CH698246B1 - Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen. - Google Patents
Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen. Download PDFInfo
- Publication number
- CH698246B1 CH698246B1 CH02130/02A CH21302002A CH698246B1 CH 698246 B1 CH698246 B1 CH 698246B1 CH 02130/02 A CH02130/02 A CH 02130/02A CH 21302002 A CH21302002 A CH 21302002A CH 698246 B1 CH698246 B1 CH 698246B1
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- beta
- secretase
- sep
- test
- labeled
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 75
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title abstract description 25
- 108091007737 beta-secretases Proteins 0.000 title abstract description 18
- 239000002439 beta secretase inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 66
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 61
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102100021257 Beta-secretase 1 Human genes 0.000 claims description 21
- 101000894895 Homo sapiens Beta-secretase 1 Proteins 0.000 claims description 21
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 claims description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 11
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 10
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 8
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 7
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 claims description 5
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 4
- PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N Cladribine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 3
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002436 cladribine Drugs 0.000 claims description 3
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 24
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 7
- 101800001718 Amyloid-beta protein Proteins 0.000 description 28
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 102000014303 Amyloid beta-Protein Precursor Human genes 0.000 description 14
- 108010079054 Amyloid beta-Protein Precursor Proteins 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 9
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 6
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 5
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- -1 organic acid salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical group [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenesulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 5-aminopentanoic acid Chemical compound [NH3+]CCCCC([O-])=O JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 101710150192 Beta-secretase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003942 amyloidogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 125000003716 cholic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 102000044297 human BACE1 Human genes 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N isethionic acid Chemical compound OCCS(O)(=O)=O SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKNWCIROCRMKAY-NRFANRHFSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(4-hydroxy-3,5-diiodophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 IKNWCIROCRMKAY-NRFANRHFSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N (e)-2-hydroxybut-2-enedioic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(\O)C(O)=O UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- NYPYHUZRZVSYKL-UHFFFAOYSA-N -3,5-Diiodotyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 NYPYHUZRZVSYKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 2-Methylbenzenesulfonic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(carboxymethyl)amino]acetic acid;nickel Chemical compound [Ni].OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 2-phenylacetic acid Chemical compound O[14C](=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 0.000 description 1
- VRDBIJCCXDEZJN-UHFFFAOYSA-N 2-piperidin-1-ylacetic acid Chemical compound OC(=O)CN1CCCCC1 VRDBIJCCXDEZJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYPYHUZRZVSYKL-ZETCQYMHSA-N 3,5-diiodo-L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 NYPYHUZRZVSYKL-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 102000011792 Beta-secretase BACE Human genes 0.000 description 1
- 108050002211 Beta-secretase BACE Proteins 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000898643 Candida albicans Vacuolar aspartic protease Proteins 0.000 description 1
- 101000898783 Candida tropicalis Candidapepsin Proteins 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101000898784 Cryphonectria parasitica Endothiapepsin Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 240000001973 Ficus microcarpa Species 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012879 PET imaging Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 101000933133 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000910082 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000910079 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000910086 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000910088 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-5 Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101000898773 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Saccharopepsin Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008043 acidic salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004365 benzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- XAUTYMZTJWXZHZ-IGUOPLJTSA-K bismuth;(e)-1-n'-[2-[[5-[(dimethylamino)methyl]furan-2-yl]methylsulfanyl]ethyl]-1-n-methyl-2-nitroethene-1,1-diamine;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Bi+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-][N+](=O)\C=C(/NC)NCCSCC1=CC=C(CN(C)C)O1 XAUTYMZTJWXZHZ-IGUOPLJTSA-K 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 229960000415 diiodotyrosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- AFAXGSQYZLGZPG-UHFFFAOYSA-N ethanedisulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCS(O)(=O)=O AFAXGSQYZLGZPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 108091007739 gamma-secretases Proteins 0.000 description 1
- 102000038383 gamma-secretases Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 102000046783 human APP Human genes 0.000 description 1
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 229940045996 isethionic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000863 loss of memory Toxicity 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- LNOPIUAQISRISI-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxy-2-propan-2-ylsulfonylethanimidamide Chemical compound CC(C)S(=O)(=O)CC(N)=NO LNOPIUAQISRISI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000007121 neuropathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- WLJNZVDCPSBLRP-UHFFFAOYSA-N pamoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC=3C4=CC=CC=C4C=C(C=3O)C(=O)O)=C(O)C(C(O)=O)=CC2=C1 WLJNZVDCPSBLRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 229950000244 sulfanilic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052713 technetium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N technetium atom Chemical compound [Tc] GKLVYJBZJHMRIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen, der die folgenden Schritte umfasst: Immobilisieren eines Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge auf einem festen Träger, Inkontaktbringen dessen mit einer Testverbindung in Gegenwart eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, und Vergleichen des Ausmasses der Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung, um zu bestimmen, ob die Testverbindung ein Inhibitor von Beta-Sekretasen ist.
Description
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen, der die folgenden Schritte umfasst: Immobilisieren eines Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge auf einem festen Träger, Inkontaktbringen dessen mit einer Testverbindung in Gegenwart eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, und Vergleichen des Ausmasses der Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung, um zu bestimmen, ob die Testverbindung ein Inhibitor von Beta-Sekretasen ist.
[0002] Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine degenerative Hirnstörung, die klinisch durch einen zunehmenden Verlust des Gedächtnisses, der zeitlichen und örtlichen Orientierung, der Wahrnehmung, der Verständigung, des Urteilsvermögens und der emotionalen Stabilität gekennzeichnet ist. Die AD ist eine häufige Ursache für die progressive Demenz bei Menschen und eine der häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten. Die AD wurde weltweit bei allen Rassen und ethnischen Gruppen festgestellt und stellt gegenwärtig und auch für die Zukunft ein wichtiges Gesundheitsproblem dar. Zurzeit gibt es keine Behandlung, die die AD wirksam verhindert oder die klinischen Symptome und die zugrunde liegende Pathophysiologie lindert (eine Übersicht findet sich in Annu. Rev. Cell Biol. 10 (1994), 373–403).
[0003] Die histopathologische Untersuchung von Hirngewebe, das mittels Autopsie oder aus neurochirurgischen Proben von betroffenen Patienten erhalten wurde, zeigte, dass in der Hirnrinde solcher Patienten Amyloidplaques und neurofibrilläre Plaques vorliegen. Ähnliche Veränderungen wurden bei Patienten mit Trisomie 21 (Down-Syndrom) und hereditärer Hirnblutung mit Amyloidose des Dutch-Typs festgestellt.
[0004] Neurofibrilläre Plaques sind nicht-membrangebundene Bündel von abnormen proteinartigen Filamenten, bei denen biochemische und immunchemische Untersuchungen ergaben, dass die zugrunde liegende Proteinuntereinheit eine veränderte, phosphorylierte Form des tau-Proteins ist (eine Übersicht findet sich in Annu. Rev. Neurosci. 17 (1994), 489–517).
[0005] Biochemische und immunologische Untersuchungen zeigten, dass die hauptsächlich vorliegende proteinartige Komponente des Amyloidplaques ein etwa 4,2 Kilodalton (kD) grosses Protein mit etwa 39 bis 43 Aminosäuren ist. Dieses Protein wurde mit A-Beta-Amyloid-Peptid und manchmal mit Beta/A4 bezeichnet; hier wird es A-Beta genannt. A-Beta liegt, zusätzlich zu den Ablagerungen in Amyloidplaques, ausserdem in den Wänden von Meningeal- und Parenchymarteriolen, kleinen Arterien, Kapillaren und manchmal Venen vor. Im Jahr 1984 wurde A-Beta erstmals gereinigt und eine partielle Aminosäuresequenz davon beschrieben (Biochem. Biophys. Res. Commun. 120 (1984), 885–890). Die Isolierung und die Sequenzdaten für die ersten 28 Aminosäuren sind im US-Patent Nr. 4 666 829 beschrieben.
[0006] Während der letzen zehn Jahre gab es immer mehr deutliche Beweise dafür, dass A-Beta ein inneres Polypeptid ist, das von einem integralen Typ-1-Membranprotein abstammt, welches mit Beta-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) bezeichnet wird. Das APP wird normalerweise durch viele Zellen produziert, und zwar sowohl in vivo als auch in gezüchteten Zellen, die aus verschiedenen Tieren und Menschen stammen. A-Beta entsteht durch Spaltung von APP durch ein Enzym- (Protease-) System(e), diese werden zusammen Sekretasen genannt.
[0007] Das Vorliegen von mindestens vier proteolytischen Aktivitäten wurde postuliert. Sie umfassen Beta-Sekretase(n), die den N-Terminus von A-Beta erzeugen, Alpha-Sekretase(n), die etwa bei der 16/17-Peptidbindung in A-Beta spalten, und Gamma-Sekretasen, die C-terminale A-Beta-Fragmente erzeugen, welche an der Position 38, 39, 40, 42 und 43 enden, oder die C-terminale verlängerte Vorläufer erzeugen, die anschliessend zu den vorstehenden Polypeptiden verkürzt werden.
