KR20220104000A - 알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병의 진단, 치료 및 예방을 위한 신규한 화합물 - Google Patents

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아르민 기제
펠릭스 슈미트
다니엘 브에크베커
안드레이 레오노프
세르게이 랴자노프
크리스티안 그리징거
번드 피츨러
크리스티나 헤르페르트
안드레아스 마우레르
라우라 퀴블러
사브리나 부스
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모다크 게엠베하
막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우.
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Abstract

본 발명은 하기 일반식 (Ia), (Ib), (IIa) 또는 (IIb)로 표시되는 화합물에 관한 것이다.
Figure pct00045

이들 화합물은 알파-시누클레인의 이미징 및 알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병의 진단에 적합하다. 상기 화합물은 또한 알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병의 치료 및 예방에 유용하다.

Description

알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병의 진단, 치료 및 예방을 위한 신규한 화합물
발명의 요약
본 발명은 알파-시누클레인의 이미징 및 알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병의 진단에 적합한 신규한 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 또한 알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병의 치료 및 예방에 유용하다.
다수의 신경성 및 신경변성 질환이 알려져 있으며, 그 중 상당수는 현재 치료가 불가능하고 진단하기 어렵다. 모든 일반적인 신경변성 질환은 뇌에서의 특정 단백질의 미스폴딩(misfolding), 응집(aggregation) 및 침착(deposition)을 특징으로 한다. 이러한 질병에는 파킨슨병(Parkinson's disease: PD), 루이 소체 치매 (Dementia with Lewy Bodies: DLB), 다계통위축증(Multiple System Atrophy: MSA), 알츠하이머병, 진행성 핵상마비, 피질기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 크로이츠펠트-야콥병 및 기타 여러 질병이 포함된다.
시누클레인병증(Synucleinopathies)은 응집되고 미스폴딩된 알파 시누클레인 단백질(αSYN)의 축적 및 침착을 특징으로 하는 질병 군이다. 시누클레인병증에는 파킨슨병(PD), 루이 소체 치매(DLB), 및 다계통위축증(MSA)이 포함된다. 이러한 질병은 중추 및 말초 신경계에서 응집되고 미스폴딩된 알파-시누클레인 단백질의 축적 및 침착 분포가 상이하다. 신경병리학적으로, 이들은 응집되고 미스폴딩된 알파-시누클레인 단백질의 질병-특이적인 축적 및 침착에 의해 다른 신경변성 질환과 구별될 수 있는 반면, 다른 신경변성 질환은 다른 응집되고 미스폴딩된 단백질의 축적 및 침착을 특징으로 한다. 예를 들어, 알츠하이머병은 응집되고 미스폴딩된 아밀로이드 베타(Abeta: Aβ) 및 타우 단백질을 특징으로 하고, 진행성 핵상마비 및 피질기저핵 변성은 응집되고 미스폴딩된 타우 단백질을 특징으로 하며, 또한 전두측두엽 치매의 일부 사례는 응집되고 미스폴딩된 타우 단백질을 특징으로 한다. 크로이츠펠트-야콥병은 응집되고 미스폴딩된 프리온 단백질을 특징으로 한다.
응집되고 미스폴딩된 단백질의 질병 특이적인 축적 및 침착은 이러한 응집되고 미스폴딩된 단백질 침착물에 결합하는 화합물에 의한 치료 뿐만 아니라 진단 양자 모두를 위한 표적을 제공한다.
응집되고 미스폴딩된 단백질의 질병 특이적 축적 및 침착의 진단적 검출을 위한 하나의 옵션은 응집된 단백질의 상기 침착물에 특이적이고 선택적인 고-친화도 결합을 나타내는 검출 가능하게 표지된 화합물을 사용하는 것이다. 이것은 예를 들어 적절한 방사성 동위원소로 표지된 화합물을 사용하고 검출을 위해 PET 이미징을 사용하여 수행할 수 있다. Abeta 및 타우의 PET 이미징을 위한 임상적 사용에 화합물이 이용가능한 반면, 시누클레인병증에서 알파-시누클레인 침착물의 진단 PET 이미징에 사용될 수 있는 화합물은 지금까지 발명되지 않았다(Kotzbauer, P.T., Tu, Z. and Mach, R.H., Current status of the development of PET radiotracers for imaging alpha synuclein aggregates in Lewy bodies and Lewy neurites. Clin. Transl. Imaging, 2017. 5: p. 3-14). 지금까지 다른 그룹에서 개발되고 테스트된 화합물에는 응집되고 미스폴딩된 알파-시누클레인에 대한 높은 결합 친화도, 응집되고 미스폴딩된 다른 단백질, 특히 Abeta 및 타우에 비해 결합 친화도에서 충분한 선택성을 포함하는 특성의 적절한 조합이 부족하였다(응집되고 미스폴딩된 단백질의 질병 특이적 축적 및 침착을 특징으로 하는 다양한 질병의 감별 진단을 위해 요구됨 그리고 동시에 하나 이상의 질병(즉, 루이 소체 치매 및 알츠하이머병)을 앓고 있는 환자에서도 응집되고 미스폴딩된 알파-시누클레인의 존재를 정확하게 감지하는 능력이 요구됨). 또한, 요구되는 특성에는 혈액-뇌 장벽을 통과하고 세포 내 침착물에 결합하는 능력, 뇌 조직에 대한 낮은 비특이적 결합 및 뇌로부터 결합되지 않은 화합물의 신속한 세척이 포함된다.
WO 2009/146343호는 알츠하이머병의 진단을 허용하기 위해 생체 내 뇌의 아밀로이드 침착을 연구하기 위한 양전자 방출 단층촬영(PET) 이미징에서 추적자인 특정 피라졸, 1,2,4-옥사디아졸 및 1,3,4-옥사디아졸을 언급하였다. 알츠하이머병은 Abeta 및 타우 단백질의 응집을 특징으로 하며, 언급된 PET 추적자는 이러한 단백질의 응집체에 결합한다. 대조적으로, 본 발명은 알파-시누클레인의 응집을 특징으로 하는 질병을 표적으로 한다. 응집된 알파-시누클레인의 선택적 진단 이미징의 경우, 알파-시누클레인에 대한 선택적 결합이 필요하고 응집된 Abeta 및 타우에 대한 낮은 결합은 필요하지 않다.
WO 00/66578호에는 비만과 같은 NPY 매개 질병/상태의 치료에 유용한 특정 NPY 길항제(antagonist)가 기재되어 있다. NPY5 서브타입에 대한 WO 0066578호의 화합물의 "직접적인(direct)" 효과 이외에도 인슐린 저항성, 내당능 장애(impaired glucose tolerance), II형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심혈관계 질환, 담석증, 특정 암, 수면 무호흡증(sleep apnea) 등과 같은 체중 감소로부터 유익을 얻을 질병/상태가 있다고 언급되어 있다.
WO 2010/000372호는 단백질 응집과 관련된 질병 및/또는 신경변성 질환의 치료 또는 예방에 유용한 특정 화합물에 관한 것이다. WO 2010/000372호의 화합물은 파킨슨병을 비롯한 단백질 응집과 관련된 질병을 치료하는데 특히 적합하다. 그들은 Abeta 및 타우를 포함한 여러 다른 응집된 단백질에 결합하는 것으로 나타났다. 따라서, 단백질 응집과 관련된 장애를 진단하는데 사용할 수는 있지만 알파-시누클레인 응집과 관련된 장애와 타우병증이나 알츠하이머병과 같은 아밀로이드 단백질 응집과 관련된 기타 장애를 확실하게 구별하는 것은 불가능하다. 그러나, 이것은 단백질 응집과 관련된 장애의 임상적 징후가 매우 유사하기 때문에 중요할 것이며, 예를 들어 그에 따라 치료를 적용하기 위해 다양한 장애를 구별하는 것이 매우 바람직할 것이다. 더욱이, WO 2010/000372호에 기재된 분자는 지질 및 소수성 단백질에 대한 높은 비특이적 결합을 가지며, 이것은 뇌 조직 및 기타 조직에서 강한 비특이적 결합을 초래한다. 따라서, PET 추적자에 필요한 알파-시누클레인에 대한 요구되는 특정 결합 및 신호 대 잡음비(Signal-to-noise ratio)에 도달하지 못한다.
전술한 관점에서, 진단으로서 개선된 특성을 갖는 화합물에 대한 요구가 있었다. 특히, 알파-시누클레인에 대한 결합 특이성을 개선해야 한다. 뇌 조직 및 기타 조직에서의 비특이적 결합은 감소되어야 하고, 결합 친화도는 증가되어야 하며, 생리학적 반감기는 감소되어야 한다.
US 2005/0075375호는 C형 간염 바이러스를 치료하기 위한 특정 헤테로시클릭 화합물을 개시하고 있다.
본 발명은 하기 일반식 Ia, Ib, IIa 또는 IIb로 표시되는 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
X1, X2, 및 X3은 CR2, N 및 NR1로부터 독립적으로 선택되고, 단 X1, X2, 및 X3 중 적어도 2개는 N 또는 NR1이다. N 및 NR1은 원자가가 허용하는 한 존재하는 것으로 이해되는데, 즉, N은 =X1-, =X2- 또는 =X3- 위치에서만 존재할 수 있고, NR1은 -X1- 또는 -X2- 위치에만 존재할 수 있다.
예로서,
Figure pct00003
예로서,
Figure pct00004
바람직한 실시 형태에서,
Figure pct00005
Y 1 , Y 2 , Y 3 , Y 4 , Y 5 , Y 6 , Y 7 및 Y 8 은 CR3 및 N로부터 독립적으로 선택되고, 단 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 적어도 하나는 N이다.
식 Ia 또는 식 Ib의 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, 및 Y6은 CR3 및 N으로부터 독립적으로 선택되며, 단 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, 및 Y6 중 적어도 하나는 N이다. 보다 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, 및 Y6 중 1개 또는 2개 또는 3개는 N이고, 더욱 더 바람직하게는 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, 및 Y6 중 1개 또는 2개는 N이고, 더욱 바람직하게는 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, 및 Y6 중 하나는 N이다. 바람직한 실시 형태에서, Y1은 N이다.
