ES2327521T3 - Procedimientos de prevencion, tratamiento y diagnostico de trastornos de la agregacion de proteinas. - Google Patents

Abstract

Scyllo-inositol para su utilización en el tratamiento o la prevención de un estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico asociado a un trastorno en la agregación o el plegado de proteínas, o la formación, deposición, acumulación o persistencia de amiloide.

Description

Procedimientos de prevención, tratamiento y diagnóstico de trastornos de la agregación de proteínas.

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de las solicitudes provisionales US con números de serie 60/451.363, 60/520.958 y 60/523.534, presentadas el 27 de febrero de 2003, el 17 de noviembre de 2003 y el 19 de noviembre de 2003, respectivamente.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a scyllo-inositol para su utilización en el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis, por ejemplo inhibiendo y reduciendo la formación de fibrilla amiloide en la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis.

Descripción de la técnica relacionada

La enfermedad de Alzheimer está caracterizada neuropatológicamente porque presenta unos depósitos de amiloide, marañas neurofibrilares y pérdida neuronal selectiva. El componente principal de los depósitos de amiloide es \beta-amiloide (A\beta), un péptido de 39-43 residuos. Las formas solubles de A\beta generadas a partir de la escisión de la proteína precursora amiloide son productos normales del metabolismo. La importancia de los residuos 1-42 (A\beta42) en la enfermedad de Alzheimer se puso de relieve con el descubrimiento de que las mutaciones en el codón 717 del gen de la proteína precursora amiloide, los genes de presenilina 1 y presenilina 2 dan como resultado un aumento de la producción de A\beta42 con respecto a A\beta1-40. Estos resultados, junto con la presencia de A\beta42 tanto en placas maduras como amiloide difuso condujeron a la hipótesis de que esta especie más amiloidogénica puede ser el elemento crítico en la formación de placas. Esta hipótesis estaba apoyada por el hecho de que la deposición de A\beta42 precede a la de A\beta40 en el síndrome de Down en mutaciones de PS1 y en la hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis.

Muchos estudios in vitro han demostrado que el A\beta puede ser neurotóxico o potenciar la susceptibilidad de las neuronas a agresiones excitotóxicas, metabólicas u oxidativas. Inicialmente, se pensó que sólo la forma de fibrilla de A era tóxica para las neuronas, pero una caracterización más concienzuda de las estructuras de A\beta demostró que los dímeros y los pequeños agregados de A\beta son también neurotóxicos. Estos datos sugirieron que la prevención de la oligomerización de A\beta sería una estrategia probable para prevenir la neurodegeneración relacionada con la EA. Varios estudios han demostrado que la neurotoxicidad inducida por A\beta in vitro puede suprimirse mediante compuestos que pueden aumentar la resistencia neuronal seleccionando como diana rutas celulares implicadas en la apoptosis, el bloqueo de rutas aguas abajo tras la inducción por A\beta de vías destructivas, o el bloqueo de la oligomerización de A\beta y finalmente la formación de fibrillas. El sitio en el que actúa A\beta para inducir neurotoxicidad no se ha dilucidado todavía pero sus efectos tóxicos se han bloqueado mediante una variedad de agentes dispares.

El acoplamiento de fibrillas de A\beta a membranas de células gliales y neuronales puede ser una etapa temprana e intermedia durante la evolución de la EA. La formación de placas de amiloide, así como la neurotoxicidad e inflamación, pueden ser consecuencias directas o indirectas de la interacción de A con moléculas que contienen restos de azúcar. Estudios previos han demostrado que la interacción de A\beta con glicosaminoglicanos da como resultado la agregación de A\beta, añadiéndose posiblemente a su insolubilidad y persistencia de placas. Los glicosaminoglicanos se han implicado también en la toxicidad neuronal y la activación de la microglia. Alternativamente, la interacción con glicolípidos tales como gangliósidos da como resultado la estabilización y prevención de la formación de fibrillas de A\beta, así como, el sitio de producción de A\beta. La familia de fosfatidilinositoles, por otra parte, da como resultado la aceleración de la formación de fibrillas. El grupo principal del fosfatidilinositol es el mio-inositol, un azúcar sencillo que se produce de manera natural implicado en la biosíntesis de lípidos, la transducción de señales y el control de la osmolaridad.

Asimismo, es de interés que una variedad de otras enfermedades humanas demuestran también la deposición de amiloide y habitualmente implican a órganos sistémicos (es decir, órganos o tejidos que se encuentran fuera del sistema nervioso central), con la acumulación de amiloide conduciendo a fallo o disfunción orgánica. En la enfermedad de Alzheimer y enfermedades amiloides "sistémicas", no hay actualmente cura ni tratamiento eficaz, y habitualmente el paciente muere en el plazo de 3 a 10 años desde la aparición de la enfermedad.

La patente US nº 4.847.082 da a conocer la utilización de ácido fítico, una sal de fitato, un isómero o hidrolizado de ácido fítico para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. También da a conocer que los isómeros del ácido fítico o sal de fitato comprenden las conformaciones de mio-inositol-hexakisfosfato, scyllo-inositol-hexakisfosfato, D-quiro-inositol-hexakisfosfato, L-quiro-inositol-hexakisfosfato, neo-inositol-hexakisfosfato y muco-inositol-hexakisfosfato. El ácido fítico es inositol-hexakisfosfato (IP6).

La patente US nº 5.112.814 da a conocer la utilización de ácido fítico e isómeros del mismo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Como en el caso de la patente US nº 4.847.082, los isómeros del ácido fítico dados a conocer en esta patente conservan los seis grupos fosfato en el azúcar inositol de seis carbonos.

Es de interés que en publicaciones posteriores se investigó la capacidad de inositol-monofosfato, inositol-1,4-bisfosfato e inositol-1,4,5-trifosfato para inhibir la fibrilogénesis del péptido beta-amiloide, y se encontró que no eran eficaces (J. Mol. Biol. 278: 183-194, 1998).

Barak et al. dan a conocer la utilización de inositol para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA). (Prog Neuro-psychopamacol & Biol Psychiat. 20: 729-735, 2000). Sin embargo, esta referencia no da a conocer la utilización de isómeros del inositol. Los pacientes tratados con inositol no mostraron ninguna diferencia significativa en las puntuaciones de la función cognitiva global (índice CAMCOG) entre inositol y placebo (dextrosa) en pacientes con EA mientras que dos subescalas específicas del índice CAMCOG sí mostraron mejora significativa (orientación y lenguaje).

Levine J. revisa el artículo de Barak et al. anterior y establece específicamente que el tratamiento con inositol no es beneficioso en la EA o disfunción cognitiva inducida por ECT (Eur Neuropsychoparm. 1997; 7,147-155, 1997).

Colodny L, et al. sugieren estudios adicionales para determinar la utilidad del inositol en la enfermedad de Alzheimer haciendo referencia al artículo de Barak et al. anterior y por tanto no da a conocer ni sugiere tal utilización para los isómeros del inositol (Altern Med Rev 3(6):432-47, 1998).

McLaurin et al. dieron a conocer que el mio-inositol estabiliza una pequeña micela de A\beta42 (J. Mol. Biol. 278,183-194, 1998). Además, McLaurin et al. dan a conocer que el epi- y scyllo- pero no el quiro-inositol podían inducir una transición estructural desde una estructural al azar hasta una en \beta en A\beta42 (J Biol Chem. Jun 16; 275 (24):18495-502, 2000; y J Struct Biol 130: 259-270, 2000). Alternativamente, ninguno de los estereoisómeros pudo inducir una transición estructural en A\beta40. La microscopía electrónica mostró que el inositol estabiliza pequeños agregados de A\beta42. Estas referencias también dan a conocer que las interacciones inositol-A\beta dan como resultado un complejo que no es tóxico para células PC-12 diferenciadas mediante el factor de crecimiento nervioso y cultivos neuronales humanos primarios.

Se ha llevado a cabo mucho trabajo en la enfermedad de Alzheimer, pero poco se sabe de manera convencional sobre compuestos o agentes para regímenes terapéuticos para detener o revertir la formación, deposición, acumulación y/o persistencia de amiloide que se produce en la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis.

Por tanto, se necesitan urgentemente nuevos compuestos o agentes para regímenes terapéuticos para detener o revertir la formación, deposición, acumulación y/o persistencia de amiloide que se produce en la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona scyllo-inositol para su utilización en el tratamiento o la prevención de un estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico asociado a un trastorno en la agregación o el plegado de proteínas, o formación, deposición, acumulación o persistencia de amiloide.

La presente invención proporciona también scyllo-inositol para su utilización en el diagnóstico de la presencia de proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide en un sujeto, comprendiendo el procedimiento de diagnóstico: (a) administrar a dicho sujeto un scyllo-inositol radiactivo o scyllo-inositol marcado con una sustancia que emite una señal detectable en una cantidad suficiente y en condiciones que permiten la unión de dicho compuesto a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrillas o amiloide, si están presentes; y (b) detectar la radiactividad o la señal del scyllo-inositol unido a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrillas o amiloide, diagnosticando así la presencia de proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide en dicho sujeto.