[0008] Mehrere Hinweise legen nahe, dass die abnorme Akkumulierung von A-Beta eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der AD spielt. Erstens ist A-Beta das Protein, das in Amyloidplaques hauptsächlich vorliegt. Zweitens ist A-Beta neurotoxisch und kann mit dem bei AD-Patienten auftretenden Absterben von Neuronen ursächlich in Zusammenhang gebracht werden. Drittens können Missense-DNA-Mutationen an der Position 717 in der 770-lsoform von APP bei betroffenen Mitgliedern, nicht jedoch bei nicht-betroffenen Mitgliedern mehrerer Familien mit einer genetisch bestimmten (familiären) Form der AD festgestellt werden. Ausserdem wurden verschiedene andere APP-Mutationen in familiären Formen der AD beschrieben. Viertens wurden ähnliche neuropathologische Veränderungen in transgenen Tieren festgestellt, die mutierte Formen des menschlichen APP überexprimieren. Fünftens weisen Individuen mit Down-Syndrom eine erhöhte Gendosis von APP auf und entwickeln eine früh einsetzende AD.
[0009] Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass Ablagerungen von A-Beta mit der AD in einem ursächlichen Zusammenhang stehen.
[0010] Es gibt die Hypothese, dass die Hemmung der A-Beta-Produktion dazu führt, dass die neurologische Degeneration verhindert und reduziert wird, wobei die Bildung von Amyloidplaques eingeschränkt, die Neurotoxizität abgeschwächt und allgemein die mit der A-Beta-Produktion einhergehende Pathologie gelindert wird. Ein mögliches Behandlungsverfahren würde somit auf Arzneistoffen beruhen, die die Bildung von A-Beta in vivo hemmen.
[0011] Behandlungsverfahren könnten an der Bildung von A-Beta durch die Enzyme angreifen, die an der proteolytischen Prozessierung von APP beteiligt sind. Verbindungen, die die Aktivität der Beta- oder Gamma-Sekretase entweder direkt oder indirekt hemmen, könnten die Produktion von A-Beta einschränken.
[0012] Die Beta-Sekretase wurde in mehreren Veröffentlichungen beschrieben, umfassend EP-Veröffentlichung Nr. EP 0 855 444, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 0 017 369, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 0 058 479, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 0 047 618 und PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 0 100 663 und WO 0 100 665.
[0013] Zwei Gene, BACE (Synonyme hierfür sind Asp-2, Memapsin-2) und BACE-2 (Synonyme hierfür sind Asp-1, Memapsin-1), codieren Beta-Sekretasen, die zur Familie der Membran-überspannenden Aspartat-Proteasen gehören. Vermutlich handelt es sich hierbei um die ersten Enzyme in der Kaskade des APP-Abbaus, wodurch das A-Beta-Peptid gebildet wird, welches für die Amyloid-Ablagerungen im Gehirn von AD-Patienten verantwortlich ist. Somit würde die Hemmung der Beta-Sekretase vor der AD schützen, indem der amyloidogene Stoffwechselweg des APP-Abbaus zu dem nicht-amyloidogenen Stoffwechselweg über die Alpha-Sekretase-Spaltung des APP umgeleitet wird.
[0014] Es wurde gefunden, dass BACE-/-Mäuse trotz der ubiquitären Expression von BACE in den meisten Geweben und trotz seiner hohen Expression im Gehirn und im Pankreas lebensfähig sind (Nature Neurosci. 4 (2001), 231–232). Dieses Ergebnis, nämlich dass bei den Mäusen keine mit dem BACE-Mangel zusammenhängenden negativen Effekte zu sehen sind, legt nahe, dass die Hemmung von BACE bei Menschen vermutlich keine Toxizität zur Folge hat, die dem Mechanismus zuzuschreiben wäre, ein Problem, das bei der Gamma-Sekretase vermutet wird, die die lebenswichtige «Notch»-Signalgebung kontrolliert.
[0015] Zelluläre Screeningverfahren nach Inhibitoren der A-Beta-Produktion, Testverfahren zur In-vivo-Suppression der A-Beta-Produktion und Tests mit Membranen oder Zellextrakten zum Nachweisen der Sekretase-Aktivität sind nach dem Stand der Technik bekannt und wurden in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, umfassend PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/22 493, US-Patent Nr. 5703 129 und US-Patent Nr. 5 593 846; die alle hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
[0016] Der Standardtest für Beta-Sekretase ist ein Fluoreszenz-Test, der auf der Spaltung eines Peptidsubstrats beruht, das eine Fluorophore und einen Löscher trägt. Wenn dieser Test für Screening-Zwecke eingesetzt wird, ist er anfällig für «falsch-positive Ergebnisse», und zwar entweder weil die Verbindungen eine Eigenfluoreszenz zeigen oder stark gefärbt sind, oder weil sie das Enzym absorbieren und aus der Lösung ausfällen. Aus diesem Grund wäre ein anderer Test für ein Inhibitor-Screening von grossem Wert.
[0017] Erstaunlicherweise wurde gefunden, dass Übergangsstadium-Mimetika von Beta-Sekretasen, die mit einer ausreichend hohen Radioaktivität markiert sind, als direkte Sonde für die am aktiven Zentrum erfolgende Bindung an die Beta-Sekretase eingesetzt werden können.
[0018] Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen, der die folgenden Schritte umfasst: Immobilisieren eines Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge auf einem festen Träger, Inkontaktbringen dessen mit einer Testverbindung in Gegenwart eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, und Vergleichen des Ausmasses der Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung, um zu bestimmen, ob die Testverbindung ein Inhibitor von Beta-Sekretasen ist. Fig. 1:<sep>Formeln von Baueinheiten der Formel (I) Fig. 2:<sep>Formeln von tritiierten Baueinheiten der Formel (I), wobei Tritium als T dargestellt ist. Fig. 3:<sep>Die graphische Darstellung zeigt die Hemmkurven, die durch veröffentlichte peptidomimetische Inhibitoren (Peptid H-4848 (Bachem), beschrieben in Nature 402 (1999), 537; und Peptid H-5108 (Bachem), beschrieben in J. Am. Chem. Soc. 122 (2000), 3522) und andere auf das aktive Zentrum gerichtete Inhibitoren erhalten werden. Sie zeigt ausserdem, dass der Test nicht empfindlich ist gegenüber stark gefärbten Verbindungen (Kongorot) oder den «klebrigen Verbindungen», die früher im FRET-Test als falsch-positiv eingestuft wurden Fig. 4:<sep>Gleichgewicht der Bindung einer tritiierten Verbindung A an gereinigtes BACE, wie in Beispiel 6 (A) beschrieben. Die Scatchard-Analyse zeigt eine Isotherme einer einzelnen Bindungsstelle und eine kompetitive Hemmung durch das Peptid H-4848 (B). Fig. 5:<sep>Test von peptidomimetischen Verbindungen als Beta-Sekretase-Inhibitoren im Test der vorliegenden Erfindung über ein breites Spektrum von IC-50-Werten (A). Korrelation von IC-50-Werten für 19 peptidomimetische BACE-Inhibitoren, die durch den FRET-Test und den kompetitiven Radioligand-Bindungstest erhalten wurden (B). Fig. 6:<sep>Wirkung von BSA auf die Hemmung der Bindung, erläutert in einem Streudiagramm (% der Kontroll-dpm im Platten (P)- und im Säulen (C)-Pool (3200 Punkte)). Das Ergebnis erläutert die Heterogenität der Hemmung der Bindung, die ohne BSA im Bindungspuffer festgestellt wurde. Idealerweise sollte jede Verbindung, die durch einen Punkt dargestellt ist, im Säulen-Pool und im Platten-Pool die identische Hemmung ergeben und somit auf der Diagonallinie liegen (A). Die Hemmung der Bindung ohne BSA, dargestellt in einem Streudiagramm (% der Kontroll-dpm im Platten (P)- und im Säulen (C)-Pool (3200 Punkte)). Dieses Ergebnis erläutert die Homogenität der Hemmung der Bindung, die mit BSA im Bindungspuffer festgestellt wurde (B). Fig. 7:<sep>Dosisabhängige Hemmung der Radioligand-Bindung durch die Verbindung H-4848 (Bachem, beschrieben in Nature 402 (1999), 537) unter Einfluss von 0,02% Cholsäure (gefüllte Kreise), 0,02% Tween 20 (leere Kreise) und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA, gefüllte Dreiecke).
