CH698246B1 - Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen. - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen, der die folgenden Schritte umfasst: Immobilisieren eines Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge auf einem festen Träger, Inkontaktbringen dessen mit einer Testverbindung in Gegenwart eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, und Vergleichen des Ausmasses der Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung, um zu bestimmen, ob die Testverbindung ein Inhibitor von Beta-Sekretasen ist.

Description

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen, der die folgenden Schritte umfasst: Immobilisieren eines Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge auf einem festen Träger, Inkontaktbringen dessen mit einer Testverbindung in Gegenwart eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, und Vergleichen des Ausmasses der Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung, um zu bestimmen, ob die Testverbindung ein Inhibitor von Beta-Sekretasen ist.

[0002] Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine degenerative Hirnstörung, die klinisch durch einen zunehmenden Verlust des Gedächtnisses, der zeitlichen und örtlichen Orientierung, der Wahrnehmung, der Verständigung, des Urteilsvermögens und der emotionalen Stabilität gekennzeichnet ist. Die AD ist eine häufige Ursache für die progressive Demenz bei Menschen und eine der häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten. Die AD wurde weltweit bei allen Rassen und ethnischen Gruppen festgestellt und stellt gegenwärtig und auch für die Zukunft ein wichtiges Gesundheitsproblem dar. Zurzeit gibt es keine Behandlung, die die AD wirksam verhindert oder die klinischen Symptome und die zugrunde liegende Pathophysiologie lindert (eine Übersicht findet sich in Annu. Rev. Cell Biol. 10 (1994), 373–403).

[0003] Die histopathologische Untersuchung von Hirngewebe, das mittels Autopsie oder aus neurochirurgischen Proben von betroffenen Patienten erhalten wurde, zeigte, dass in der Hirnrinde solcher Patienten Amyloidplaques und neurofibrilläre Plaques vorliegen. Ähnliche Veränderungen wurden bei Patienten mit Trisomie 21 (Down-Syndrom) und hereditärer Hirnblutung mit Amyloidose des Dutch-Typs festgestellt.

[0004] Neurofibrilläre Plaques sind nicht-membrangebundene Bündel von abnormen proteinartigen Filamenten, bei denen biochemische und immunchemische Untersuchungen ergaben, dass die zugrunde liegende Proteinuntereinheit eine veränderte, phosphorylierte Form des tau-Proteins ist (eine Übersicht findet sich in Annu. Rev. Neurosci. 17 (1994), 489–517).

[0005] Biochemische und immunologische Untersuchungen zeigten, dass die hauptsächlich vorliegende proteinartige Komponente des Amyloidplaques ein etwa 4,2 Kilodalton (kD) grosses Protein mit etwa 39 bis 43 Aminosäuren ist. Dieses Protein wurde mit A-Beta-Amyloid-Peptid und manchmal mit Beta/A4 bezeichnet; hier wird es A-Beta genannt. A-Beta liegt, zusätzlich zu den Ablagerungen in Amyloidplaques, ausserdem in den Wänden von Meningeal- und Parenchymarteriolen, kleinen Arterien, Kapillaren und manchmal Venen vor. Im Jahr 1984 wurde A-Beta erstmals gereinigt und eine partielle Aminosäuresequenz davon beschrieben (Biochem. Biophys. Res. Commun. 120 (1984), 885–890). Die Isolierung und die Sequenzdaten für die ersten 28 Aminosäuren sind im US-Patent Nr. 4 666 829 beschrieben.

[0006] Während der letzen zehn Jahre gab es immer mehr deutliche Beweise dafür, dass A-Beta ein inneres Polypeptid ist, das von einem integralen Typ-1-Membranprotein abstammt, welches mit Beta-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) bezeichnet wird. Das APP wird normalerweise durch viele Zellen produziert, und zwar sowohl in vivo als auch in gezüchteten Zellen, die aus verschiedenen Tieren und Menschen stammen. A-Beta entsteht durch Spaltung von APP durch ein Enzym- (Protease-) System(e), diese werden zusammen Sekretasen genannt.

[0007] Das Vorliegen von mindestens vier proteolytischen Aktivitäten wurde postuliert. Sie umfassen Beta-Sekretase(n), die den N-Terminus von A-Beta erzeugen, Alpha-Sekretase(n), die etwa bei der 16/17-Peptidbindung in A-Beta spalten, und Gamma-Sekretasen, die C-terminale A-Beta-Fragmente erzeugen, welche an der Position 38, 39, 40, 42 und 43 enden, oder die C-terminale verlängerte Vorläufer erzeugen, die anschliessend zu den vorstehenden Polypeptiden verkürzt werden.

[0008] Mehrere Hinweise legen nahe, dass die abnorme Akkumulierung von A-Beta eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der AD spielt. Erstens ist A-Beta das Protein, das in Amyloidplaques hauptsächlich vorliegt. Zweitens ist A-Beta neurotoxisch und kann mit dem bei AD-Patienten auftretenden Absterben von Neuronen ursächlich in Zusammenhang gebracht werden. Drittens können Missense-DNA-Mutationen an der Position 717 in der 770-lsoform von APP bei betroffenen Mitgliedern, nicht jedoch bei nicht-betroffenen Mitgliedern mehrerer Familien mit einer genetisch bestimmten (familiären) Form der AD festgestellt werden. Ausserdem wurden verschiedene andere APP-Mutationen in familiären Formen der AD beschrieben. Viertens wurden ähnliche neuropathologische Veränderungen in transgenen Tieren festgestellt, die mutierte Formen des menschlichen APP überexprimieren. Fünftens weisen Individuen mit Down-Syndrom eine erhöhte Gendosis von APP auf und entwickeln eine früh einsetzende AD.

[0009] Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass Ablagerungen von A-Beta mit der AD in einem ursächlichen Zusammenhang stehen.

[0010] Es gibt die Hypothese, dass die Hemmung der A-Beta-Produktion dazu führt, dass die neurologische Degeneration verhindert und reduziert wird, wobei die Bildung von Amyloidplaques eingeschränkt, die Neurotoxizität abgeschwächt und allgemein die mit der A-Beta-Produktion einhergehende Pathologie gelindert wird. Ein mögliches Behandlungsverfahren würde somit auf Arzneistoffen beruhen, die die Bildung von A-Beta in vivo hemmen.

[0011] Behandlungsverfahren könnten an der Bildung von A-Beta durch die Enzyme angreifen, die an der proteolytischen Prozessierung von APP beteiligt sind. Verbindungen, die die Aktivität der Beta- oder Gamma-Sekretase entweder direkt oder indirekt hemmen, könnten die Produktion von A-Beta einschränken.

[0012] Die Beta-Sekretase wurde in mehreren Veröffentlichungen beschrieben, umfassend EP-Veröffentlichung Nr. EP 0 855 444, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 0 017 369, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 0 058 479, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 0 047 618 und PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 0 100 663 und WO 0 100 665.