La presente invención proporciona además un procedimiento de diagnóstico de la presencia de proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide en un sujeto que comprende: (a) recoger una muestra de dicho sujeto; (b) poner en contacto dicha muestra con un scyllo-inositol radiactivo o scyllo-inositol marcado con una sustancia que emite una señal detectable en condiciones que permiten la unión de dicho scyllo-inositol a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide si está presente; y (c) detectar la radiactividad o la señal del scyllo-inositol unido a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrillas o amiloide, diagnosticando así la presencia de proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide en dicho sujeto.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A muestra la estructura de mio-, epi- y scyllo-inositol mientras que las figuras 1B-1H muestran la versión de memoria de referencia espacial de la prueba de laberinto de agua de Morris en ratones TgCRND8. Los tratamientos con mio-inositol no alteraron la función cognitiva (1B). A los 6 meses de edad, los TgCRND8 no tratados (n=10) muestran una disfunción cognitiva en relación con controles no-Tg y ratones tratados con epi- (1C) y scyllo-inositol (1D) (n=10 por grupo, p <0,02 no tratados frente a tratados). El rendimiento de ratones TgCRND8 tratados con epi-inositol se mantuvo alterado con respecto a compañeros de camada no-Tg (1E) mientras que el rendimiento de TgCRND8 tratados con scyllo-inositol se aproximó al de compañeros de camada no-Tg (1F). El comportamiento de compañeros de camada no-Tg no estaba afectado por el tratamiento o bien con epi- (1G) o bien con scyllo-inositol (1H). Las barras verticales representan el EEM.

Las figuras 2A-2I muestran, a los 6 meses de edad, la carga de placas y astrogliosis en ratones TgCRND8 tratados con epi- y scyllo-inositol. Los animales control presentan una astrogliosis y carga de placas altas en el hipocampo (2A) y la corteza cerebral (2B). Un mayor aumento demuestra que la activación astrocítica no sólo está asociada a la carga de placas (2C). El tratamiento con epi-inositol presenta un efecto modesto sobre la carga de amiloide con una disminución en la astrogliosis (2D, 2E y 2F). El tratamiento con scyllo-inositol redujo significativamente la carga de amiloide y la gliosis (2G, 2H y 2I). Un mayor aumento ilustra el tamaño de placa medio más pequeño en ratones tratados con scyllo-inositol (2I). Los astrocitos se marcaron utilizando anticuerpo anti-GFAP y se identificó la carga de placas utilizando anticuerpo anti-A\beta. Barra de escala de 450 micras (A, B, D, E, G, H) y 94 micras (C, F, I).

Las figuras 3A-3D muestran que las especies de A\beta, 1-42, 1-40 y 1-38, en ratones TgCRND8 tratados y control, eran indistinguibles (3A) como lo era el grado de procesamiento de APP (3B). Se cuantificó la carga de amiloide vascular sobre secciones sagitales en serie en ratones TgCRND8 tratados y no tratados. Los ratones TgCRND8 presentan una carga de amiloide vascular significativa que está asociada a vasos de tamaño medio y pequeño, la carga se reduce en ratones TgCRND8 tratados con scyllo-inositol (3A). El tratamiento con scyllo-inositol redujo significativamente la carga vascular total en comparación con ratones TgCRND8 tratados con epi-inositol y no tratados (3C). El scyllo-inositol reduce la deposición de placas tal como se ilustra mediante la reducción significativa en el tamaño de placa medio (3D).

La figura 4 muestra el efecto del agua sobre la función cognitiva de ratones TgCRND8 y no-Tg utilizando la versión de memoria de referencia espacial del laberinto de agua de Morris en un modelo de ensayo de tres días.

La figura 5 muestra el efecto de scyllo-inositol sobre la función cognitiva de ratones TgCRND8 y no-Tg utilizando la versión de memoria de referencia espacial del laberinto de agua de Morris en un modelo de ensayo de tres días.

La figura 6 muestra el efecto de epi-inositol sobre la función cognitiva de ratones TgCRND8 y no-Tg utilizando la versión de memoria de referencia espacial del laberinto de agua de Morris en un modelo de ensayo de tres días.

La figura 7 muestra el efecto de mio-inositol sobre la función cognitiva de ratones TgCRND8 y no-Tg utilizando la versión de memoria de referencia espacial del laberinto de agua de Morris en un modelo de ensayo de tres días.

La figura 8 muestra el efecto de scyllo-inositol, epi-inositol y mio-inositol sobre la función cognitiva de TgCRND8 (fase de aprendizaje y prueba de memoria) y en comparación con ratones de tipo natural utilizando la versión de memoria de referencia espacial del laberinto de agua de Morris en un modelo de ensayo de tres días.

La figura 9 muestra el porcentaje de área del cerebro cubierta con placas en ratones TgCRND8 no tratados frente a ratones tratados con scyllo-inositol, epi-inositol o mio-inositol.

Las figuras 10A y 10B muestran las tasas de supervivencia de ratones TgCRND8 tratados con agua frente a epi-inositol o mio-inositol (10A) o frente a scyllo-inositol (10B).

Las figuras 11A-D muestran los resultados de la versión de memoria de referencia espacial de la prueba del laberinto de agua de Morris en ratones TgCRND8 de 6 meses de edad no tratados o tratados con manitol (A, B). Los ratones TgCRND8 tratados con manitol no eran significativamente diferentes de los ratones TgCRND8 no tratados (p= 0,89; A). El rendimiento de ratones TgCRND8 tratados con manitol era significativamente diferente de compañeros de camada no-Tg tratados con manitol (p=0,05; B). Se analizó la carga de placas a los 6 meses de edad utilizando análisis de imágenes cuantitativos (C). Los ratones TgCRND8 tratados con manitol eran indistinguibles de los ratones TgCRND8 no tratados cuando se utilizó el recuento de placas como una medición de la carga de placas total (p=0,87). Las barras verticales representan el EEM. Gráficas de supervivencia acumulativa de Kaplan-Meier para ratones TgCRND8 tratados y no tratados con manitol (D). Las dos cohortes de animales, n=35 por grupo, no eran significativamente diferentes tal como se determinó mediante la prueba estadística de Tarone-Ware, p=0,87.

Las figuras 12A y B muestran los resultados de una prueba de memoria de referencia espacial en los estudios de tratamiento cuando se realizó en un modelo de ensayo de tres días. El rendimiento de ratones TgCRND8 tratados con scyllo-inositol era comparable al de compañeros de camada no-Tg tratados con scyllo-inositol (p=0,38; A). En concordancia, los ratones TgCRND8 tratados con scyllo-inositol seguían siendo indistinguibles de los compañeros de camada no-Tg tras dos meses de tratamiento (p=0,67; B).

Las figuras 13A y B muestran los niveles de A\beta dentro del SNC tras la administración de diversas dosis de scyllo-inositol que se administraron una vez al día durante un mes a ratones Tg CRND8 de cinco meses de edad. Se redujeron los niveles de A\beta42 soluble a todas las dosis y eran significativamente diferentes de los controles no tratados (A). En cambio, A\beta42 insoluble no era significativamente diferente en todas las condiciones (B). Las barras verticales representan el EEM.

Figura 14. Se analizaron ratones TgCRND8 a los que se administraron diversas dosis de scyllo-inositol una vez al día durante un mes para determinar los niveles de A\beta40 cerebral. No se detectaron diferencias en los niveles de A\beta40 soluble (A) e insoluble (B) de ratones TGCRND88 no tratados y tratados con scyllo-inositol a todas las dosis examinadas.

La figura 15 muestra el rendimiento cognitivo de ratones TgCRND8 tratados con alo-inositol de 6 meses de edad en comparación con el de sus compañeros de camada no transgénicos.

La figura 16A-D muestra que a los 2 meses de edad, la carga de placas en ratones TgPS1 x APP disminuye en ratones tratados con scyllo-inositol. Los animales control presentan una carga de placas alta en el hipocampo (A) y la corteza cerebral (B). El tratamiento con scyllo-inositol redujo significativamente la carga de amiloide (C, D). La carga de placas se identificó utilizando anticuerpo anti-A\beta (marrón). Barra de escala de 300 \mum.

Las figuras 17A-C muestran la cuantificación de la carga de placas en ratones TgPS1xAPP tras el tratamiento con scyllo-inositol. El porcentaje de área del cerebro cubierta con placas (A), el tamaño de placa medio (B) y el recuento de placas (C) se redujeron significativamente. Las barras verticales son el EEM.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención da a conocer propiedades nuevas, impredecibles e inesperadas de ciertos estereoisómeros del inositol en relación con el tratamiento de trastornos relacionados con el amiloide tales como la enfermedad de Alzheimer.