[0019] Die vorliegende Erfindung stellt einen Test zur Identifizierung von Beta-Sekretase-Inhibitoren bereit, der die folgenden Schritte umfasst: Immobilisieren eines Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge auf einem festen Träger, Zufügen einer Testverbindung und anschliessend eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, Inkubieren der Testkomponenten bis zum Bindungsgleichgewicht, und Messen des gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitors.
[0020] Der hier verwendete Begriff «Beta-Sekretase» ist als eine Aspartyl-Protease definiert, die den N-Terminus von A-Beta erzeugt. Bevorzugte Beta-Sekretasen sind menschliche BACE und BACE-2. Am stärksten bevorzugt sind menschliche BACE und BACE-2, die durch die Nucleotidsequenzen codiert sind, wie in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 dargestellt. Die Beta-Sekretase ist eine Beta-Sekretase der vollen Länge. Beta-Sekretasen können Aminosäuresubstitutionen enthalten, sofern solche Substitutionen die Beta-Sekretase-Aktivität nicht allgemein verändern. Aminosäuresubstitutionen in Proteinen und Polypeptiden, die die biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflussen, sind dem Fachmann bekannt und werden von H. Neurath und R. L. Hill in: «The Proteins», Academic Press, New York, (1979), beschrieben. Sechs allgemeine Klassen von Aminsosäureketten, die wie vorstehend beschrieben eingeteilt sind, umfassen: Klasse I (Cys); Klasse II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Klasse III (Asn, Asp, Gln, Glu); Klasse IV (His, Arg, Lys); Klasse V (IIe, Leu, Val, Mat); und Klasse VI (Phe, Tyr, Trp). Beta-Sekretasen können zusätzlich noch Sequenzen mit mehreren Aminosäuren enthalten, die durch «Linker»-Sequenzen codiert sind. Diese Sequenzen kommen aus den Expressionsvektoren zustande, die für die rekombinante Expression von Beta-Sekretasen verwendet werden. Beta-Sekretasen der vorliegenden Erfindung können auch spezifische Sequenzen enthalten, die am N- oder am C-Terminus angehängt sind und die vorzugsweise an ein Affinitäts-Trägermaterial binden. Beispiele solcher Sequenzen sind Sequenzen, die mindestens zwei angrenzende Histidinreste enthalten (vgl. Europäisches Patent Nr. EP 282 042). Solche Sequenzen binden selektiv an Nitrilotriessigsäure-Nickelchelat-Harze. Beta-Sekretasen, die eine solche spezifische Sequenz enthalten, können somit selektiv von den restlichen Polypeptiden abgetrennt oder zur Immobilisierung an einen festen Träger angehängt werden. Die cDNA-Sequenz der Beta-Sekretase BACE, die sechs C-terminale His-Reste codiert, ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt.
[0021] In diesem Test kann eine natürliche oder eine rekombinant hergestellte Beta-Sekretase verwendet werden. Ein «rekombinantes Protein» ist ein Protein, das durch die Expression in einer heterologen Zelle isoliert, gereinigt oder identifiziert wird, wobei die Zelle mit einem rekombinanten Expressionsvektor entweder transient oder stabil transduziert oder transfiziert wurde, der gentechnisch so hergestellt wurde, dass er die Expression des Proteins in der Wirtszelle steuert. Die rekombinante Beta-Sekretase kann in prokaryotischen Zellen, z.B. E. coli, in Hefen, z.B. S. pombe, oder in eukaryotischen Zellen, z.B. HEK 293, Sf9-Insektenzellen, hergestellt werden. Vorzugsweise werden Sf9-Insektenzellen für eine hohe Expression einer rekombinanten Beta-Sekretase verwendet. Die im Test eingesetzte Beta-Sekretase kann gereinigt werden. Der hier verwendete Begriff «gereinigt» bezieht sich auf Polypeptide, die aus ihrer natürlichen Umgebung oder aus der Quelle der rekombinanten Produktion entfernt, isoliert oder getrennt wurden, und die zu mindestens 60% und stärker bevorzugt mindestens 80% frei von anderen Komponenten, z.B. Membranen und Mikrosomen, sind, mit denen sie von Natur aus assoziiert sind. Trotzdem schliesst ein solcher Begriff nicht das Vorliegen in der gleichen Probe von Spleiss- oder anderen Proteinvarianten (Glykosylierungsvarianten) in der gleichen, ansonsten homogenen Probe aus.
[0022] Ein Protein oder Polypeptid wird im Allgemeinen als «im Wesentlichen gereinigt» angesehen, wenn eine Probe, die es enthält, auf einem elektrophoretischen, mit Coomassie gefärbten Acrylamid-Gel eine Hauptproteinbande zeigt.
[0023] Der hier verwendete Begriff «Immobilisieren» kann ein direktes Immobilisieren von Beta-Sekretase auf einem festen Träger oder ein indirektes Immobilisieren von Beta-Sekretase über einen angehängten Linker oder unter Verwendung eines zusätzlichen Linkers sein. Der angehängte Linker kann aus Histidinresten bestehen, oder der Linker kann Streptavidin oder ein Antikörper sein, vorzugsweise ein gegen Beta-Sekretase gerichteter Antikörper. Der feste Träger kann Mikroplatten oder Kügelchen darstellen. Vorzugsweise können die in diesem Test verwendeten Mikroplatten weiss oder schwarz sein, bevorzugt sind weisse Optiplatten (Optiplate Packard). Die Beschichtungsreaktion wird mit einer Proteinkonzentration von 1 µg/ml bis 50 µg/ml, vorzugsweise 10 µg/ml, durchgeführt. Für die Beschichtungsreaktion wird ein Puffer auf einen pH-Bereich von 3 bis 8, vorzugsweise auf einen pH-Bereich von 5 bis 6, eingestellt. Am stärksten bevorzugt ist ein Citratpuffer, der auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt ist.
[0024] Der Bindungspuffer, in dem der Bindungstest durchgeführt wird, kann ein Puffer sein, der auf einen pH-Bereich von 2,5 bis 6 eingestellt ist. Vorzugsweise ist der Puffer ein Citrat- oder Acetatpuffer, der auf einen pH-Bereich von 3,5 bis 4,5 eingestellt ist. Am stärksten bevorzugt ist ein Citratpuffer mit einem pH-Wert von 4,1. Der Bindungspuffer kann ein Protein mit hohem Molekulargewicht enthalten, dessen Vorliegen eine unspezifische Bindung verhindert. Vorzugsweise ist das Protein BSA (Fig. 6A und 6B). Am stärksten bevorzugt beträgt die Konzentration von BSA im Bindungspuffer 0,1% (Gew./Vol.). Der Bindungspuffer kann auch ein nicht-ionisches Detergens oder ein ionisches Detergens enthalten. Das nicht-ionische Detergens ist vorzugsweise Tween-20. Das ionische Detergens ist vorzugsweise Cholsäure oder Desoxycholsäure. Stärker bevorzugt ist das ionische Detergens Cholsäure. Am stärksten bevorzugt beträgt die Konzentration des nicht-ionischen oder des ionischen Detergens im Bindungspuffer 0,02%. Das Vorliegen von Cholsäure im Bindungspuffer könnte den IC-50-Wert einer Testsubstanz im Vergleich zum Vorliegen von Tween-20 weiter um das Drei- bis Vierfache reduzieren (Fig. 7). Die Komponenten des Tests werden zehn Minuten bis 24 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4°C inkubiert, bis das Bindungsgleichgewicht eingestellt ist. Vorzugsweise werden die Testverbindungen 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
[0025] Der hier verwendete Begriff «Beta-Sekretase-Inhibitor» soll eine Verbindung bedeuten, die spezifisch an das aktive Zentrum von Beta-Sekretase bindet und dadurch die Spaltung eines natürlichen Beta-Sekretase-Substrats, z.B. APP, hemmt. Die vorliegende Erfindung betrifft kompetitive Bindungs-Studien zum Screening nach Inhibitoren, die für das aktive Zentrum der Beta-Sekretase spezifisch sind. Wenn die Ergebnisse, die mit den Testverbindungen im Kompetitionstest der vorliegenden Erfindung erhaltenen wurden, mit den in einem FRET-Test erhaltenen Ergebnissen verglichen wurden (Fig. 5A und 5B), konnte gezeigt werden, dass die Testverbindungen, die die Bindung eines markierten Beta-Sekretase Inhibitors an Beta-Sekretase hemmen, auch die proteolytische Aktivität von Beta-Sekretase, die zur Produktion von A-Beta führt, über ein breites Spektrum von IC-50-Werten hemmen. Somit kann die Bindung von markierten Beta-Sekretase-Inhibitoren an isolierte Beta-Sekretase eingesetzt werden, um Inhibitoren der A-Beta-Produktion anhand von kompetitiven Bindungstests zu identifizieren. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass kompetitive Bindungstests mit markierten Beta-Sekretase-Inhibitoren nicht gegenüber stark gefärbten Verbindungen (Kongorot) oder «klebrigen Verbindungen» empfindlich sind, die früher in anderen Testformaten zu falsch-positiven Ergebnissen führten (Fig. 3).