[0013] Zwei Gene, BACE (Synonyme hierfür sind Asp-2, Memapsin-2) und BACE-2 (Synonyme hierfür sind Asp-1, Memapsin-1), codieren Beta-Sekretasen, die zur Familie der Membran-überspannenden Aspartat-Proteasen gehören. Vermutlich handelt es sich hierbei um die ersten Enzyme in der Kaskade des APP-Abbaus, wodurch das A-Beta-Peptid gebildet wird, welches für die Amyloid-Ablagerungen im Gehirn von AD-Patienten verantwortlich ist. Somit würde die Hemmung der Beta-Sekretase vor der AD schützen, indem der amyloidogene Stoffwechselweg des APP-Abbaus zu dem nicht-amyloidogenen Stoffwechselweg über die Alpha-Sekretase-Spaltung des APP umgeleitet wird.

[0014] Es wurde gefunden, dass BACE-/-Mäuse trotz der ubiquitären Expression von BACE in den meisten Geweben und trotz seiner hohen Expression im Gehirn und im Pankreas lebensfähig sind (Nature Neurosci. 4 (2001), 231–232). Dieses Ergebnis, nämlich dass bei den Mäusen keine mit dem BACE-Mangel zusammenhängenden negativen Effekte zu sehen sind, legt nahe, dass die Hemmung von BACE bei Menschen vermutlich keine Toxizität zur Folge hat, die dem Mechanismus zuzuschreiben wäre, ein Problem, das bei der Gamma-Sekretase vermutet wird, die die lebenswichtige «Notch»-Signalgebung kontrolliert.

[0015] Zelluläre Screeningverfahren nach Inhibitoren der A-Beta-Produktion, Testverfahren zur In-vivo-Suppression der A-Beta-Produktion und Tests mit Membranen oder Zellextrakten zum Nachweisen der Sekretase-Aktivität sind nach dem Stand der Technik bekannt und wurden in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, umfassend PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/22 493, US-Patent Nr. 5703 129 und US-Patent Nr. 5 593 846; die alle hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.

[0016] Der Standardtest für Beta-Sekretase ist ein Fluoreszenz-Test, der auf der Spaltung eines Peptidsubstrats beruht, das eine Fluorophore und einen Löscher trägt. Wenn dieser Test für Screening-Zwecke eingesetzt wird, ist er anfällig für «falsch-positive Ergebnisse», und zwar entweder weil die Verbindungen eine Eigenfluoreszenz zeigen oder stark gefärbt sind, oder weil sie das Enzym absorbieren und aus der Lösung ausfällen. Aus diesem Grund wäre ein anderer Test für ein Inhibitor-Screening von grossem Wert.

[0017] Erstaunlicherweise wurde gefunden, dass Übergangsstadium-Mimetika von Beta-Sekretasen, die mit einer ausreichend hohen Radioaktivität markiert sind, als direkte Sonde für die am aktiven Zentrum erfolgende Bindung an die Beta-Sekretase eingesetzt werden können.

[0018] Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen, der die folgenden Schritte umfasst: Immobilisieren eines Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge auf einem festen Träger, Inkontaktbringen dessen mit einer Testverbindung in Gegenwart eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, und Vergleichen des Ausmasses der Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung, um zu bestimmen, ob die Testverbindung ein Inhibitor von Beta-Sekretasen ist. Fig. 1:<sep>Formeln von Baueinheiten der Formel (I) Fig. 2:<sep>Formeln von tritiierten Baueinheiten der Formel (I), wobei Tritium als T dargestellt ist. Fig. 3:<sep>Die graphische Darstellung zeigt die Hemmkurven, die durch veröffentlichte peptidomimetische Inhibitoren (Peptid H-4848 (Bachem), beschrieben in Nature 402 (1999), 537; und Peptid H-5108 (Bachem), beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 122 (2000), 3522) und andere auf das aktive Zentrum gerichtete Inhibitoren erhalten werden. Sie zeigt ausserdem, dass der Test nicht empfindlich ist gegenüber stark gefärbten Verbindungen (Kongorot) oder den «klebrigen Verbindungen», die früher im FRET-Test als falsch-positiv eingestuft wurden Fig. 4:<sep>Gleichgewicht der Bindung einer tritiierten Verbindung A an gereinigtes BACE, wie in Beispiel 6 (A) beschrieben. Die Scatchard-Analyse zeigt eine Isotherme einer einzelnen Bindungsstelle und eine kompetitive Hemmung durch das Peptid H-4848 (B). Fig. 5:<sep>Test von peptidomimetischen Verbindungen als Beta-Sekretase-Inhibitoren im Test der vorliegenden Erfindung über ein breites Spektrum von IC-50-Werten (A). Korrelation von IC-50-Werten für 19 peptidomimetische BACE-Inhibitoren, die durch den FRET-Test und den kompetitiven Radioligand-Bindungstest erhalten wurden (B). Fig. 6:<sep>Wirkung von BSA auf die Hemmung der Bindung, erläutert in einem Streudiagramm (% der Kontroll-dpm im Platten (P)- und im Säulen (C)-Pool (3200 Punkte)). Das Ergebnis erläutert die Heterogenität der Hemmung der Bindung, die ohne BSA im Bindungspuffer festgestellt wurde. Idealerweise sollte jede Verbindung, die durch einen Punkt dargestellt ist, im Säulen-Pool und im Platten-Pool die identische Hemmung ergeben und somit auf der Diagonallinie liegen (A). Die Hemmung der Bindung ohne BSA, dargestellt in einem Streudiagramm (% der Kontroll-dpm im Platten (P)- und im Säulen (C)-Pool (3200 Punkte)). Dieses Ergebnis erläutert die Homogenität der Hemmung der Bindung, die mit BSA im Bindungspuffer festgestellt wurde (B). Fig. 7:<sep>Dosisabhängige Hemmung der Radioligand-Bindung durch die Verbindung H-4848 (Bachem, beschrieben in Nature 402 (1999), 537) unter Einfluss von 0,02% Cholsäure (gefüllte Kreise), 0,02% Tween 20 (leere Kreise) und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA, gefüllte Dreiecke).

[0019] Die vorliegende Erfindung stellt einen Test zur Identifizierung von Beta-Sekretase-Inhibitoren bereit, der die folgenden Schritte umfasst: Immobilisieren eines Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge auf einem festen Träger, Zufügen einer Testverbindung und anschliessend eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, Inkubieren der Testkomponenten bis zum Bindungsgleichgewicht, und Messen des gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitors.