Se ha descubierto sorprendentemente que ciertos estereoisómeros del inositol y compuestos relacionados bloquean el deterioro cognitivo progresivo inducido por A\beta y la patología de placas de amiloide cerebrales, y mejoran la supervivencia cuando se administran a un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer humana durante la fase incipiente de la deposición de A\beta.

Tal como se dio a conocer anteriormente, los datos previos sugerían que algunos, pero no todos los estereoisómeros del inositol podrían presentar un efecto sobre la agregación del amiloide en células neuronales en cultivo in vitro (McLaurin et al., J. Biol. Chem. 275 (24): 18495-18502 (2000)). Esas observaciones no proporcionaban ningún procedimiento para predecir cuál, si es que había alguno, de los estereoisómeros estudiados (mio-, epi-, scyllo- y quiro-inositoles) presentaba tales efectos, ni si algún otro estereoisómero presentaba tales efectos. Además, esos estudios no pudieron predecir si algún estereoisómero del inositol presentaba efectos sobre la deposición de amiloide, los defectos cognitivos o la duración de la vida in vivo. La presente invención describe los resultados impredecibles de que sólo ciertos estereoisómeros del inositol, en particular scyllo- y alo-inositoles reducen la carga de placas de amiloide, mejoran la cognición y aumentan la duración de la vida en modelos animales de trastornos relacionados con el amiloide, mientras que otros estudiados no presentaban tales efectos.

Los estudios previos también sugerían que sólo ciertos estereoisómeros del inositol (por ejemplo, epi- y scyllo-inositoles) podrían inhibir la agregación de amiloide de novo in vitro. La presente invención describe los resultados inesperados de que el scyllo-inositol inhibe la deposición de amiloide cerebral ya establecida, y lo hace en el cerebro vivo. Esto no está implícito en los datos in vitro publicados anteriormente que consideraban sólo ciertos tipos de células neuronales en cultivo, no los complejos tejidos del cerebro vivo, y sólo sugerían que los inositoles podrían inhibir la agregación de novo, no presentando de ese modo relevancia para la enfermedad establecida.

Los datos in vitro previos también sugerían que la administración de epi- y scyllo-inositol afecta a los niveles de amiloide A\beta40 así como a los niveles de A\beta42. El estudio de dosificación in vivo de la presente invención reveló el resultado impredecible de que la administración de alo- o scyllo-inositol reducía específicamente los niveles de A\beta42, mientras que los niveles de A\beta42 insoluble y de A\beta40 o bien soluble o bien insoluble permanecían inalterados.

La observación de la presente invención que muestra cambios en la inflamación y actividad glial es nueva y sorprendente, y no podía haberse predicho mediante los datos in vitro anteriormente publicados.

La observación de la presente invención que demuestra que el scyllo-inositol mejora la duración de la vida en animales modelo transgénicos es también nueva y sorprendente, dado que no se había mostrado anteriormente ningún fármaco para la enfermedad de Alzheimer que aumentase la supervivencia y prolongase la duración de la vida in vivo.

Incluso cuando se administra tras haberse establecido bien la patología amiloide durante varios meses, el scyllo-inositol revierte de manera eficaz la acumulación de A\beta cerebral y la patología amiloide.

Por consiguiente, se encuentra que el scyllo-inositol es útil en el tratamiento o la prevención en un sujeto de un estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico asociado a un trastorno en la agregación o el plegado de proteínas, o formación, deposición, acumulación o persistencia de amiloide. Se encuentra que el scyllo-inositol también es útil en la prevención del plegado anómalo de proteínas, la agregación anómala de proteínas, la formación, deposición, acumulación o persistencia de amiloide, o interacciones amiloide-lípidos así como para provocar la disociación de proteínas agregadas de manera anómala y/o disolver o romper fibrillas de amiloide o amiloide predepositados o preformados en un sujeto.

Preferentemente, el estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico da como resultado la deposición de proteínas, fragmentos de proteínas y péptidos en láminas plegadas en beta y/o fibrillas y/o agregados. Más preferentemente, el estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico se selecciona de entre el grupo constituido por: enfermedad de Alzheimer, formas seniles y preseniles; angiopatía amiloide; disfunción cognitiva leve; demencia relacionada con la enfermedad de Alzheimer; tauopatía; \alpha-sinucleinopatía; enfermedad de Parkinson; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de motoneuronas; paraplejía espástica; enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa, ataxia de Freidrich; enfermedades neurodegenerativas asociadas a agregados intracelulares y/o intraneuronales de proteínas con poliglutamina, polialanina u otras repeticiones que surgen de expansiones patológicas de elementos de tri- o tetra-nucleótidos con genes correspondientes; enfermedades cerebrovasculares; síndrome de Down; traumatismo craneal con acumulación postraumática de péptido beta-amiloide; enfermedad relacionada con priones; demencia británica familiar; demencia danesa familiar; demencia presenil con ataxia espástica; angiopatía amiloide cerebral, tipo británico; demencia presenil con angiopatía amiloide cerebral con ataxia espástica, tipo danés; encefalopatía familiar con cuerpos de inclusión de neuroserpina (FENIB); polineuropatía amiloide; miositis por cuerpos de inclusión debida a péptido beta-amiloide; amiloidosis de tipo finés y familiar; amiloidosis sistémica asociada a mieloma múltiple; fiebre mediterránea familiar; inflamaciones e infecciones crónicas; y diabetes mellitus tipo II asociada a polipéptido amiloide de los islotes (IAPP).

Asimismo, preferentemente, las demencias relacionadas con la enfermedad de Alzheimer son demencia por Alzheimer o vascular y tauopatía seleccionadas de entre el grupo constituido por demencia con gránulos argirófilos, degeneración corticobasal, demencia pugilística, marañas neurofibrilares difusas con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo, enfermedad relacionada con priones, enfermedad de Hallervorden-Spatz, distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de motoneuronas no de Guam con marañas neurofibrilares, enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral de proteína priónica, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda y demencia sólo por marañas.

Asimismo, preferentemente, la \alpha-sinucleinopatía se selecciona de entre el grupo constituido por demencia con cuerpos de Lewy, atrofia sistémica múltiple con inclusiones citoplasmáticas gliales, síndrome de Shy-Drager, degeneración estriatonigral, atrofia olivopontocerebelosa, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, tipo I, disfunción olfativa y esclerosis lateral amiotrófica.

De nuevo preferentemente, la enfermedad de motoneuronas está asociada a filamentos y agregados de neurofilamentos y/o proteínas superóxido dismutasa, la paraplejía espástica está asociada a una función defectuosa de las chaperonas y/o las proteínas A triples y la ataxia espinocerebelosa es DRPLA o enfermedad de Machado-Joseph.

Asimismo, preferentemente, la enfermedad relacionada con priones se selecciona de entre el grupo constituido por enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker y variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y la polineuropatía amiloide es polineuropatía amiloide senil o amiloidosis sistémica.

Más preferentemente, el estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico es enfermedad de Parkinson incluyendo los tipos familiar y no familiar. Lo más preferentemente, dicho estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico es enfermedad de Alzheimer.

Preferentemente, se administra scyllo-inositol al sujeto a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 g por kg, preferentemente de 1 mg a aproximadamente 200 mg por kg, más preferentemente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg por kg y lo más preferentemente de aproximadamente 30 mg a 70 mg por kg del peso de dicho sujeto. La administración puede lograrse mediante una variedad de vías tales como por vía oral (pastilla oral, suspensión o líquido oral), por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intradérmica, por vía transcutánea, por vía subcutánea, por vía intranasal, por vía sublingual, mediante supositorio rectal o inhalación, siendo la más preferida la administración oral. La administración de scyllo-inositol puede emprenderse a diversos intervalos tales como una vez al día, dos veces al día, una vez a la semana, una vez al mes o de manera continua.

Preferentemente, se administra scyllo-inositol en combinación con otros tratamientos tales como inhibidores de beta-secretasa, inhibidores de gamma-secretasa (específicos o no específicos de APP), inhibidores de épsilon-secretasa (específicos o no específicos de APP), otros inhibidores de la agregación en lámina beta/fibrilogénesis/formación de ADDL (por ejemplo Alzhemed), antagonistas de NMDA (por ejemplo memantina), compuestos antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo Ibuprofeno, Celebrex), antioxidantes (por ejemplo vitamina E), hormonas (por ejemplo estrógenos), nutrientes y complementos alimenticios (por ejemplo Gingko biloba); inhibidores de acetilcolinesterasa (por ejemplo donezepilo), agonista muscarínico (por ejemplo AF102B (Cevimelina, EVOXAC), AF150(S) y AF267B), antipsicóticos (por ejemplo haloperidol, clozapina, olanzapina); antidepresivos, incluyendo inhibidores tricíclicos y de la recaptación de serotonina (por ejemplo Sertralina y Citalopram Hbr), terapia génica y/o enfoques basados en fármacos para regular por incremento la neprilisina (una enzima que degrada el A\beta); terapia génica y/o enfoques basados en fármacos para regular por incremento la enzima que degrada la insulina (una enzima que degrada el A\beta), vacunas, compuestos inmunoterapéuticos y anticuerpos frente a A\beta (por ejemplo ELAN AN-1792), estatinas y otros fármacos hipocolesteromiantes (por ejemplo Lovastatina y Simvastatina), células madre y otros tratamientos basados en células, inhibidores de cinasas (CDK5, GSK3a, GSK3\beta) que fosforilan la proteína TAU (por ejemplo cloruro de litio) o inhibidores de cinasas que modulan la producción de A\beta (cinasas GSK3\alpha, GSK3\beta, Rho/ROCK) (por ejemplo cloruro de litio e Ibuprofeno).