[0026] Hierin beschrieben sind Beta-Sekretase-Inhibitoren, die peptidomimetische Verbindungen sind, welche auf einem nicht-spaltbaren Übergangsstadium-Mimetikum beruhen. Die Beta-Sekretase-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind Peptidomimetika der Formel (I):
Y-P4-P3-P2-P1-P1 ́-P2 ́-P3 ́-P4 ́-W,
wobei P1 als Leustatin, Chastatin oder Tyrstatin definiert ist,
P2 als Asn definiert ist,
P3 als Val, Cpe, Che oder Cha definiert ist,
P4 als Glu definiert ist,
P1 ́ als Val definiert ist,
P2 ́ als Ala definiert ist,
P3 ́ als Glu definiert ist,
P4 ́ als Tyr, Cha, Phe(l) oder Tyr (I2) definiert ist,
Y als keinen, einen oder mehrere Aminosäurereste definiert ist,
W als keinen, einen oder mehrere Aminosäurereste definiert ist,
sowie Kombinationen davon. Vorzugsweise ist Y keine Aminosäure. Vorzugsweise ist W keine Aminosäure. Die Formeln von Leustatin, Chastatin, Tyrstatin, Cpe, Che und Cha sind in Fig. 1definiert.
[0027] Die in dem erfindungsgemässen Test verwendeten Beta-Sekretase-Inhibitoren sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Spezifische Beispiele der Formel (I) sind die Verbindungen A, B, C und D, die am Ende der Tabelle angegeben sind:
<3> Verbindung
Nr.<sep>Inhibitor<sep><sep>IC-50
FRET<sep>(µM)
H-RLBA H-5108<sep>Glu-Val-Asn-<sep>O-Ala-Glu-Phe<sep>0.29<sep>0.1 5512<sep>DiPropN-<sep>Renin- Cyclhexacid<sep>19<sep>7.5 3268<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Alasta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>1.7<sep>2 3271<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Phesta-Val-Ala- Glu-Phe-NH2<sep>0.09<sep>0.15 3616<sep>Hyp-Ava-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>1000<sep>1000 3617<sep>Hyp-Abu-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>1000<sep>1000 3618<sep>Hyp-Apro-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>140<sep>130 3619<sep>Hyp-Cmp-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>1000<sep>1000 3620<sep>Hyp-Alasta-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>170<sep>135 3621<sep>Hyp-Valsta-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>18<sep>22.2 3622<sep>Hyp-Leusta-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>25<sep>45.7 3623<sep>Hyp-Val-Asn-<sep>Phesta-Val-Ala-NH2<sep>10<sep>9.5 3273<sep>Glu-Gly-Asn-<sep>TyrOBzsta-Val-Ala- Glu-Phe-<sep>25<sep>15 3363<sep>Hyp-Ava-<sep>TyrOBzsta-Val-Ala-NH2<sep>40<sep>30 1733<sep>Glu-Ala-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>4.7<sep>7 1753<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>0.12<sep>0.15 1756<sep>Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>80<sep>100 1736<sep><sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe-NH2<sep>1000<sep>1000 2062<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-NH2<sep>0.75<sep>0.2 <sep><sep><sep><sep> D<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Tyr-NH2<sep>0.05<sep>0.05 C<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Cha-NH2<sep>0.18<sep>0.05 B<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Phe(I)-NH2<sep>0.09<sep>0.03 A<sep>Glu-Val-Asn-<sep>Leusta-Val-Ala-Glu-Tyr(I2)-NH2<sep>0.06<sep>0.02
[0028] Die Übergangsstadium-Analoga innerhalb der Peptide sind untereinander angeordnet. O ist wie in Science 290 (2000), 150–153, definiert. Hyp ist als Hydroxyprolin definiert, Ava ist als δ-Aminovaleriansäure definiert, Abu ist als γ-Aminobuttersäure definiert, Apro ist als β-Aminopropionsäure definiert, Cmp ist als Carboxymethylpiperidin und TyrOBzsta als Tyrosyl-O-benzylstatin definiert.
[0029] Die peptidomimetischen Beta-Sekretase-Inhibitoren können chemisch synthetisiert werden, indem Standardverfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, vorzugsweise Festphasenverfahren, wie die Verfahren von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149–2154) und Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press Oxford, 1989).
[0030] Ausserdem werden im erfindungsgemässen Test Beta-Sekretase-Inhibitoren der Formel (I) für die Herstellung von markierten Beta-Sekretase-Inhibitoren und Beta-Sekretase-Inhibitoren der Formel (I), die markiert sind, eingesetzt.
[0031] Der hier verwendete Begriff «markierter Beta-Sekretase-Inhibitor» soll «Beta-Sekretase-lnhibitor»-Verbindungen bedeuten, die markiert sind. Mit «markiert» oder «markierter Beta-Sekretase-lnhibitor» ist gemeint, dass die betreffenden Inhibitorverbindungen eine Markierung enthalten, die in einem Testsystem oder bei Verabreichung an einen Säuger nachgewiesen werden kann. Geeignete Markierungen sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Radioisotope, fluoreszierende Gruppen, Biotin (in Verbindung mit der Streptavidin-Komplexierung) und Photoaffinitätsgruppen. Geeignete Radioisotope sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Isotope von Halogenen (wie Chlor, Fluor, Brom und lod) und Metalle, umfassend Technetium und Indium. Bevorzugte Radioisotope umfassen <3>H, <11>C, <18>F, <32>P, <33>P, <35>S, <123>l, <125>l und <131>l. Am stärksten bevorzugt sind <3>H, <125>l und <131>l. Die radiomarkierten Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren zur Radiomarkierung hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Geeignete Syntheseverfahren werden nachstehend ausführlich beschrieben. Die Beta-Sekretase-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung können entweder direkt (d.h. durch Einbau der Radiomarkierung direkt in die Verbindungen) oder indirekt radiomarkiert werden (d.h. durch Einbau der Radiomarkierung in die Verbindungen über ein Chelat-bildendes Mittel, wobei das Chelat-bildende Mittel in die Verbindungen eingebaut wurde). Ausserdem kann die Radiomarkierung isotopisch oder nicht-isotopisch sein. Bei einer isotopischen Radiomarkierung wird ein Atom oder eine Gruppe von Atomen, das/die bereits in den erfindungsgemässen Verbindungen vorliegt, durch das Radioisotop substituiert (ausgetauscht).
[0032] Bei einer nicht-isotopischen Radiomarkierung wird das Radioisotop zu den Verbindungen zugefügt, ohne dass eine bereits vorliegende Gruppe substituiert (ausgetauscht) wird. Direkt und indirekt radiomarkierte Verbindungen, ausserdem isotopische und nicht-isotopische radiomarkierte Verbindungen sind in dem Begriff «radiomarkierte Beta-Sekretase-Inhibitoren» eingeschlossen, der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
[0033] Eine solche Radiomarkierung sollte angemessen stabil sein, sowohl chemisch als auch metabolisch, wobei anerkannte Standards nach dem Stand der Technik angewendet werden. Obwohl die Verbindungen der Erfindung durch ein grosses Spektrum von Techniken mit einer Vielfalt von unterschiedlichen Radioisotopen markiert werden können, wie dem Fachmann bekannt ist, sollte eine solche Radiomarkierung in einer Art und Weise durchgeführt werden, dass die hohe Bindungsaffinität und Spezifität des unmarkierten oder nicht mit Markierung versehenen Beta-Sekretase-Inhibitors zu der Beta-Sekretase nicht signifikant beeinträchtigt wird. Mit «nicht signifikant beeinträchtigt» ist gemeint, dass die Bindungsaffinität und Spezifität nicht mehr als etwa 2 log Einheiten beeinträchtigt wird, vorzugsweise nicht mehr als etwa 2 log Einheiten und stärker bevorzugt nicht mehr als etwa 1 log Einheit, noch stärker bevorzugt nicht mehr als etwa 500% und noch stärker bevorzugt nicht mehr als etwa 250%, und am stärksten bevorzugt wird die Bindungsaffinität und Spezifität überhaupt nicht beeinträchtigt.