[0020] Der hier verwendete Begriff «Beta-Sekretase» ist als eine Aspartyl-Protease definiert, die den N-Terminus von A-Beta erzeugt. Bevorzugte Beta-Sekretasen sind menschliche BACE und BACE-2. Am stärksten bevorzugt sind menschliche BACE und BACE-2, die durch die Nucleotidsequenzen codiert sind, wie in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 dargestellt. Die Beta-Sekretase ist eine Beta-Sekretase der vollen Länge. Beta-Sekretasen können Aminosäuresubstitutionen enthalten, sofern solche Substitutionen die Beta-Sekretase-Aktivität nicht allgemein verändern. Aminosäuresubstitutionen in Proteinen und Polypeptiden, die die biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflussen, sind dem Fachmann bekannt und werden von H. Neurath und R. L. Hill in: «The Proteins», Academic Press, New York, (1979), beschrieben. Sechs allgemeine Klassen von Aminsosäureketten, die wie vorstehend beschrieben eingeteilt sind, umfassen: Klasse I (Cys); Klasse II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Klasse III (Asn, Asp, Gln, Glu); Klasse IV (His, Arg, Lys); Klasse V (IIe, Leu, Val, Mat); und Klasse VI (Phe, Tyr, Trp). Beta-Sekretasen können zusätzlich noch Sequenzen mit mehreren Aminosäuren enthalten, die durch «Linker»-Sequenzen codiert sind. Diese Sequenzen kommen aus den Expressionsvektoren zustande, die für die rekombinante Expression von Beta-Sekretasen verwendet werden. Beta-Sekretasen der vorliegenden Erfindung können auch spezifische Sequenzen enthalten, die am N- oder am C-Terminus angehängt sind und die vorzugsweise an ein Affinitäts-Trägermaterial binden. Beispiele solcher Sequenzen sind Sequenzen, die mindestens zwei angrenzende Histidinreste enthalten (vgl. Europäisches Patent Nr. EP 282 042). Solche Sequenzen binden selektiv an Nitrilotriessigsäure-Nickelchelat-Harze. Beta-Sekretasen, die eine solche spezifische Sequenz enthalten, können somit selektiv von den restlichen Polypeptiden abgetrennt oder zur Immobilisierung an einen festen Träger angehängt werden. Die cDNA-Sequenz der Beta-Sekretase BACE, die sechs C-terminale His-Reste codiert, ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt.

[0021] In diesem Test kann eine natürliche oder eine rekombinant hergestellte Beta-Sekretase verwendet werden. Ein «rekombinantes Protein» ist ein Protein, das durch die Expression in einer heterologen Zelle isoliert, gereinigt oder identifiziert wird, wobei die Zelle mit einem rekombinanten Expressionsvektor entweder transient oder stabil transduziert oder transfiziert wurde, der gentechnisch so hergestellt wurde, dass er die Expression des Proteins in der Wirtszelle steuert. Die rekombinante Beta-Sekretase kann in prokaryotischen Zellen, z.B. E. coli, in Hefen, z.B. S. pombe, oder in eukaryotischen Zellen, z.B. HEK 293, Sf9-Insektenzellen, hergestellt werden. Vorzugsweise werden Sf9-Insektenzellen für eine hohe Expression einer rekombinanten Beta-Sekretase verwendet. Die im Test eingesetzte Beta-Sekretase kann gereinigt werden. Der hier verwendete Begriff «gereinigt» bezieht sich auf Polypeptide, die aus ihrer natürlichen Umgebung oder aus der Quelle der rekombinanten Produktion entfernt, isoliert oder getrennt wurden, und die zu mindestens 60% und stärker bevorzugt mindestens 80% frei von anderen Komponenten, z.B. Membranen und Mikrosomen, sind, mit denen sie von Natur aus assoziiert sind. Trotzdem schliesst ein solcher Begriff nicht das Vorliegen in der gleichen Probe von Spleiss- oder anderen Proteinvarianten (Glykosylierungsvarianten) in der gleichen, ansonsten homogenen Probe aus.

[0022] Ein Protein oder Polypeptid wird im Allgemeinen als «im Wesentlichen gereinigt» angesehen, wenn eine Probe, die es enthält, auf einem elektrophoretischen, mit Coomassie gefärbten Acrylamid-Gel eine Hauptproteinbande zeigt.

[0023] Der hier verwendete Begriff «Immobilisieren» kann ein direktes Immobilisieren von Beta-Sekretase auf einem festen Träger oder ein indirektes Immobilisieren von Beta-Sekretase über einen angehängten Linker oder unter Verwendung eines zusätzlichen Linkers sein. Der angehängte Linker kann aus Histidinresten bestehen, oder der Linker kann Streptavidin oder ein Antikörper sein, vorzugsweise ein gegen Beta-Sekretase gerichteter Antikörper. Der feste Träger kann Mikroplatten oder Kügelchen darstellen. Vorzugsweise können die in diesem Test verwendeten Mikroplatten weiss oder schwarz sein, bevorzugt sind weisse Optiplatten (Optiplate Packard). Die Beschichtungsreaktion wird mit einer Proteinkonzentration von 1 µg/ml bis 50 µg/ml, vorzugsweise 10 µg/ml, durchgeführt. Für die Beschichtungsreaktion wird ein Puffer auf einen pH-Bereich von 3 bis 8, vorzugsweise auf einen pH-Bereich von 5 bis 6, eingestellt. Am stärksten bevorzugt ist ein Citratpuffer, der auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt ist.

[0024] Der Bindungspuffer, in dem der Bindungstest durchgeführt wird, kann ein Puffer sein, der auf einen pH-Bereich von 2,5 bis 6 eingestellt ist. Vorzugsweise ist der Puffer ein Citrat- oder Acetatpuffer, der auf einen pH-Bereich von 3,5 bis 4,5 eingestellt ist. Am stärksten bevorzugt ist ein Citratpuffer mit einem pH-Wert von 4,1. Der Bindungspuffer kann ein Protein mit hohem Molekulargewicht enthalten, dessen Vorliegen eine unspezifische Bindung verhindert. Vorzugsweise ist das Protein BSA (Fig. 6A und 6B). Am stärksten bevorzugt beträgt die Konzentration von BSA im Bindungspuffer 0,1% (Gew./Vol.). Der Bindungspuffer kann auch ein nicht-ionisches Detergens oder ein ionisches Detergens enthalten. Das nicht-ionische Detergens ist vorzugsweise Tween-20. Das ionische Detergens ist vorzugsweise Cholsäure oder Desoxycholsäure. Stärker bevorzugt ist das ionische Detergens Cholsäure. Am stärksten bevorzugt beträgt die Konzentration des nicht-ionischen oder des ionischen Detergens im Bindungspuffer 0,02%. Das Vorliegen von Cholsäure im Bindungspuffer könnte den IC-50-Wert einer Testsubstanz im Vergleich zum Vorliegen von Tween-20 weiter um das Drei- bis Vierfache reduzieren (Fig. 7). Die Komponenten des Tests werden zehn Minuten bis 24 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4°C inkubiert, bis das Bindungsgleichgewicht eingestellt ist. Vorzugsweise werden die Testverbindungen 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