식 Ia 또는 식 Ib의 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y3, Y4, 및 Y6 중 적어도 하나는 N이다. 식 Ia 또는 식 Ib의 더욱 바람직한 실시 형태에서, Y1은 N이고, Y3, Y4, 및 Y6 중 적어도 하나는 N이다.
식 Ia 또는 식 Ib의 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y3, Y4, 및 Y6 중 적어도 하나는 N이고, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, 및 Y6 중 나머지는 CR3(예컨대 CH)이다. 식 Ia 또는 식 Ib의 더욱 바람직한 실시 형태에서, Y3, Y4, 및 Y6 중 적어도 하나는 N이고, Y2, Y3, Y4, Y5, 및 Y6 중 나머지는 CR3(예컨대 CH)이다.
식 Ia 또는 식 Ib의 바람직한 실시 형태에서, Y1은 N이고 Y2, Y3, Y4, Y5, 및 Y6 중 나머지는 CR3이고, 보다 바람직하게는 Y1는 N이고 Y2, Y3, Y4, Y5, 및 Y6는 CH이다.
식 IIa 또는 식 IIb의 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8은 CR3 및 N으로부터 독립적으로 선택되며, 단 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 적어도 하나는 N이다. 보다 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 1개 또는 2개 또는 3개는 N이고, 더욱 더 바람직하게는 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 1개 또는 2개는 N이고, 더욱 바람직하게는 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 하나는 N이다. 바람직한 실시 형태에서, Y1은 N이다.
식 IIa 또는 식 IIb의 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 적어도 하나는 N이다. 식 IIa 또는 식 IIb의 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y3, Y4, Y5, 및 Y7 중 적어도 하나는 N이다. 식 IIa 또는 식 IIb의 더욱 바람직한 실시 형태에서, Y1는 N이고, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 적어도 하나는 N이다.
식 IIa 또는 식 IIb의 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 적어도 하나는 N이고, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 나머지는 CR3(예컨대 CH)이다. 식 IIa 또는 식 IIb의 바람직한 실시 형태에서, Y1, Y3, Y4, Y5, 및 Y7 중 적어도 하나는 N이고, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 나머지는 CR3(예컨대 CH)이다. 식 IIa 또는 식 IIb의 더욱 바람직한 실시 형태에서, Y1는 N이고, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 적어도 하나는 N이고, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 나머지는 CR3 (예컨대 CH)이다. 식 IIa 또는 식 IIb의 더욱 바람직한 실시 형태에서, Y1는 N이고, Y3, Y4, Y5, 및 Y7 중 적어도 하나는 N이고, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 나머지는 CR3(예컨대 CH)이다.
식 IIa 또는 식 IIb의 바람직한 실시 형태에서, Y1는 N이고, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 나머지는 CR3이고, 보다 바람직하게는 Y1는 N이고, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8는 CH이다.
놀랍게도 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8과 같은 하나 이상의 질소 원자의 도입이 알파-시누클레인에 대한 결합의 선택성을 강력하게 증가시켜, 예컨대 파킨슨병, 루이 소체 치매, 및 다계통위축증과 같은 알파-시누클레인 응집과 관련된 해당 장애는 주로 Abeta 및 타우 응집이 있는 예컨대 알츠하이머병과 같은 다른 단백질 응집을 갖는 장애와 구별될 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 신호 대 잡음비가 향상되었다.
R1은 수소, C1-4 알킬 및 -(CH2)-O-P(=O)(OR)(OR)에서 선택되며, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, R1은 수소, 메틸 또는 2-플루오로에틸이다. 존재하는 경우, -(CH2)-O-P(=O)(OR)(OR)가 X1 또는 X2에 부착되는 것이 바람직하다.
R은 수소 또는 양이온이다. 양이온은 약제학적으로 허용가능한 임의의 양이온일 수 있다. 바람직하게는, 양이온은 1가의 양이온이다. 예로는, 나트륨, 리튬, 칼륨, 암모늄 및 에탄올아민, 콜린, 리신, 메글루민, 피페라진 및 트로메타민의 양성자화된 형태이다. 바람직하게는, 양이온은 나트륨이다. 본 발명의 화합물에서 R 양자 모두는 수소일 수 있고, R 양자 모두는 양이온(동일하거나 상이한 양이온)일 수 있거나, 하나의 R은 수소일 수 있고 다른 하나는 양이온일 수 있다. 바람직하게는, 양자의 R은 모두 나트륨이다. 예컨대, Ca2+, Mg2+, 및 Zn2+ 같은 2가의 양이온 또는 예컨대 Al3+와 같은 3가의 양이온이 가능하지만, 생성된 염이 덜 수용성이기 때문에 바람직하지 않다. R1이 -(CH2)-O-P(=O)(OR)(OR)인 화합물과 이들의 합성은 WO 2017/102893호에 기재되어 있으며, 이것은 본원에 참고로 포함된다.
R2는 수소, 할로겐 및 C1-4 알킬로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, R2는 수소이다.
R3은 수소, 할로겐, C1-4 알킬, OH 및 C1-4 알콕시이며, 여기서 C1-4 알킬 및 C1-4 알콕시는 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, R3는 수소 또는 불소이다. 더욱 더 바람직하게는 R3는 수소이다.
R4 및 R5는 H 및 C1-4 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있거나, 또는 여기서 R4 및 R5는 이들이 결합된 질소 원자와 함께, R4 및 R5가 결합된 질소 원자 이외에 O 및 N으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는, 4-원(membered) 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리를 형성하며, 여기서 4-원 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리는 하나 이상의 R6으로 선택적으로 치환될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, R4 및 R5는 H 및 C1-4 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, R4 및 R5는 H 및 C1-4 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 바람직한 실시 형태에서, R4 및 R5 중 적어도 하나는 C1-4 알킬이고, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있다. 보다 바람직한 실시 형태에서, R4는 수소이고 R5는 C1-4 알킬이며, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있다. 보다 바람직한 실시 형태에서, R4 및 R5 중 적어도 하나는 C1-4 알킬이다. 보다 바람직한 실시 형태에서, R4는 수소이고 R5는 C1-4 알킬이다.
추가의 실시 형태에서, R4 및 R5는 이들이 결합된 질소 원자와 함께, R4 및 R5가 결합된 질소 원자 이외에 O 및 N으로부터 선택된 하나 이상의(예를 들어, 하나의) 헤테로원자를 선택적으로 함유하는, 4-원 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리를 형성하며, 여기서 4-원 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리는 하나 이상의 R6으로 선택적으로 치환될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 4-원 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리가 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐 및 피페라지닐로부터 선택되고, 여기서 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐 및 피페라지닐은 하나 이상의 R6으로 선택적으로 치환될 수 있다. 보다 바람직하게는, 4-원 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리는 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐 및 피페라지닐로부터 선택되고, 여기서 피페라지닐의 N-원자는 R6으로 선택적으로 치환될 수 있다.
R6은 할로겐, C1-4 알킬, OH 및 C1-4 알콕시로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 C1-4 알킬 및 C1-4 알콕시는 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있으며, 바람직하게는 R6은 C1-4 알킬 또는 불소이다.
Hal은 Br, Cl 및 F와 같은 할로겐이고, 바람직하게는 Hal은 Br 또는 F이다.
m은 Y1, Y2, Y3, 및 Y4를 포함하는 고리에서 수소 이외의 R3기의 수이다. m은 0 내지 mmax의 정수이고, mmax는 Y1, Y2, Y3, 및 Y4를 포함하는 고리 내의 탄소 원자의 수이다. 바람직하게는, m은 0이다.
n은 Y5, Y6, Y7, 및 Y8을 포함하는 고리에서 수소 이외의 R3기의 수이다(식 IIa 및 식 IIb). n은 0 내지 nmax의 정수이고, nmax는 Y5, Y6, Y7, 및 Y8을 포함하는 고리 내의 탄소 원자 수이다. 바람직하게는, n은 0이다.
p는 Y5 및 Y6을 포함하는 고리에서 수소 이외의 R3기의 수이다(식 Ia 및 식 Ib). p는 0 내지 pmax의 정수이고, pmax는 Y5 및 Y6을 포함하는 고리 내의 탄소 원자 수이다. 바람직하게는, p는 0이다.
본 발명의 화합물은 또한 그의 프로드럭, 용매 화합물 또는 염의 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 본 발명의 범위 내에 있는 염을 형성한다. 본원에서 본 발명의 화합물에 대한 언급은 달리 표시되지 않는 한 그의 염에 대한 언급을 포함하는 것으로 이해된다. 약제학적으로 허용 가능한(즉, 무독성, 생리학적으로 허용 가능한) 염이 바람직하지만, 다른 염도 예를 들어 제조 동안 또는 시험관 내 방법에서 사용될 수 있는 분리 또는 정제 단계에서 유용하다. 본 발명의 화합물의 염은, 예를 들어 염이 침전되는 매질과 같은 매질 또는 수성 매질에서 화합물을 등량과 같은 일정량의 산과 반응시킨 후 동결 건조함으로써 형성될 수 있다.
염기성 모이어티를 포함하는 화합물은 다양한 유기산 및 무기산과 염을 형성할 수 있다. 예시적인 산 부가 염은 아세테이트(예컨대, 아세트산 또는 트리할로아세트산, 예를 들어 트리플루오로아세트산으로 형성된 것), 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 히드록시에탄설포네이트(예를 들어, 2-히드록시에탄설포네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄-설포네이트, 나프탈렌설포네이트(예를 들어, 2-나프탈렌설포네이트), 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 페닐프로피오네이트(예를 들어, 3-페닐프로피오네이트), 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 설페이트(예를 들어, 황산으로 형성된 것), 설포네이트(예를 들어, 본원에 언급된 것), 타르트레이트(tartrates), 티오시아네이트, 톨루엔술포네이트 예컨대 토실레이트, 운데카노에이트 등을 포함한다.
본 발명의 화합물의 프로드럭 및 용매 화합물이 또한 본원에서 고려된다. 본원에 사용되는 용어 "프로드럭"은 대상에 투여 시, 대사 또는 화학적 과정에 의해 화학적 전환을 거쳐 본 발명의 화합물 또는 그의 염 및/또는 용매 화합물을 생성하는 화합물을 의미한다.