[0034] Bei den radiomarkierten Beta-Sekretase-Inhibitoren kann die Markierung an jeder beliebigen Position auf dem Beta-Sekretase-Inhibitor erscheinen und eines, zwei oder mehrere radioaktive Isotope aufweisen, die in die Struktur eingebaut sind. Bevorzugte radiomarkierte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Beta-Sekretase-Inhibitoren, die mit Tritium radiomarkiert sind. Stärker bevorzugte radiomarkierte Verbindungen der Erfindung sind radiomarkierte Verbindungen der Formel (I), in denen eines, zwei oder mehrere radioaktive Isotope in die Struktur eingebaut sind und wobei die Radiomarkierung auf P1, P3 und/oder P4 ́ liegt. Am stärksten bevorzugt sind Beta-Sekretase-Inhibitoren der Formel (I), in denen die Radiomarkierung auf P1, P3 und/oder P4 ́ <3>H oder <123>l, <125>l oder <131>l ist. Fig. 2 zeigt tritiierte Baueinheiten der Formel (I), die an den Positionen P1, P3 und P4 ́ eingebaut sein können.
[0035] Wie in Beispiel 4 beschrieben, kann ein Beta-Sekretase-Inhibitor der Formel (I) mit Diiodtyrosin an Position P4 ́ (Verbindung A) für die Radiomarkierung ausgewählt werden, weil das lod durch eine Reduktion auf Palladium gegen <3>H ausgetauscht werden kann. Die Reduktion ergibt eine Verbindung, die von der Verbindung A chemisch nicht zu unterscheiden ist.
[0036] Der radiomarkierte Beta-Sekretase-Inhibitor kann eine spezifische Aktivität im Bereich von 500 mCi/mMol bis 60 Ci/mMol aufweisen. Vorzugsweise hat er eine spezifische Aktivität von 55 Ci/mMol. Der gebundene radiomarkierte Beta-Sekretase-Inhibitor kann durch Zugabe eines Szintillators gemessen werden. Vorzugsweise ist der Szintillator MicrScint20 oder Microscint40 (Packard).
[0037] Andererseits ist dem Fachmann bekannt, dass im Radioligand-Kompetitions-Bindungstest der vorliegenden Erfindung ein Szintillations-Näherungstest (SPA) eingesetzt werden kann. Z.B. können gereinigte Proteine auf dem SPA-Träger immobilisiert werden, anschliessend wird der Träger dann mit einem markierten Beta-Sekretase-Inhibitor in Gegenwart einer Testverbindung inkubiert. Der SPA-Träger verstärkt aufgrund seiner Konstruktion das radioaktive Szintillationssignal der gebundenen radioaktiven Verbindungen, während er das Signal der frei in der Lösung vorliegenden radioaktiven Verbindungen nicht verstärkt. Deshalb kann der gebundene markierte Beta-Sekretase-Inhibitor nachgewiesen und durch Szintillationszählung in Gegenwart des freien markierten Beta-Sekretase-Inhibitors quantitativ bestimmt werden.
[0038] Es ist so zu verstehen, dass der Prozess der Trennung des gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitors vom freien markierten Beta-Sekretase-Inhibitor anhand verschiedener Verfahren durchgeführt werden kann. Z.B. umfasst der Trennprozess, ist jedoch nicht beschränkt auf Waschen, Filtration oder Zentrifugation. Der Trennprozess soll die quantitative Bestimmung des gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitors erleichtern. Aus diesem Grund soll der Trennprozess auch homogene Techniken umfassen, z.B. SPA, wobei der freie markierte Beta-Sekretase-Inhibitor in situ nicht vom gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitor abgetrennt wird.
[0039] Die vorstehenden radiomarkierten Verbindungen können im erfindungsgemässen Test und Verfahren als Beta-Sekretase-Inhibitoren eingesetzt werden. Die radiomarkierten Verbindungen der Erfindung sind auch für therapeutische Zwecke und für radio-bildgebende Verfahren (Q. J. Nucl. Med. 41 (2) (1997), 163–169) und PET-bildgebende Verfahren zu verwenden (Clin. Geriatr. Med. 17 (2) (2001), 255–279).
[0040] Der hier verwendete Begriff «Testverbindung» soll eine beliebige Verbindung bedeuten, die auf die Hemmung der Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors an Beta-Sekretase gescreent wird, und die deshalb die Produktion von A-Beta hemmt, wobei der in der vorliegenden Erfindung beschriebene Test verwendet wird. Es ist so zu verstehen, dass eine «Testverbindung», die im erfindungsgemässen Test auf die Hemmung der Bindung an BACE aktiv ist, anschliessend in dem erfindungsgemässen Test als ein «markierter Beta-Sekretase-Inhibitor», wie vorstehend definiert, verwendet werden kann, sobald die Verbindung markiert wurde. Es ist ausserdem so zu verstehen, dass eine «Testverbindung», die im erfindungsgemässen Test wirksam die Bindung an BACE hemmt, anschliessend in Arzneimitteln zur Behandlung von degenerativen neurologischen Störungen, die eine Produktion von A-Beta umfassen, vorzugsweise zur Behandlung der AD eingesetzt werden kann.
[0041] Der hier verwendete Begriff «gebundener, markierter» Beta-Sekretase-Inhibitor soll die Gesamtbindung eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors bedeuten, einschliesslich spezifischer und unspezifischer Bindung. Die unspezifische Bindung wird durch Kompetition mit einer Sättigungskonzentration eines anderen bekannten Beta-Sekretase-Inhibitors bestimmt. Die spezifische Bindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors wird sodann durch Subtrahieren der unspezifischen Bindung von der Gesamtbindung des markierten Beta-Sekretase-Inhibitors ermittelt.
[0042] Der hier verwendete Begriff «Hemmkonzentration» soll die Konzentration bedeuten, bei der die in dem erfindungsgemässen Test gescreente Verbindung, «der mögliche Inhibitor von Beta-Sekretase», 50% eines markierten Inhibitors ersetzt. Beispiele von «Hemmkonzentrations»-Werten liegen im Bereich von IC-50 bis IC-90 und sind vorzugsweise IC-50, IC-60, IC-70, IC-80 oder IC-90, die 50%, 60%, 70%, 80% bzw. 90% Ersatz des markierten Inhibitors bedeuten. Stärker bevorzugt wird die «Hemmkonzentration» als der IC-50-Wert gemessen. Es ist so zu verstehen, dass die Bezeichnung IC-50 die halbe maximale Hemmkonzentration bedeutet. Der IC-50-Wert eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors, der im Test und im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, kann ≤ 5 µM betragen. Stärker bevorzugt ist der IC-50-Wert ≤ 1 µM. Am stärksten bevorzugt ist der IC-50-Wert ≤ 0,25 µM.
[0043] Die vorliegende Erfindung betrifft vorstehend beschriebenen Test, wobei der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor die Formel (I) aufweist.
[0044] Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen markierte Beta-Sekretase-Inhibitoren der Formel (I) für die Verwendung in dem wie vorstehend beschriebenen erfindungsgemässen Test dar.
[0045] Darüber hinaus wird die Verwendung eines markierten Beta-Sekretase-Inhibitors zur Identifizierung von Inhibitorverbindungen von Beta-Sekretasen beschrieben. Für diese Verwendung kann der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor die Formel (I) aufweisen, und er kann eine radioaktive Markierung oder spezifischer eine Tritium-Markierung umfassen.
[0046] Ausserdem werden Inhibitoren von Beta-Sekretasen beschrieben, die durch den Test und das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden. Diese können dann selbst zum Identifizieren neuer Inhibitoren von Beta-Sekretase eingesetzt werden.
[0047] Ferner kann durch die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel bereitgestellt werden, das einen pharmazeutisch verträglichen Träger und eine therapeutisch wirksame Menge eines Inhibitors von Beta-Sekretasen umfasst, der durch den Test und das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde; sowie pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
[0048] Der Begriff «pharmazeutisch verträglich» wird hier verwendet, um die Verbindungen, Stoffe, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen zu bezeichnen, die nach der üblichen medizinischen Meinung für die Verwendung in Kontakt mit Geweben von Menschen und Tieren geeignet sind, ohne dass sie eine starke Toxizität, Reizung, allergische Reaktion oder ein anderes Problem oder eine andere Komplikation verursachen, wobei sie ein vernünftiges Nutzen-Risiko-Verhältnis aufweisen.
[0049] Der hier verwendete Begriff «pharmazeutisch verträgliche Salze» bezieht sich auf Derivate der beschriebenen Verbindungen, wobei die ursprüngliche Verbindung modifiziert wird, indem saure oder basische Salze davon hergestellt werden. Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Salzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Mineral- oder organische Säuresalze von basischen Resten, wie Aminen; Alkali- oder organische Salze von sauren Resten, wie Carbonsäuren; und dergleichen. Die pharmazeutisch verträglichen Salze umfassen die herkömmlichen nicht-toxischen Salze oder die quartären Ammoniumsalze der ursprünglichen Verbindung, die z.B. aus nicht-toxischen anorganischen oder organischen Säuren gebildet werden. Solche herkömmlichen nicht-toxischen Salze umfassen z.B. Salze, die von anorganischen Säuren stammen, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Sulfaminsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen; und die Salze, die aus organischen Säuren hergestellt wurden, wie Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Glykolsäure, Stearinsäure, Milchsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Pamoasäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Phenylessigsäure, Glutaminsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Sulfanilsäure, 2-Acefoxybenzoesäure, Fumarsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, Oxalsäure, Isethionsäure und dergleichen.