[0025] Der hier verwendete Begriff «Beta-Sekretase-Inhibitor» soll eine Verbindung bedeuten, die spezifisch an das aktive Zentrum von Beta-Sekretase bindet und dadurch die Spaltung eines natürlichen Beta-Sekretase-Substrats, z.B. APP, hemmt. Die vorliegende Erfindung betrifft kompetitive Bindungs-Studien zum Screening nach Inhibitoren, die für das aktive Zentrum der Beta-Sekretase spezifisch sind. Wenn die Ergebnisse, die mit den Testverbindungen im Kompetitionstest der vorliegenden Erfindung erhaltenen wurden, mit den in einem FRET-Test erhaltenen Ergebnissen verglichen wurden (Fig. 5A und 5B), konnte gezeigt werden, dass die Testverbindungen, die die Bindung eines markierten Beta-Sekretase Inhibitors an Beta-Sekretase hemmen, auch die proteolytische Aktivität von Beta-Sekretase, die zur Produktion von A-Beta führt, über ein breites Spektrum von IC-50-Werten hemmen. Somit kann die Bindung von markierten Beta-Sekretase-Inhibitoren an isolierte Beta-Sekretase eingesetzt werden, um Inhibitoren der A-Beta-Produktion anhand von kompetitiven Bindungstests zu identifizieren. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass kompetitive Bindungstests mit markierten Beta-Sekretase-Inhibitoren nicht gegenüber stark gefärbten Verbindungen (Kongorot) oder «klebrigen Verbindungen» empfindlich sind, die früher in anderen Testformaten zu falsch-positiven Ergebnissen führten (Fig. 3).

[0026] Hierin beschrieben sind Beta-Sekretase-Inhibitoren, die peptidomimetische Verbindungen sind, welche auf einem nicht-spaltbaren Übergangsstadium-Mimetikum beruhen. Die Beta-Sekretase-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind Peptidomimetika der Formel (I): Y-P4-P3-P2-P1-P1 ́-P2 ́-P3 ́-P4 ́-W, wobei P1 als Leustatin, Chastatin oder Tyrstatin definiert ist, P2 als Asn definiert ist, P3 als Val, Cpe, Che oder Cha definiert ist, P4 als Glu definiert ist, P1 ́ als Val definiert ist, P2 ́ als Ala definiert ist, P3 ́ als Glu definiert ist, P4 ́ als Tyr, Cha, Phe(l) oder Tyr (I2) definiert ist, Y als keinen, einen oder mehrere Aminosäurereste definiert ist, W als keinen, einen oder mehrere Aminosäurereste definiert ist, sowie Kombinationen davon. Vorzugsweise ist Y keine Aminosäure. Vorzugsweise ist W keine Aminosäure. Die Formeln von Leustatin, Chastatin, Tyrstatin, Cpe, Che und Cha sind in Fig. 1definiert.

[0027] Die in dem erfindungsgemässen Test verwendeten Beta-Sekretase-Inhibitoren sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Spezifische Beispiele der Formel (I) sind die Verbindungen A, B, C und D, die am Ende der Tabelle angegeben sind: <3> Verbindung Nr.<sep>Inhibitor<sep><sep>IC-50 FRET<sep>(µM) H-RLBA H-5108<sep>Glu-Val-Asn-<sep>O-Ala-Glu-Phe<sep>0.29<sep>0.1 5512<sep>DiPropN-<sep>Renin- Cyclhexacid<sep>19<sep>7.5 3268<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Alasta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>1.7<sep>2 3271<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Phesta-Val-Ala- Glu-Phe-NH2<sep>0.09<sep>0.15 3616<sep>Hyp-Ava-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>1000<sep>1000 3617<sep>Hyp-Abu-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>1000<sep>1000 3618<sep>Hyp-Apro-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>140<sep>130 3619<sep>Hyp-Cmp-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>1000<sep>1000 3620<sep>Hyp-Alasta-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>170<sep>135 3621<sep>Hyp-Valsta-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>18<sep>22.2 3622<sep>Hyp-Leusta-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>25<sep>45.7 3623<sep>Hyp-Val-Asn-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>10<sep>9.5 3273<sep>Glu-Gly-Asn-<sep>TyrOBzsta-Val-Ala- Glu-Phe-<sep>25<sep>15 3363<sep>Hyp-Ava-<sep>TyrOBzsta-Val-Ala-NH2<sep>40<sep>30 1733<sep>Glu-Ala-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>4.7<sep>7 1753<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>0.12<sep>0.15 1756<sep>Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>80<sep>100 1736<sep><sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>1000<sep>1000 2062<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-NH2<sep>0.75<sep>0.2 <sep><sep><sep><sep> D<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Tyr-NH2<sep>0.05<sep>0.05 C<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Cha-NH2<sep>0.18<sep>0.05 B<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe(I)-NH2<sep>0.09<sep>0.03 A<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Tyr(I2)-NH2<sep>0.06<sep>0.02

[0028] Die Übergangsstadium-Analoga innerhalb der Peptide sind untereinander angeordnet. O ist wie in Science 290 (2000), 150–153, definiert. Hyp ist als Hydroxyprolin definiert, Ava ist als δ-Aminovaleriansäure definiert, Abu ist als γ-Aminobuttersäure definiert, Apro ist als β-Aminopropionsäure definiert, Cmp ist als Carboxymethylpiperidin und TyrOBzsta als Tyrosyl-O-benzylstatin definiert.

[0029] Die peptidomimetischen Beta-Sekretase-Inhibitoren können chemisch synthetisiert werden, indem Standardverfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, vorzugsweise Festphasenverfahren, wie die Verfahren von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149–2154) und Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press Oxford, 1989).

[0030] Ausserdem werden im erfindungsgemässen Test Beta-Sekretase-Inhibitoren der Formel (I) für die Herstellung von markierten Beta-Sekretase-Inhibitoren und Beta-Sekretase-Inhibitoren der Formel (I), die markiert sind, eingesetzt.

[0031] Der hier verwendete Begriff «markierter Beta-Sekretase-Inhibitor» soll «Beta-Sekretase-lnhibitor»-Verbindungen bedeuten, die markiert sind. Mit «markiert» oder «markierter Beta-Sekretase-lnhibitor» ist gemeint, dass die betreffenden Inhibitorverbindungen eine Markierung enthalten, die in einem Testsystem oder bei Verabreichung an einen Säuger nachgewiesen werden kann. Geeignete Markierungen sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Radioisotope, fluoreszierende Gruppen, Biotin (in Verbindung mit der Streptavidin-Komplexierung) und Photoaffinitätsgruppen. Geeignete Radioisotope sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Isotope von Halogenen (wie Chlor, Fluor, Brom und lod) und Metalle, umfassend Technetium und Indium. Bevorzugte Radioisotope umfassen <3>H, <11>C, <18>F, <32>P, <33>P, <35>S, <123>l, <125>l und <131>l. Am stärksten bevorzugt sind <3>H, <125>l und <131>l. Die radiomarkierten Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren zur Radiomarkierung hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Geeignete Syntheseverfahren werden nachstehend ausführlich beschrieben. Die Beta-Sekretase-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung können entweder direkt (d.h. durch Einbau der Radiomarkierung direkt in die Verbindungen) oder indirekt radiomarkiert werden (d.h. durch Einbau der Radiomarkierung in die Verbindungen über ein Chelat-bildendes Mittel, wobei das Chelat-bildende Mittel in die Verbindungen eingebaut wurde). Ausserdem kann die Radiomarkierung isotopisch oder nicht-isotopisch sein. Bei einer isotopischen Radiomarkierung wird ein Atom oder eine Gruppe von Atomen, das/die bereits in den erfindungsgemässen Verbindungen vorliegt, durch das Radioisotop substituiert (ausgetauscht).

