Ａβ４０）が、最も豊富に生成されるＡβペプチドであるのに対して、わずかに長く且つあまり豊富ではない４２アミノ酸型（Ａβ４２）は、より病原性の高い種であるとされている（非特許文献４）。ｉｎｖｉｔｒｏ条件下で、Ａβ４２は、Ａβ４０及び他のより短いＡβペプチドより極めて迅速に凝集体を形成し、これらの凝集体は培養物中の様々な細胞に毒性である。主要ではないＡβ種であるにもかかわらず、ＡＤ脳において、Ａβ４２はＡβ４０より早期に且つ一貫して沈着する。

Ａβ沈着、神経原線維濃縮体（tangle）の蓄積、及び神経細胞の欠損に加えて、ＡＤの末期病状において、Ａβ沈着に関与することが多い炎症応答の多くの細胞マーカー及び分子マーカーの存在が顕著である（非特許文献５）。細胞炎症応答は、広範な星膠症（astrogliosis）及び小膠細胞症から成る。複数のサイトカイン、インターロイキン、他の急性期タンパク質及び補体成分を含む多くの炎症の分子マーカーがあるが、未だに増えている。Ａβ凝集体には炎症応答刺激能があると考えられており、炎症がＡβ生成の増大を促進し、またＡβ沈着を高める可能性があることが証明されている（同上）。したがって、Ａβ誘導性炎症応答は、さらなるＡβ蓄積及び炎症増大を促進する可能性がある。代替的に、或る特定の状況下では、炎症応答が有益であり、実際にＡβ除去を促進することもある（非特許文献６）。

Ａβに対する炎症応答が有害であるという概念を考慮して、抗炎症薬が、ＡＤ療法に有益な作用因子として提示されている（非特許文献７、非特許文献８）。この考えは、非アスピリンＮＳＡＩＤの長期使用がＡＤの進行からの保護に関与することを一貫して示す疫学データによって支持される（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。実際に、この証拠は、ＡＤにおける選択ＮＳＡＩＤの以前の臨床試験及び進行中の臨床試験に対する原理として使用されている。ＣＮＩ−１４９３は、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｃ−Ｒａｆのリン酸化を阻害し、単球及びマクロファージからの炎症誘発性サイトカインの放出を抑制する四価のグアニルヒドラゾンである（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）。ＣＮＩ−１４９３の全身投与は、実験的自己免疫性脳脊髄炎、脳虚血、クローン病及び関節炎の治療に効果的である（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１３、非特許文献１９）。

Selkoe, 2001 Hardy及びHiggins, 1992 Golde他, 2000 Younkin, 1998 Akiyama他, 2000 Wyss-Coray他, 2002 Aisen, 1997 McGeer他, 1996 in t'Veld他, 2001 Stewart他, 1997 Zandi他, 2002 Cohen他, 1997 Lowenberg他, 2005 Bianchi他, 1996 Wang他, 1988 Tracy, 1998 Martiney他, 1998 Meistrell他, 1997 Akerlund他, 1999

したがって、本発明者は、或る特定の化合物が様々なタンパク質（例えばアミロイド−ベータ（Ａβ）及びシヌクレイン）の凝集、及びこのようなタンパク質凝集体の蓄積を阻害することを発見している。したがって、本発明は、アミロイド−ベータ（Ａβ）の凝集又は凝集したＡβの蓄積を阻害する方法に関する。この方法は、Ａβの凝集又は凝集したＡβの蓄積を阻害するのに十分な様式で、Ａβを化合物Ｉと接触させることを含む。これらの方法で、化合物Ｉは、

（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ₃−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−若しくはｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ₃）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ₂−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）−であり、但しＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄の少なくとも１つはＨではない）である。

本発明は、哺乳動物におけるアミロイド関連疾患を治療又は予防する方法にも関する。この方法は、疾患を治療又は予防するのに十分な様式で、化合物Ｉを哺乳動物に投与することを含み、化合物Ｉは、

さらに本発明は、アルツハイマー病の被験体を治療する方法に関する。この方法は、疾患を治療するのに十分な様式で、化合物Ｉを被験体に投与することを含み、化合物Ｉは、

さらに本発明は、アルツハイマー病の危険性がある被験体を治療する方法に関する。この方法は、化合物Ｉを被験体に投与することを含み、化合物Ｉは、

さらに本発明は、シヌクレインの凝集及び／又は凝集したシヌクレインの蓄積を阻害する方法に関する。この方法は、シヌクレインの凝集又は蓄積を阻害するのに十分な様式で、シヌクレインを化合物Ｉと接触させることを含み、化合物Ｉは、

本発明は、シヌクレインによって少なくとも部分的に媒介される疾患の被験体を治療する方法にも関する。この方法は、化合物Ｉを被験体に投与することを含み、化合物Ｉは、

さらに本発明は、シヌクレインによって少なくとも部分的に媒介される疾患の危険性がある被験体を治療する方法に関する。この方法は、化合物Ｉを被験体に投与することを含み、化合物Ｉは、

さらに本発明は、コンフォメーション病に関与するタンパク質の凝集及び／又はタンパク質の凝集体の蓄積を阻害する方法に関する。この方法は、タンパク質の凝集又は蓄積を阻害するのに十分な様式で、タンパク質を化合物Ｉと接触させることを含み、化合物Ｉは、

さらに本発明は、哺乳動物においてアミロイド関連疾患を治療又は予防するための薬物の製造に対する化合物Ｉの使用に関する。ここで、化合物Ｉは、

さらに本発明は、アルツハイマー病の被験体を治療するための薬物の製造に対する化合物Ｉの使用に関する。これらの使用に関して、化合物Ｉは、

さらに本発明は、シヌクレインによって少なくとも部分的に媒介される疾患の被験体を治療するための薬物の製造に対する化合物Ｉの使用に関する。ここで、化合物Ｉは、

さらに本発明は、哺乳動物においてアミロイド関連疾患を治療又は予防するための化合物Ｉの使用に関する。ここで、化合物Ｉは、

また本発明は、アルツハイマー病の被験体を治療するための化合物Ｉの使用に関する。ここで、化合物Ｉは、

さらに本発明は、シヌクレインによって少なくとも部分的に媒介される疾患の被験体を治療するための化合物Ｉの使用に関する。これらの使用に関して、化合物Ｉは、

さらに本発明は、コンフォメーション病の被験体を治療するための薬物の製造に対する化合物Ｉの使用に関する。ここで、化合物Ｉは、

トランスジェニックＡＰＰ発現ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて、ＣＮＩ−１４９３がＡβ病変プラークを低減させることを示す実験結果の顕微鏡写真図である。ＴｇＣＲＮＤ８マウスをＣＮＩ−１４９３又はビヒクルで処理した後、処理の２ヵ月後に屠殺した。マウス抗ヒトＡβモノクローナル抗体６Ｆ／３Ｄを用いて、ビヒクル処理マウス又はＣＮＩ−１４９３処理マウスの矢状断面をＡβに関して免疫組織化学的に染色した。ビヒクル及びＣＮＩ−１４９３で処理したトランスジェニックＡＰＰ発現ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおけるＡβプラーク評価を示す実験結果のグラフ図であり、これがＣＮＩ−１４９３処理後のプラーク沈着の強い低減を示す。皮質及び海馬のデジタル画像を撮影し、画像解析ソフトウェア「ＳＩＳ解析ＡｕｔｏＳｏｆｔｗａｒｅ３．２」で解析した。プラークの数を対象の領域（ｍｍ²）で割ることによって、プラーク数を算出した。ＣＮＩ−１４９３は、プラーク数を皮質で５７％（ｐ＜０．０１）、及び海馬で６０％（ｐ＜０．０１）低減させた。プラーク面積は、コンピュータを用いて、対象の領域１ｍｍ²当たりのプラークの面積（μｍ²）で表した。ＣＮＩ−１４９３は、プラーク面積を皮質で７０％（ｐ＜０．０１）、及び海馬で８６％（ｐ＜０．０１）低減させた。それぞれの棒は４体の動物で表される。トランスジェニックＡＰＰ発現ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおける可溶性Ａβに対するＣＮＩ−１４９３の影響を示すウェスタンブロット図である。パネルＡ：プレキャストＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘ４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルによって、１つのレーン当たりタンパク質２０μｇを分離し、ＸＣｅｌｌＩＩ（商標）ブロットシステムを用いて、ニトロセルロース膜上に転写した。膜結合した可溶性Ａβの検出のために、６Ｅ１０モノクローナル抗体を用いた。４体のＣＮＩ−１４９３処理動物の内の２体の脳で、可溶性Ａβアイソフォームの大量欠損を測定した。ＧＡＰＤＨに対するモノクローナル抗体で膜を再びプローブすることによって、等しいタンパク質充填を評価した（パネルＢ）。ＣＮＩ−１４９３が、ＣＮＩ−１４９３処理トランスジェニックＡＰＰ発現ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて小膠細胞を不活性化することを示すウェスタンブロット図である。プレキャストＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘ４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルによって、１つのレーン当たりタンパク質６０μｇを分離し、ＸＣｅｌｌＩＩ（商標）ブロットシステムを用いて、ニトロセルロース膜上に転写した。Ｆ４／８０抗原に対する抗体で、マクロファージ活性化に関して染色することによって、膠細胞の活性化を評価した。ウェスタンブロット分析によって、全てのＣＮＩ−１４９３動物においてＦ４／８０の減少が示された。ＧＡＰＤＨに対するモノクローナル抗体で膜を再びプローブすることによって、等しいタンパク質充填を評価した。野生型ＡＰＰ６９５を発現するＮ２ａ細胞におけるＡＰＰプロセシングに対するＣＮＩ−１４９３の影響を示すウェスタンブロット図である。指示濃度のＣＮＩ−１４９３で２４時間、細胞を処理した。培地を変え、さらに４時間、薬物処理を続けて、Ａβを分泌させた。６Ｅ１０抗体を用いるウェスタンブロットによって、総分泌Ａβ（総ｓＡβ）を分析した（パネルａ）。それぞれ６Ｅ１０抗体及びＲ１抗体を用いて、ＡＰＰのＣ末端断片Ｃ９９（パネルｂ）及びＣ８３（パネルｃ）を分析した。抗体ＬＮ２７で全長ＡＰＰ（パネルｄ）を試験した。抗オリゴマー抗体による認識を妨げるＣＮＩ−１４９２によって示されるように、ＣＮＩ−１４９３が、Ａβ４２、Ａβ４０及びシヌクレインの凝集を妨げることを示す実験結果のグラフ図である。ＡβのＣＮＩ−１４９３への曝露がＡβオリゴマーアセンブリを破壊することを示す、実験結果のグラフ図及び電子顕微鏡写真図である。パネルＡは、漸増ＣＮＩ−１４９３濃度の溶液中で、（ＥＬＩＳＡにおいて光学密度［ＯＤ］の低減として示される）抗Ａβオリゴマー抗体を用いる、ＥＬＩＳＡにおけるＡβオリゴマーの認識の低減を示すグラフ図である。パネルＢは、ＣＮＩ−１４９３への曝露によるＡβ４２オリゴマーのフィブリル化（fibrilization）の阻害を示す電子顕微鏡写真図である。パネルＣは、漸増濃度のＣＮＩ−１４９３の添加に対するＡβ曝露神経芽腫細胞の細胞生存率の増大を示すグラフ図である。

したがって、本発明者は、或る特定の化合物が、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏの両方で様々なタンパク質（例えばアミロイドベータ（Ａβ）及びシヌクレイン）の凝集を阻害することを発見した。実施例を参照されたい。これらの実施例では、化合物ＣＮＩ−１４９３、即ちＮ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩を用いて、この凝集の阻害が示された。さらに、ＣＮＩ−１４９３を含む広範な種類のグアニルヒドラゾン化合物は、ＣＮＩ−１４９３と同様の特性を有していることが知られている。米国特許第５，５９９，９８４号明細書、同第５，７５０，５７３号明細書、同第５，７５３，６８４号明細書、同第５，８４９，７９４号明細書、同第５，８５４，２８９号明細書、同第５，８５９，０６２号明細書、同第６，００８，２５５号明細書、同第６，０２２，９００号明細書、同第６，１８０，６７６（Ｂ１）号明細書及び同第６，２４８，７８７（Ｂ１）号明細書を参照されたい。

したがって本発明は、アミロイドベータ（Ａβ）の凝集又は凝集したＡβの蓄積を阻害する方法に関する。この方法は、Ａβの凝集又は凝集したＡβの蓄積を阻害するのに十分な様式で、Ａβを化合物Ｉと接触させることを含む。これらの方法において、化合物Ｉは、

（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ₃−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−若しくはｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ₃）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ₂−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）−であり、但しＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄の少なくとも１つはＨではない）である。好ましくは、これらの方法で用いられる化合物Ｉは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩である。

生きた哺乳動物の外部にあるＡβ、又は好ましくは生きた哺乳動物部分にあるＡβに、これらの方法を用いることができる。この方法は、Ａβ４０及びＡβ４２を含む任意の型のＡβに有用である。この方法を生きた哺乳動物に用いる場合、哺乳動物は、アルツハイマー病の危険性があるか、又はアルツハイマー病であることが好ましい。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。

本明細書で用いられるように、「アルツハイマー病」は、Ａβペプチドから成る神経原線維プラークを特徴とするよく知られたヒト疾患、並びにこの疾患の任意の既知の動物モデルである（例えば実施例１を参照されたい）。

生きた哺乳動物に用いる場合、これらの方法における化合物は、医薬的に許容可能な賦形剤中で配合することが好ましい。「医薬的に許容可能」とは、（ｉ）組成物をその本来の目的に対して不適にすることなく、組成物の他の成分に適合する、且つ（ｉｉ）過度の有害な副作用（例えば毒性、炎症及びアレルギー反応）もなく、本明細書で与えられるように被験体に用いるのに好適である材料を意味する。副作用が「過度」であるとは、危険性が組成物によって与えられる利点を上回る場合である。医薬的に許容可能な担体の非限定的な例としては、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油／水エマルション等のエマルション、マイクロエマルション等の任意の標準的な医薬担体が挙げられるが、これらに限定されない。

ヒトを含む哺乳動物への投与、必要に応じて特定用途のために、余計な実験をせずに上記の化合物を配合することができる。さらに、標準的な用量反応プロトコルを用いて余計な実験をせずに、組成物の正確な投与量を求めることができる。

したがって、余計な実験をせずに、当該技術分野で既知の手段、例えば不活性希釈剤又は食用担体によって、経口投与、舌投与、舌下投与、口腔投与及び口腔内投与のために設計された組成物を作製することができる。組成物は、ゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与のために、本発明の医薬組成物を賦形剤と組合せて、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース、チューイングガム等の形態で用いてもよい。

錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、結合剤、レシピエント（recipients：受容体）、崩壊剤、滑剤、甘味剤及び香料添加剤も含有し得る。結合剤の幾つかの例としては、微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンが挙げられる。賦形剤の例としては、デンプン又はラクトースが挙げられる。崩壊剤の幾つかの例としては、アルギン酸、コーンスターチ等が挙げられる。滑剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カリウムが挙げられる。流動促進剤（glidant：滑剤）の例としては、コロイド状二酸化ケイ素が挙げられる。甘味剤の幾つかの例としては、スクロース、サッカリン等が挙げられる。香料添加剤の例としては、ペパーミント、サルチル酸メチル、オレンジ風味料等が挙げられる。これらの様々な組成物を調製するのに用いられる材料は、医薬的に純粋であり、使用される量で非毒性である必要がある。

非経口で（例えば静脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、又は皮下注射によって）、化合物を容易に投与することができる。溶液又は懸濁液に化合物を組み込むことによって、非経口投与を行うことができる。このような溶液又は懸濁液としては、注射用水等の殺菌希釈剤、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒も挙げられ得る。非経口製剤としては、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、及びＥＤＴＡ等のキレート剤も挙げられ得る。酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等の緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の等張化剤を添加してもよい。非経口調剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、又はガラス若しくはプラスチック製の複数回投与バイアル中に入れることができる。

直腸投与は、医薬組成物中の化合物を直腸又は大腸に投与することを含む。これは、坐薬又は浣腸剤を用いて行うことができる。当該技術分野で既知の方法によって、坐薬製剤を容易に製造することができる。例えば、約１２０℃までグリセリンを加熱し、グリセリン中に組成物を溶解し、加熱したグリセリンを混合し（その後、精製水を添加してもよい）、加熱した混合物を坐薬鋳型に流し込むことによって、坐薬製剤を調製することができる。

経皮投与は、皮膚を介した組成物の経皮吸収を含む。経皮製剤としては、パッチ（例えば既知のニコチンパッチ）、軟膏(ointmemts)、クリーム、ジェル、軟膏（salves）等が挙げられる。

本発明は、治療的に有効な量の化合物を哺乳動物に経鼻投与することを含む。本明細書で用いられるように、経鼻投与すること又は経鼻投与は、化合物を患者の鼻道又は鼻腔の粘膜に投与することを含む。本明細書で用いられるように、化合物の経鼻投与用の医薬組成物には、例えば鼻噴霧液、鼻液滴、懸濁液、ジェル、軟膏、クリーム又は粉末として投与される、既知の方法で調製された治療的に有効な量の化合物が含まれる。鼻タンポン又は鼻スポンジを用いて、化合物の投与を行ってもよい。

血液脳関門を通す必要があるような化合物を末梢投与する場合、化合物の哺乳動物の血液脳関門を透過する能力を高める医薬組成物中に化合物を配合することが好ましい。このような製剤は当該技術分野で既知であり、吸収を促進する親油性化合物が挙げられる。非親油性化合物の取り込みは、親油性物質と組合せることによって高めることができる。鼻粘膜を通る化合物の送達を高めることができる親油性物質としては、脂肪酸（例えば、パルミチン酸）、ガングリオシド（例えば、ＧＭ−１）、リン脂質（例えば、ホスファチジルセリン）、及び乳化剤（例えば、ポリソルベート８０）、デオキシコール酸ナトリウム等の胆汁塩、並びに例えばトゥイーン（商標）等のポリソルベート８０、トリトン（商標）Ｘ−１００等のオクトキシノール、及びタウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）を含む界面活性剤様物質が挙げられるが、これらに限定されない。Lee他, Biopharm., April 1988 issue:3037を参照されたい。

本発明の特定の実施形態では、化合物を親油性物質から成るミセルと組合せる。このようなミセルは、鼻粘膜の浸透性を変更し、化合物の吸収を高めることができる。好適な親油性ミセルとしては、ガングリオシド（例えば，ＧＭ−１ガングリオシド）、及びリン脂質（例えば、ホスファチジルセリン）が挙げられるが、これらに限定されない。胆汁塩及びその誘導体並びに界面活性剤様物質は、ミセル製剤中にも含まれることができる。化合物を１つ又は複数の種類のミセルと組合せることができ、さらにミセル内に含入するか、又はミセル表面と結び付けることができる。

代替的に、化合物をリポソーム（脂質小胞）と組合せて、吸収を高めることができる。化合物をリポソーム内に含入若しくは溶解するか、及び／又はリポソーム表面に結び付けることができる。好適なリポソームとしては、リン脂質（例えば、ホスファチジルセリン）及び／又はガングリオシド（例えば、ＧＭ−１）が挙げられる。リン脂質小胞を作製する方法に関しては、例えばRoberts他への米国特許第４，９２１，７０６号明細書、及びYiournas他への米国特許第４，８９５，４５２号明細書を参照されたい。胆汁塩及びその誘導体並びに界面活性剤様物質は、リポソーム製剤中にも含まれることができる。

本発明は、哺乳動物においてアミロイド関連疾患を治療又は予防する方法にも関する。この方法は、疾患を治療又は予防するのに十分な様式で、化合物Ｉを哺乳動物に投与することを含み、化合物Ｉは、

（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ₃−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−若しくはｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ₃）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ₂−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）−であり、但しＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄の少なくとも１つはＨではない）である。好ましくは、化合物Ｉは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩である。

これらの方法において、哺乳動物は、アルツハイマー病の危険性があるか、又はアルツハイマー病であることが好ましい。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。

（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ₃−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−若しくはｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ₃）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ₂−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）−であり、但しＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄の少なくとも１つはＨではない）である。上記の方法と同様に、化合物Ｉは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩であることが好ましい。

（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ₃−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−若しくはｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ₃）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ₂−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）−であり、但しＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄の少なくとも１つはＨではない）である。これらの方法における化合物Ｉは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩であることが好ましい。

これらの方法を生きた哺乳動物の外部にあるシヌクレインに、又は好ましくは生きた哺乳動物部分にあるシヌクレインに用いることができる。この方法を生きた哺乳動物に用いる場合、哺乳動物は、シヌクレインによって少なくとも部分的に媒介される疾患であるか、又はその危険性があることが好ましい。このような疾患の例は、パーキンソン病及び或る特定の神経変性疾患である。したがって、より好ましくは、哺乳動物は、パーキンソン病若しくは神経変性疾患であるか、又はその危険性がある。最も好ましくは、哺乳動物は、パーキンソン病であるか、又はその危険性がある。

（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ₃−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−若しくはｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ₃）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ₂−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）−であり、但しＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄の少なくとも１つはＨではない）である。好ましくは、化合物Ｉは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩である。より好ましくは、シヌクレインによって少なくとも部分的に媒介される疾患は、パーキンソン病又は神経変性疾患、最も好ましくはパーキンソン病である。

上記の方法におけるグアニルヒドラゾン化合物がＡβ及びシヌクレインの凝集を阻害するので、この化合物は概して、コンフォメーション病に関与するタンパク質の凝集又は蓄積を阻害すると考えられる。本明細書で用いられるように、「コンフォメーション病」は、少なくとも１つのミスフォールドしたタンパク質又はペプチドを伴う疾患である。コンフォメーション病に関与するタンパク質の例としては、セルピン、プリオン、グルタミン反復タンパク質、タウタンパク質、ヘモグロビン、シヌクレイン、免疫グロブリンの軽鎖、血清アミロイドＡタンパク質、β₂ミクログロブリン、シスタチンＣ、ハンチンチン、アポリポタンパク質Ａ１、リゾチーム、トランスサイレチン、Ａβ、β−アミロイドペプチド、プロカルシトニン、アミリン及び膵島アミロイドポリペプチドが挙げられる。コンフォメーション病の例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病、及び２型真性糖尿病が挙げられる。

したがって、本発明は、コンフォメーション病に関与するタンパク質の凝集又は蓄積を阻害する方法にさらに関する。この方法は、タンパク質の凝集又は蓄積を阻害するのに十分な様式で、タンパク質を化合物Ｉと接触させることを含み、化合物Ｉは、

これらの方法におけるタンパク質は、セルピン、プリオン、グルタミン反復タンパク質、タウヘモグロビン、シヌクレイン、免疫グロブリンの軽鎖、血清アミロイドＡタンパク質、β₂ミクログロブリン、シスタチンＣ、ハンチンチン、アポリポタンパク質Ａ１、リゾチーム、トランスサイレチン、Ａβ、β−アミロイドペプチド、プロカルシトニン、アミリン又は膵島アミロイドポリペプチドであることが好ましい。

これらの方法を生きた哺乳動物の外部タンパク質に、又は好ましくは生きた哺乳動物部分にあるタンパク質に用いることができる。この方法を生きた哺乳動物に用いる場合、哺乳動物は、このタンパク質によって少なくとも部分的に媒介される疾患であるか、又はその危険性があることが好ましい。最も好ましくは、哺乳動物は、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病若しくは２型真性糖尿病であるか、又はその危険性がある。

さらに本発明は、哺乳動物においてアミロイド関連疾患の治療又は予防のための薬物の製造に対する化合物Ｉの使用に関する。ここで、化合物Ｉは、

これらの使用に関して、化合物Ｉは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩であることが好ましい。哺乳動物がアルツハイマー病の危険性があるか、又はアルツハイマー病であることも好ましい。

これらの使用は、哺乳動物のいずれかに適用することができる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ₃−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−若しくはｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ₃）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ₂−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）−であり、但しＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄の少なくとも１つはＨではない）である。好ましくは、化合物Ｉは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩である。哺乳動物がヒトであることも好ましい。

（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ₃−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−若しくはｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ₃）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ₂−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）−であり、但しＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄の少なくとも１つはＨではない）である。好ましくは、ここで化合物Ｉは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩である。疾患がパーキンソン病又は神経変性疾患であることも好ましい。さらに疾患が、シヌクレインによって少なくとも部分的に媒介され、パーキンソン病であることが好ましい。

さらに本発明は、哺乳動物におけるアミロイド関連疾患の治療又は予防のための化合物Ｉの使用に関する。ここで、化合物Ｉは、

（式中、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ₃−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−若しくはｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ₃）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ₂−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ₃がＮＨ₂（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₃）−であり、但しＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃及びＸ₄の少なくとも１つはＨではない）である。好ましくは、化合物Ｉは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩である。コンフォメーション病がタンパク質の凝集を伴うことも好ましく、このタンパク質は、セルピン、プリオン、グルタミン反復タンパク質、タウヘモグロビン、シヌクレイン、免疫グロブリンの軽鎖、血清アミロイドＡタンパク質、β₂ミクログロブリン、シスタチンＣ、ハンチンチン、アポリポタンパク質Ａ１、リゾチーム、トランスサイレチン、Ａβ、β−アミロイドペプチド、プロカルシトニン、アミリン又は膵島アミロイドポリペプチドであることが好ましい。

本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例で説明される。本明細書における特許請求の範囲内の他の実施形態は、本明細書で開示される本発明の詳述又は実践を考慮して、当業者には明らかである。実施例と共に与えられる詳述は、単に例示目的であると考えられ、本発明の範囲及び精神は、添付の特許請求の範囲によって示されることが意図される。

（実施例１）
ＣＮＩ−１４９３は、アルツハイマー病の動物モデルにおいてＡβ生成を阻害し、プラークの形成を防ぐ
実施例の要約
アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳における広範なアミロイド沈着によって引き起こされる小膠媒介性炎症応答を特徴とする。非ステロイド系抗炎症剤処理によって、ＡＤの危険性が低減し、疾患の進行が遅くなり、小膠の活性化が低減するが、これらの効果の分子基盤は知られていない。本発明者らは、わずか８週の治療期間で効力のあるマクロファージ不活性化剤ＣＮＩ−１４９３による、ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を過剰発現する４ヶ月齢のＴｇＣＲＮＤ８マウスの処理によって、Ａβ沈着が劇的に低減したと報告している。ＣＮＩ−１４９３処理によって、これらの動物の皮質においてアミロイドプラーク面積が７０％低減し、海馬では８７％低減した。さらに、ＣＮＩ−１４９３処理によって、Ｆ４／８０発現によって測定されるように、ＴｇＣＲＮＤ８マウスにおいて小膠の活性化が有意に低減した。

本発明者らのＡＰＰ過剰発現細胞株におけるＡＰＰプロセシングに対するＣＮＩ−１４９３処理のｉｎｖｉｔｒｏ分析によって、総Ａβ蓄積の強い用量依存的な低減が示唆される。この効果は、ＡＰＰの生成、及びβ−セクレターゼ又はγ−セクレターゼの活性変化の両方と完全に無関係であると考えられる。

この研究によって、ＡＤの治療及び予防に非常に効力がある候補物質として抗炎症剤ＣＮＩ−１４９３が特定される。

導入
この研究の目的は、ＣＮＩ−１４９３が、ＡＰＰ発現ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスの脳においてアミロイド病変の発達及び炎症応答を抑制するように作用するか否かを調べることであった。本明細書に記載される研究は、わずか２ヶ月のＣＮＩ−１４９３処理によって、これらのマウスにおいてプラーク量（plaque burden）が大幅に低減し、小膠の活性化が低減したことを確立している。

材料及び方法
動物。全ての動物手順が、地方長官室（office of the district president）及びマンスター大学の動物管理使用委員会（institutional animal care and use committee）によって承認されていた。本発明者らは、ＴｇＣＲＮＤ８マウス株（カナダのオンタリオ州トロントにあるトロント大学のDavid Westawayによる無償提供）を用いた。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、ＰｒＰ遺伝子プロモータ（Chishti他, 2001）の制御下で二重変異型のアミロイド前駆体タンパク質６９５（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ＋Ｖ７１７Ｆ）をコードする。チオフラビンＳ陽性Ａβアミロイド沈着物は３ヶ月目で存在し、５ヶ月齢で有芯プラーク及び神経炎病変が明らかになる。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、６ヶ月齢で脳１ｇ当たり３２００ｐｍｏｌ〜４６００ｐｍｏｌのＡβ４２を示し、Ａβ４２はＡβ４０よりも過剰である。

ＴｇＣＲＮＤ８マウスの薬物処理。４ヶ月齢のＡＰＰトランスジェニックＴｇＣＲＮＤ８マウスに、８週間、ＣＮＩ−１４９３２００μｇ（８ｍｇ／ｋｇ）を含有する２００μｌの腹腔内注射を１週間に２回行った。それぞれの処理群には、４体の動物が存在した。動物は、個々のケージに１体ずつ収容した。実験期間の終わりに、動物を断頭によって屠殺した。脳を解剖し、正中線に沿って半球に分断した。一方の半球を２４時間、４％緩衝ホルムアルデヒドで固定した後、脱水してパラフィン包埋を行った。もう一方の半球を液体窒素中で即座に急速凍結し、−８０℃に維持した。

免疫組織化学。それぞれのトランスジェニック動物の３対の矢状脳切片２μｍをＡβ免疫反応性に関して染色した。正中矢状索裂から横に１００μｍ、２００μｍ及び３００μｍで、これらの対（１０μｍ間隔）を定めた。全ての切片をギ酸で前処理し、残基８〜１７に対する６Ｆ／３Ｄ抗Ａβモノクローナル抗体（Dako、１：１００）によって、ＴｅｃｈＭａｔｅ機器（Dako Cytomation、ドイツのハンブルグ）で自動染色した。さらなる工程では、DakoのＳｔｒｅｐｔＡＢＣ複合体−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合「Ｄｕｅｔ」抗マウス／ウサギ抗体キットを用い、色原体として３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて発色させた。ヘマトキシリンを用いて、対比染色を行った。２回の連続した手順で全ての切片を染色し、両方の実験群の脳が両方の出順に等しく分配されたことを確認した。

画像解析。Ａβプラーク量を定量するために、一定の光及びフィルタ設定で、３．３メガピクセルのＣＣＤカメラＣｏｌｏｒＶｉｅｗＩＩによって、全ての染色切片の皮質及び海馬をデジタル画像化した。カラー画像をグレースケールに変換し、陽性の免疫反応性とバックグラウンドとの間で最良のコントラストを得た。全ての画像で免疫反応性染色を検出するように、コントラスト閾値を選択した。

画像解析ソフトウェア「ＳＩＳ解析ＡｕｔｏＳｏｆｔｗａｒｅ３．２」（Soft Imaging System GmbH、http://www.soft-imaging.org/）によって、形態学的測定を行った。プラークの総数及び表面が、解析された総面積と関連していた。

生化学分析。脳の半分を秤量して、製造業者のガイドラインに従って、適量のＴ−ＰＥＲ（Perbio、ドイツのボン）でホモジナイズした。ＢＣＡキット（Perbio）によって、溶解タンパク質濃度を測定した。１つのサンプル当たり１５μｇ〜６０μｇのタンパク質をプレキャストＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘ４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に充填し、Ｎｏｖｅｘ電気泳動システム（Invitrogen、ドイツのカールスルーエ（Karsruhe））を用いて分離した。続いて、ＸＣｅｌｌＩＩ（商標）ブロット（Invitrogen）を用いて、タンパク質をニトロセルロース膜（Invitrogen）上に転写した。ＭｅｍＣｏｄｅ可逆タンパク質染色キット（Perbio）を用いて、固定タンパク質を可視化した。Ｒｏｔｉ−Ｂｌｏｃｋ（Roth、ドイツのカールスルーエ）で４℃で一晩、膜を遮断した。膜結合Ａβの検出のために、回転振盪機において周囲温度で１時間、一次検出抗体として、１０００倍希釈の６Ｅ１０モノクローナル抗体（Dunn Labortechnikによって株式分配されたBiodesign（ドイツのアスバッハ））を用いた。０．０５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳで４回、膜を洗浄し、１時間、２５００００倍希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗マウスＩｇＧ（Perbio）でインキュベートした。ブロットを１０分間４回洗浄し、５分間、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＤｕｒａＥｘｔｅｎｄｅｄＤｕｒａｔｉｏｎＳｕｂｓｔｒａｔｅ希釈標準溶液（Perbio）でインキュベートして、オートラジオグラフィフィルム（KodakによるＴ−ＭａｔＰｌｕｓＤＧフィルム）に露光した。代替的に、膜をラット抗マウスＦ４／８０抗体（Serotec、ドイツのデュッセルドルフ）とハイブリダイズした。ＧＡＰＤＨ（Acris、ドイツのヒッデンハウセン（Hiddenhausen））に対するモノクローナル抗体によって再びプローブすることによって、全ての膜の等しいタンパク質充填を評価した。

Ｎ２ａ細胞におけるＡＰＰプロセシング分析。ＡＰＰ₆₉₅トランスフェクトＮ２ａ細胞（Marambaud他, 2005）を５％ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシン並びに０．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した１：１のＤＭＥＭ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで増殖させた。指示濃度のＣＮＩ−１４９３で２４時間、細胞を密集して処理した。それから、培地を変え、さらに２時間、処理を続けて、Ａβを分泌させた。調整培地２０μｌを１６．５％トリス−トリシンゲル上で電気泳動して、０．２μｍのニトロセルロース膜上に転写した。それから、ＰＢＳ中で５分間、膜をマイクロ波にかけて、ＴＢＳ中の５％無脂肪乳で遮断して、４℃で一晩、６Ｅ１０（Signet、PierceのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ中で１０００倍希釈）とインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１％ＳＤＳを含有する氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche））で溶解した。６Ｅ１０、Ｒ１（抗ＡＰＰのＣ末端ドメイン、参考文献番号２１）、及びＬＮ２７（抗ＡＰＰ_1-200、Zymed）によるウェスタンブロットによって、抽出物１０μｇを分析した。

結果及び考察
ＣＮＩ−１４９３は、ＡＰＰ発現ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスにおいてＡβプラークの形成を防ぐ。マウスが、このモデルにおいて典型的にプラークの沈着が始まるおよそ４ヶ月齢になったときに処理を開始した。ビヒクル処理マウスは、ＣＮＩ−１４９３処理動物よりも有意に多くのプラークを発現した（図１及び図２）。アミロイド沈着の評価は、ＣＮＩ−１４９３処理によって、プラーク数（対象の面積（ｍｍ²）で割ったプラークの数）が、対照の動物に比べて皮質で５７％、及び海馬で６０％低減したことを示した。本発明者らが、プラーク領域（対象の面積（ｍｍ²）で割ったプラークの面積（μｍ²））を算出すると、ＣＮＩ−１４９３によるこの効果はさらに一層顕著であった。ここでは、本発明者らは、対照の動物に比べて、皮質で７０％、及び海馬で８６％の低減を得た。本発明者らは、ＣＮＩ−１４９３によるＡβプラークの低減の程度が、ＮＳＡＩＤイブプロフェンで近年報告されているものよりも高かっただけでなく、４ヶ月又は６ヶ月のイブプロフェン処理に比べて、わずか２ヶ月の処理で達したことを強調したい（Lim他, 2000、Yan他, 2003）。

ＡＰＰ発現ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスにおける可溶性Ａβ含量に対するＣＮＩ−１４９３の効果。２ヶ月の比較的短い治療期間でのプラーク沈着に対するＣＮＩ−１４９３の潜在的な効果を示した後に、続いて本発明者らは、見込み可溶性ＡβのＣＮＩ−１４９３依存性調節に関して、脳細胞質画分を分析した。本発明者らは、ウェスタンブロットによる４体のＣＮＩ−１４９３処理動物の内の２体で、可溶性Ａβアイソフォームのほとんど完全な低減を得たのに対し、残りの２対の動物は、ビヒクル処理動物に比べて、可溶性Ａβ含量の明らかな変化は見られなかった（図３）。注目すべき点は、ＣＮＩ−１４９３を受けた４体全ての動物が、Ａβプラークレベルの有意な低減を示したことである。その一方で、本発明者らが可溶性Ａβアイソフォームのほぼ完全な欠損を検出した動物は、プラーク減少率が最も高い動物でもあった。抗炎症剤（例えばＣＮＩ−１４９３）がヒトにおけるＡＤの危険性、及び疾患の動物モデルにおけるアミロイド病変に効果がある機構は、複雑且つ多様であると考えられる。２体のＣＮＩ−１４９３処理動物における可溶性Ａβアイソフォームのレベルが変わらなかったことは、ＣＮＩ−１４９３依存性のプラーク沈着障害の動的プロセスを示唆し、この障害は可溶性Ａβレベルに少なくとも部分的に依存すると考えられる。

ＣＮＩ−１４９３は、ＡＰＰ発現ＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスにおいて小膠細胞を不活性化する。ＮＳＡＩＤの主な細胞標的は、アミロイド沈着の結果として表現型的に活性化する小膠であることが論じられている。ＣＮＩ−１４９３は、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｃ−Ｒａｆのリン酸化を阻害し、単球及びマクロファージからの炎症誘発性サイトカインの放出を抑制する四価のグアニルヒドラゾンである（Cohen他, 1997、Lowenberg他, 2005、Bianchi他, 1996、Wang他, 1988、Tracy, 1998）。ＣＮＩ−１４９３の全身投与は、実験的自己免疫性脳脊髄炎、クローン病、脳虚血及び関節炎の治療に有効である（Martiney他, 1998、Meistrell他, 1997、Lowenberg他, 2005、Akerlund他, 1999）。

本発明者らは、小膠細胞の活性化の後に上昇する、マクロファージ表面マーカーＦ４／８０の発現を分析することによって小膠の活性化を評価した（Ezekowitz他, 1981）。本発明者らは、対照の動物に比べて、全てのＣＮＩ−１４９３処理動物の脳細胞質内でＦ４／８０シグナルの低減を得た（図４）。

Ｎ２ａ細胞における総ＡβのＣＮＩ−１４９３依存的な低減は、セクレターゼ（secretease）活性とは無関係である。ＡＰＰのプロセシングを選択的に調節ＮＳＡＩＤが近年数多く報告されており、この効果が、ＡＤにおけるそれらの有益な効果の基礎となり得ることが主張されている（Weggen他, 2001）。ＡＰＰ過剰発現細胞のＮＳＡＩＤ処理は、Ａβ４２の生成の選択的低減、及び平行したＡβ３８の増大をもたらすことが報告されたが、Ａβ４０に対する影響はなかった（同上）。

この最初の研究において、本発明者らは、ＣＮＩ−１４９３がヒトＡＰＰを過剰発現するＮ２ａ細胞において生成される総Ａβを変化させるか否かを調べた。ＣＮＩ−１４９３処理によって、培地に分泌される総Ａβレベルが用量依存的に劇的に低減した（図５ａ）。この結果は、ＡＰＰプロセシングに対するＣＮＩ−１４９３の効果が、Ａβ４２の低減に制限されず、Ａβ４０の低減も含まれることをはっきりと示している。観察された総Ａβの低減は、ＡＰＰ生成レベルの低減と同時には起こらなかった（図５ｄ）。さらに、ＣＮＩ−１４９３は、ＡＰＰのβ−セクレターゼ又はγ−セクレターゼの切断に対して全く効果がなく（図５ｂ、図５ｃ）、このことが、イブプロフェンによるＡβ低減の作用形態に対して近年示唆されている（Yan他, 2003）。

本研究によって生じる主な考察は、マウスのＡβプラーク沈着モデルにおいて効力があるマクロファージ不活性化剤ＣＮＩ−１４９３の有効性である。本発明者らは、ＡＰＰ発現トランスジェニックＴｇＣＲＮＤ８マウスにおけるＣＮＩ−１４９３処理の主な効果が、処理のわずか２ヶ月後でのプラーク沈着の非常に有意な低減であるという有力な証拠を提示している。予想される通り、ＣＮＩ−１４９３処理は、小膠の不活性化と同時に起こる。本発明者らのＡＰＰ過剰発現細胞株におけるＡＰＰプロセシングに対するＣＮＩ−１４９３処理のｉｎｖｉｔｒｏ分析によって、分泌された総Ａβの強い用量依存的な低減が示される。この効果は、ＡＰＰの生成、及びβ−セクレターゼ又はγ−セクレターゼの活性変化の両方と完全に無関係であると考えられる。

（実施例２）
ＣＮＩ−１４９２とシヌクレインとの相互作用
ＥＬＩＳＡアッセイにおける抗オリゴマー抗体（アーヴィンにあるカルフォルニア大学のC. Glabe博士の寄贈）によるシヌクレインの認識を測定することによって、シヌクレインの凝集を防ぐＣＮＩ−１４９３の能力を調べた。ＣＮＩ−１４９２又はペンタミジン（陽性対照）のいずれかを、Ａβ４２、Ａβ４０又はシヌクレインのいずれかと組合せることによって、抗体による認識が低減し（図６）、このことは、ＣＮＩ−１４９２がこれらのタンパク質の凝集を防ぐことを示している。

（実施例３）
ｉｎｖｉｔｒｏ及び細胞におけるＣＮＩ−１４９３とＡβ４２との相互作用
Ａβ４２を様々な濃度のＣＮＩ−１４９３と組合せて、Ａβオリゴマー特異的抗体を用いてＥＬＩＳＡによって、Ａβオリゴマーを定量した。漸増濃度のＣＮＩ−１４９３によって、ＥＬＩＳＡにおける最終ＯＤが低減し（図７Ａ）、このことは、ＣＮＩ−１４９３への曝露が、Ａβオリゴマーアセンブリ又は抗Ａβオリゴマー抗体によるオリゴマーの認識を破壊することを示す。電子顕微鏡観察によって、Ａβオリゴマーは、ＣＮＩ−１４９３処理では（左側のパネル、図７Ｂ）、ＣＮＩ−１４９３の非存在下で（右側のパネル）形成される線維凝集体を形成しないことが確認された。

ＣＮＩ−１４９３処理形態のＡβが毒性であるか否かを求めるために、ＣＮＩ−１４９３で前処理した、又は前処理しなかったＡβをＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞と組合せた。ＭＴＴ（チアゾリルブルー）の還元（ミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼ活性）及び乳酸デヒドロゲナーゼ活性（ＬＤＨ）を用いて、毒性をモニタリングした。ＭＴＴアッセイとＬＤＨアッセイとは、互いに相関性があった。図７Ｃで示されるように、可溶性Ａβオリゴマーは毒性であり、ＣＮＩ−１４９３の添加によって、用量依存的にこの毒性が低減された。さらに、初代神経細胞を用いた同様のアッセイで、ＣＮＩ−１４９３の保護効果を調べた。ＳＹ５Ｙ細胞と同様に、ＣＮＩ−１４９３はＡβ毒性から神経細胞を保護した。

（参考文献）

米国特許第５,５９９,９８４号明細書
米国特許第５,７５０,５７３号明細書
米国特許第５,７５３,６８４号明細書
米国特許第５,８４９,７９４号明細書
米国特許第５,８５４,２８９号明細書
米国特許第５,８５９,０６２号明細書
米国特許第６,００８,２５５号明細書
米国特許第６,０２２,９００号明細書
米国特許第６,１８０,６７６（Ｂ１）号明細書
米国特許第６,２４８,７８７（Ｂ１）号明細書

上記を考慮すると、本発明の幾つかの利点が達成され、他の利点も実現されると考えられる。

本発明の範囲を逸脱することなく、上記の方法及び組成物において様々な変更を行うことができるので、上記の記載に含まれ、添付の図面で示される全ての内容が限定の意味ではなく、例示的なものとして解釈されるべきであることが意図される。

本明細書で言及される全ての参考文献は、参照により本明細書中に援用される。本明細書中での参考文献の考察は、著者によって為される主張を単に要約するように意図されるものであり、任意の参照が従来技術を構成することを認めるものではない。出願人は、言及される参考文献の正確性及び適切性を疑う権利を留保する。

Claims

（ｉ）アミロイド−ベータ（Ａβ）の凝集又は凝集したＡβの蓄積を阻害するための；（ｉｉ）哺乳動物において、アミロイド関連疾患を治療又は予防するための；又は（ｉｉｉ）アルツハイマー病であるか、若しくはその危険性がある被験体を治療するための薬物の製造に対する化合物Ｉの使用であって、該化合物Ｉが、

（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３及びＸ_４が独立して、ＧｈｙＣＨ−、ＧｈｙＣＣＨ_３−、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ_３−、又はＨであり、ＧｈｙＣＨがＮＨ_２（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−であり、ＧｈｙＣＣＨ_３がＮＨ_２（ＣＮＨ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＨがＮＨ_２（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ_２−であり、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ_３がＮＨ_２（ＣＮＨ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ_３）−であり、但しＸ₁、Ｘ_２、Ｘ_３及びＸ_４の少なくとも１つはＨではない）である、化合物Ｉの使用。
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３及びＸ_４が独立して、ＧｈｙＣＨ−である、請求項１の使用。
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３及びＸ_４が独立して、ＧｈｙＣＣＨ_３−である、請求項１の使用。
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３及びＸ_４が独立して、ｒｅｄＧｈｙＣＨ−である、請求項１の使用。
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３及びＸ_４が独立して、ｒｅｄＧｈｙＣＣＨ_３−である、請求項１の使用。
前記化合物Ｉが、Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジアセチルフェニル）デカンジアミドテトラキス（アミジノヒドラゾン）四塩酸塩である、請求項１に記載の使用。
アミロイド−ベータ（Ａβ）の凝集又は凝集したＡβの蓄積を阻害するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
哺乳動物において、アミロイド関連疾患を治療するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
哺乳動物において、アミロイド関連疾患を予防するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
アルツハイマー病である被験体を治療するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
アルツハイマー病の危険性がある被験体を治療するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
前記疾患がパーキンソン病である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。