[0050] Die pharmazeutisch verträglichen Salze der vorliegenden Erfindung können aus der ursprünglichen Verbindung, die eine basische oder saure Gruppe enthält, durch herkömmliche chemische Verfahren synthetisiert werden. Im Allgemeinen können solche Salze hergestellt werden, indem die freien Säuren- oder Basenformen dieser Verbindungen mit einer stöchiometrischen Menge der geeigneten Base oder Säure in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel oder in einem Gemisch aus beiden umgesetzt wird; im Allgemeinen sind nicht-wässrige Medien, wie Ether, Essigsäureethylester, Ethanol, Isopropanol oder Acetonitril, bevorzugt. Listen mit geeigneten Salzen finden sich in Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, S. 1418, dessen Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
[0051] «Stabile Verbindung» und «stabile Struktur» sollen eine Verbindung bezeichnen, die ausreichend robust ist, um die Isolierung bis zu einem geeigneten Reinheitsgrad aus einem Reaktionsgemisch und die Formulierung zu einem wirksamen Arzneimittel zu überleben.
[0052] Beta-Sekretase-Inhibitor-Verbindungen, die durch den Test der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, können zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit oder einer anderen zerebrovaskulären Amyloidose verwendet werden. Die durch den erfindungsgemässen kompetitiven Bindungstest identifizierten Inhibitoren von Beta-Sekretase können zur Behandlung von neurologischen Störungen oder anderen Störungen eingesetzt werden, an denen A-Beta, APP und/oder A-Beta/APP-assoziierte Makromoleküle und andere Makromoleküle beteiligt sind, die mit dem aktiven Zentrum der BACE-Bindung assoziiert sind.
[0053] Patienten, die an der Alzheimer-Krankheit oder einer anderen zerebrovaskulären Amyloidose leiden oder eine Prädisposition hierfür haben, können durch die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Dosis einer Verbindung an einen Patienten, die wirksam die Beta-Sekretase hemmt und die durch den Test oder das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, behandelt werden.
[0054] Die vorliegende Erfindung wurde nun allgemein beschrieben, zum besseren Verständnis sind die spezifischen Beispiele, die hier lediglich der Erläuterung dienen und in keiner Weise die Erfindung einschränken sollen, sofern nicht anders spezifiziert, in Verbindung mit den folgenden Figuren angegeben.
Beispiele
[0055] Im Handel verfügbare Reagenzien, die in den Beispielen angesprochen werden, wurden, sofern nichts anderes angegeben ist, gemäss den Anweisungen des Herstellers eingesetzt.
Beispiel 1: Clonierung und Expression von BACE
[0056] Eine die menschliche Aspartyl-Protease BACE und BACE-2 codierende cDNA wurde durch PCR modifiziert, und zwar in der 5 ́-nicht-codierenden Region durch eine Kozack-Sequenz, um die ribosomale Erkennung zu optimieren, und durch Austausch von GC-reichen Codons, um die Clonierungseffizienz zu optimieren, und am 3 ́-Prime-Ende durch Anfügen einer Sequenz, die 6 x His-Reste codiert, um eine rasche Reinigung des rekombinanten Proteins zu ermöglichen (SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2). Das Start-ATG liegt in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 an Position 16. Die Expression in Sf9-Insektenzellen (Glycoconj. J. 16 (2) (1999), 109–123) über einen rekombinanten Baculovirus führte zu höheren Ausbeuten als die Expression in E. coli, S. pombe oder HEK293-Zellen. Deshalb wurde die cDNA für die Expression in Insektenzellen als ein BamHI x Xbal-Fragment in den pFASTBAC1-Vektor (Life Technologies, Inc.) cloniert und das PCR-Produkt durch Sequenzierung bestätigt. Nach der Rekombination in das Baculovirusgenom wurde die gereinigte Virus-DNA in die Insektenzellen transformiert. Die Sf9-Zellen wurden bei 27°C in TC100-Medium (BioWhittaker) mit 5% (Vol./Vol.) fetalem Kälberserum gezüchtet. Virusstammlösungen wurden mit einem Titer von 1,5 × 10<9> pfu/ml hergestellt. Für die Produktion im grossen Massstab von BACE und BACE-2 wurden 24-Liter-Fermenter von Sf9-Zellen mit einer MOI von 1 infiziert.
Beispiel 2: Reinigung von BACE der vollen Länge
[0057] 50 g (Feuchtgewicht) Sf9-Zellen wurden in 750 ml PBS, 2% Triton X-100 suspendiert und mit einem Glashomogenisator von Hand homogenisiert. Das Homogenisat wurde 30 Min. auf Eis gerührt und anschliessend 20 Min. bei 100 000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf pH 8,0 eingestellt und auf eine 2,6 × 2,5 cm Ni<2><+> NTA-Sepharose-Säule (Qiagen, Bundesrepublik Deutschland) aufgetragen, die in 50 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, 100 mM NaCI, 0,1% Triton X-100, pH 8,0, äquilibriert worden war. Anschliessend wurde die Säule mit diesem Puffer und danach mit 50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 100 mM NaCI, 0,1% Triton X-100 gewaschen. Sodann wurde die Säule mit 50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 100 mM NaCI, 200 mM Imidazol, 0,1% Triton X-100 eluiert (10 Säulenvolumina). Die vereinigten Fraktionen, die BACE der vollen Länge enthielten, wurden über eine 5 ml HiTrap Q-Säule (Pharmacia, Schweiz) passiert und das ungebundene Material gesammelt. Dieses Material wurde anschliessend in 50 mM TrisHCI, pH 7,4, 10 mM NaCI, 0,1% Triton 10-fach verdünnt und erneut auf eine zweite 5 ml HiTrap Q-Säule aufgetragen, die in 50 mM TrisHCI, pH 7,4, 10 mM NaCI, 0,1% Triton X-100 äquilibriert worden war. Die Säule wurde in diesem Puffer gewaschen und mit einem Gradienten von 50 mM TrisHCI, pH 7,4, 1 M NaCI, 0,1% Triton X-100 eluiert (20 Säulenvolumina). Die BACE-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, gegen 50 mM TrisHCI, pH 8,0, 0,1% Triton X-100 dialysiert und auf eine Mono S HR5/5-Säule (Pharmacia, Schweiz) aufgetragen. Das ungebundene Material, das BACE enthielt, wurde vereinigt und bei 4°C gelagert.
Beispiel 3: Synthese der Peptidverbindung A
[0058] Eine Festphasensynthese mit kontinuierlichem Durchfluss erfolgte auf einem Pioneer™ Peptidsynthese-System, wobei vom Tenta Gel S RAM-Harz gestartet wurde (0,25 mMol/g; Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Bundesrepublik Deutschland), gemäss dem von Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press Oxford, 1989), beschriebenen Verfahren. Die gegenüber Basen labile Fmoc-Gruppe wurde zum Schutz der α-Aminogruppe eingesetzt. Seitenketten wurden mit den folgenden Schutzgruppen geschützt: -Asn(Trt) und Glu(OtBu). Für die Synthese wurden die kommerziell verfügbaren Fmoc-Statin (Neosystem) und Fmoc-3,5-diiod-L-tyrosin (Fluka) eingesetzt. Fmoc-Aminosäuren (2,5 Äquiv.) wurden mit einer äquivalenten Menge von O-(1,2-Dihydro-2-oxopyrid-1-yl)-N,N,N ́,N ́-tetramethyluronium-Tetrafluorborat (TPTU) und N,N-Diisopropylethylamin (Hünig-Base) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppen erfolgte mit 20% Piperidin in DMF. Glu(OBut)-Val-Asn(Trt)-Statin-Val-Ala-Glu(OtBu)-Tyr (l2)-amid Tenta Gel S-Harz (0,200 g) wurde mit einem Gemisch (5 ml) aus 95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% Triisopropylsilan in fünf Stunden erreicht. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und in Diethylether gegossen, und der Niederschlag wurde abfiltriert und aus Wasser gefriergetrocknet. Das rohe Peptid wurde durch eine präparative RP-HPLC gereinigt. Dabei wurde homogenes Glu-Val-Asn-Statin-Val-Ala-Glu-Tyr(l2)-NH2erhalten (Verbindung A; 12 mg, MH<+> = 1231,3). Andere Beta-Sekretase-Inhibitoren wurden entsprechend synthetisiert.