[0032] Bei einer nicht-isotopischen Radiomarkierung wird das Radioisotop zu den Verbindungen zugefügt, ohne dass eine bereits vorliegende Gruppe substituiert (ausgetauscht) wird. Direkt und indirekt radiomarkierte Verbindungen, ausserdem isotopische und nicht-isotopische radiomarkierte Verbindungen sind in dem Begriff «radiomarkierte Beta-Sekretase-Inhibitoren» eingeschlossen, der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

[0033] Eine solche Radiomarkierung sollte angemessen stabil sein, sowohl chemisch als auch metabolisch, wobei anerkannte Standards nach dem Stand der Technik angewendet werden. Obwohl die Verbindungen der Erfindung durch ein grosses Spektrum von Techniken mit einer Vielfalt von unterschiedlichen Radioisotopen markiert werden können, wie dem Fachmann bekannt ist, sollte eine solche Radiomarkierung in einer Art und Weise durchgeführt werden, dass die hohe Bindungsaffinität und Spezifität des unmarkierten oder nicht mit Markierung versehenen Beta-Sekretase-Inhibitors zu der Beta-Sekretase nicht signifikant beeinträchtigt wird. Mit «nicht signifikant beeinträchtigt» ist gemeint, dass die Bindungsaffinität und Spezifität nicht mehr als etwa 2 log Einheiten beeinträchtigt wird, vorzugsweise nicht mehr als etwa 2 log Einheiten und stärker bevorzugt nicht mehr als etwa 1 log Einheit, noch stärker bevorzugt nicht mehr als etwa 500% und noch stärker bevorzugt nicht mehr als etwa 250%, und am stärksten bevorzugt wird die Bindungsaffinität und Spezifität überhaupt nicht beeinträchtigt.

[0034] Bei den radiomarkierten Beta-Sekretase-Inhibitoren kann die Markierung an jeder beliebigen Position auf dem Beta-Sekretase-Inhibitor erscheinen und eines, zwei oder mehrere radioaktive Isotope aufweisen, die in die Struktur eingebaut sind. Bevorzugte radiomarkierte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Beta-Sekretase-Inhibitoren, die mit Tritium radiomarkiert sind. Stärker bevorzugte radiomarkierte Verbindungen der Erfindung sind radiomarkierte Verbindungen der Formel (I), in denen eines, zwei oder mehrere radioaktive Isotope in die Struktur eingebaut sind und wobei die Radiomarkierung auf P1, P3 und/oder P4 ́ liegt. Am stärksten bevorzugt sind Beta-Sekretase-Inhibitoren der Formel (I), in denen die Radiomarkierung auf P1, P3 und/oder P4 ́ <3>H oder <123>l, <125>l oder <131>l ist. Fig. 2 zeigt tritiierte Baueinheiten der Formel (I), die an den Positionen P1, P3 und P4 ́ eingebaut sein können.

[0035] Wie in Beispiel 4 beschrieben, kann ein Beta-Sekretase-Inhibitor der Formel (I) mit Diiodtyrosin an Position P4 ́ (Verbindung A) für die Radiomarkierung ausgewählt werden, weil das lod durch eine Reduktion auf Palladium gegen <3>H ausgetauscht werden kann. Die Reduktion ergibt eine Verbindung, die von der Verbindung A chemisch nicht zu unterscheiden ist.

[0036] Der radiomarkierte Beta-Sekretase-Inhibitor kann eine spezifische Aktivität im Bereich von 500 mCi/mMol bis 60 Ci/mMol aufweisen. Vorzugsweise hat er eine spezifische Aktivität von 55 Ci/mMol. Der gebundene radiomarkierte Beta-Sekretase-Inhibitor kann durch Zugabe eines Szintillators gemessen werden. Vorzugsweise ist der Szintillator MicrScint20 oder Microscint40 (Packard).

[0037] Andererseits ist dem Fachmann bekannt, dass im Radioligand-Kompetitions-Bindungstest der vorliegenden Erfindung ein Szintillations-Näherungstest (SPA) eingesetzt werden kann. Z.B. können gereinigte Proteine auf dem SPA-Träger immobilisiert werden, anschliessend wird der Träger dann mit einem markierten Beta-Sekretase-Inhibitor in Gegenwart einer Testverbindung inkubiert. Der SPA-Träger verstärkt aufgrund seiner Konstruktion das radioaktive Szintillationssignal der gebundenen radioaktiven Verbindungen, während er das Signal der frei in der Lösung vorliegenden radioaktiven Verbindungen nicht verstärkt. Deshalb kann der gebundene markierte Beta-Sekretase-Inhibitor nachgewiesen und durch Szintillationszählung in Gegenwart des freien markierten Beta-Sekretase-Inhibitors quantitativ bestimmt werden.

[0038] Es ist so zu verstehen, dass der Prozess der Trennung des gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitors vom freien markierten Beta-Sekretase-Inhibitor anhand verschiedener Verfahren durchgeführt werden kann. Z.B. umfasst der Trennprozess, ist jedoch nicht beschränkt auf Waschen, Filtration oder Zentrifugation. Der Trennprozess soll die quantitative Bestimmung des gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitors erleichtern. Aus diesem Grund soll der Trennprozess auch homogene Techniken umfassen, z.B. SPA, wobei der freie markierte Beta-Sekretase-Inhibitor in situ nicht vom gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitor abgetrennt wird.

[0039] Die vorstehenden radiomarkierten Verbindungen können im erfindungsgemässen Test und Verfahren als Beta-Sekretase-Inhibitoren eingesetzt werden. Die radiomarkierten Verbindungen der Erfindung sind auch für therapeutische Zwecke und für radio-bildgebende Verfahren (Q. J. Nucl. Med. 41 (2) (1997), 163–169) und PET-bildgebende Verfahren zu verwenden (Clin. Geriatr. Med. 17 (2) (2001), 255–279).

[0040] Der hier verwendete Begriff «Testverbindung» soll eine beliebige Verbindung bedeuten, die auf die Hemmung der Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors an Beta-Sekretase gescreent wird, und die deshalb die Produktion von A-Beta hemmt, wobei der in der vorliegenden Erfindung beschriebene Test verwendet wird. Es ist so zu verstehen, dass eine «Testverbindung», die im erfindungsgemässen Test auf die Hemmung der Bindung an BACE aktiv ist, anschliessend in dem erfindungsgemässen Test als ein «markierter Beta-Sekretase-Inhibitor», wie vorstehend definiert, verwendet werden kann, sobald die Verbindung markiert wurde. Es ist ausserdem so zu verstehen, dass eine «Testverbindung», die im erfindungsgemässen Test wirksam die Bindung an BACE hemmt, anschliessend in Arzneimitteln zur Behandlung von degenerativen neurologischen Störungen, die eine Produktion von A-Beta umfassen, vorzugsweise zur Behandlung der AD eingesetzt werden kann.

[0041] Der hier verwendete Begriff «gebundener, markierter» Beta-Sekretase-Inhibitor soll die Gesamtbindung eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors bedeuten, einschliesslich spezifischer und unspezifischer Bindung. Die unspezifische Bindung wird durch Kompetition mit einer Sättigungskonzentration eines anderen bekannten Beta-Sekretase-Inhibitors bestimmt. Die spezifische Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors wird sodann durch Subtrahieren der unspezifischen Bindung von der Gesamtbindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors ermittelt.

[0042] Der hier verwendete Begriff «Hemmkonzentration» soll die Konzentration bedeuten, bei der die in dem erfindungsgemässen Test gescreente Verbindung, «der mögliche Inhibitor von Beta-Sekretase», 50% eines markierten Inhibitors ersetzt. Beispiele von «Hemmkonzentrations»-Werten liegen im Bereich von IC-50 bis IC-90 und sind vorzugsweise IC-50, IC-60, IC-70, IC-80 oder IC-90, die 50%, 60%, 70%, 80% bzw. 90% Ersatz des markierten Inhibitors bedeuten. Stärker bevorzugt wird die «Hemmkonzentration» als der IC-50-Wert gemessen. Es ist so zu verstehen, dass die Bezeichnung IC-50 die halbe maximale Hemmkonzentration bedeutet. Der IC-50-Wert eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, der im Test und im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, kann ≤ 5 µM betragen. Stärker bevorzugt ist der IC-50-Wert ≤ 1 µM. Am stärksten bevorzugt ist der IC-50-Wert ≤ 0,25 µM.

[0043] Die vorliegende Erfindung betrifft vorstehend beschriebenen Test, wobei der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor die Formel (I) aufweist.

[0044] Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen markierte Beta-Sekretase-Inhibitoren der Formel (I) für die Verwendung in dem wie vorstehend beschriebenen erfindungsgemässen Test dar.

[0045] Darüber hinaus wird die Verwendung eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors zur Identifizierung von Inhibitorverbindungen von Beta-Sekretasen beschrieben. Für diese Verwendung kann der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor die Formel (I) aufweisen, und er kann eine radioaktive Markierung oder spezifischer eine Tritium-Markierung umfassen.

[0046] Ausserdem werden Inhibitoren von Beta-Sekretasen beschrieben, die durch den Test und das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden. Diese können dann selbst zum Identifizieren neuer Inhibitoren von Beta-Sekretase eingesetzt werden.

[0047] Ferner kann durch die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel bereitgestellt werden, das einen pharmazeutisch verträglichen Träger und eine therapeutisch wirksame Menge eines Inhibitors von Beta-Sekretasen umfasst, der durch den Test und das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde; sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon.

[0048] Der Begriff «pharmazeutisch verträglich» wird hier verwendet, um die Verbindungen, Stoffe, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen zu bezeichnen, die nach der üblichen medizinischen Meinung für die Verwendung in Kontakt mit Geweben von Menschen und Tieren geeignet sind, ohne dass sie eine starke Toxizität, Reizung, allergische Reaktion oder ein anderes Problem oder eine andere Komplikation verursachen, wobei sie ein vernünftiges Nutzen-Risiko-Verhältnis aufweisen.

[0049] Der hier verwendete Begriff «pharmazeutisch verträgliche Salze» bezieht sich auf Derivate der beschriebenen Verbindungen, wobei die ursprüngliche Verbindung modifiziert wird, indem saure oder basische Salze davon hergestellt werden. Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Salzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Mineral- oder organische Säuresalze von basischen Resten, wie Aminen; Alkali- oder organische Salze von sauren Resten, wie Carbonsäuren; und dergleichen. Die pharmazeutisch verträglichen Salze umfassen die herkömmlichen nicht-toxischen Salze oder die quartären Ammoniumsalze der ursprünglichen Verbindung, die z.B. aus nicht-toxischen anorganischen oder organischen Säuren gebildet werden. Solche herkömmlichen nicht-toxischen Salze umfassen z.B. Salze, die von anorganischen Säuren stammen, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Sulfaminsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen; und die Salze, die aus organischen Säuren hergestellt wurden, wie Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Glykolsäure, Stearinsäure, Milchsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Pamoasäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Phenylessigsäure, Glutaminsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Sulfanilsäure, 2-Acefoxybenzoesäure, Fumarsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, Oxalsäure, Isethionsäure und dergleichen.

[0050] Die pharmazeutisch verträglichen Salze der vorliegenden Erfindung können aus der ursprünglichen Verbindung, die eine basische oder saure Gruppe enthält, durch herkömmliche chemische Verfahren synthetisiert werden. Im Allgemeinen können solche Salze hergestellt werden, indem die freien Säuren- oder Basenformen dieser Verbindungen mit einer stöchiometrischen Menge der geeigneten Base oder Säure in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel oder in einem Gemisch aus beiden umgesetzt wird; im Allgemeinen sind nicht-wässrige Medien, wie Ether, Essigsäureethylester, Ethanol, Isopropanol oder Acetonitril, bevorzugt. Listen mit geeigneten Salzen finden sich in Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, S. 1418, dessen Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

[0051] «Stabile Verbindung» und «stabile Struktur» sollen eine Verbindung bezeichnen, die ausreichend robust ist, um die Isolierung bis zu einem geeigneten Reinheitsgrad aus einem Reaktionsgemisch und die Formulierung zu einem wirksamen Arzneimittel zu überleben.

[0052] Beta-Sekretase-Inhibitor-Verbindungen, die durch den Test der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, können zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit oder einer anderen zerebrovaskulären Amyloidose verwendet werden. Die durch den erfindungsgemässen kompetitiven Bindungstest identifizierten Inhibitoren von Beta-Sekretase können zur Behandlung von neurologischen Störungen oder anderen Störungen eingesetzt werden, an denen A-Beta, APP und/oder A-Beta/APP-assoziierte Makromoleküle und andere Makromoleküle beteiligt sind, die mit dem aktiven Zentrum der BACE-Bindung assoziiert sind.

[0053] Patienten, die an der Alzheimer-Krankheit oder einer anderen zerebrovaskulären Amyloidose leiden oder eine Prädisposition hierfür haben, können durch die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Dosis einer Verbindung an einen Patienten, die wirksam die Beta-Sekretase hemmt und die durch den Test oder das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, behandelt werden.

[0054] Die vorliegende Erfindung wurde nun allgemein beschrieben, zum besseren Verständnis sind die spezifischen Beispiele, die hier lediglich der Erläuterung dienen und in keiner Weise die Erfindung einschränken sollen, sofern nicht anders spezifiziert, in Verbindung mit den folgenden Figuren angegeben.

Beispiele

[0055] Im Handel verfügbare Reagenzien, die in den Beispielen angesprochen werden, wurden, sofern nichts anderes angegeben ist, gemäss den Anweisungen des Herstellers eingesetzt.