Se cree que estos otros tratamientos actúan mediante un mecanismo diferente y pueden presentar efectos aditivos/sinérgicos con la presente invención. Además, muchos de estos otros tratamientos presentarán efectos secundarios basados en el mecanismo y/u otros efectos secundarios que limitan la dosis o duración en la que pueden administrarse solos.

Debido a su capacidad de unirse a amiloidosis in vivo tal como se trata a continuación en la presente memoria en más detalle, el scyllo-inositol es útil también en el diagnóstico de la presencia de una proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide en un sujeto utilizando un procedimiento que comprende administrar a dicho sujeto scyllo-inositol radiactivo o scyllo-inositol marcado con una sustancia que emite una señal detectable en una cantidad suficiente y en condiciones que permiten la unión de dicho scyllo-inositol a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrillas o amiloide, si están presentes; y detectar la radiactividad o la señal del scyllo-inositol unido a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrillas o amiloide, diagnosticando así la presencia de la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide.

Alternativamente, se recoge de un sujeto una muestra sospechosa de contener proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide y se pone en contacto con scyllo-inositol radiactivo o scyllo-inositol marcado con una sustancia que emite una señal detectable en condiciones que permiten la unión de scyllo-inositol a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide si están presentes; y después de eso detectar la radiactividad o la señal del scyllo-inositol unido a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrillas o amiloide, diagnosticando así la presencia de proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide en dicho sujeto.

Preferentemente, dicha señal detectable es una señal fluorescente o de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas y dicha muestra es sangre completa (incluyendo todos los constituyentes celulares) o plasma.

Tal como se muestra a continuación en la presente memoria, el scyllo-inositol puede suprimir la acumulación cerebral de A\beta, la deposición de placas de amiloide cerebrales y el deterioro cognitivo en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer cuando se administra durante la fase "presintomática tardía", antes de la aparición de déficits cognitivos manifiestos y neutopatología amiloide en estos ratones. Además, incluso cuando se administra tras la aparición de déficits cognitivos y neuropatología de placas de amiloide, el scyllo-inositol puede revertir de manera eficaz la deposición de amiloide y la neuropatología. De manera importante, el mecanismo de acción del scyllo-inositol sigue un diseño racional basado en su capacidad para modular el ensamblaje de monómeros de A\beta en protofibrillas y/o oligómeros neurotóxicos.

Otras ventajas del scyllo-inositol incluyen el hecho de que se transporta al SNC tanto mediante transportadores conocidos como mediante difusión pasiva, y por tanto proporciona una fácil biodisponibilidad en el SNC. En segundo lugar, el scyllo-inositol se cataboliza hasta glucosa. En tercer lugar, el scyllo-inositol presenta un bajo perfil de toxicidad.

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Ejemplo 1

Desarrollo de un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer y procedimientos de administración de compuestos de la presente invención

Los ratones TgCRND8 son un modelo murino robusto de la enfermedad de Alzheimer tal como se describe por Janus et al. (Nature 408: 979-982 (2000)). Expresan un transgén de la proteína precursora amiloide humana (APP695) bajo la regulación del promotor de priones de hámster sirio en un antecedente no cosanguíneo C3H/B6. El transgén APP695 humano lleva dos mutaciones que provocan EA en seres humanos (K670N/M671L y V717F). Comenzando a aproximadamente 3 meses de edad, los ratones TgCRND8 presentan déficits de aprendizaje espacial progresivos que están acompañados por niveles crecientes de A\beta cerebral y por un número creciente de placas de amiloide extracelulares cerebrales que son similares a las observadas en los cerebros de seres humanos con EA (C. Janus et al., Nature 408: 979-982 (2000)).

Las cohortes emparejadas por sexo y edad de ratones TgCRND8 y compañeros de camada no transgénicos (n=35 en cada cohorte) estaban o bien sin tratar, o bien se les administró un compuesto de la presente invención tal como se indica a continuación a 30 mg/día/ratón comenzando a la edad de aproximadamente 6 semanas. Se hizo un seguimiento de los ratones para obtener mediciones de los desenlaces de la función cognitiva, los niveles de A\beta cerebrales, la patología cerebral y la supervivencia a los 4 meses y 6 meses de edad.

Procedimientos de los estudios de prevención

Ratones - Se alimentaron grupos experimentales de ratones TgCRND8 con mio-, epi- y scyllo-inositol a 30 mg/ratón/día. Dos cohortes entraron en el estudio a las 6 semanas de edad y se analizaron los desenlaces a los 4 y 6 meses de edad. Se monitorizó el peso corporal, las características del pelaje y el comportamiento en la jaula. Se realizaron todos los experimentos según las directrices del Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales ("Canadian Council on Animal Care guidelines").

Pruebas de comportamiento - Tras el tratamiento previo no espacial, se sometió a los ratones a entrenamiento de discriminación de lugares durante 5 días con 4 ensayos por día. Se analizaron los datos de comportamiento utilizando un modelo mixto de análisis factorial de la varianza (ANOVA) con fármaco o genotipo o sesiones de entrenamiento como factores de medición repetidos.

Carga de amiloide cerebral - Se extirparon los cerebros y se fijó un hemisferio en paraformaldehído al 4% y se incrustó en cera de parafina en el plano sagital medio. Para generar conjuntos de secciones al azar uniformes sistemáticas, se recogieron secciones en serie de 5 \mum a través de todo el hemisferio. Se utilizaron conjuntos de secciones a intervalos de 50 mm para los análisis (10-14 secciones/conjunto). Se identificaron las placas tras la recuperación del antígeno con ácido fórmico, y se incubó con anticuerpo primario anti-A\beta (Dako M-0872), seguido por anticuerpo secundario (kit Dako StreptABCcomplex/peroxidasa del rábano). Se visualizaron los productos finales con DAB teñido por contraste con hematoxilina. Se evaluó la carga de placas de amiloide utilizando el software de análisis de imágenes Leco IA-3001 conectado con un microscopio Leica y una cámara de vídeo Hitachi KIP-MU CCD. Se analizó la carga vascular de manera similar y se utilizó un disector para medir el diámetro de los vasos afectados.

Contenido en A\beta plasmático y cerebral - Se homogeneizaron muestras de hemicerebro en una disolución de sacarosa tamponada, seguido por o bien dietilamina al 0,4%/NaCl 100 mM para los niveles de A\beta soluble o bien ácido fórmico frío para el aislamiento de A\beta total. Tras la neutralización, se diluyeron las muestras y se analizaron para detectar A\beta40 y A\beta42 utilizando kits disponibles comercialmente (BIOSOURCE International). Se analizó cada hemisferio por triplicado notificándose la media \pm EEM. Se realizaron análisis de inmunotransferencia de tipo Western en todas las fracciones utilizando geles de urea para los análisis de la especie de A\beta. Se detectó A\beta utilizando 6E10 (BIOSOURCE International) y quimioluminiscencia potenciada (Amersham).

Análisis de APP en el cerebro - Se homogeneizaron muestras de hemicerebro de ratón en Tris 20 mM pH 7,4, sacarosa 0,25 M, EDTA 1 mM y EGTA 1 mM, y un cóctel de inhibidor de proteasas, se mezcló con DEA al 0,4% (dietilamina)/NaCl 100 mM y se centrifugó a 109.000 Xg. Se analizaron los sobrenadantes para determinar los niveles de APP mediante inmunotransferencia de tipo Western utilizando Acm 22C11, mientras que se analizaron los sedimentos para detectar la holoproteína APP utilizando Acm C1/6.1.

Cuantificación de la gliosis - Se recogieron cinco secciones sagitales espaciadas de manera uniforme, seleccionadas al azar de hemisferios congelados y fijados con paraformaldehído de ratones tratados y control. Se inmunomarcaron secciones para detectar astrocitos con IgG_{2a} anti-GFAP de rata (Dako; diluida 1:50) y para detectar la microglia con IgG_{2b} anti-CD68 de rata (Dako; 1:50). Se capturaron imágenes digitales utilizando una cámara digital Coolsnap (Photometrics, Tuscon, Arizona) montada en un microscopio Axioscope 2 Plus de Zeiss. Se analizaron las imágenes utilizando el software de procesamiento de imágenes Openlab 3.08 (Improvision, Lexington MA).

Censo de supervivencia - Se evaluó la probabilidad de supervivencia mediante la técnica de Kaplan-Meier, que calcula la probabilidad de supervivencia en cada caso de muerte, lo que la hace adecuada para tamaños de muestra pequeños. Para los análisis de la supervivencia, se utilizaron 35 ratones para cada grupo de tratamiento. Se notificó la comparación entre tratamientos utilizando la prueba de Tarone-Ware.

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Ejemplo 2

Prevención de los déficits cognitivos

Se evaluó la función cognitiva de ratones TgCRND8 utilizando la versión de memoria de referencia espacial del laberinto de agua de Morris utilizando un modelo de ensayo de cinco días (figuras 1C-1H). Se analizaron datos de ratones TgCRND8 tratados y no tratados, y de compañeros de camada no-Tg tratados y no tratados (n= 0 para todas las combinaciones) utilizando un modelo mixto de análisis de la varianza (ANOVA) con el tratamiento (no tratado, epi- o scyllo-inositol) y el genotipo (TgCRND8 frente a no-Tg) como factores "entre sujetos". Los ratones TgCRND8 tratados o bien con epi- o bien con scyllo-inositol tuvieron un rendimiento significativamente mejor que los ratones TgCRND8 no tratados (p < 0,02; figuras 1C y D). En comparación con compañeros de camada no-Tg tratados o no tratados, los ratones TgCRND8 tratados con epi-inositol presentaron una curva de aprendizaje ligeramente más lenta durante los primeros tres días de entrenamiento. Sin embargo, tras 4 días de entrenamiento, los ratones TgCRND8 tratados con epi-inositol no eran estadísticamente diferentes de sus compañeros de camada no-Tg (figura 2E). En cambio, los ratones TgCRND8 tratados con scyllo-inositol eran indistinguibles de sus compañeros de camada no-Tg en todos los días. Por tanto, ambos estereoisómeros inhibieron el desarrollo de déficits cognitivos, y el scyllo-inositol previno realmente los déficits hasta tal grado que los ratones TgCRND8 tratados con scyllo-inositol eran indistinguibles de los ratones normales. Este rendimiento mejorado no se debía a un efecto no específico sobre los sistemas de comportamiento, motores o de percepción debido a que el tratamiento con epi- y scyllo-inositol no tuvo efecto sobre el rendimiento de ratones no-Tg (figuras 2G y 2H). El rendimiento mejorado tampoco se debía a efectos nutricionales o calóricos porque el peso corporal, la actividad y el estado del pelaje no eran diferentes entre las cohortes tratada y no tratada. Además, el tratamiento con manitol (un azúcar de peso molecular similar) no tuvo efectos sobre el comportamiento. Los efectos del género no eran significativos entre ningún grupo de tratamiento
(p=0,85).

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Ejemplo 3

Reducción de la carga de A\beta cerebral y neuropatología amiloide

A los cuatro meses de edad, los ratones TgCRND8 no tratados presentaban una expresión robusta tanto de A\beta40 como de A\beta42 (tabla 1). El tratamiento con epi-inositol tal como se describió en el ejemplo 1 redujo tanto los niveles de A\beta40 (reducción del 43\pm2% tanto en los conjuntos solubles como insolubles; p\leq0,05) como los niveles de A\beta42 (reducción del 69% en el conjunto soluble, p=0,05; reducción del 28% en el conjunto insoluble, p=0,02) a los 4 meses de edad. Sin embargo, estas mejoras no se mantuvieron, y a los 6 meses de edad, los niveles de A\beta cerebrales se elevaron hasta niveles similares a los observados en ratones TgCRND8 no tratados (tabla 1).

En cambio, a los cuatro meses de edad, el tratamiento con scyllo-inositol redujo el A\beta40 cerebral total en un 62% (p=0,0002) y el A\beta42 cerebral total en un 22% (p=0,0096; tabla 1). A los 6 meses de edad, el tratamiento con scyllo-inositol provocó una reducción del 32% en los niveles de A\beta40 (p=0,04) y una reducción del 20% en A\beta42 (p=0,02) en comparación con ratones TgCRND8 no tratados.

Debido a que la disminución de las concentraciones de A\beta detectada tras el tratamiento con inositol podía haber resultado de una salida alterada de A\beta hacia el plasma, se examinaron los niveles de A\beta-\beta en el plasma a los 4 y 6 meses de edad (tabla 1). Los ratones TgCRND8 presentan altas concentraciones plasmáticas en la EA a los 4 meses de edad y se mantienen constantes a los 6 meses de edad aún cuando la carga de placas del SNC está aumentando todavía a los 6 meses de edad (tabla 1). Ni el tratamiento con epi-inositol ni el tratamiento con scyllo-inositol tuvieron ningún efecto sobre los niveles de A\beta plasmáticos en comparación con ratones TgCRND8 no tratados (p=0,89). La explicación más simple para esta observación es que los inositoles han alterado selectivamente la fibrilización de A\beta en el SNC, pero no han afectado a la actividad \beta- o \gamma-secretasa, o a los mecanismos normales de aclaramiento de A\beta en el plasma. No obstante, esta observación es significativa por dos razones. En primer lugar, se detecta habitualmente una caída en los niveles de A\beta plasmáticos y en LCR a medida que avanza la evolución clínica en pacientes con EA no tratados (Mayeux, et al., Ann,. Neurol. 46, 412, 2001). En segundo lugar, los pacientes en el estudio de inmunización AN1792 que desarrollaron una fuerte respuesta de anticuerpos y una respuesta clínica evidente no presentaban niveles de A\beta-\beta plasmáticos alterados (Hock et al., Neuron 38,547 2003). Por tanto, estos resultados indican que no es necesario cambiar los niveles de A\beta plasmáticos para obtener un desenlace terapéutico eficaz.

Para confirmar que los estereoisómeros del inositol no presentaban efecto o bien sobre la expresión o bien sobre el procesamiento proteolítico de APP, se examinaron los niveles de holoproteína APP, sAPP-\alpha y diversas especies de A\beta dentro del cerebro de ratones TgCRND8 tratados y no tratados con inositol. De manera consecuente con los datos anteriormente notificados (McLaurin, et al., Nat. Med. 8,1263, 2002), A\beta42, A\beta40 y A\beta38 son las especies predominantes en el cerebro de ratones TgCRND8 (figura 3A), y los niveles en el SNC de APP inmadura y madura glicosilada (figura 3B) y de sAPP-\alpha eran indistinguibles independientemente del tratamiento. En combinación, estos resultados indican que el epi- y scyllo-inositol presentan un efecto directo y selectivo sobre la oligomerización de A\beta y no sobre el procesamiento de APP.

Los cambios en la carga de péptido A\beta-\beta estaban acompañados por una disminución significativa en la carga de placas (tabla 1; figuras 2A-2I). En ratones TgCRND8 tratados con epi-inositol, hubo una disminución significativa en el tamaño de placa medio a los 4 pero no a los 6 meses de edad en comparación con ratones TgCRND8 no tratados (95 \pm 4,3 \mum^{2} frente a 136 \pm 15 \mum^{2}, p = 0,04; 370 \pm 9 \mum^{2} frente a 423 \pm 22 \mum^{2}, p = 0,06, respectivamente). Estos resultados indican que a niveles de A\beta modestos, el epi-inositol previene la oligomerización de A\beta pero una vez iniciada a concentraciones de A\beta superiores, el epi-inositol no puede inhibir la fibrilogénesis. El tratamiento con scyllo-inositol redujo el tamaño de placa medio desde 136\pm15 \mum^{2} hasta 103\pm4 \mum^{2} (p = 0,01) a los 4 meses de edad. En ratones TgCRND8 tratados con scyllo-inositol a los 6 meses de dad, la disminución en los niveles de péptido A\beta estaba acompañada por una reducción del 20% en el número de placas (p = 0,005), una disminución del 35% en el área del cerebro cubierta con placas (p = 0,015) y una disminución en el tamaño de placa medio (339 \pm 10 frente a 423 \pm 21 \mum^{2}, p = 0,009). Estos resultados demuestran que en cada medición hubo una reducción en la carga de placas tras el tratamiento con scyllo-inositol.

1

Ejemplo 4

Reducción de la inflamación y actividad gliales

Las reacciones de la astroglia y microglia son características neuropatológicas tanto de la EA humana como de todos los modelos de ratón con amiloide (Irizarry et al., J Neuropathol Exp Neurol. 56, 965, 1997; KD. Bornemann et al. Ann N Y Acad Sci, 908, 260, 2000). Por tanto, se investigó el efecto del tratamiento con epi- y scyllo-inositol sobre la astrogliosis y microgliosis en los cerebros de ratones TgCRND8 (figuras 3A-3D). Se tiñeron secciones sagitales en serie con el marcador astrocítico proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y se cuantificaron para determinar el tanto por ciento de área del cerebro cubierta por astrogliosis. Los ratones TgCRND8 presentan una alta astrogliosis basal a los 4 meses de edad (0,459\pm0,048%), que aumenta ligeramente a los 6 meses de edad (0,584\pm0,089%) y que no está limitada a las áreas con placas (figuras 2A-C). El epi-inositol redujo la respuesta astrogliótica hasta el 0,388\pm0,039% a los 6 meses de edad (p=0,04; figuras 2D-F). El scyllo-inositol, por otra parte, redujo la astrogliosis de manera mucho más eficaz hasta el 0,269\pm0,028% a los 6 meses de edad, (p=0,006) (figuras 2G-I). Se atenuó también significativamente la activación de la microglia en ratones TgCRND8 tratados con scyllo-inositol (0,20\pm0,008% del área del cerebro) en comparación con ratones TgCRND8 no tratados emparejados por sexo y edad (0,31 \pm 0,01%; p<0,001). Sin embargo, los ratones tratados con epi-inositol no mostraron una reducción significativa en la activación de la microglia a los 6 meses (0,248 \pm 0,02%; p=NS). Tomados juntos, estos datos indican que el tratamiento con scyllo-inositol reduce la respuesta inflamatoria inducida por A\beta dentro del SNC.

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Ejemplo 5

Reducción de la carga de amiloide vascular

La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la presencia de depósitos de amiloide tanto vascular como parenquimatoso. En ratones TgCRND8 de 6 meses de edad no tratados, aproximadamente el 0,03% del cerebro está asociado a amiloide vascular. No pudieron detectarse diferencias en la carga de amiloide vascular tras el tratamiento con epi-inositol a los 6 meses de edad (figura 3C). En cambio, el tratamiento con scyllo-inositol redujo significativamente la carga de amiloide vascular (p=0,05) (figura 3C), y la deposición de amiloide se localizaba predominantemente en vasos más pequeños, <25 m^{2} de diámetro (56 \pm 2% frente a 70 \pm 8% en vasos pequeños en ratones TgCRND8 no tratados). El tamaño medio de las placas cerebrovasculares se redujo significativamente en los ratones tratados con scyllo-inositol en comparación con ratones no tratados (154\pm16 frente a 363\pm34, p=0,008; figura
3D).

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Ejemplo 6

Mejora de la supervivencia

Los ratones TgCRND8 presentan una supervivencia del 50% a los 175 días, que tras el tratamiento mejoró hasta el 72% con scyllo-inositol (n=35 por grupo, p<0,02 para scyllo-inositol frente al control, figura 10B). El tratamiento con mio-inositol no afectó a la supervivencia global significativamente (figura 10A). Experimentos control confirmaron que la supervivencia potenciada de ratones tratados con scyllo-inositol no era un efecto indirecto del aumento de la ingesta calórica. Por tanto, el tratamiento de ratones de tipo natural con scyllo-inositol no tuvo efecto o bien sobre la supervivencia o bien sobre otros parámetros tales como el peso, el estado de la piel o el comportamiento en la jaula. Además, el peso, el estado de la piel y el comportamiento en la jaula de ratones TgCRND8 tratados con inositol no variaron de los de ratones TgCRND8 no tratados. Experimentos simultáneos con manitol, un azúcar sencillo de peso molecular similar, tampoco tuvieron efecto sobre la supervivencia de ratones TgCRND8.

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Ejemplo 7

Tratamiento y reversión de la deposición de amiloide

Tomados juntos, los estudios de prevención demuestran que el scyllo-inositol inhibe la deposición de amiloide tanto parenquimatoso como cerebrovascular y da como resultado una función cognitiva y supervivencia mejoradas en el modelo de ratón TgCRND8 de la enfermedad de Alzheimer.

Sin embargo, la mayoría de los pacientes con enfermedad de Alzheimer buscarán probablemente un tratamiento sólo una vez que presentan síntomas, y cuando la oligomerización, deposición, toxicidad y formación de placas de A\beta está ya muy avanzada dentro del SNC. Por tanto, se inició un estudio piloto en ratones TgCRND8 de 5 meses de edad. Estos ratones presentan cargas de placas y A\beta significativas que son comparables a las del cerebro de seres humanos con EA.

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Procedimientos del estudio de tratamiento

Ratones - Se alimentaron grupos experimentales de ratones TgCRND8 con mio-, epi- y scyllo-inositol a 30 mg/ratón/día. Una cohorte entró en el estudio a los 5 meses de edad y se analizaron los desenlaces a los 6 meses de edad. Se monitorizaron el peso corporal, las características del pelaje y el comportamiento en la jaula. Se realizaron todos los experimentos según las directrices del Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales.

Censo de supervivencia - Se evaluó la probabilidad de supervivencia mediante la técnica de Kaplan-Meier, que calcula la probabilidad de supervivencia en cada caso de muerte, lo que la hace adecuada para tamaños de muestra pequeños. Para los análisis de supervivencia, se utilizaron 35 ratones para cada grupo de tratamiento. Se notificó la comparación entre tratamientos utilizando la prueba de Tarone-Ware.

Prueba de comportamiento - Estudio de reversión - Se introdujo a los ratones en la prueba del laberinto de agua de Morris con una plataforma escondida en el día uno sin entrenamiento previo. Se sometió a prueba a los ratones durante 3 días con seis ensayos por día. En el cuarto día, se quitó la plataforma de la piscina y cada ratón recibió un ensayo de prueba de natación de 30 s. El último día, se sometió a los animales a una prueba de indicios con el fin de evaluar la capacidad de nadar, la vista y la cognición general. La prueba de indicios se realiza colocando la plataforma en un cuadrante diferente al utilizado para las pruebas y marcándola con una bandera. Se les deja a los animales 60 s para que encuentren la plataforma. Los animales que no encuentran la plataforma no se utilizan en los análisis finales de la memoria espacial. Se analizaron los datos de comportamiento utilizando un modelo mixto de análisis factorial de la varianza (ANOVA) con el fármaco o el genotipo y las sesiones de entrenamiento como factores de medición
repetidos.

Carga de amiloide cerebral - Se extirparon los cerebros y se fijó un hemisferio en paraformaldehído al 4% y se incrustó en cera de parafina en el plano sagital medio. Para generar conjuntos de secciones al azar uniformes sistemáticas, se recogieron secciones en serie de 5 \mum por todo el hemisferio. Se utilizaron conjuntos de secciones a intervalos de 50 mm para los análisis (10-14 secciones/conjunto). Se identificaron las placas tras la recuperación del antígeno con ácido fórmico, y se incubó con anticuerpo primario anti-A\beta (Dako M-0872), seguido por anticuerpo secundario (kit Dako StreptABCcomplex/peroxidasa del rábano). Se visualizaron los productos finales con DAB teñido por contraste con hematoxilina. Se evaluó la carga de placas de amiloide utilizando el software de análisis de imágenes Leco IA-3001 conectado con un microscopio Leica y una cámara de vídeo Hitachi KIP-MU CCD.

Contenido en A\beta plasmático y cerebral - Se homogeneizaron muestras de hemicerebro en una disolución de sacarosa tamponada, seguido por o bien dietilamina al 0,4%/NaCl 100 mM para los niveles de A\beta solubles o bien ácido fórmico frío para el aislamiento de A\beta total. Tras la neutralización, se diluyeron las muestras y se analizaron para detectar A\beta40 y A\beta42 utilizando kits disponibles comercialmente (BIOSOURCE International). Se analizó cada hemisferio por triplicado notificándose la media \pm el EEM.

Resultados y relevancia - Todos los animales que entraron en el estudio de reversión sobrevivieron y no presentaron signos externos de molestia o toxicidad. Se evaluó la función cognitiva de ratones TgCRND8 utilizando la versión de memoria de referencia espacial del laberinto de agua de Morris utilizando un modelo de ensayo de tres días (figuras 4-8). Se analizaron los datos de ratones TgCRND8 tratados y no tratados, y de compañeros de camada no-Tg tratados y no tratados (n=10 para todas las combinaciones) utilizando un modelo mixto de análisis de la varianza (ANOVA) con el tratamiento (no tratado, mio-, epi- o scyllo-inositol) y el genotipo (TgCRND8 frente a no-Tg) como factores "entre sujetos". En este modelo, los ratones TgCRND8 estaban significativamente alterados en comparación con los compañeros de camada de tipo natural (figura 4). En cambio, los ratones TgCRND8 tratados con scyllo-inositol eran indistinguibles de los compañeros de camada no-Tg en todos los días. (p=0,38; figura 5). En comparación con los compañeros de camada no-Tg tratados, los ratones TgCRND8 tratados con epi-inositol eran casi significativamente diferentes (p=0,07; figura 6). De manera similar, los ratones TgCRND8 tratados con mio-inositol eran significativamente diferentes de los compañeros de camada no-Tg tratados (p=0,05, figura 7). Cuando se compara la fase de aprendizaje de la prueba del laberinto de agua de Morris entre tratamientos, todos los ratones se comportaron de manera similar (figura 8). En cambio, sólo los tratados con scyllo-inositol eran indistinguibles de los compañeros de camada no-Tg (figura 8). Por tanto, el scyllo-inositol revirtió realmente los déficits cognitivos en tal grado que los ratones TgCRND8 tratados con scyllo-inositol eran indistinguibles de los ratones normales. Este rendimiento mejorado no se debía a un efecto no específico sobre los sistemas de comportamiento, motores o de percepción porque el tratamiento con epi-y scyllo-inositol no presentaba ningún efecto sobre el rendimiento de ratones no-Tg. El rendimiento mejorado tampoco se debía a efectos nutricionales o calóricos porque el peso corporal, la actividad y el estado del pelaje no eran diferentes entre las cohortes tratada y no tratada.

Con el fin de determinar si la mejora de la cognición estaba asociada a una disminución en la carga de placas y la carga de A\beta, se examinó post-mortem tejido cerebral. Los cambios en la cognición estaban acompañados por un cambio correspondiente en la carga de placas y la carga de A\beta (figura 9 y tabla 2). El tratamiento con mio-inositol no afectó a la carga de placas ni a la carga de A\beta (figura 9 y tabla 2). En ratones TgCRND8 tratados con epi-inositol, no hubo una disminución significativa en el tamaño de placas medio en comparación con ratones TgCRND8 no tratados (figura 9), aunque la carga de A\beta disminuyó significativamente (tabla 2). Estos resultados sugieren que a niveles de A\beta modestos, el epi-inositol previene la oligomerización de A\beta pero a concentraciones de A\beta superiores, el epi-inositol no puede inhibir la fibrilogénesis completamente. El tratamiento con scyllo-inositol redujo significativamente la carga de placas y la carga de A\beta. Estos resultados demuestran que en cada medición hubo una reducción en la carga de placas tras el tratamiento con scyllo-inositol. Estos resultados son comparables en el tamaño del efecto a los estudios profilácticos de 6 meses, y apoyan adicionalmente el potencial del scyllo-inositol.

Debido a que la disminución de las concentraciones de A\beta detectada tras el tratamiento con inositol podía haber resultado de una salida alterada de A\beta hacia el plasma, se examinaron los niveles de A\beta en el plasma (tabla 2). Los ratones TgCRND8 presentan altas concentraciones plasmáticas de A\beta a los 6 meses de edad. Ni el tratamiento con mio-inositol ni con epi-inositol ni con scyllo-inositol tuvieron ningún efecto sobre los niveles de A\beta plasmáticos en comparación con ratones TgCRND8 no tratados (p=0,89). La explicación más simple para esta observación es que los inositoles han alterado selectivamente la fibrilización de A\beta en el SNC, pero no han afectado a la actividad \beta- o \gamma-secretasa, o a los mecanismos normales de aclaramiento de A\beta en el plasma. No obstante, esta observación es significativa por dos razones. En primer lugar, se detecta habitualmente una caída en los niveles de A\beta plasmáticos y en LCR a medida que avanza la evolución clínica en pacientes con EA no tratados. En segundo lugar, los pacientes en el estudio de inmunización AN1792 que desarrollaron una fuerte respuesta de anticuerpos y una respuesta clínica evidente no presentaban niveles de A\beta plasmáticos alterados. Por tanto, estos resultados indican además que no es necesario cambiar los niveles de A\beta plasmáticos para obtener un desenlace terapéutico eficaz.

Tomados juntos, estos datos revelan que el scyllo-inositol seleccionado puede suprimir la acumulación cerebral de A\beta, la deposición de placas de amiloide cerebrales y el deterioro cognitivo en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer cuando se administra durante la fase "presintomática tardía", antes de la aparición de déficits cognitivos manifiestos y neuropatología amiloide en estos ratones. Además, incluso cuando se administra scyllo-inositol tras la aparición de déficits cognitivos y neuropatología por placas de amiloide, estos compuestos pueden revertir eficazmente los déficits cognitivos, la neuropatología y la deposición de amiloide. Por tanto, estos resultados indican que el scyllo-inositol es eficaz tanto en la prevención de la enfermedad como en el tratamiento de la enfermedad existente en pacientes a los que ya se les ha diagnosticado la EA.

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(Tabla pasa a página siguiente)

2

Ejemplo 8

Estudio de tratamiento de dos meses con scyllo-inositol

Con el fin de determinar intervalos de eficacia más largos de scyllo-inositol para el tratamiento de la enfermedad, se alimentaron ratones TgCRND8 de 5 meses de edad con scyllo-inositol o no se trataron durante dos meses (n=10 por grupo). Se comparó la función cognitiva de los ratones TgCRND8 de 7 meses de edad tratados con scyllo-inositol con TgCRND8 no tratados y compañeros de camada no-Tg tratados en el modelo de tres días del laberinto de agua de Morris. Se analizaron los datos de comportamiento utilizando un modelo mixto de análisis factorial de la varianza (ANOVA) con el fármaco y el genotipo como variables entre sujetos y las sesiones de entrenamiento como variable dentro de los sujetos.

Tal como se observa con el tratamiento de 1 mes de scyllo-inositol (figura 12A), los ratones TgCRND8 tratados durante dos meses con scyllo-inositol eran indistinguibles de los compañeros de camada no-Tg tratados con scyllo-inositol (figura 12B). Con el fin de correlacionar la mejora de la cognición con la patología, se analizaron los niveles de A\beta40 y A\beta42 en el cerebro (tabla 3). Los niveles tanto de A\beta42 como de A\beta40 insoluble disminuyeron en un 20% tras el tratamiento con scyllo-inositol. Estos resultados demuestran que los efectos del scyllo-inositol persisten durante la evolución de la enfermedad.

TABLA 3 El tratamiento con inositol reduce los niveles de A\beta40 y A\beta42

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Ejemplo 9

Efecto de la dosis sobre el desenlace patológico de ratones TgCRND8 que portan la enfermedad

Se alimentaron con sonda ratones TgCRND8 de 5 meses de edad una vez al día con scyllo-inositol en agua a dosis de 10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kg o no se trataron. Se sacrificaron los animales tras un mes de tratamiento y se analizaron para determinar los desenlaces patológicos. El análisis de los niveles de A\beta dentro del cerebro de todas las cohortes demuestra que todas las dosis de fármaco eran eficaces en el mismo grado en la reducción de los niveles de A\beta42 soluble en comparación con ratones TgCRND8 no tratados (reducción del 20%, F_{3,15}=3,1, p=0,07; figura 13A). Los análisis de dosis individuales demuestran que las dosis de 10 mg/kg y 30 mg/kg eran significativamente diferentes de los controles no tratados (p=0,03 y p=0,02, respectivamente). Ninguna de las dosis elegidas eran significativamente diferentes entre sí (F_{2,11}=0,6, p=0,57; figura 13A). La dosificación con sonda nasogástrica no tuvo ningún efecto significativo sobre A\beta42 insoluble (F_{3,15}=0,69, p=0,58; figura 13B) o A\beta40 soluble e insoluble (F_{3,15}=0,04, p=0,99 y F_{3,15}=0,36, p=0,79, respectivamente; figura 14A y 14B).

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Ejemplo 10

Eficacia del alo-inositol para el tratamiento de ratones TgCRND8 que portan la enfermedad (sólo como referencia)

Para evaluar si el alo-inositol podría ser también eficaz en la prevención de la evolución adicional y/o podría revertir parcialmente un fenotipo de tipo EA bien establecido, se retrasó el comienzo del tratamiento de los ratones TgCRND8 hasta los 5 meses de edad. Se trataron las cohortes de compañeros de camada no transgénicos y TgCRND8 o bien durante 28 días con alo-inositol, o bien no se trataron. En estos experimentos, la dosificación y la administración oral de los compuestos, y los ensayos neuroquímicos y de comportamiento fueron los mismos que los empleados en los experimentos de tratamiento anteriores.

La cohorte de ratones TgCRND8 tratados con alo-inositol de 6 meses de edad tuvo un rendimiento significativamente mejor que los ratones TgCRND8 no tratados (F_{1,13}=0,45, p=0,05; datos no mostrados). El rendimiento cognitivo de ratones TgCRND8 tratados con alo-inositol de 6 meses de edad era todavía significativamente diferente del de sus compañeros de camada no transgénicos (F_{1,13}=5,9, p=0,05; figura 15). El efecto beneficioso del tratamiento con inositol no se debía a efectos no específicos sobre los sistemas de comportamiento, motores o de percepción porque el tratamiento con inositol no tuvo ningún efecto sobre el rendimiento cognitivo de ratones no-Tg (F_{1,12}=0,98; p=0,49). Se analizaron los niveles de A\beta cerebrales para el tratamiento frente a ratones TgCRND8 no tratados para determinar si la mejora del comportamiento podía correlacionarse con cambios en A\beta (tabla 4). El tratamiento con alo-inositol redujo el A\beta42 soluble (reducción del 20%, p<0,05), un efecto similar al observado para el scyllo-inositol. El alo-inositol no alteró significativamente el A\beta40 o A\beta42 insoluble (conjuntos soluble e insoluble). Una posible explicación para la disminución de A\beta42 es el aclaramiento de A\beta42 en la periferia con un aumento posterior en el A\beta42 plasmático. Los niveles de A\beta42 en plasma tras el tratamiento con alo-inositol eran indistinguibles de los niveles plasmáticos de TgCRND8 no tratados (tabla 5). De acuerdo con los otros estereoisómeros del inositol, estos resultados demuestran que los niveles de A\beta plasmáticos no se ven afectados por el tratamiento con alo-inositol.

TABLA 4 El tratamiento con alo-inositol reduce los niveles de A\beta42

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TABLA 5 Características bioquímicas sanguíneas - Estudio de la dosis de scyllo-inositol

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Ejemplo 11

El tratamiento con inositol no afecta a las características químicas sanguíneas

Con el fin de descartar cualquier efecto perjudicial del tratamiento con inositol sobre las características químicas sanguíneas y la función orgánica, se analizó la sangre tras un tratamiento de un mes tanto con scyllo- como alo-inositol (tabla 5,6). La proteína total, albúmina, globulina, bilirrubina, fosfatasa alcalina, glucosa, urea y creatinina no eran significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento o con respecto a los ratones TgCRND8 no tratados. Todos los niveles se encontraban dentro del intervalo normal tal como se determinó para ratones de tipo natural no transgénicos. Además la hemolisis, la ictericia y la lipemia eran todas normales. Estos resultados sugieren que el alo- y scyllo-inositol no presentan efectos perjudiciales obvios sobre las características químicas sanguíneas o la función orgánica.

TABLA 6 Características bioquímicas sanguíneas - Estudio de tratamiento de 1 mes

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Ejemplo 12

Eficacia del scyllo-inositol en la prevención de una patología de tipo EA en un modelo de ratón transgénico doble de la enfermedad de Alzheimer, PS1 x APP

Los ratones Tg PS1 x APP son un modelo potenciado de la enfermedad de Alzheimer que expresan un transgén PS1 humano mutante que codifica para dos mutaciones familiares (M146L y L286V) junto con el transgén APP humano que codifica para la mutaciones familiares Indiana y sueca. Estos animales desarrollan una expresión robusta de niveles de A\beta cerebrales y deposición de amiloide a los 30-45 días de edad. En un ensayo profiláctico, se trataron los ratones TgPS1xAPP con scyllo-inositol desde el destete y se evaluaron para detectar efectos sobre la neuropatología a los 2 meses de edad (figuras 16 y 17). En comparación con ratones TgPS1xAPP no tratados, los ratones TgPS1xAPP tratados con scyllo-inositol mostraron una disminución significativa en todas las mediciones de la carga de placas a los 2 meses de edad. (% de área del cerebro cubierta de placas = 0,157\pm0,007 frente a 0,065\pm0,016, p<0,001; tamaño de placas medio = 177\pm8 \mum^{2} frente a 149\pm5 \mum^{2}, p<0,05; recuento de placas 3054\pm324 frente a 1514\pm510, p<0,01; (figura 17). Estos resultados demuestran que el scyllo-inositol previene la deposición de amiloide en dos modelos robustos de la enfermedad de Alzheimer.

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Ejemplo 13

Efecto del aumento de la ingesta calórica sobre ratones TgCRND8 (sólo como referencia)

Con el fin de descartar la contribución del aumento de la ingesta calórica o efectos no específicos, se trataron los ratones TgCRND8 con un azúcar sencillo de peso molecular similar, manitol. A los 6 meses de edad, los ratones TgCRND8 tratados con manitol eran indistinguibles de los ratones TgCRND8 no tratados (figura 11A) y eran significativamente diferentes de los compañeros de camada no-Tg tratados con manitol (figura 11B). El manitol no presentaba ningún efecto sobre el comportamiento de ratones no-Tg, dado que los ratones no-Tg tratados con manitol eran indistinguibles de los ratones no-Tg no tratados. Estos resultados se correlacionan con los estudios patológicos que indican que el manitol no alteraba la carga de placas en ratones TgCRND8 (figura 11C). La monitorización simultánea de la supervivencia demostró que el manitol no presentaba ningún efecto sobre la supervivencia de ratones TgCRND8 (figura 11D).

Claims (14)

1. Scyllo-inositol para su utilización en el tratamiento o la prevención de un estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico asociado a un trastorno en la agregación o el plegado de proteínas, o la formación, deposición, acumulación o persistencia de amiloide.

2. Scyllo-inositol según la reivindicación 1, en el que el estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico da como resultado la deposición de proteínas, fragmentos de proteínas y péptidos en láminas plegadas en beta y/o fibrillas y/o agregados.

3. Scyllo-inositol según la reivindicación 1 ó 2, en el que el estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico se selecciona de entre el grupo constituido por: enfermedad de Alzheimer, formas seniles y preseniles; angiopatía amiloide; disfunción cognitiva leve; demencia relacionada con la enfermedad de Alzheimer; tauopatía; \alpha-sinucleinopatía; enfermedad de Parkinson; esclerosis lateral amiotrófica; enfermedad de motoneuronas; paraplejía espástica; enfermedad de Huntington; ataxia espinocerebelosa; enfermedades neurodegenerativas asociadas a agregados intracelulares y/o intraneuronales de proteínas con poliglutamina, polialanina u otras repeticiones que surgen de expansiones patológicas de elementos de tri o tetranucleótidos con genes correspondientes; enfermedades cerebrovasculares; síndrome de Down; traumatismo craneal con acumulación postraumática de péptido beta-amiloide; enfermedad relacionada con priones; demencia británica familiar; demencia presenil con ataxia espástica; angiopatía amiloide cerebral, tipo británico; demencia presenil con angiopatía amiloide cerebral con ataxia espástica, tipo danés; encefalopatía familiar con cuerpos de inclusión de neuroserpina (FENIB); polineuropatía amiloide; miositis por cuerpos de inclusión debida a péptido beta-amiloide; amiloidosis de tipo finés y familiar; amiloidosis sistémica asociada a mieloma múltiple; fiebre mediterránea familiar; inflamaciones e infecciones crónicas; y diabetes mellitus tipo II asociada a polipéptido amiloide de los islotes.

4. Scyllo-inositol según la reivindicación 3, en el que el estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico es la enfermedad de Alzheimer.

5. Scyllo-inositol según la reivindicación 3, en el que la demencia relacionada con la enfermedad de Alzheimer es demencia por Alzheimer o vascular.

6. Scyllo-inositol para su utilización en el diagnóstico de la presencia de una proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide en un sujeto, en el que el procedimiento de diagnóstico comprende las siguientes etapas:

(a)

administrar al sujeto scyllo-inositol radiactivo o scyllo-inositol marcado con una sustancia que emite una señal detectable en una cantidad suficiente y en condiciones que permiten la unión de dicho scyllo-inositol a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrillas o amiloide, si están presentes; y

(b)

detectar la radiactividad de la señal del scyllo-inositol unido a la proteína agregada o plegada de manera anómala o fibrillas o amiloide, diagnosticando de este modo la presencia de proteína agregada o plegada de manera anómala o fibrilla amiloide y/o amiloide en el sujeto.

7. Procedimiento para diagnosticar la presencia de proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrilla amiloide o amiloide en un sujeto, que comprende las siguientes etapas:

(a)

recoger una muestra del sujeto;

(b)

poner en contacto la muestra con scyllo-inositol radiactivo o scyllo-inositol marcado con una sustancia que emite una señal detectable en condiciones que permiten la unión del scyllo-inositol a la proteína agregada o plegada de manera anómala y/o fibrillas o amiloide, si están presentes; y

(c)

detectar la radiactividad de la señal del scyllo-inositol unido a la proteína agregada o plegada de manera anómala o fibrillas o amiloide, diagnosticando de este modo la presencia de proteína agregada o plegada de manera anómala o fibrilla amiloide y/o amiloide en el sujeto.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la muestra es sangre completa.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la muestra es plasma.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la señal detectable es una señal de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

11. Scyllo-inositol o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que la señal detectable es una señal fluorescente.

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12. Scyllo-inositol o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que la señal detectable es una señal radiactiva.

13. Scyllo-inositol o procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer.

14. Utilización de scyllo-inositol en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o a la prevención de un estado del sistema nervioso central o periférico u órgano sistémico asociado a un trastorno en la agregación o el plegado de proteínas, o la formación, deposición, acumulación o persistencia de amiloide.