Beispiel 4: Tritiierung von Verbindung A
[0059]
[0060] 9,3 mg (0,0069 mMol) von Verbindung A wurden in 1 ml Methanol (Merck # 1.06009.1000) und 6 Tropfen Wasser gelöst. Nach Zugabe von 7 µl Triethylamin (Fluka Puriss # 90335) und 4 mg 10% Palladium auf Aktivkohle (Degussa Typ 101 ND) wurde die Suspension eine Stunde in einer Tritium-Gas-Atmosphäre gerührt. Hierfür wurde eine Tritiierungs-Apparatur von RC Tritec AG, 9053 Teufen, verwendet (Helv. Chim. Acta 68 (1985), 1880). Nach Entfernen der flüchtigen Tritiumkomponenten wurde der Rückstand in Methanol/Wasser 9/1 suspendiert. Nach einer kurzen Beschallung wurde die Suspension durch Millex-HV 0,45 µm filtriert (Katalog-Nr. SL HV013 NL). Das Filtrat wurde auf 100 ml Methanol/Wasser 9/1 verdünnt. Die <3>H-Gesamtaktivität betrug 108,54 mCi, und die radiochemische Reinheit war gemäss HPLC 84% (Säule Vydac 5 µ 4,6 × 250 mm, Fliessrate 1 ml/Min., Lösungsmittel A: 95% Wasser – 5% Acetonitril – 1% TFA; Lösungsmittel B: 10 mM TFA in Wasser/Acetonitril 3/1; Gradient B: 0 bis 40%, in 30 Min., Retentionszeit: 23,27 Min.; λ = 254 nm). Die spezifische Aktivität betrug 55 Ci/mMol, wie durch Massenspektrometrie bestimmt wurde. Das Millex-HV-Filter wurde mehrmals mit Wasser/Methanol 9/1 gespült, wodurch eine weitere Menge des Peptids mit 66 mCi erhalten wurde. Die Reinigung dieser Menge durch HPLC ergab 43,4 mCi der tritiierten Verbindung A, gemäss HPLC mit einer Reinheit von 100%. <3>H-NMR zeigte einen Einzelpeak nahe 7 ppm, so dass das Vorliegen von labilem Tritium ausgeschlossen werden konnte.
Beispiel 5: FRET-Test zur Charakterisierung neuer Beta-Sekretase-Inhibitoren
[0061] Alle Enzymtests wurden bei 20°C auf einem FLUOstar (BMG Lab Technologies, D-77656 Offenburg) unter Verwendung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (DYNEX Microfluor 2, Chantilly, VA, USA) durchgeführt. Das Testvolumen betrug 100 µl. Typischerweise wurden die in Dimethylsulfoxid gelösten Inhibitoren in verschiedenen Konzentrationen zu einer Vertiefung zugegeben, anschliessend folgten Puffer und Enzym. Die Dimethylsulfoxid-Konzentration wurde unter 4% gehalten. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe des Substrats gestartet. Die pH- und Puffer-Bedingungen, unter denen die Experimente durchgeführt wurden, sind in den Figur- und Tabellen-Legenden angegeben. Der Verlauf der Fluoreszenzzunahme wurde bei λEmmission= 520 nm mit einer Fluoreszenzanregung bei λAnregung= 430 nm gemessen. Die Reaktionskinetiken wurden während 30 Minuten bei verschiedenen Substratkonzentrationen regelmässig verfolgt. Die nachgewiesenen Signale wurden in Mol hybridisiertes Substrat pro Sekunde umgewandelt. Die kinetischen Werte wurden aus den Lineweaver-Burke-Diagrammen graphisch bestimmt. Es sollte beachtet werden, dass die durch Ändern der Substratkonzentration erhaltenen Ergebnisse um den Effekt der übermässigen Löschungskapazität korrigiert werden mussten, die für alle hier verwendeten FRET-Substrate typisch ist.
[0062] Die Tests wurden bei Enzymkonzentrationen durchgeführt, die einen linearen Ablauf der Produktbildung garantierten.
Beispiel 6: Kompetitiver Radioligand-Bindungstest (RLBA)
[0063] Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Optiplate Packard) werden mit dem gereinigten BACE-Protein beschichtet, wobei eine Konzentration von 1 µg/ml in 30 mM Natriumcitratpuffer, eingestellt auf pH 5,5, verwendet wird. Die Beschichtung erfolgt durch Inkubation von 100 µI/Vertiefung für einen bis drei Tage bei 4°C. Anschliessend wird die Platte mit 2 × 300 µI/Vertiefung 10 mM Citrat, pH 4,1, gewaschen. Zu jeder Vertiefung werden 100 µl Bindungspuffer (30 mM Citrat, 100 mM NaCI, 0,1% BSA, pH 4,1) zugegeben. Die Testverbindung (Peptid H-4848 in Fig. 4A und B) wird in 5 µl einer DMSO-Stammlösung oder geeigneter Verdünnungen zugefügt. Hierzu wird der Tracer (die tritiierte Verbindung A) in 10 µI/Vertiefung einer 10 µCi/ml Stammlösung in Bindungspuffer gegeben. Nach 1,5 bis 2 Stunden Inkubation in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur wird die Platte mit 2 × 300 µl Wasser pro Vertiefung gewaschen und auf einem trockenen Tuch abgeschnipst. Nach Zugabe von 50 µl MicroScint20 (Packard) pro Vertiefung wird die Platte versiegelt und fünf Sekunden vibriert. Die gebundene Radioaktivität wird auf einem Topcount (Packard) gezählt. Die gesamte Bindung liegt typischerweise zwischen 2000 und 10 000 cpm/Vertiefung, abhängig hauptsächlich von der Reinheit und der Konzentration des BACE-Proteins. Die unspezifische Bindung, die durch Kompetition mit > 1 µM Peptid H-4848 (Bachem # H-4848) bestimmt wurde, liegt typischerweise zwischen 30 und 300 cpm/Vertiefung. Die IC-50-Werte werden durch Microsoft Excel FIT berechnet.
Sequenzprotokoll
[0064]
Claims (11)
1. Test zum Identifizieren von Beta-Sekretase-Inhibitoren, der die folgenden Schritte umfasst:
(a) Immobilisieren eines isolierten, im Wesentlichen gereinigten und rekombinant hergestellten Beta-Sekretase-Proteins der vollen Länge,
(b) Zufügen einer Testverbindung und anschliessend eines markierten Beta-Sekretase-lnhibitors,
(c) Inkubieren der Testkomponenten, und
(d) Messen des gebundenen markierten Beta-Sekretase-Inhibitors.
2. Test nach Anspruch 1, wobei der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor ein Beta-Sekretase-Inhibitor der Formel I: Y-P4-P3-P2-P1-P1 ́-P2 ́-P3 ́-P4 ́-W ist, der markiert ist, wobei P1 als Leustatin, Chastatin oder Tyrstatin definiert ist,
P2 als Asn definiert ist,
P3 als Val, Cpe, Che oder Cha definiert ist,
P4 als Glu definiert ist,
P1 ́ als Val definiert ist,
P2 ́ als Ala definiert ist,
P3 ́ als Glu definiert ist,
P4 ́ als Tyr, Cha, Phe(l) oder Tyr(I2) definiert ist,
Y als keinen, einen oder mehrere Aminosäurereste definiert ist, und
W als keinen, einen oder mehrere Aminosäurereste definiert ist, sowie Kombinationen davon.
3. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Beta-Sekretase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus BACE und BACE-2 besteht.
4. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor ein Beta-Sekretase-Inhibitor ist, der mit einer radioaktiven Markierung markiert ist.
5. Test nach Anspruch 4, wobei die radioaktive Markierung Tritium ist.
6. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der markierte Beta-Sekretase-Inhibitor eine Hemmkonzentration von etwa oder weingier als 1µM aufweist.
7. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Komponenten des Tests in Bindungspuffer inkubiert werden, der BSA enthält.
8. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Komponenten des Tests in Bindungspuffer inkubiert werden, der ein nicht-ionisches Detergens enthält.
9. Test nach Anspruch 8, wobei das nicht-ionische Detergens Tween-20 ist.
10. Test nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Komponenten des Tests in Bindungspuffer inkubiert werden, der ein ionisches Detergens enthält.