Beispiel 1: Clonierung und Expression von BACE

[0056] Eine die menschliche Aspartyl-Protease BACE und BACE-2 codierende cDNA wurde durch PCR modifiziert, und zwar in der 5 ́-nicht-codierenden Region durch eine Kozack-Sequenz, um die ribosomale Erkennung zu optimieren, und durch Austausch von GC-reichen Codons, um die Clonierungseffizienz zu optimieren, und am 3 ́-Prime-Ende durch Anfügen einer Sequenz, die 6 x His-Reste codiert, um eine rasche Reinigung des rekombinanten Proteins zu ermöglichen (SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2). Das Start-ATG liegt in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 an Position 16. Die Expression in Sf9-Insektenzellen (Glycoconj. J. 16 (2) (1999), 109–123) über einen rekombinanten Baculovirus führte zu höheren Ausbeuten als die Expression in E. coli, S. pombe oder HEK293-Zellen. Deshalb wurde die cDNA für die Expression in Insektenzellen als ein BamHI x Xbal-Fragment in den pFASTBAC1-Vektor (Life Technologies, Inc.) cloniert und das PCR-Produkt durch Sequenzierung bestätigt. Nach der Rekombination in das Baculovirusgenom wurde die gereinigte Virus-DNA in die Insektenzellen transformiert. Die Sf9-Zellen wurden bei 27°C in TC100-Medium (BioWhittaker) mit 5% (Vol./Vol.) fetalem Kälberserum gezüchtet. Virusstammlösungen wurden mit einem Titer von 1,5 × 10<9> pfu/ml hergestellt. Für die Produktion im grossen Massstab von BACE und BACE-2 wurden 24-Liter-Fermenter von Sf9-Zellen mit einer MOI von 1 infiziert.

Beispiel 2: Reinigung von BACE der vollen Länge

[0057] 50 g (Feuchtgewicht) Sf9-Zellen wurden in 750 ml PBS, 2% Triton X-100 suspendiert und mit einem Glashomogenisator von Hand homogenisiert. Das Homogenisat wurde 30 Min. auf Eis gerührt und anschliessend 20 Min. bei 100 000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf pH 8,0 eingestellt und auf eine 2,6 × 2,5 cm Ni<2><+> NTA-Sepharose-Säule (Qiagen, Bundesrepublik Deutschland) aufgetragen, die in 50 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, 100 mM NaCI, 0,1% Triton X-100, pH 8,0, äquilibriert worden war. Anschliessend wurde die Säule mit diesem Puffer und danach mit 50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 100 mM NaCI, 0,1% Triton X-100 gewaschen. Sodann wurde die Säule mit 50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 100 mM NaCI, 200 mM Imidazol, 0,1% Triton X-100 eluiert (10 Säulenvolumina). Die vereinigten Fraktionen, die BACE der vollen Länge enthielten, wurden über eine 5 ml HiTrap Q-Säule (Pharmacia, Schweiz) passiert und das ungebundene Material gesammelt. Dieses Material wurde anschliessend in 50 mM TrisHCI, pH 7,4, 10 mM NaCI, 0,1% Triton 10-fach verdünnt und erneut auf eine zweite 5 ml HiTrap Q-Säule aufgetragen, die in 50 mM TrisHCI, pH 7,4, 10 mM NaCI, 0,1% Triton X-100 äquilibriert worden war. Die Säule wurde in diesem Puffer gewaschen und mit einem Gradienten von 50 mM TrisHCI, pH 7,4, 1 M NaCI, 0,1% Triton X-100 eluiert (20 Säulenvolumina). Die BACE-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, gegen 50 mM TrisHCI, pH 8,0, 0,1% Triton X-100 dialysiert und auf eine Mono S HR5/5-Säule (Pharmacia, Schweiz) aufgetragen. Das ungebundene Material, das BACE enthielt, wurde vereinigt und bei 4°C gelagert.

Beispiel 3: Synthese der Peptidverbindung A

[0058] Eine Festphasensynthese mit kontinuierlichem Durchfluss erfolgte auf einem Pioneer™ Peptidsynthese-System, wobei vom Tenta Gel S RAM-Harz gestartet wurde (0,25 mMol/g; Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Bundesrepublik Deutschland), gemäss dem von Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press Oxford, 1989), beschriebenen Verfahren. Die gegenüber Basen labile Fmoc-Gruppe wurde zum Schutz der α-Aminogruppe eingesetzt. Seitenketten wurden mit den folgenden Schutzgruppen geschützt: -Asn(Trt) und Glu(OtBu). Für die Synthese wurden die kommerziell verfügbaren Fmoc-Statin (Neosystem) und Fmoc-3,5-diiod-L-tyrosin (Fluka) eingesetzt. Fmoc-Aminosäuren (2,5 Äquiv.) wurden mit einer äquivalenten Menge von O-(1,2-Dihydro-2-oxopyrid-1-yl)-N,N,N ́,N ́-tetramethyluronium-Tetrafluorborat (TPTU) und N,N-Diisopropylethylamin (Hünig-Base) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppen erfolgte mit 20% Piperidin in DMF. Glu(OBut)-Val-Asn(Trt)-Statin-Val-Ala-Glu(OtBu)-Tyr (l2)-amid Tenta Gel S-Harz (0,200 g) wurde mit einem Gemisch (5 ml) aus 95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% Triisopropylsilan in fünf Stunden erreicht. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und in Diethylether gegossen, und der Niederschlag wurde abfiltriert und aus Wasser gefriergetrocknet. Das rohe Peptid wurde durch eine präparative RP-HPLC gereinigt. Dabei wurde homogenes Glu-Val-Asn-Statin-Val-Ala-Glu-Tyr(l2)-NH2erhalten (Verbindung A; 12 mg, MH<+> = 1231,3). Andere Beta-Sekretase-Inhibitoren wurden entsprechend synthetisiert.

Beispiel 4: Tritiierung von Verbindung A

[0059]

[0060] 9,3 mg (0,0069 mMol) von Verbindung A wurden in 1 ml Methanol (Merck # 1.06009.1000) und 6 Tropfen Wasser gelöst. Nach Zugabe von 7 µl Triethylamin (Fluka Puriss # 90335) und 4 mg 10% Palladium auf Aktivkohle (Degussa Typ 101 ND) wurde die Suspension eine Stunde in einer Tritium-Gas-Atmosphäre gerührt. Hierfür wurde eine Tritiierungs-Apparatur von RC Tritec AG, 9053 Teufen, verwendet (Helv. Chim. Acta 68 (1985), 1880). Nach Entfernen der flüchtigen Tritiumkomponenten wurde der Rückstand in Methanol/Wasser 9/1 suspendiert. Nach einer kurzen Beschallung wurde die Suspension durch Millex-HV 0,45 µm filtriert (Katalog-Nr. SL HV013 NL). Das Filtrat wurde auf 100 ml Methanol/Wasser 9/1 verdünnt. Die <3>H-Gesamtaktivität betrug 108,54 mCi, und die radiochemische Reinheit war gemäss HPLC 84% (Säule Vydac 5 µ 4,6 × 250 mm, Fliessrate 1 ml/Min., Lösungsmittel A: 95% Wasser – 5% Acetonitril – 1% TFA; Lösungsmittel B: 10 mM TFA in Wasser/Acetonitril 3/1; Gradient B: 0 bis 40%, in 30 Min., Retentionszeit: 23,27 Min.; λ = 254 nm). Die spezifische Aktivität betrug 55 Ci/mMol, wie durch Massenspektrometrie bestimmt wurde. Das Millex-HV-Filter wurde mehrmals mit Wasser/Methanol 9/1 gespült, wodurch eine weitere Menge des Peptids mit 66 mCi erhalten wurde. Die Reinigung dieser Menge durch HPLC ergab 43,4 mCi der tritiierten Verbindung A, gemäss HPLC mit einer Reinheit von 100%. <3>H-NMR zeigte einen Einzelpeak nahe 7 ppm, so dass das Vorliegen von labilem Tritium ausgeschlossen werden konnte.

Beispiel 5: FRET-Test zur Charakterisierung neuer Beta-Sekretase-Inhibitoren

[0061] Alle Enzymtests wurden bei 20°C auf einem FLUOstar (BMG Lab Technologies, D-77656 Offenburg) unter Verwendung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (DYNEX Microfluor 2, Chantilly, VA, USA) durchgeführt. Das Testvolumen betrug 100 µl. Typischerweise wurden die in Dimethylsulfoxid gelösten Inhibitoren in verschiedenen Konzentrationen zu einer Vertiefung zugegeben, anschliessend folgten Puffer und Enzym. Die Dimethylsulfoxid-Konzentration wurde unter 4% gehalten. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe des Substrats gestartet. Die pH- und Puffer-Bedingungen, unter denen die Experimente durchgeführt wurden, sind in den Figur- und Tabellen-Legenden angegeben. Der Verlauf der Fluoreszenzzunahme wurde bei λEmmission= 520 nm mit einer Fluoreszenzanregung bei λAnregung= 430 nm gemessen. Die Reaktionskinetiken wurden während 30 Minuten bei verschiedenen Substratkonzentrationen regelmässig verfolgt. Die nachgewiesenen Signale wurden in Mol hybridisiertes Substrat pro Sekunde umgewandelt. Die kinetischen Werte wurden aus den Lineweaver-Burke-Diagrammen graphisch bestimmt. Es sollte beachtet werden, dass die durch Ändern der Substratkonzentration erhaltenen Ergebnisse um den Effekt der übermässigen Löschungskapazität korrigiert werden mussten, die für alle hier verwendeten FRET-Substrate typisch ist.

[0062] Die Tests wurden bei Enzymkonzentrationen durchgeführt, die einen linearen Ablauf der Produktbildung garantierten.

Beispiel 6: Kompetitiver Radioligand-Bindungstest (RLBA)

[0063] Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Optiplate Packard) werden mit dem gereinigten BACE-Protein beschichtet, wobei eine Konzentration von 1 µg/ml in 30 mM Natriumcitratpuffer, eingestellt auf pH 5,5, verwendet wird. Die Beschichtung erfolgt durch Inkubation von 100 µI/Vertiefung für einen bis drei Tage bei 4°C. Anschliessend wird die Platte mit 2 × 300 µI/Vertiefung 10 mM Citrat, pH 4,1, gewaschen. Zu jeder Vertiefung werden 100 µl Bindungspuffer (30 mM Citrat, 100 mM NaCI, 0,1% BSA, pH 4,1) zugegeben. Die Testverbindung (Peptid H-4848 in Fig. 4A und B) wird in 5 µl einer DMSO-Stammlösung oder geeigneter Verdünnungen zugefügt. Hierzu wird der Tracer (die tritiierte Verbindung A) in 10 µI/Vertiefung einer 10 µCi/ml Stammlösung in Bindungspuffer gegeben. Nach 1,5 bis 2 Stunden Inkubation in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur wird die Platte mit 2 × 300 µl Wasser pro Vertiefung gewaschen und auf einem trockenen Tuch abgeschnipst. Nach Zugabe von 50 µl MicroScint20 (Packard) pro Vertiefung wird die Platte versiegelt und fünf Sekunden vibriert. Die gebundene Radioaktivität wird auf einem Topcount (Packard) gezählt. Die gesamte Bindung liegt typischerweise zwischen 2000 und 10 000 cpm/Vertiefung, abhängig hauptsächlich von der Reinheit und der Konzentration des BACE-Proteins. Die unspezifische Bindung, die durch Kompetition mit > 1 µM Peptid H-4848 (Bachem # H-4848) bestimmt wurde, liegt typischerweise zwischen 30 und 300 cpm/Vertiefung. Die IC-50-Werte werden durch Microsoft Excel FIT berechnet.

Sequenzprotokoll

[0064]

Claims (11)

1. Test zum Identifizieren von Beta-Sekretase-Inhibitoren, der die folgenden Schritte umfasst: (a) Immobilisieren eines isolierten, im Wesentlichen gereinigten und rekombinant hergestellten Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge, (b) Zufügen einer Testverbindung und anschliessend eines markierten Beta-Sekretase-lnhibitors, (c) Inkubieren der Testkomponenten, und (d) Messen des gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitors.

2. Test nach Anspruch 1, wobei der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor ein Beta-Sekretase-Inhibitor der Formel I: Y-P4-P3-P2-P1-P1 ́-P2 ́-P3 ́-P4 ́-W ist, der markiert ist, wobei P1 als Leustatin, Chastatin oder Tyrstatin definiert ist, P2 als Asn definiert ist, P3 als Val, Cpe, Che oder Cha definiert ist, P4 als Glu definiert ist, P1 ́ als Val definiert ist, P2 ́ als Ala definiert ist, P3 ́ als Glu definiert ist, P4 ́ als Tyr, Cha, Phe(l) oder Tyr(I2) definiert ist, Y als keinen, einen oder mehrere Aminosäurereste definiert ist, und W als keinen, einen oder mehrere Aminosäurereste definiert ist, sowie Kombinationen davon.

3. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Beta-Sekretase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus BACE und BACE-2 besteht.

4. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor ein Beta-Sekretase-Inhibitor ist, der mit einer radioaktiven Markierung markiert ist.

5. Test nach Anspruch 4, wobei die radioaktive Markierung Tritium ist.

6. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor eine Hemmkonzentration von etwa oder weingier als 1µM aufweist.

7. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Komponenten des Tests in Bindungspuffer inkubiert werden, der BSA enthält.

8. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Komponenten des Tests in Bindungspuffer inkubiert werden, der ein nicht-ionisches Detergens enthält.

9. Test nach Anspruch 8, wobei das nicht-ionische Detergens Tween-20 ist.

10. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Komponenten des Tests in Bindungspuffer inkubiert werden, der ein ionisches Detergens enthält.

11. Test nach Anspruch 10, wobei das ionische Detergens aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cholsäure und Desoxycholsäure umfasst.