본 발명의 화합물의 용매 화합물은 예를 들어 수화물을 포함한다.
거울상이성질체 형태 및 부분입체이성질체 형태를 포함하는, 본 발명의 화합물의 모든 입체 이성질체들(예를 들어, 다양한 치환기 상의 비대칭 탄소로 인해 존재할 수 있는 것들)은 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 본 발명의 화합물의 개별 입체 이성질체는 예를 들어 다른 이성질체가 실질적으로 없을 수 있거나(예를 들어, 특정 활성을 갖는 순수하거나 실질적으로 순수한 광학 이성질체로서), 또는 예를 들어 라세미체로서 또는 다른 모든 입체 이성질체와, 또는 다른 선택된 입체 이성질체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 화합물의 키랄 중심은 IUPAC 1974 권장사항에 의해 정의된 바와 같은 S-배열(configuration) 또는 R-배열을 가질 수 있다.
라세미 형태는 분별 결정화, 부분입체이성질체 유도체의 분리 또는 결정화 또는 키랄 컬럼 크로마토그래피에 의한 분리와 같은 물리적 방법에 의해 분해될 수 있다. 개별 광학 이성질체는 광학 활성 산을 사용한 염 형성 후 결정화를 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 임의의 적합한 방법에 의해 라세미체로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 화합물의 모든 배위 이성질체(configurational isomer)는 혼합물로 또는 순수하거나 또는 실질적으로 순수한 형태 중 하나로 고려된다. 본 발명의 화합물의 정의는 시클릭 탄화수소 또는 헤테로시클릭 고리의 시스 및 트랜스 이성질체 뿐만 아니라 시스(Z) 및 트랜스(E) 알켄 이성질체 양자 모두를 포함한다.
청구된 화합물의 중수소화된 버전(Deuterated versions)도 또한 제공될 수 있다. 중수소화가 존재하는 위치는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 R4 및 R5의 C1-4 알킬 내 일 수 있다.
명세서 전체에 걸쳐, 안정한 모이어티 및 화합물을 제공하기 위해 그의 기 및 치환기가 선택될 수 있다.
본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 선택적으로 포함하는 진단 또는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "진단 조성물"은 알파-시누클레인 응집과 관련된 질병의 기저에 있는 응집된 알파-시누클레인의 존재를 결정하기 위한 조성물에 관한 것이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 화합물은 검출 가능하거나 검출 가능하게 표지된다. 본 발명에 따르면 화합물의 존재가 예컨대 NMR 분광법, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), 광학 검출, 양전자 방출 단층촬영(PET), 전자 현미경, 자기 공명 영상(MRI), 분광법, 크로마토그래피, ELISA 분석, 바람직하게는 PET에 의한 방사성 방사의 검출, 보다 바람직하게는 PET에 의한 섬광 계수 또는 감마 계수와 같은 기존 기술에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 화합물이 응집된 알파-시누클레인을 이미징하기 위한 프로브로 사용되는 경우, 이들은 표지되어야만 한다. 표지의 특정 특성은 이미징에 사용되는 방법에 따라 다를 것이다. 전형적으로 양전자(PET)를 방출하고 예컨대 18F, 11C, 125I, 123I, 131I, 77Br 및 76Br, 특히 18F 및 11C와 같이 짧은 반감기를 갖는 방사성 표지가 유용할 것이다. 그들의 짧은 반감기로 인해, 본 발명의 표지된 화합물은 테스트에 사용되기 직전에 제조되어야 한다. 결과적으로, 본 발명의 진단 조성물은 또한 본 발명의 화합물의 적어도 2개의 전구체로 이루어진 키트의 형태로 제공될 수 있으며, 이것들은 반응하여 본 발명의 원하는 화합물을 형성한다.
도 1은 [3H]-화합물 1을 사용한 루이 소체 치매를 앓고 있는 환자의 인간 뇌 조직을 이용한 오토래디오그래피(Autoradiography)이다.
당업자는 검출 가능한 표지가 본 발명의 화합물에 부착될 수 있는 방법을 고안할 수 있을 것이다. 하기의 도식은 예시적인 예로서 제공될 수 있다.
18 F로 표지:
2-[18F]플루오로에틸 토실레이트는 WO2010/000372호, 32 페이지, 화합물 23으로부터 출발하는 화합물 21 및 화합물 22의 제조를 위한 도식 A에 기재된 바와 같이 질소, 산소 및 황 친핵체를 함유하는 화합물의 플루오로에틸화를 통하여 18F를 포함하기 위한 유용한 전구체이다. 화합물 A 및 B도 동일한 방식으로 제조할 수 있다. 또 다른 방법은 C에서 D로의 전환(참조, J. Med. Chem. 2013, 56, 4568-4579, 도식 2) 또는 도식 1에서 화합물 24의 화합물 12로의 전환에 대해 나타낸 바와 같이 적합한 이탈기의 직접적인 친핵성 치환을 포함한다.
도식 1
Figure pct00006
11 C로 표지:
11C로 표지된 본 발명의 화합물은 WO 2010/000372호, 32 페이지, 화합물 23으로부터 출발하는 화합물 27 및 화합물 28의 제조를 위한 도식 B에 기재된 바와 같이 적합한 전구체를 [11C] MeI로 직접 친핵성 알킬화하여 제조할 수 있다. 본 발명의 화합물 1은 화합물 2를 시작으로 유사하게 합성할 수 있다. 동일한 방식으로, 화합물 18과 화합물 19는 도식 2와 같이 화합물 9를 시작으로 합성할 수 있다. 대안적으로, [11C]메틸 아이오다이드를 전환하여 디메틸포름아미드 중의 용액으로 [11C]포름알데히드를 제조하는 간단하고 접근 가능한 방법(J.M. Hooker et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 5989-5992)은 비활성(specific activity)의 손실이 없는 온화한 조건 하에서 [11C]포름알데히드로 환원성 아민화를 통해 화합물 2를 화합물 1로 전환하는데 사용할 수 있다.
도식 2:
Figure pct00007
본 발명은 응집된 알파-시누클레인의 침착물을 이미징하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계:
(i) 본 발명의 검출 가능하게 표지된 화합물을 포함하는 조성물의 검출 가능한 양을 대상에 도입하는 단계;
(ii) 화합물이 응집된 알파-시누클레인과 결합되기에(associated) 충분한 시간을 허용하는 단계; 및
(iii) 응집된 알파-시누클레인과 결합된 화합물을 검출하는 단계;
를 포함한다.
검출 가능하게 표지된 화합물을 포함하는 조성물은 예를 들어 경구적으로 또는 비경구적으로와 같은 하기에 기재된 임의의 투여 경로에 의해 대상 내로 도입될 수 있다. 표지된 화합물은 환자에게 도입될 수 있고, 화합물이 응집된 알파-시누클레인과 결합되기에 충분한 시간 범위 후에, 상기 표지된 화합물은 환자 내부에서 비침습적으로 검출된다. 대안적으로, 표지된 화합물을 환자에게 도입할 수 있고, 화합물이 응집된 알파-시누클레인과 결합되도록 충분한 시간을 허용한 다음, 환자로부터 조직 샘플을 채취하고 표지된 화합물은 환자로부터 분리된 조직에서 검출될 수 있다. 표지된 화합물을 조직 샘플에 도입하기 전에 조직 샘플을 환자로부터 제거할 수도 있다. 화합물이 응집된 알파-시누클레인에 결합되도록 충분한 시간을 허용한 후, 화합물을 검출할 수 있다.
응집된 알파-시누클레인의 이미징은 또한 응집된 알파-시누클레인의 양을 결정할 수 있도록 정량적으로 수행될 수 있다.
본 발명은 추가로 알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물, 뿐만 아니라 그의 프로드럭, 용매 화합물 또는 염에 관한 것이다.
추가 실시 형태는 알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도 뿐만 아니라 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병의 치료 또는 예방 방법이다. 여기에는 하기에 설명된 "약제학적 조성물"로서의 화합물의 용도가 포함된다.
본 발명에 따른 용어 "응집"은 복합체로의 탄수화물, 핵산, 지질 및/또는 금속 이온과 같은 추가의 생체분자의 통합을 수반할 수 있는 알파-시누클레인의 올리고머성 또는 다량체성 복합체의 형성을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "알파-시누클레인의 응집과 관련된 질병"은 응집된 알파-시누클레인의 존재를 특징으로 하는 질병들을 지칭한다. 이러한 응집된 알파-시누클레인은 특정 조직, 보다 바람직하게는 신경 조직 또는 뇌 조직에 침착물을 형성할 수 있다. 응집의 정도는 특정 질병에 따라 다르다.
본 발명에 따르면, 용어 "약제학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 언급된 화합물 및 선택적으로 본 발명의 화합물의 특성을 변경함으로써, 예를 들어 이들의 기능을 안정화하고, 조정하고 그리고/또는 활성화시킬 수 있는 추가의 분자를 포함한다. 조성물은 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 그 중에서도, 분말(들), 정제(들), 용액(들) 또는 에어로졸(들)의 형태일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 선택적으로 그리고 추가적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체 및 부형제의 예들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀전, 예컨대 오일/물 에멀전, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액, DMSO를 비롯한 유기 용매 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 개별 환자의 임상 상태, 약제학적 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의사들에게 알려져 있는 기타 요인을 고려하여 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화되고 투여될 것이다. 따라서, 본 명세서의 목적을 위한 약제학적 조성물의 "유효량"은 이러한 고려에 의해 결정된다. 당업자는 개인에게 투여되는 약제학적 조성물의 유효량이, 그 중에서도, 화합물의 성질에 의존할 것임을 알고 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 직장, 비경구, 수조내(intracisternally), 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 점적제 또는 경피 패치에 의함), 구강, 또는 경구 또는 비강 스프레이로서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 진단을 위한 PET 추적자로 사용되는 경우 정맥 내로 투여될 것이고, 질병의 치료 또는 예방에 사용되는 경우 경구로 투여될 것이다.
"약제학적으로 허용가능한 담체"는 모든 유형의 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 제제 보조제를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 지칭한다.
치료 목적을 위하여, 약제학적 조성물은 또한 서방성(sustained release) 시스템에 의해 적합하게 투여될 수 있다. 서방성 조성물의 적합한 예로는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스는 폴리락티드(미국 특허 번호 3,773,919호, EP 58 481호), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), 및 R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트(R. Langer et al., Id.) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133 988호)를 포함한다. 서방성 약제학적 조성물은 또한 리포솜으로 포획된 화합물을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물을 함유하는 리포솜은 그 자체로 공지된 방법: DE 32 18 121호; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52 322호; EP 36 676호; EP 88 046호; EP 143 949호; EP 142 641호; 일본 특허 출원 83-118008호; 미국 특허 출원번호 4,485,045호 및 4,544,545호; 및 EP 102324호에 의해 제조된다. 일반적으로, 리포솜은 지질 함량이 약 30 mol% 콜레스테롤보다 큰, 작은(약 200 내지 800 옹스트롬) 단일 라멜라 타입(unilamellar type)이며, 선택된 비율은 최적의 치료를 위해 조정된다.
비경구 투여의 경우, 약제학적 조성물은 일반적으로 원하는 순도에서, 단위 투여형 주사 가능한 형태(용액, 현탁액 또는 에멀전)로 약제학적으로 허용가능한 담체, 즉, 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 독성이 없고 제형의 다른 성분과 호환되는 것과 혼합함으로써 제형화된다.
일반적으로, 제형은 약제학적 조성물의 성분을 액상 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 양자 모두와 균일하고 밀접하게 접촉시킴으로써 제조된다. 그런 다음, 필요한 경우, 제품을 원하는 제형으로 성형한다. 바람직하게는, 담체는 비경구 담체이고, 보다 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 용액이다. 이러한 담체 비히클의 예로는 물, 식염수, 링거액 및 포도당 용액이 있다. 고정 오일(fixed oils) 및 에틸 올레이트와 같은 비수성 비히클 뿐만 아니라 리포솜도 본 발명에서 유용하다. 담체는 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질과 같은 소량의 첨가제를 적절하게 포함한다. 이러한 물질은 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아세트산 및 기타 유기산 또는 이들의 염과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) (폴리)펩티드, 예를 들어 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 셀룰로오스 또는 그 유도체, 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 반대이온; 및/또는 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
치료학적 투여에 사용되는 약제학적 조성물의 성분은 멸균되어야만 한다. 멸균은 멸균 여과막(예를 들어, 0.2 μm 막)을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 약제학적 조성물의 치료 성분은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥 내 용액 백 또는 바이알에 배치된다.
약제학적 조성물의 성분은 일반적으로 수용액 또는 재구성을 위한 동결 건조 제형으로서 단위 또는 다중 용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 또는 바이알에 저장될 것이다. 동결 건조 제형의 예로서, 10-ml 바이알에 5 ml의 멸균 여과된 1%(w/v) 수용액을 채우고, 생성된 혼합물을 동결건조시킨다. 주입 용액은 정균적 주사용 멸균수를 사용하여 동결 건조된 화합물(들)을 재구성하여 제조된다.
본 발명은 추가로 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 알파-시누클레인 응집과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용되는, 용어 "치료학적 유효량"은 원하는 생물학적 반응을 이끌어내기에 충분한 양을 지칭한다. 본 발명에서, 원하는 생물학적 반응은 알파-시누클레인 응집의 억제 및/또는 조직에 존재하는 응집된 알파-시누클레인 양의 감소이다.
본 발명은 또한 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 알파-시누클레인 응집을 억제하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 화합물의 용도에 관한 것이다.
알파-시누클레인 응집과 관련된 질병은 특별히 제한되지 않으며 일반적으로 파킨슨병, 루이 소체 치매, 다계통위축증으로부터 선택된다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것으로 의도된다. 그러나, 이들 실시예들로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 합성 및 테스트
화학 합성 절차
하기 방법은 본 발명의 화합물의 제조 및 예시적인 실시예에 대한 세부사항과 함께 제공된다. 본 발명의 화합물은 유기 합성 분야의 당업자에 의해 공지되거나 상업적으로 입수 가능한 출발 물질 및 시약으로부터 제조될 수 있다.
모든 출발 물질 및 용매는 상업용 등급이었고, 달리 명시되지 않는 한 받은 그대로 사용되었다.
박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography: TLC)는 Macherey-Nagel사의 사전 코팅된 시트, 0.25 mm ALUGRAM® SIL G/UV254 플레이트를 사용하여 수행하였고, UV로 검출하고/하거나 10 중량% 에탄올성 포스포몰리브덴산 시약으로 탄화시킨 후 200℃에서 가열하였다.
플래시 컬럼 크로마토그래피(Flash column chromatography)는 Merck사의 실리카 겔 60(0.063-0.100 mm)을 사용하여 수행되었다.
분석 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 Waters 996 포토 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 Waters사의 HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다. 모든 분리에는 수 중 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)(v/v) 및 아세토니트릴 중 0.1% TFA의 이동상이 포함되었다. 역상(RP) 컬럼 Eurospher RP 18, 100 Å, 5 μm, 250×4.6 mm를 1 mL·min-1의 유속으로 사용하여 HPLC를 수행하였다.
전자분무 이온화 질량분석기(ESI-MS) 및 액체 크로마토그래피/질량분석기(LC/MS) 분석은 Waters Micromass ZQ 4000 질량분석기를 전술한 Waters사 HPLC 장치와 함께 사용하여 수득하였다.
TXI HCN z-그래디언트 프로브가 장착된 400 MHz Bruker Avance 분광계(Bruker AG, Rheinstetten, Germany)를 사용하여 NMR 스펙트럼을 기록하였다. 모든 스펙트럼은 TOPSPIN 3.1(Bruker AG, Karlsruhe, Germany)을 사용하여 처리되었다. 1H NMR 화학적 이동(δ)은 내부 표준으로서 CHCl3, DMSO-d5 및 TFA-d1 대한 백만분율(ppm)로 보고되었다. 데이터는 다음과 같이 보고되었다: 화학적 이동, 다중도(s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선, qi = 오중선, dd = 이중선의 이중선, dt = 삼중선의 이중선, b = 확장됨, m = 다중선), 결합 상수(J, Hz로 제공), 적분. 13C NMR 화학적 이동(δ)은 내부 표준으로서 CDCl3, DMSO-d6 및 TFA-d1에 대한 백만분율(ppm)로 보고되었다. 화합물의 공명을 기록하기 위해 다음 실험이 사용되었다: 1H-1D, 13C-1D NMR 스펙트럼 및 13C-APT(단일 J-에볼루션 시간이 1/145초인 부착된 양성자 테스트, 스펙트럼은 4차 및 메틸렌기가 포지티브 사인을 가지며 메틸 및 메틴기는 네거티브 사인을 갖도록 처리된다). 1H 및 APT 스펙트럼에서의 공명의 중첩을 해결하고 감지할 수 없는 공명을 복구하기 위하여, 2D-[13C,1H]-HSQC(이핵 단일 양자 일관성), 2D-[13C,1H]-HMBC(이핵 다중 결합 상관 관계) 및 2D-NOESY는 일부 화합물들에 대해 기록되었다.
선택된 화합물(화합물 1, 화합물 2, 화합물 12, 화합물 18)은 99% 삼중수소 가스/Kerr 촉매로 H/T 교환 표지를 사용하여 스위스 Teufen에 소재한 RC TRITEC AG사에 의한 결합 분석을 위해 삼중수소화되었다. 화합물은 185 MBq 패키징, 37 MBq/mL 농도 및 1.1 내지 2.3 GBq/mmol 범위의 비활성을 갖는 에탄올 용액으로서 전달되었다.
방법 A: 1H- 피라졸의 합성
당업자는 하기에 도시된 화합물 11A 및 화합물 11B가 동일한 화합물의 2개의 호변이성질체 형태임을 인식할 것이다. 이러한 모든 호변이성질체 형태는 본 발명의 일부로서 간주된다. 예시로서, 예를 들어 하기 화합물 11에 대해 도시된 바와 같은 피라졸 모이어티의 모든 호변이성질체 형태가 본 발명에 포함된다. 관련된 방식으로, 당업자는 본원에 포함된 화합물 명칭은 호변이성질체 구성이 하기 화합물 11A와 관련하여 도시된 명명 규칙에 기초함을 인식할 것이다. 따라서, 1,3-벤조디옥솔 치환기는 3의 위치에 있다. 다른 명명 규칙은 하기 호변이성질체 화합물 11B를 기반으로 하고 해당 규칙에서 1,3-벤조디옥솔 치환기는 5의 위치에 있다.
Figure pct00008
도시적인 예시: 2-[3-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-1H-피라졸-5-일]-6-플루오로피리딘 화합물 11
Figure pct00009
DMSO (7.5 mL) 및 THF (1.9 mL) 중에서 수소화 나트륨(FW 24.00, 오일 중 60%, 3.9 mmol, 156 mg)을 1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)에탄온(FW 164.16, 492 mg, 3.00 mmol) 및 메틸 6-플루오로피리딘-2-카복실레이트(FW 155.13, 605 mg, 3.9 mmol)의 용액에 첨가하였고, 반응 혼합물을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 60mL의 얼음과 AcOH(450μL)가 포함된 물에 부었다. 상기 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 생성된 침전물을 여과하여 제거하였고, 물(10mL), 헥산: EtOH=5:1(10mL), 헥산(10mL)으로 세척하였고, 공기 중에서 건조하여 조(crude) 중간체 1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-3-(6-플루오로피리딘-2-일)프로판-1,3-디온(594 mg)을 황색 고체로서 얻었다. EtOH(20 mL) 중의 이 조 중간체의 현탁액에 히드라진 수화물(146 μL, 150 mg, 3 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 5시간 동안 교반하고, 냉각시키고, 진공 내에서 농축시켰다. 잔류물을 MeOH(10mL) 중에서 현탁시키고, 5분 동안 교반하면서 끓이고, 냉각시키고, 여과하여 제거하고, MeOH(10mL)로 세척하고, 20℃에서 15시간 동안 고진공에서 건조시켜 순수한 생성 화합물 11(471 mg, 1.66 mmol, 2단계에 걸쳐 55%)을 백색 고체로서 수득하였다.
방법 B: 1 H -피라졸의 합성
도시적인 예시: 4-[3-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-1H-피라졸-5-일]-2-브로모피리딘 화합물 9
Figure pct00010
무수 THF(5 mL) 중의 칼륨 tert-부톡시드 (FW 112.21, 281 mg, 2.5 mmol)의 용액을 질소 하에 1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)에탄온 (FW 164.16, 328 mg, 2 mmol) 및 메틸 2-브로모피리딘-4-카복실레이트(FW 216.03, 518 mg, 2.4 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 20 μL 분취량을 샘플링하고 1M 인산염 완충액(pH 7)으로 퀀치하였고(quenched), EtOAc로 추출하였고 TLC로 분석하였다. 케톤의 완전한 전환이 관찰되었다. 혼합물을 1M 인산염 완충액 pH 7(15mL) 및 얼음물(15mL)에 붓고, 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 생성된 황색 고체를 여과하여 제거하였고, 물(5×10 mL)로 세척하였고 공기 건조하여 조 중간체 1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-3-(2-브로모피리딘-4-일)프로판-1.3-디온을 656 mg (1.88 mmol, 94%) 수득하였는데, 이것은 정제 없이 다음 단계에 사용되었다. THF (10 mL) 중에서 이 중간체와 히드라진 일수화물(FW 50.06, d 1.03; 274μL, 282mg, 5.64 mmol)의 혼합물을 50℃에서 15시간 동안 교반하였다. 냉각된 혼합물을 물(40mL)에 붓고 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 생성된 침전물을 여과하여 제거하였고, 물로 세척하고, 공기 건조시켰다. 조 생성물을 n-BuOH(10 mL) 및 DMF(1 mL)로부터 결정화하여 순수한 생성 화합물 9(458 mg, 1.33 mmol, 2단계에 걸쳐 67%)를 백색 분말로서 수득하였다.
방법 C: Boc 보호기 제거
도시적인 예시: 4-[5-(2-브로모피리딘-4-일)-1H-피라졸-3-일]아닐린 화합물 7
Figure pct00011
트리플루오로아세트산(2 mL, 2.96 g, 26 mmol)을 방법 B에 따라 tert-부틸 N-(4-아세틸페닐)카바메이트 및 메틸 2-브로모피리딘-4-카복실레이트로부터 제조된 조 tert-부틸 {4-[5-(2-브로모피리딘-4-일)-1H-피라졸-3-일]페닐}카바메이트(FW 415.28, 865 mg, 2.08 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하고 진공 내에서 농축하였다. 1M 인산염 완충액 pH 7(20mL)을 첨가하였고, 생성된 침전물을 여과하여 제거하였고, 물(2×10mL)로 세척하고, 공기 건조하여 원하는 생성물 543mg(1.72mmol, 3단계에 걸쳐 69%)을 황색-주황색 고체로서 수득하였다.
방법 D: 1 H -피라졸의 합성
도시적인 예시: 4-[3-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-1H-피라졸-5-일]-2-플루오로피리딘 화합물 12
Figure pct00012
CH2Cl2(35 mL) 중에서 iPr2NEt(1.79 mL, 1.33 g, 10.26 mmol)를 1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)에탄온(561 mg, 3.42 mmol) 및 MgBr2·Et2O(1.56 g, 6.04 mmol)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 5분 동안 교반한 다음, CH2Cl2(7 mL) 중의 펜타플루오로페닐 2-플루오로피리딘-4-카복실레이트(1.37 g, 4.45 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 48시간 동안 교반하였다. 이어서, 1N 수성 HCl(20mL)을 첨가하였고 교반을 5분 동안 계속하였다. 수성 층을 CH2Cl2(20 mL)로 추출하였고 합쳐진 유기 추출물을 건조시키고(MgSO4) 진공 내에서 농축시켰다. 잔류물을 Et2O(10 mL)로 트리튜레이트하고(triturated) 여과하였다. 상기 고체를 Et2O로 세척하였고 공기 건조하여 조 생성물(1.14g, 주황색 고체)을 얻었다. 조 생성물을 EtOAc(8 mL) 및 헥산(4 mL)으로부터 재결정화하여 순수한 중간체 1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-3-(2-플루오로피리딘-4-일)프로판-1,3-디온(900 mg, 3.13 mmol, 92%)을 주황색 고체로서 수득하였다. 이 중간체를 THF(20mL) 중에 현탁시키고 히드라진 일수화물(292 μL, 300 mg, 6 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 5시간 동안 교반하였고, 냉각시키고, 진공 내에서 농축시켰다. 잔류물을 Et2O (10 mL) 중에 현탁시키고, 5분 동안 교반하면서 끓이고, 냉각시키고, 여과하여 제거하였고, Et2O (2×10 mL)로 세척하였고, 20℃에서 15시간 동안 고진공 중에 건조하여 생성 화합물 12(722 mg, 2.55 mmol, 2 단계에 걸쳐 76%)를 백색 고체로서 수득하였다.
방법 E: 펜타플루오로페닐 에스테르의 합성
도시적인 예시: 펜타플루오로페닐 2-플루오로피리딘-4-카복실레이트 화합물 59
Figure pct00013
1,4-디옥산(40 mL) 중에서 DCC(FW 206.33, 2.27g, 11mmol)를 2-플루오로피리딘-4-카르복실산(1.41 g, 10 mmol) 및 펜타플루오로페놀(1.84 g, 10 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 15시간 동안 교반을 계속하였고, 그 시간까지 무색의 침전물이 형성되었다. 상기 혼합물을 Celite®를 통해 여과하였고 증발시켜 반고체를 얻었다. 실리카 겔 크로마토그래피로 에스테르 화합물 59(2.21g, 7.2mmol, 72%)를 순수한 무색 오일로 얻었다.
방법 F: 1 H -피라졸의 합성
도시적인 예시: 6-[3-(3-브로모페닐)-1H-피라졸-5-일]-1,3-디옥솔로[4,5-c]피리딘 화합물 20
Figure pct00014
단계 1
메탄올(0.7 mL)중의 1,3-디옥솔로[4,5-c]피리딘-6-카르복스알데히드 (WO/2019/208509)(35 mg, 0.23 mmol) 및 1-(3-브로모페닐)에탄온(46 mg, 0.23 mmol)의 현탁액에 Ba(OH)2 *8H2O(5 mg) 및 NaOH(0.5 mg)를 첨가하였고, 생성된 혼합물을 실온(RT)에서 밤새 교반하였다. 진공 내에서 메탄올을 증발시킨 후, 잔류물을 물(5mL)에서 트리튜레이트하고, 고체를 여과에 의해 수집하였고, 차가운 메탄올(0.5mL)로 세척하였고 건조시켜 중간체 화합물 1-(3-브로모페닐)-3-([1,3]디옥솔로[4,5-c]피리딘-6-일)프로프-2-엔-1-온 (67 mg, 88%)을 백색 고체로서 수득하였다.
단계 2
DMSO(0.8 mL) 중에서 1-(3-브로모페닐)-3-([1,3]디옥솔로[4,5-c]피리딘-6-일)프로프-2-엔-1-온(67 mg, 0.2 mmol)의 격렬하게 교반된 현탁액에 H2O2 수용액(30%, 45 mg, 0.4 mmol)을 첨가한 다음, 수성 NaOH(10%, 16 μL, 0.04 mmol)를 적가하였다. 황색 혼합물을 RT에서 1.5시간 동안 교반하였고 차가운 인산염 완충액(20mL, 0.1M, pH 7)에 부었다. 유성 침전물을 에틸 아세테이트(2×15 mL)로 추출하였고, 합쳐진 유기 분획을 Na2SO4로 건조시키고, 진공 내에서 농축시키고, 잔류물을 톨루엔(0.8 mL) 중에서 재현탁시켰다. 톨루엔 중의 현탁액을 히드라진 수화물(35 mg, 0.7 mmol) 및 PTSA 수화물(5 mg)로 처리하였고, 상기 혼합물을 환류 하에서 1.5시간 동안 교반하였다. 냉각 후, 인산염 완충액(0.3M, 20mL)을 첨가하였고, 생성물을 에틸 아세테이트(2×20mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기 분획을 염수(5mL)로 세척하였고, Na2SO4로 건조시키고, 진공 내에서 농축시켰다. 조 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(15g, 실리카겔 63-100, CHCl3/MeOH = 100/1)로 정제하여 황색 고체를 수득하였고, 이것을 Et2O (1 mL)로 세척하여 화합물 20(25 mg, 36%)을 백색 고체로서 얻었다.
방법 G: 1 H -피라졸의 합성
도시적인 예시: 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-1H-이미다졸-2-일]-2-브로모피리딘 화합물 48
Figure pct00015
DCM (5 mL) 중 1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)에탄온(138 mg, 0.84 mmol), MgBr2·Et2O(542 mg, 2.1 mmol)의 혼합물을 DIPEA(323 mg, 426 μL, 2.5 mmol)로 처리하였고, RT에서 10분 동안 교반하였다. 다음으로, 25℃에서 3시간 동안 무수 DCM(5 mL) 중에서 3,6-디클로로피리다진-4-카르복실산(203 mg, 1.05 mmol), 벤조트리아졸 (125 mg, 1.05 mmol) 및 DCC(216 mg, 1.05 mmol)을 교반하여 별도로 제조한 1H-벤조트리아졸-1-일(3,6-디클로로피리다진-4-일)메탄온의 조 혼합물을 5분에 걸쳐 적가하였다. 생성된 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반한 다음, 수성 0.5M HCl(2mL)로 처리하였고 25℃에서 추가로 10분 동안 교반하였다. 물(20mL)을 첨가한 후, 혼합물을 DCM(2×15mL)으로 추출하였다. 합쳐진 유기 분획을 염수로 세척하였고, Na2SO4로 건조시키고, 진공 내에서 농축시켰다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 중간체 1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-3-(3,6-디클로로피리다진-4-일)프로판-1,3-디온(190 mg, 67%)을 주황색 고체로서 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 이 중간체를 THF(4mL) 중에 현탁시키고 히드라진 일수화물(40mg, 0.8mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 밤새 교반하였고, 냉각시키고, 진공 내에서 농축시켰다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 63-100, 20g, 클로로포름/메탄올 = 100/1)로 정제하여 화합물 48(100mg, 2단계에 걸쳐 36%)을 연한 황색 고체로 제공하였다.
방법 H: 1 H -이미다졸의 합성
도시적인 예시: 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-1H-이미다졸-2-일]-2-브로모피리딘 화합물 33
Figure pct00016
단계 1
DMF(6 mL) 중의 1-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-브로모에탄온(729 mg, 3 mmol), 2-브로모피리딘-4-카르복실산(606 mg, 3 mmol) 및 K2CO3(414 mg, 3 mmol)의 현탁액을 55 내지 60℃에서 6시간 동안 교반하였다. 냉각 후, 혼합물을 물(60mL)에 붓고, 10분 동안 교반하고 생성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 필터 상에서 물(20mL)로 세척하고 건조하여 중간체 화합물 2-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-옥소에틸 2-브로모피리딘-4-카복실레이트(899 mg, 87%)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
단계 2
톨루엔(7 mL) 중의 중간체 화합물 2-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-옥소에틸 2-브로모피리딘-4-카복실레이트(364 mg, 1 mmol) 및 AcONH4(924 mg, 12 mmol)의 현탁액을 4시간 동안 격렬하게 교반하면서 100℃에서 가열하였다. 냉각 후, 반응 혼합물을 인산염 완충액(50mL, 0.25M, pH 7)으로 처리하였고, 에틸 아세테이트(2×50mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기 분획을 염수로 세척하였고, Na2SO4로 건조시키고, 진공 내에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 63-100, 30g, CHCl3/MeOH = 100/1 → 100/3)로 정제하였다. 정제된 생성물을 수성 에탄올(90%)로부터 재결정화하여 화합물 33(140 mg, 41%)을 연한 고체로서 제공하였다.
방법 I: 1 H -1,2,4-트리아졸의 합성
도시적인 예시: 4-[3-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-1H-1,2,4-트리아졸-5-일]-2-브로모피리딘 화합물 30
Figure pct00017
n-BuOH(2 mL) 중의 t-BuOK(84mg, 0.75mmol)의 용액에 벤조[1,3]디옥솔-5-카르복사미딘 하이드로클로라이드(100mg, 0.5mmol)을 0℃에서 첨가하였고, 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반하였다. 2-브로모이소니코틴산 히드라지드(108 mg, 0.5 mmol)를 첨가한 후, 황색 현탁액을 85℃에서 3시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 에탄올(4mL)을 첨가하였고 CO2를 현탁액에 5분 동안 버블링시켰다. 진공 내에서 용매를 제거한 후, 잔류물을 물(10mL)에서 트리튜레이트하였고, 생성된 침전물을 여과에 의해 수집하였고, 물(5mL)로 세척하였고, 건조시켜 화합물 30(85mg, 49%)을 회색 고체로서 제공하였다.
방법 J: 1 H -1,2,4-트리아졸의 합성
도시적인 예시 4-[3-(2-브로모피리딘-4-일)-1H-1,2,4-트리아졸-5-일]-N,N-디메틸아닐린 화합물 44
Figure pct00018
n-BuOH(2 mL) 중의 2-브로모이소니코틴산 히드라지드(151 mg, 0.7 mmol), 4-(디메틸아미노)벤조니트릴(307 mg, 2.1 mmol) 및 K2CO3(48 mg, 0.5 mmol)의 혼합물을 145℃에서 8시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 내에서 농축시키고 조 생성물을 2개의 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 63-100, 20g, CHCl3/MeOH=100/1) 및 (실리카 겔 63-100, 20g, 아세톤/헥산=1/5)로 정제하여 화합물 44(20 mg, 8%)를 베이지색 고체로서 제공하였다.
방법 K: 4-클로로-1 H -피라졸의 합성
4-[3-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-4-클로로-1H-피라졸-5-일]-2-브로모피리딘, 화합물 28
Figure pct00019
물(3mL) 중 화합물 9(100mg, 0.29mmol) 및 NCS(80mg, 0.6mmol)의 현탁액을 70℃에서 16시간 동안 교반하였고, TLC는 출발 물질의 소모를 나타내었다. RT로 냉각한 후, 침전물을 여과에 의해 수집하였고, 물(2×5 mL)로 세척하였고, 에탄올(8 mL)로부터 재결정화하여 화합물 28(52 mg, 47%)을 회색 고체로서 제공하였다.
방법 L: 1-[4-(4-R-피페라진-1-일)페닐]에탄온의 합성
도시적인 예시 1-{4-[4-(2-메톡시에틸)피페라진-1-일]페닐}에텐온
Figure pct00020
DMF(5 mL) 중의 1-[4-(피페라진-1-일)페닐]에탄온(408 mg, 2 mmol), 1-브로모-2-메톡시에탄(417 mg, 3 mmol), 및 Cs2CO3(1304 mg, 4 mmol)의 혼합물을 25℃에서 밤새 교반하였다. DMF를 진공 내에서 증발시킨 후, 잔류물을 물(25mL)과 에틸 아세테이트(35mL) 사이에 파티셔닝하였고(partitioned), 수성 상을 에틸 아세테이트(25mL)로 추출하였고, 합쳐진 유기 분획을 염수로 세척하였고, Na2SO4로 건조시키고, 진공 내에서 농축하였다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피(30g 실리카 겔 63-100, 클로로포름 → 클로로포름/MeOH = 100/2)로 정제하여 1-{4-[4-(2-메톡시에틸)피페라진-1-일]페닐}에텐온(525 mg, 99%)을 밝은-황색 고체로서 제공하였다.
2-메톡시에틸 2,6-디브로모피리딘-4-카복실레이트 및 2-메톡시에틸 2,6-디클로로피리딘-4-카복실레이트는 공개된 프로토콜(Journal of Medicinal Chemistry (2012), 55, 10564-10571)에 따라 제조되었다.
tert-부틸(4-아세틸페닐)메틸카바메이트, tert-부틸(4-아세틸페닐)-N-(2H3)메틸카바메이트, tert-부틸(4-아세틸페닐)에틸카바메이트 및 tert-부틸(4-아세틸페닐)(2-플루오로에틸)카바메이트는 공개된 프로토콜(Organic Letters (2020), 22, 5522-5527)에 따라 제조되었다.
1-[4-(4-플루오로피페리딘-1-일)페닐]에탄온 및 1-[4-(3-플루오로아제티딘-1-일)페닐]에탄온은 공개된 프로토콜(WO 2011071570 A1)에 따라 제조되었다.
펜타플루오로페닐 2-플루오로피리딘-4-카복실레이트 및 펜타플루오로페닐 2-클로로피리딘-4-카복실레이트는 방법 E에 따라 제조되었다. 1-{4-[4-(2-메톡시에틸)피페라진-1-일]페닐}에텐온 및 1-{4-[4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일]페닐}에텐온은 방법 L에 따라 제조되었다.
본 발명의 예시적인 화합물을 표 1 및 표 2에 나타내었다. 표 1은 특정 실시예 화합물에 대한 명칭, 구조, IUPAC 명칭, 제조를 위한 출발 물질, 합성 방법 및 화학적 수율을 나타낸다. 표 2는 특정 실시예 화합물에 대한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 보유 시간, HPLC와 결합된 저분해능 질량 분석을 사용하여 발견된 분자량, 및 양성자 핵 자기 공명(1H-NMR)을 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
[표 2]
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
a그래디언트 50% CH3CN /50% H2O → 100% CH3CN 30분
b그래디언트 5% CH3CN /100% H2O → 100% CH3CN 30분
실시예 2: 응집된 알파-시누클레인, 타우 및 Abeta를 사용한 결합 연구
화합물의 결합 친화도 및 표적 선택성을 분석하기 위하여, 2가지 유형의 시험관 내 피브릴 결합 분석, 즉, 포화 분석 및 경쟁 분석이 사용되었다.
1) 피브릴의 제조
알파-시누클레인 및 tau46은 확립된 프로토콜(Nuscher B, et al., J. Biol. Chem., 2004; 279(21) :21966-75)에 따라 E. coli로부터 정제되었으며, Aβ1-42는 미국, 조지아주(GA), 왓킨스빌(Watkinsville)의 rPeptide로부터 수득하였다. 일정한 교반을 통해 재조합 단백질의 응집에 의해 피브릴을 제조하였다. 구체적으로, 50 mM Tris, pH 7.0 + 0.02% NaN3 중에 100mM NaCl과 혼합된 70μM의 알파-시누클레인을 96시간 동안 1,400rpm, 37℃에서 배양하였다. 10 μM의 tau46을 50 mM Tris, pH = 7.0에서 0.03 mg/ml 헤파린과 함께 1,000 rpm, 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. Aβ1-42는 20 mM NaPi, pH = 8.0 + 0.2 mM EDTA + 0.02% NaN3에 용해되었다(Deeg AA, et al., Biochim. Biophys. Acta, 2015;1850(9): 1884-90; Goedert M, et al. Nature, 1996; 383(6600): 550-3).
2a) 포화 결합 분석
PBS 중에 희석된 초음파 처리된 αSYN(0.04 μM) 또는 tau46(0.4 μM) 또는 Aβ1-42(6μM) 피브릴은 50 mM Tris-base, 10% 에탄올, 0.05% Tween20, pH 7.4 중에서 감소하는 농도의 [3H]-표지 화합물(48 nM 또는 24 nM - 23 pM)로 배양되었다. 비특이적 결합을 결정하기 위해, 각각의 표지되지 않은 화합물(400nM)을 결합 반응의 이중 세트에 첨가하였다.
분석 플레이트를 플라스틱 호일(재밀봉 가능한 테이프, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 덮고 37℃에서 2시간 동안 교반하면서 배양하였다. 수확하기 전에, 필터(Printed filtermat B, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 4℃에서 30분 동안 5mg/mL 폴리에틸렌이민(PEI, 폴리(에틸렌이민) 용액, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)를 사용하여 배양하였다. 배양 후, 결합 및 유리 리간드를 수확기(Filtermate harvester, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 진공 여과에 의해 분리하였다. 필터를 4℃로 냉각된 완충액으로 3회 세척한 후 중간 출력에서의 마이크로웨이브 오븐에서 2분 동안 건조시켰다. 멜트-온 신틸레이터 시트(Melt-on scintillator sheets)(MeltiLex™ B/HS, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 120℃로 설정된 가열판을 사용하여 필터에 용융시켰다. 실온에서 응고시킨 후, 필터를 플라스틱 백(MicroBeta®용 샘플 백, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에 밀봉하였다. 삼중수소의 축적은 액체 신틸레이션 카운터(Wallac MicroBeta® TriLux, 1450 LSC & Luminescence Counter, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에서 즉시 계수되었다. 증가하는 삼중수소-표지 화합물 또는 콜드 화합물(cold compound) 농도에 대해 방사능을 플로팅하였다. GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., Version 7.03, La Jolla, CA, USA)에서 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이터 포인트(Data points)를 피팅하였다.
2b) 변형된 포화 결합 분석
포화 결합 분석을 위하여, 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석된 초음파 처리된 인간 재조합 αSYN(15nM/웰) 또는 tau46(250nM/웰) 또는 Aβ1-42(1μM/웰) 피브릴의 고정된 농축물을 낮은-결합 플레이트(96 웰 마이크로 테스트 플레이트, Ratiolab GmbH, Dreieich, Germany)에서 [3H]-화합물 1 또는 [3H]-화합물 2로 총 부피의 200 μL/웰 중에서, 30 mM Tris HCl, 10 % 에탄올, 0.05 % Tween20, pH 7.4(이하 배양 버퍼라고 함) 중의 증가하는 농도(0.05 nM 내지 12 nM/24 nM)에서 배양하였다. 방사성 추적자의 비특이적 결합은 400 nM 비-표지된 화합물 1 또는 화합물 2와의 공동 배양에 의해 결정되었다. 최적의 피브릴 농도는 농도 결정 분석을 사용하여 결정되었다.
제거 가능한 밀봉 테이프(PerkinElmer)로 덮인 플레이트를 쉐이커(MaxQ™ 6000, 궤도 직경 1.9cm, Thermo Fisher Scientific Inc., Marietta, OH, USA)에서 45rpm으로 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 필터매트 수확기(PerkinElmer)를 사용하여 유리 섬유 필터매트 B(PerkinElmer)를 통한 진공 여과에 의해 결합 및 유리 방사성 리간드를 분리하였다. αSYN 및 Aβ1-42 피브릴을 포함하는 플레이트를 수확하기 위하여, 필터매트를 수확 전에 4℃에서 30분 동안 5 mg/mL 폴리에틸렌이민과 함께 추가로 배양하였다. 필터를 100 mL(대략 1mL/웰)의 빙냉 배양 완충액으로 3회 세척한 다음, 중간 출력에서의 마이크로웨이브 오븐에서 2.5분 동안 건조시켰다. 멜트-온 신틸레이터 시트(MeltiLex™ B/HS, PerkinElmer)를 120℃로 설정된 가열판을 사용하여 필터에 용융시켰다. 실온에서 응고시킨 후, 필터를 플라스틱 샘플 백(PerkinElmer)에 밀봉하였다. 삼중수소의 축적은 Wallac MicroBeta® TriLux 액체 신틸레이션 카운터(PerkinElmer)에서 즉시 계수되었다. 3H-표지 화합물 농도에 대해 방사능을 플로팅하였다. GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc., version 7.03, La Jolla (CA), USA)에서 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이터 포인트를 피팅하였다.
3a) 경쟁 결합 분석
인산염 완충 식염수(PBS)에 희석된 초음파 처리된 인간 재조합 αSYN(200nM/웰) 또는 tau46(208nM/웰)의 피브릴의 고정된 농축물을 낮은-결합 플레이트(96 웰 마이크로 테스트 플레이트, Ratiolab GmbH, Dreieich, Germany)에서 50 mM Tris-base, 10 % EtOH, 0.05 % Tween20, pH 7.4 중에서 희석된 1 μM로부터 시작하여 관심있는 1 nM [3H]-화합물 1 및 1:4 연속 희석의 콜드 화합물과 함께 배양하였다. Ki 값의 계산을 위해 초음파 처리된 인간 재조합 αSYN 피브릴에 대한 화합물 1의 KD 값은 3nM으로 설정되었다.
분석 플레이트를 플라스틱 호일(재밀봉 가능한 테이프, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 덮고 37℃에서 2시간 동안 교반하면서 배양하였다. 수확하기 전에, 필터(Printed filtermat B, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 4℃에서 30분 동안 5mg/mL 폴리에틸렌이민(PEI, 폴리(에틸렌이민) 용액, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany)를 사용하여 배양하였다. 배양 후, 결합 및 유리 리간드를 수확기(Filtermate harvester, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 진공 여과에 의해 분리하였다. 필터를 4℃로 냉각된 완충액으로 3회 세척한 후, 중간 출력에서의 마이크로웨이브에서 2분 동안 건조시켰다. 필터를 플라스틱 백(MicroBeta®용 샘플 백, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에서 추가된 신틸레이터(BETAPLATE SCINT, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)와 함께 밀봉하였다. 삼중수소의 축적은 액체 신틸레이션 카운터(Wallac MicroBeta® TriLux, 1450 LSC & Luminescence Counter, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)에서 즉시 계수되었다. 증가하는 삼중수소-표지 화합물 또는 콜드 화합물 농도에 대해 방사능을 플로팅하였다. GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., Version 7.03, La Jolla, CA, USA)에서 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이터 포인트를 피팅하였다.
3b) 변형된 경쟁 결합 분석
경쟁적 결합 실험을 위하여, 고정된 농도의 재조합 αSYN 피브릴(초음파 처리함, 15nM/웰)을 총 부피의 200 μL/웰 중에서, 30 mM Tris-HCl, 10 % 에탄올, 0.05 % Tween20, pH 7.4 중의 1nM [3H]-화합물 1 또는 [3H]-화합물 2 및 비표지된 경쟁자의 연속 희석의 감소하는 농도(연속 희석 1:4 또는 1:3.5 또는 1:3으로 각각 비표지된 경쟁자의 1 μM-1 pM 또는 1 μM-4 nM 또는 1 μM-17 pM의 농도 범위를 제공함)와 함께 배양하였다. 플레이트를 제거 가능한 밀봉 테이프(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 덮은 RT에서 4.5시간 동안 배양하였다.
포화 결합 분석에 대해 설명된 대로 여과 및 판독을 수행하였다. [3H]-표지된 리간드 결합[CMP 중]은 증가하는 경쟁자 농도에 대해 플로팅되었고, 데이터 포인트는 IC50 및 Ki 값을 계산하기 위해 비선형 회귀 분석을 사용하여 피팅되었다(GraphPad Software, Inc., Version 7.03, La Jolla (CA), USA). 초음파 처리된 재조합 αSYN 피브릴을 사용한 경쟁적 결합 분석에서 Ki 값의 계산은 화합물 1 및 화합물 2에 대해 각각 0.6nM 및 0.2nM의 KD 값을 기반으로 수행되었다.
피브릴-결합 포화 분석은 KD 값을 제공한다. 이 분석은 직접 방사성 표지된 화합물(예를 들어, 3H 표지)로 수행된다. KD 값은 표 3a 및 표 3b에 나와 있다. 포화 결합 분석은 각각 재조합 인간 알파-시누클레인, Aβ1-42 및 tau46에서 생성된 피브릴형 응집체를 표적 구조로 사용하여 수행되었다.
결과는 알파-시누클레인 피브릴에 대한 높은 친화도를 나타낸다. 화합물 1, 화합물 2 및 화합물 12는 10 nM 미만의 KD 값에서 매우 높은 친화도를 나타내었다. 화합물 1 및 화합물 2는 또한 Abeta 및 tau46 피브릴에 대한 결합과 관련하여 테스트되었으며, 탁월한 선택성이 우수함을 나타내었고, 이것은 응집된 알파-시누클레인의 진단적 검출을 위한 이들 화합물의 적합성을 입증하였다.
[표 3a]: 프로토콜 2a에 따른 포화 분석
Figure pct00032
[표 3b]: 프로토콜 2b에 따른 포화 분석
Figure pct00033
피브릴 경쟁 분석은 Ki 값을 제공한다. Ki는 기준 화합물의 50%를 대체하는 데 필요한 비방사성 테스트 화합물(경쟁자 리간드)의 농도를 나타내는 정량적 척도이며, 이 경우 표적 구조(1 nM)와 결합하는 [3H]-화합물 1 (1 nM) 또는 [3H]-화합물 2 (1 nM)은, 본 경우의 재조합 알파-시누클레인 및 tau46 피브릴이다. 이 분석은 비방사성 리간드의 스크리닝에 적합하다. 테스트된 화합물에 대해 얻은 Ki 값은 표 4a, 표 4b 및 표 5에 나타내었다.
[표 4a]: 프로토콜 3a에 따른 경쟁 분석(기준 리간드 [3H]-화합물 1 (1nM))
Figure pct00034
*반복
[표 4b]: 프로토콜 3b에 따른 경쟁 분석(기준 리간드 [3H]-화합물 1 (1nM))
Figure pct00035
[표 5]: 프로토콜 3b에 따른 경쟁 분석(기준 리간드 [3H]-화합물 2 (1nM))
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
다양한 경쟁 분석 결과는 테스트된 화합물에 대한 알파-시누클레인 피브릴에 대한 높은 결합 친화도를 나타낸다(낮은 Ki 값은 더 높은 결합 친화도를 나타냄). 화합물 1에 대한 경쟁 분석의 경우(표 4a), 알파-시누클레인 및 tau46 피브릴에 대한 유사한 Ki 값은 화합물 1과 유사한 선택성을 나타내며, 알파-시누클레인 피브릴에 대한 것보다 tau46 피브릴에 대한 Ki 값이 더 높은 화합물에 대하여, 데이터는 추가로 개선된 선택성을 제안한다.
추가적으로, 화합물 63, 64 및 65는 페닐 고리 중 하나에 질소 원자를 포함하는 해당 화합물과 직접 비교하여 테스트되었다. 표 6에서 화합물 1에 대한 Ki 값은 0.4nM를 얻은 반면, 화합물 65(페닐 고리에 질소 원자가 없음)에 대한 Ki 값은 훨씬 더 높아(1.9nM) 화합물 1에 대한 결합 친화도가 상당히 개선되었음을 나타내었다. Ki 값을 기반으로 한 결합 특성의 분석은 N-함유 화합물에 대해 상당히 개선된 결합 친화도를 나타내었다. 기준 리간드 [3H]-화합물 1 (1nM)을 사용한 경쟁적 결합 분석에서 테스트된 화합물에 대해 수득한 Ki 값은 표 6에 나타내었다.
[표 6]: 프로토콜 3b에 따른 경쟁 분석(기준 리간드 [3H]-화합물 1 (1nM))
Figure pct00040
* 초음파 처리된 알파-시누클레인 피브릴
실시예 3: 세포 배양에서의 치료학적 효과
잠재적인 치료학적으로 유용한 효과를 확인하기 위하여, 화합물은 H4 세포에서 응집된 알파-시누클레인 의존성 독성의 2가지 세포 모델에서 테스트되었다. 이러한 세포 모델은 알파-시누클레인 헤미-비너스 융합 구조(hemi-Venus fusion constructs)(V1S+SV2) 또는 전장 알파-시누클레인의 유도성 과발현을 허용한다(상기 모델은 『Bartels M, Weckbecker D, Kuhn PH, Ryazanov S, Leonov A, Griesinger C, Lichtenthaler SF, Botzel K, Giese A: Iron-mediated aggregation and toxicity in a novel neuronal cell culture model with inducible alpha-synuclein expression, Sci. Rep. 2019 Jun 24; 9(1):9100』에 상세하게 기재되었다). 또한, DMSO 및 FeCl3의 첨가는 세포독성 증가와 관련된 알파-시누클레인의 응집을 촉진시킨다. 세포 배양 분석은 어떤 화합물이 가장 유망한 효과를 나타내어 치료학적으로 유용할 수 있는지에 대한 정보를 수득하기 위하여, 세포 수의 변화와 세포 사멸을 나타내는 응축된 핵의 분율 변화를 측정함으로써 이러한 효과를 사용하였다.
데이터는 하기 표 7에 요약되어 있다. 이들 실험에서, 세포는 양성 대조군으로서 10 μM anle138c의 존재 하에 100 μM FeCl3 및 0.75% DMSO로 화합물 1 내지 화합물 19(10μM)를, 또는 음성 대조군으로 DMSO로 배양하였다. 48시간 후, 세포를 OPERA 고처리량 이미징 시스템으로 이미지화하였고, Acapella 소프트웨어(Perkin Elmer)를 사용하여 분석하였다. 표는 DMSO 대조군에 대한 세포 수의 변화와 응축된 핵을 갖는 세포(즉, 세포사멸 세포)의 분율 변화를 나타내었다. 응축된 핵 분율의 감소(세포 수에서의 강력한 감소가 없는 경우)는 유익한 치료학적 효과를 나타내었다.
[표 7]: 세포 모델에서의 치료학적 화합물 효과
Figure pct00041
실시예 4: [11C]-표지 화합물 1 및 화합물 2의 생체 내 생체분포(In vivo biodistribution)
[11C]-표지 화합물 1 및 화합물 2를 각각 마우스의 꼬리 정맥에 정맥주사하였다. 그런 다음, 마우스를 작은 동물 PET 기기에서 이미징하였다. 2개의 화합물 모두에서, SUV 값>1.5로 우수한 혈액-뇌-장벽 침투(blood-brain-barrier penetration)가 관찰되었다. 또한, 뇌에서 빠른 워시아웃(washout)이 발견되었다. [11C]-표지 화합물 1 및 화합물 2의 클리어런스 반감기는 각각 12분 및 9분이었다.
실시예 5: 인간의 뇌 조직을 이용한 오토래디오그래피
오토래디오그래피는 삼중수소 화합물 1과 루이 소체 치매를 앓는 환자의 대상회(cingulate gyrus)에서 유래한 뇌 조직을 사용하여 동결된 뇌 조직의 조직학적 슬라이스에 대해 수행되었다. 조직 배양 후 세척 단계를 위해 농도 3nM에서의 [3H]-화합물 1을 사용할 경우, 응집된 알파-시누클레인의 알려진 분포와 동일한 패턴인 회백질에 대한 우선적인 결합이 관찰될 수 있다(도 1, 왼쪽 패널). 특이적 결합이 과량의 삼중수소화되지 않은(즉, "콜드(cold)") 화합물 1에 의해 차단되는 경우, 뇌 조직에 대한 화합물 1의 매우 낮은 비특이적 결합이 보이지 않는다(도 1, 오른쪽 패널).
이러한 발견은 화합물 1이 인간 시누클레인병증 환자에게 존재하는 병리학적으로 응집된 알파-시누클레인에 특이적이고 높은 친화도로 결합하여 응집된 알파-시누클레인의 진단학적 검출을 허용한다는 것을 나타낸다.

Claims (20)

  1. 하기 일반식 Ia, Ib, IIa 또는 IIb로 표시되는 화합물
    Figure pct00042

    또는 그의 프로드럭(prodrug), 용매 화합물(solvate) 또는 염으로서,
    여기서,
    X 1 , X 2 , 및 X 3 은 CR2, N 및 NR1로부터 독립적으로 선택되고, 단 X1, X2, 및 X3 중 적어도 2개는 N 또는 NR1이고;
    Y 1 , Y 2 , Y 3 , Y 4 , Y 5 , Y 6 , Y 7 및 Y 8 은 CR3 및 N로부터 독립적으로 선택되고, 단 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 적어도 하나는 N이고;
    R 1 은 수소, C1-4 알킬 및 -(CH2)-O-P(=O)(OR)(OR)로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있고;
    R 2 는 수소, 할로겐, 및 C1-4 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있고;
    R은 수소 또는 양이온이고;
    R 3 은 수소, 할로겐, C1-4 알킬, OH 및 C1-4 알콕시이고, 여기서 C1-4 알킬 및 C1-4 알콕시는 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있고;
    R 4 및 R 5 는 H 및 C1-4 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있거나, 또는 여기서 R4 및 R5는 이들이 결합된 질소 원자와 함께, R4 및 R5가 결합된 질소 원자 이외에 O 및 N으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는, 4-원(membered) 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리를 형성하며, 여기서 4-원 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리는 하나 이상의 R6으로 선택적으로 치환될 수 있고;
    R 6 은 할로겐, C1-4 알킬, OH 및 C1-4 알콕시로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 C1-4 알킬 및 C1-4 알콕시는 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있고;
    Hal은 할로겐인, 화합물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    Figure pct00043

    여기서 R1 및 R2는 청구항 1에서 정의된 것인, 화합물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    Figure pct00044

    여기서 R1 및 R2는 청구항 1에서 정의된 것인, 화합물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 1개 또는 2개 또는 3개가 N인, 화합물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    식 Ia 또는 식 Ib에서, Y1은 N이고, Y3, Y4, 및 Y6 중 적어도 하나는 N이거나; 또는
    식 IIa 또는 식 IIb에서, Y1은 N이고, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8 중 적어도 하나는 N인, 화합물.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    Y1은 N이고, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8은 CR3이고, 바람직하게는 Y1은 N이고, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 및 Y8은 CH인, 화합물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    R2는 H인, 화합물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 R4 및 R5 중 적어도 하나가 C1-4 알킬이고, 여기서 C1-4 알킬은 하나 이상의 할로겐으로 선택적으로 치환될 수 있는, 화합물.
  9. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 R4 및 R5는 이들이 결합된 질소 원자와 함께, R4 및 R5가 결합된 질소 원자 이외에 O 및 N으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는, 4-원 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리를 형성하며, 여기서 4-원 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리는 하나 이상의 R6으로 선택적으로 치환될 수 있는, 화합물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    여기서 4-원 내지 6-원 포화 헤테로시클릭 고리가 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐 및 피페라지닐로부터 선택되고, 여기서 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐 및 피페라지닐은 하나 이상의 R6으로 선택적으로 치환될 수 있는, 화합물.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 프로드럭, 용매 화합물 또는 염으로서, 여기서 화합물이 검출 가능하게 표지되고, 바람직하게는 여기서 화합물은 18F, 11C, 125I, 123I, 131I, 77Br 및 76Br로 검출 가능하게 표지되고, 보다 바람직하게는 여기서 화합물은 18F 또는 11C로 검출 가능하게 표지되는, 화합물.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 정의된 화합물 또는 그의 용매 화합물 또는 염 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 진단 조성물.
  13. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 정의된 화합물 또는 그의 프로드럭, 용매 화합물 또는 염 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 알파-시누클레인 응집(alpha-synuclein aggregation)과 관련된 질병의 진단에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 프로드럭, 용매 화합물 또는 염.
  15. 알파-시누클레인 응집과 관련된 질병의 치료에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 프로드럭, 용매 화합물 또는 염.
  16. 청구항 14 또는 청구항 15에 있어서,
    여기서 알파-시누클레인 응집과 관련된 질병이 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이 소체 치매(dementia with Lewy bodies) 및 다계통위축증(multiple system atrophy)으로부터 선택되는 용도의 화합물.
  17. 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 알파-시누클레인 응집을 억제하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 프로드럭, 용매 화합물 또는 염의 용도.
  18. 알파-시누클레인 응집체의 이미징(imaging)에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 용매 화합물 또는 염.
  19. 응집된 알파-시누클레인의 침착물(deposits)을 이미징하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
    (i) 청구항 11에 기재된 검출 가능하게 표지된 화합물의 검출 가능한 양을 대상(subject)에 도입하는 단계;
    (ii) 화합물이 응집된 알파-시누클레인과 결합되기에(associated) 충분한 시간을 허용하는 단계; 및
    (iii) 응집된 알파-시누클레인과 결합된 화합물을 검출하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  20. 청구항 11에 기재된 검출 가능하게 표지된 화합물 또는 그의 용매 화합물 또는 염을 제조하기 위한 키트(kit)로서,
    여기서 키트는 반응 시 청구항 11에 정의된 화합물 또는 그의 용매 화합물 또는 염을 형성하는 적어도 2개의 전구체 화합물을 포함하는, 키트.
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