11. Test nach Anspruch 10, wobei das ionische Detergens aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cholsäure und Desoxycholsäure umfasst.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01130282 | 2001-12-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH698246B1 true CH698246B1 (de) | 2009-06-30 |
Family
ID=8179605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH02130/02A CH698246B1 (de) | 2001-12-20 | 2002-12-13 | Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030125257A1 (de) |
| JP (2) | JP3913164B2 (de) |
| CH (1) | CH698246B1 (de) |
| DE (1) | DE10259834B4 (de) |
| FR (1) | FR2835255B1 (de) |
| GB (1) | GB2385124B (de) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7521481B2 (en) | 2003-02-27 | 2009-04-21 | Mclaurin Joanne | Methods of preventing, treating and diagnosing disorders of protein aggregation |
| EP1666068A4 (de) * | 2003-09-24 | 2010-08-04 | Santen Pharmaceutical Co Ltd | Mittel zur behandlung von augenerkrankungen mit verletzungen des sehnervs |
| JP2007509898A (ja) | 2003-11-03 | 2007-04-19 | プロビオドルグ エージー | 神経障害治療に有用な組合せ |
| US7304086B2 (en) | 2004-02-05 | 2007-12-04 | Probiodrug Ag | Inhibitors of glutaminyl cyclase |
| WO2006038684A1 (ja) | 2004-10-01 | 2006-04-13 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 膜貫通型酵素阻害物質のスクリーニング方法 |
| WO2006050862A1 (en) * | 2004-11-10 | 2006-05-18 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Statine derivatives for the treatment of alzheimer's disease |
| WO2006050861A2 (en) * | 2004-11-10 | 2006-05-18 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Statine derivatives for the treatment of alzheimer's disease |
| US7893267B2 (en) * | 2005-03-14 | 2011-02-22 | High Point Pharmaceuticals, Llc | Benzazole derivatives, compositions, and methods of use as β-secretase inhibitors |
| US20060257958A1 (en) * | 2005-05-13 | 2006-11-16 | Pronucleotein Biotechnologies, Llc | Magnetically-assisted test strip cartridge and method for using same |
| JP2009504613A (ja) * | 2005-08-11 | 2009-02-05 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | アルツハイマー病の治療用化合物 |
| EP1919861A2 (de) * | 2005-08-11 | 2008-05-14 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Verbindungen zur behandlung der alzheimer erkrankung |
| JP2009504612A (ja) * | 2005-08-11 | 2009-02-05 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | アルツハイマー病の治療用化合物 |
| US8222264B2 (en) | 2007-07-06 | 2012-07-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Substituted amino-quinazolinones, medicaments comprising said compound, their use and their method of manufacture |
| WO2009013293A1 (en) * | 2007-07-24 | 2009-01-29 | Novartis Ag | Substituted cyclohexanecarboxamides useful as bace inhibitors |
| JP7153493B2 (ja) * | 2018-07-27 | 2022-10-14 | シスメックス株式会社 | 生体粒子の測定方法、非特異シグナルの検出方法、生体粒子測定方法及び生体粒子を検出するための試薬キット |
| US11525824B2 (en) | 2018-07-27 | 2022-12-13 | Sysmex Corporation | Bioparticle measuring method |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5766846A (en) * | 1992-07-10 | 1998-06-16 | Athena Neurosciences | Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production |
| US5872101A (en) * | 1995-01-06 | 1999-02-16 | Sibia Neurosciences, Inc. | Methods of treating neurodegenerative disorders using protease inhibitors |
| US5616460A (en) * | 1995-06-07 | 1997-04-01 | Abbott Laboratories | Buffer composition for reagents for immunoassay |
| DE19641180A1 (de) * | 1996-09-24 | 1998-03-26 | Schering Ag | Verfahren zur Darstellung von APP-Sekretase Modulation und deren Verwendung als Mittel zur Behandlung der Alzheimer'schen Erkrankung |
| US5703129A (en) * | 1996-09-30 | 1997-12-30 | Bristol-Myers Squibb Company | 5-amino-6-cyclohexyl-4-hydroxy-hexanamide derivatives as inhibitors of β-amyloid protein production |
| EP0942923A2 (de) * | 1996-11-22 | 1999-09-22 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | N(aryl/heteroaryl) aminosurederivate, diese anthaltende pharmazeutischezusammesetzungen, verfahren zur inhibierung amytoid peptide und deren freisetzung und produktion |
| AU2218199A (en) * | 1998-01-09 | 1999-07-26 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Method for identifying validated target and assay combinations |
| US6737038B1 (en) * | 1998-11-12 | 2004-05-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Use of small molecule radioligands to discover inhibitors of amyloid-beta peptide production and for diagnostic imaging |
| ATE300052T1 (de) * | 1998-11-12 | 2005-08-15 | Bristol Myers Squibb Pharma Co | Verwendung von radioliganden zum screening von inhibitoren der herstellung von beta-amyloid peptiden |
| GB2364059B (en) * | 1999-02-10 | 2004-01-14 | Elan Pharm Inc | Beta-Secretase enzyme compositions and methods |
| DE60045005D1 (de) * | 1999-06-28 | 2010-11-04 | Oklahoma Med Res Found | Inhibitoren des memapsin 2 und ihre verwendung |
| WO2001087354A2 (en) * | 2000-05-17 | 2001-11-22 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Use of small molecule radioligands for diagnostic imaging |
| WO2002025276A1 (en) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Wyeth | Crystal structure of bace and uses thereof |
-
2002
- 2002-12-13 CH CH02130/02A patent/CH698246B1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-12-18 US US10/322,684 patent/US20030125257A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-19 GB GB0229664A patent/GB2385124B/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-19 DE DE10259834A patent/DE10259834B4/de not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-20 FR FR0216291A patent/FR2835255B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-20 JP JP2002369209A patent/JP3913164B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-11-14 JP JP2006307401A patent/JP2007125021A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2385124B (en) | 2006-07-26 |
| JP3913164B2 (ja) | 2007-05-09 |
| DE10259834B4 (de) | 2007-11-29 |
| US20030125257A1 (en) | 2003-07-03 |
| FR2835255B1 (fr) | 2007-10-26 |
| GB2385124A (en) | 2003-08-13 |
| GB0229664D0 (en) | 2003-01-29 |
| DE10259834A1 (de) | 2003-07-17 |
| JP2007125021A (ja) | 2007-05-24 |
| JP2003261596A (ja) | 2003-09-19 |
| FR2835255A1 (fr) | 2003-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE10259834B4 (de) | Test und Screeningverfahren zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen | |
| DE69233157T2 (de) | Rekombinanter thrombinrezeptor und verwandte arzneimittel | |
| DE60035412T2 (de) | Beta-amyloid-peptidaggregation regulierende peptide mit d-aminosäuren | |
| US8394375B2 (en) | Antibodies for amyloid specific peptides | |
| KR20090048192A (ko) | 치매(알츠하이머 병)의 진단, 예방, 치료제 및 이들의스크리닝 방법 | |
| DE60038675T2 (de) | Rekombinantes plättchenkollagenrezeptorglykoprotein und dessen pharmazeutische verwendung | |
| EP3102602B1 (de) | Hybridom-zelllinie und deren verwendung zur herstellung eines monoklonalen antikörpers gegen das humane, herzspezifische myosin bindung protein c (c-protein), mybpc3, cmybp-c oder my-c) | |
| DE69720207T2 (de) | Peptide mit spezifischer affinität für pacap typ 1 rezeptoren | |
| DE102004051014A1 (de) | Chemisch modifizierte Peptidanaloga | |
| DE10101430B4 (de) | Lösliche cyclische Analoga zur Modulation der Amyloidogenese | |
| DE60221813T2 (de) | Thiazolopyrimidinderivate und deren verwendung als antagonisten des cx3cr1 rezeptors | |
| EP3099714B1 (de) | Hybridom-zelllinie (my-c-cc0c2-259-1 a4) und deren verwendung zur herstellung eines monoklonalen antikörpers gegen das humane, herzspezifische myosin binding protein c (c-protein, mybpc3, cmybp-c oder my-c) | |
| DE60124915T2 (de) | Synthetische peptide gegen neurologische krankheiten | |
| DE69630583T2 (de) | Peptide, bronchodilator und den blutstrom verbesserndes mittel | |
| DE60028407T2 (de) | Proteine und für diese kodierende dna | |
| DE69631516T2 (de) | Familie von Kaliumkanälen von Säugetieren, deren Klonierung und Anwendung für Drogenscreening | |
| DE69823528T2 (de) | Von komplementpeptid c3a abgeleitete peptide und sie enthaltende antiallergische zusammensetzungen | |
| DE69836679T2 (de) | Peptide zur behandlung des systemischen lupus erythematosus | |
| DE60129933T2 (de) | Verfahren zum screening | |
| UMEDA et al. | Characterization of calcitonin gene-related peptide (CGRP) receptors in guinea pig lung | |
| DE10053506A1 (de) | Mittel zur Prävention von Organschäden, die durch Aminoglykoside induziert werden | |
| EP3273982B1 (de) | Verfahren zur diagnose oder behandlung neurologischen störungen mit p75ecd und/oder p75 | |
| WO2002066513A2 (de) | Humane zirkulierende lekti fragmente hf7072, hf7638 und hf14448 sowie ihre verwendung | |
| EP1556488B1 (de) | Humanes chondroosteomodulin (tig2), herstellung und verwendung zur behandlung oder diagnose von knochen- und knorpelerkrankungen, fettsucht sowie entzündlichen erkrankungen und hauterkrankungen | |
| EP4230645A1 (de) | Peptidische inhibitoren von amyloid-selbst- und queranordnung |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased |