DE60038675T2

DE60038675T2 - Rekombinantes plättchenkollagenrezeptorglykoprotein und dessen pharmazeutische verwendung

Info

Publication number: DE60038675T2
Application number: DE60038675T
Authority: DE
Inventors: Kenneth J. Clemetson
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1999-05-07
Filing date: 2000-04-25
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2020-04-26
Also published as: HUP0201049A2; BR0010325A; PT2341141E; AU4555500A; WO2000068377A1; EP1177289B1; HK1045714B; EP1942186A3; KR20010112951A; CZ302693B6; BRPI0010325B1; JP2011097948A; US20070172480A1; NO333408B1; US20110237655A1; AR023848A1; KR100703592B1; EP1942186B1; ATE393223T1; JP5554696B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Glycoprotein VI (GPVI), seine Isolierung, Aufreinigung sowie Verfahren zur rekombinanten Herstellung. Vor allem betrifft die Erfindung die Verwendung von GPVI, vorzugsweise rekombinantem GPVI, bei der Behandlung von Störungen und krankhaften Ereignissen, die direkt oder indirekt mit Blutgerinnungsstörungen, wie etwa thrombotischen und kardiovaskulären Krankheiten, korreliert sind. Das extrazelluläre rekombinante Protein läßt sich auch zur Einrichtung von Screening-Testverfahren zum Auffinden potentieller Inhibitoren des membrangebundenen GPVI zur Hemmung der Wechselwirkung von Plättchen und Kollagen verwenden. GPVI wird auf der Plättchenoberfläche während der Lebensdauer des Plättchens in vivo modifiziert und kann daher als Marker des Plättchenalterprofils verwendet werden.
Bei Glycoprotein VI handelt es sich um ein Plättchenmembranglycoprotein von 62 bzw. 65 kDa (nicht reduziert bzw. reduziert), das zusammen mit der allgemeinen Fcγ-Untereinheit einen Komplex bildet. Die GPVI-Untereinheit enthält die Kollagenbindungsstelle, wobei die Fcγ-Untereinheit für die Signalgebung verantwortlich ist. Der Komplex bildet einen der Hauptkollagenrezeptoren auf der Plättchenoberfläche, der für die Plättchenaktivierung als Reaktion auf Kollagen kritisch ist. Die Erkennungssequenz auf dem Kollagen besteht aus (GlyProHyp)_n-Sequenzen. Aus Japan sind Patienten bekannt, die einen genetischen Mangel an GPVI aufweisen. Sie weisen leichte Blutungsprobleme auf, wobei ihre Plättchen nur schwach auf Kollagen, vermutlich über andere Rezeptoren, reagieren. Viele Erkenntnisse wurden über die von GPVI ausgehenden Signalgebungskaskaden gesammelt, die denen von Immunrezeptoren, einschließlich T-Zellrezeptoren, B-Zellrezeptoren und natürlicher Killerzellrezeptoren, stark ähneln. An diesen Kaskaden sind SRC-Familie-Tyrosinkinasen, wie etwa Fyn und Lyn ebenso wie p72^SYK sowie viele andere Tyrosinkinasen und Phosphatasen und Adaptorproteine, wie etwa LAT, beteiligt. Ein Hauptziel dieser Kaskaden ist die Aktivierung von Phospholipase Cγ2, die Phospholipide unter Erhalt der sekundären Botenstoffe Diacylglycerin und IP₃ spaltet. Man nimmt an, daß GPVI an der Aktivierung des Plättchenintegrins α2β1 beteiligt ist, das eine Hauptrolle bei der Anhaftung von Plättchen an beschädigte Gefäßwände spielt. Mäuse, bei denen die Fcγ-Untereinheit „ausgeknockt" ist, besitzen Plättchen, die noch auf Kollagen reagieren, was impliziert, daß der Ruhezustand von α2β1 auch über den GPVI/Fcγ-Komplex reguliert werden könnte.
Der Plättchenkollagenrezeptor GPVI ist eng mit den natürlichen Killeraktivierungsrezeptoren der p58KAR-Familie ebenso wie mit FcαR verwandt.
Bei der Anhaftung und Aktivierung ruhender, zirkulierender Plättchen an einer Stelle mit Gefäßverletzung handelt es sich um den ersten Schritt in einem Vorgang, der zur Bildung eines Thrombus führt, welcher in einen Blutstillungspfropfen umgewandelt wird. Kollagen ist einer der Hauptbestandteile der Gefäßwand, der für die Plättchenaktivierung verantwortlich ist. Es gibt viele Arten von Kollagen, wobei sieben von diesen sich in den subendothelen Schichten finden. Auf Plättchen wurden mehrere unterschiedliche Rezeptoren für Kollagen identifiziert, doch werden als Hauptrezeptoren jetzt das Integrin α2β1 sowie das Nichtintegrin GPVI angesehen. Obwohl α2β1 gut charakterisiert ist und beide Untereinheiten vor mehreren Jahren kloniert und sequenziert wurden, ist die Struktur von GPVI nach wie vor nicht bekannt, obwohl mehrere Merkmale identifiziert wurden. So wurde vor etwa 20 Jahren festgestellt, daß es sich bei GPVI um ein Hauptglycoprotein der Plättchen mit einer Molekülmasse im Bereich von 60–65 kDa und einem sauren pI-Wert handelt. Seine Rolle als mutmaßlicher Kollagenrezeptor wurde nach der Identifizierung eines Patienten in Japan mit einer leichten Blutungsstörung, dessen Plättchen einen spezifischen Defekt bei der Reaktion auf Kollagen zeigten und denen dieser Rezeptor fehlte, etabliert. Dieser Patient hatte ebenso Autoantikörper gegen den fehlenden Rezeptor entwickelt, wobei diese zur weiteren Charakterisierung des Moleküls verwendet wurden. Vor kurzem wurde ermittelt, daß GPVI nichtkovalent mit der allgemeinen Fcγ-Untereinheit, die als Signalgebungsteil des Komplexes fungiert, assoziiert ist. Ebenso wurde demonstriert, daß es sich bei der Erkennungssequenz für GPVI auf Kollagen um ein sich wiederholendes Gly-Pro-Hyp-Triplett innerhalb der Triplehelixstruktur des Kollagens handelt und das auf dieser Struktur beruhende synthetische Peptide als spezifische auf GPVI gerichtete Agonisten verwendet werden konnten. Es konnte gezeigt werden, daß der GPVI/Fcγ-Komplex dem Plättcheninneren ein Signal über einen immunrezeptorähnlichen Mechanismus übermittelt, an dem die Aktivierung von p72^SYK beteiligt ist und der über eine Kaskade von Kinase/Phosphatase/Adaptorprotein-Wechselwirkungen zur Aktivierung von PLCγ2 und somit zur Freisetzung von Körnchen und Plättchenaggregation führt. Ein weiterer Schritt bei der Charakterisierung dieses Moleküls bestand darin zu zeigen, daß das Schlangen-C-Typ-Lectin, Convulxin, aus der tropischen Klapperschlange, Crotalus durissus terrificus, in der Lage war, durch Ausbildung von Clustern mit GPVI über eine multimere Wechselwirkung Plättchen zu aktivieren. Es konnte gezeigt werden, daß Convulxin spezifisch an GPVI bindet, womit ein Verfahren zur Aufreinigung dieses Rezeptors in Verbindung mit etablierten Ansätzen bereitgestellt wird. Von Gibbins Jonathan M et al. (FEBS LETTERS, Band 413, Nr. 2, 1997, S. 255–253) wurde die durch Convulxin induzierte Anhaftung und Aktivierung menschlicher Plättchen analysiert, wobei sich herausstellte, daß Glycoprotein VI und Integrin α₂β₁ beteiligt sind.
Somit macht der Stand der Technik deutlich, daß GPVI eine sehr interessante Verbindung auf vielen therapeutischen Gebieten, vor allem im Zusammenhang mit Anwendungen, die direkt oder indirekt mit Blutgerinnungsereignissen, die von der Kollagen-Plättchen-Wechselwirkung abhängen, verbunden sind, zu sein scheint. Daher bestand das Ziel der vorliegenden Erfindung darin, GPVI in rekombinanter Form bereitzustellen und seine Wirksamkeit als direktes therapeutisches Ziel oder als Werkzeug für das Screening kurzer Verbindungen, vor allem chemisch synthetisierter oder synthetisierbarer Verbindungen mit der Fähigkeit zur Hemmung oder Blockierung der natürlichen Plättchen-Kollagen-Wechselwirkung, zu zeigen.
Die Erfindung betrifft auch Teile oder Fragmente des GPVI-Proteins, deren biologische Aktivität, also die Bindung an Kollagen, beibehalten ist.
In der vorliegenden Erfindung wurden angemessene Mengen von GPVI für eine vorläufige Charakterisierung und für die Peptidsequenzierung erfolgreich aufgereinigt. Die Sequenzen wurden zur Konstruktion von Primern für die PCR verwendet, um eine positive Sequenz in einer DNA-Bibliothek zu identifizieren. Diese DNA-Sequenz wurde dann als Sonde zur Isolierung einer fast vollständigen cDNA-Sequenz aus der Bibliothek verwendet, wobei die fehlende 5'-Sequenz unter Verwendung eines RACE-Verfahrens aus einer Plättchen-cDNA-Bibliothek gewonnen wurde.
In der vorliegenden Erfindung wurde ebenso erfolgreich die Verwendung von rekombinantem GPVI als therapeutisch anwendbare Verbindung, die bei Verabreichung an einen Patienten mit z. B. beschädigten Blutgefäßen an Kollagen binden kann und somit membrangebundenes GPVI tragende Plättchen an der Bindung an das Kollagen hindert, gezeigt. Die rekombinante lösliche extrazelluläre Domäne von GPVI enthält die Kollagenbindungsstelle und kann die Plättchenaktivierung durch Kollagen verhindern. Sie könnte daher bei der Behandlung von Krankheitszuständen, an denen eine erhöhte Plättchenaktivierung mit Kollagen beteiligt ist, wie etwa der Aterioskleroseplaqueruptur, bei Krankheiten, wie etwa instabiler Angina, oder während einer chirurgischen Behandlung, wie etwa PTCA (perkutane transluminale Koronarangioplastie), bei der Arterien durch Aufblasen eines Ballonkatheders wieder geöffnet werden, was zu beträchtlichen Schäden an der Gefäßwand und viel Plättchenaktivierung führt und häufig später das Wiederverschließen des Gefäßes zufolge hat, anwendbar sein. Der Vorteil rekombinanter GPVI-Fragmente im Vergleich mit vorhandenen Behandlungsverfahren besteht darin, daß sie in einem früheren Stadium wirken, indem sie Plättchenaktivierung verhindern oder reduzieren statt Ereignisse nach der Plättchenaktivierung, wie etwa die Aggregation durch GPIIb-IIIa-Antagonisten, zu unterdrücken. Somit werden geringere Mengen an Plättchenkörncheninhalten mit Wachstumsfaktoren und Chemokinen freigesetzt, die nicht nur an der Wundheilung, sondern auch bei der Rückbildung der Gefäßwand über die Migration glatter Muskeln und an der Anziehung phagocytotischer Zellen, wie etwa Monocyten, von denen bekannt ist, daß sie zu Arteriosklerose beitragen, beteilt sind. Das Fab-Fragment humanisierter monoklonaler Mausantikörper gegen GPVI könnte mit ähnlicher Wirkung zur Blockierung von GPVI auf der Plättchenoberfläche mit ähnlichen Anwendungen wie oben verwendet werden.
Rekombinantes GPVI gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich auch in einem Kollagenbindungstest zur Suche nach kleinen Molekülen (beispielsweise in kombinatorischen Bibliotheken) verwenden, die diese Wechselwirkung hemmen können und zur Entwicklung therapeutischer Verbindungen, die Inhibitoren der Kollagen-Plättchen-Wechselwirkung darstellen, eingesetzt werden können. Über geeignete Derivatisierung werden diese Verbindungen oral verfügbar gemacht. Wiederum besteht das Hauptziel darin, Verbindungen herzustellen, die GPVI-Kollagen-Wechselwirkungen und somit die Plättchenaktivierung in Situationen, bei denen Plättchen mit Kollagen in Kontakt kommen, reduzieren. Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Screening-Technik ist als solche im Stand der Technik allgemein bekannt. Mit derartigen Screening-Testverfahren ermöglicht die Erfindung das Auffinden und die Entwicklung neuer Ziele, die das natürliche membrangebundene GPVI auf der Plättchenoberfläche als Kollagenantagonist hemmen können. Solche Ziele, bei denen es sich um kleine chemische Moleküle handeln kann, können dann die Grundlage für weitere Erfindungen bilden.
Eine weitere Hauptanwendung von GPVI und Reagentien, die spezifische Domänen von GPVI erkennen, liegt in der Anwendung als Marker für Plättchenalter und -funktionalität. Es wird allgemein angenommen, daß junge Plättchen aktiver und funktionsfähiger sind als alte. Junge Plättchen binden an das und werden von dem Schlangengift C-Typ-Lectin-Convulxin aktiviert, das spezifisch für GPVI ist, wobei mit zunehmendem Alter der Plättchen sowohl die Bindung als auch der Grad der Aktivierung abnehmen. Dies kann entweder an proteolytischen oder Konformationsänderungen im GPVI oder an seiner Assoziation mit Fcγ aufgrund von Plättchenaktivierung oder Schädigungen im Kreislauf liegen. Hierbei kann es sich um einen nützlichen Parameter zur Messung des Alters- und Funktionsprofils von Plättchen in Patienten ebenso wie in normalen Personen während medizinischer Kontrollen handeln. Das Plättchenaltersprofil ändert sich bei vielen Krankheiten, die das Knochenmark oder das Immunsystem betreffen, und könnte ein wichtiges diagnostisches Kriterium darstellen, falls bessere Verfahren für seine Bestimmung zur Verfügung stünden. Beispielsweise zeigen Patienten mit Krankheiten unter Beteiligung von erhöhtem Plättchenumsatz eine größere Menge an jungen Plättchen, wohingegen Patienten, die eine Chemotherapie oder Strahlungsbehandlung durchlaufen, eine stetig alternde Population zeigen. Somit läßt sich ein solches Altersprofil für eine genaue Beobachtung der Behandlung einsetzen. In einer normalen gesunden Population ist nur sehr wenig über die Altersprofilverteilung und seine Rolle bei der Vorhersage von Änderungen in der Gesundheit bekannt. Es ist nicht bekannt, ob die Änderungen bei GPVI auf die teilweise Beteiligung von Plättchen an Blutstillungsereignissen zurückzuführen sind und ob die Änderungen in Patienten mit einer schweren kardiovaskulären Krankheit deutlicher sein könnten. Zur Zeit wird Thiazol Orange zum Nachweis von mRNA enthaltenden jungen retikulären Plättchen verwendet. Diese mRNA wird bald abgebaut, was das Verfahren auf lediglich die jüngsten Plättchen beschränkt. Reagentien, die in einem solchen Testverfahren verwendet werden könnten, würden GPVI-spezifische Schlangengiftproteine, wie etwa Convulxin, oder monoklonale bzw. polyklonale Antikörper, die den N-terminalen Bereich von GPVI erkennen, oder monoklonale Antikörper, die neue durch Proteolyse der N-terminalen Domäne exponierte Stellen oder Konfirmationen oder spezifische Konfirmationen, die entweder im Intaktmolekül und nicht in gealterten Molekülen vorhanden sind oder umgekehrt, erkennen, oder kleine chemische Elemente, die zur spezifischen Erkennung von intaktem GPVI oder seiner modifizierten Form ausgewählt werden, umfassen. Diese Reagentien würden mit einem Fluoreszenzmarker oder zusammen mit einem fluoreszenzmarkierten zweiten Antikörper oder Affinitätsreagens markiert und in der Durchflußzytometrie zur Messung des Plättchenbindungsprofils verwendet werden. Als Alternative zu einem späteren Zeitpunkt könnten weniger arbeitsintensive Meßtechniken auf der Grundlage der automatischen Messung von Plättchenprofilen adaptiert werden. Unter Verwendung von Zellsortierungsverfahren mit Durchflußzytometrie oder magnetischen Kügelchen sollte es möglich sein, junge und alte Plättchen zu isolieren, um die an der Entfernung alter Plättchen aus dem Kreislauf beteiligten Faktoren zu untersuchen. Spezifische Formen von GPVI erkennende Reagentien würden für solche Untersuchungen ein Schlüsselelement darstellen.
Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer für Glycoprotein VI codierenden DNA, vor allem der Sequenz in 2.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung einer DNA, codierend für Glycoprotein VI, das die Aminosäuresequenzen in 1a und 1b umfaßt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend ein rekombinantes GPVI zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungs-, Träger- oder Hilfsmittel sowie seiner Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels auf dem Gebiet der Therapie thrombotischer und kardiovaskulärer Ereignisse und Störungen in Verbindung mit Plättchen-Kollagen-Wechselwirkungen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinantem GPVI in einem Screening-Werkzeug zum Nachweis spezifischer Inhibitoren von Plättchen-Kollagen-Wechselwirkungen.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht in der Verwendung von GPVI als Marker für das Plättchenalter und das Inkontaktkommen mit kardiovaskulären Krankheiten.
Mögliche medizinische Indikationen bzw. Anwendungen sind beispielsweise instabile Angina Pectoris, PTCA, die Verwendung von Stents auf diesem Gebiet, Operationen an Koronargefäßen, allgemeine Operationen an Blutgefäßen, Operationen, die größere Blutgefäße beschädigen können, wie etwa Hüftgelenkoperationen. Darüber hinaus sind alle Indikationen miteinbezogen, die in Verbindung mit durch Störungen der Wechselwirkung zwischen der Gefäßwand und dem Gerinnungssystem verursachten thromboembolischen Ereignissen mit einem hohen Risiko der Ausbildung von Thromben und der Blockierung von Gefäßen stehen.
Wie oben angedeutet, sind das GPVI-Protein und Fragmente davon gemäß der vorliegenden Erfindung als pharmazeutisch wirksame Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen und Kombinationen geeignet.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen können wahlweise zusätzliche aktive Inhaltsstoffe, wie etwa Antikoagulantien, wie beispielsweise Hirudin oder Heparin, oder thrombolytische Mittel, wie beispielsweise Plasminogenaktivator oder Hementin, oder Antagonisten zu anderen Plättchenrezeptoren, wie beispielsweise GPIIb-IIIa-Antagonisten, wie etwa Abciximab oder Eptifibatid, oder ADP-Rezeptor-Antagonisten, wie beispielsweise Clopidogrel, umfassen.
Das neue Protein bzw. seine biologischen aktiven Fragmente gemäß der vorliegenden Erfindung können pharmazeutisch unbedenkliche Salze mit einer beliebigen nichttoxischen, organischen oder anorganischen Säure bilden. Zu anorganischen Säuren gehören beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure sowie Säuremetallsalze, wie beispielsweise Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat. Beispiele für organische Säuren sind die Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, wie beispielsweise Essigsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Hydroxybenzoesäure, Phenylessigsäure, Zimtsäure, Salicylsäure sowie Sulfonsäuren, wie etwa Methansulfonsäure. Zu Salzen der carboxyterminalen Aminosäuregruppierung gehören die nichttoxischen Carbonsäuresalze, die mit beliebigen geeigneten anorganischen oder organischen Basen gebildet werden. Zu diesen Salzen gehören beispielsweise Alkalimetalle, wie etwa Natrium und Kalium, Erdalkalimetalle, wie etwa Calcium und Magnesium, Leichtmetalle der Gruppe IIIA, einschließlich Aluminium, sowie organische primäre, sekundäre und tertiäre Amine, wie etwa Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N, N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydroabiethylamin und N-Alkylpiperidin.
Unter dem Begriff „pharmazeutisch unbedenklicher Trägerstoff", wie er hier verwendet wird, versteht man ein inertes, nichttoxisches festes oder flüssiges Füllmittel, Verdünnungsmittel oder Einkapselungsmaterial, das nicht negativ mit dem Wirkstoff oder mit dem Patienten reagiert. Geeignete, vorzugsweise flüssige Trägerstoffe sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wie etwa steriles Wasser, Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose, Zuckerlösungen, Ethanol, Glycole und Öle, einschließlich denen, die aus Petroleum, Tieren, Pflanzen oder Synthesen stammen, beispielsweise Erdnußöl, Sojabohnenöl und Mineralöl.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können als Dosiseinheiten, die herkömmliche nichttoxische pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Hilfsmittel und Vehikel enthalten, die für die parenterale Verabreichung typisch sind, verabreicht werden.
Der Begriff „parenteral" umfaßt hier subkutane, intravenöse, intraartikuläre und intratracheale Injektions- und Infusionstechniken. Auch sind andere Verabreichungsarten, wie beispielsweise orale Verabreichung und topische Verabreichung, geeignet. Parenterale Zusammensetzungen und Kombinationen werden ganz besonders bevorzugt intravenös entweder in Bolusform oder als konstante Fusion nach bekannten Verfahrensweisen verabreicht. Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung enthalten herkömmliche Hilfsstoffe, wie etwa Bindungsmittel, Füllstoffe, Verdünnungsmittel, Tablettiermittel, Schmiermittel, Sprengmittel und Benetzungsmittel. Die Tabletten können nach im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren beschichtet werden.
Orale flüssige Präparationen können in Form wäßriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupe oder Elixiere vorliegen oder können als Trockenprodukt für die Rekonstituierung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Verwendung präsentiert werden. Solche flüssigen Präparationen können herkömmliche Zusatzstoffe, wie etwa Suspensionsmittel, Emulgatoren, nichtwäßrige Vehikel und Konservierungsstoffe, enthalten.
Topische Anwendungen können in Form von wäßrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Gelen oder vorzugsweise Emulsionssalben vorliegen.
Erfindungsgemäße Dosiseinheiten können täglich benötigte Mengen des erfindungsgemäßen Proteins oder Teilmengen davon zur Erstellung der gewünschten Dosis enthalten. Die optimale therapeutisch unbedenkliche Dosierung und Dosisrate für einen gegebenen Patienten (Säuger, einschließlich Menschen) hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie etwa der Aktivität des spezifischen eingesetzten aktiven Materials, dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, der Ernährung, Zeit und dem Verabreichungsweg, der Eliminationsgeschwindigkeit, dem Ziel der Behandlung, d. h. Therapie oder Prophylaxe, sowie der Art der zu behandelnden thrombotischen Krankheit, Antiplättchen- oder Antikoagulantienaktivität.
Daher liegt bei als Antikoagulantien geeigneten Zusammensetzungen und Kombinationen bei einem behandelten Patienten (in vivo) eine pharmazeutisch wirksame tägliche Dosis der Peptide der vorliegenden Erfindung zwischen etwa 0,01 und 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 mg/kg Körpergewicht. Gemäß der Anwendungsform kann eine Einzeldosis zwischen 0,5 und 10 mg des Kollageninhibitors enthalten. Um einen Antikoagulantieneffekt in extrakorporalen Blut zu erzielen, liegt eine pharmazeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Peptide zwischen 0,2 und 150 mg/l, vorzugsweise zwischen 1 mg und 20 mg/l extrakorporalem Blut.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Proteinsequenz von GPVI (Ein-Buchstaben-Code)
1a: Leitsequenz
1b: reifes Protein

Offenes Leseraster: 339 Aminosäuren

Sternchen: Glycosylierungsstelle

Doppelt unterstrichen: Transmembrandomäne

Unterstrichen: sequenzierte Peptide
2: GPVI-Nukleotidsequenz, die ein 1017 bp großes offenes Leseraster plus 3'- und 5'-Bereiche abdeckt und insgesamt 1249 bp umfaßt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Zwei Sequenzen mit jeweils 7 Aminosäuren, die die geringste Degeneriertheit im genetischen Code zeigen, wurden für die Synthese von DNA-Primern gewählt, um einen Teil der GPVI-cDNA mittels PCR zu amplifizieren. Da die Lage der beiden Peptide im Protein vollkommen unbekannt war, wurden für sie jeweils zwei degenerierte Primer, und zwar ein sense- und ein antisense-Primer, hergestellt. Diese Primer wurden zur Amplifikation einer Bibliothek von menschlichem Knochenmark verwendet. Durch Kombinieren des für die Sequenz PAMKRSL codierenden sense-Primers 5' TYA THC CNG CNA TGA ARMG 3' mit dem DQFALYK entsprechenden antisense-Primer 5' TTR TAN ARN GCR AAY TGR TC 3' wurde ein DNA-Fragment von 221 bp amplifiziert. Zusätzlich zu den ausgewählten Peptiden codierte die amplifizierte DNA für das LysC/AspN-Peptid DQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSS, womit die Sequenz eindeutig mit der cDNA für GPVI verbunden ist.
Aus dem Screening von 600.000 pfu von einer Knochenmarksbibliothek mit diesem 221 bp großen DNA-Fragment wurden 4 positive pfu erhalten. Drei davon wiesen Insertionen von jeweils 1350 bp auf, egal ob sie von dem Restriktionsenzym Sal I oder EcoR I geschnitten wurden, und gehörten zur IgG-Superfamilie. Die vierte wies ein 4,6 kb große Insertion in der Verdauung mit Sal I auf und ergab zwei Fragmente von 2300 bp bzw. 1300 bp bei Behandlung mit EcoRI. Ihre DNA codierte für die Sequenz für die 10 aus der Aminosäuresequenzierung von GPVI abgeleiteten Peptide, hörte jedoch kurz vor dem Aminoterminus auf. Es ließ sich weder ein Start-Methionin noch eine Leitsequenz finden, doch waren mehr als 2000 bp von zuvor sequenzierter, nicht im Leseraster liegender DNA, die in einer Alu-Sequenz endete, vorhanden. Das 5'-Ende-RACE-Experiment wurde an Plättchen-Poly-A-RNA mit in einem Teil der GPVI-Sequenz, die durch die der Peptide bestätigt worden war, liegenden Primern vervollständigt. Dabei wurden ein Fragment von 348 bp, einschließlich 278 bp auf der Sequenz des vierten Klons sowie 70 neuen bp von bp 1987, die 14 Aminosäuren, einschließlich des ersten Methionins, entsprechen, gefunden, bevor die etablierte GPVI-Sequenz wieder erreicht wurde. Somit ließ sich eine cDNA sequenzieren, die insgesamt 1249 bp enthielt, nämlich eine 25 bp lange 5'-Sequenz stromaufwärts des Startcodons, ein für ein Protein mit 339 Aminosäuren, einschließlich Leitsequenz, codierendes offenes Leseraster von 1017 bp sowie einen 207 bp langen 3'-Bereich, einschließlich des Stopcodons.
Eine für Plättchen-GPVI codierende cDNA wurde aus einer cDNA-Bibliothek von menschlichem Knochenmark unter Verwendung von RACE mit Plättchen-mRNA zur Bereitstellung fehlender 5'-Sequenz kloniert und sequenziert. Das offene Leseraster von 1017 bp codiert für 339 Aminosäuren und einen nichttranslatierten 3'-Bereich. Die Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz zeigte das Vorhandensein zweier mutmaßlicher Transmembrandomänen, einer mutmaßlichen 20 Aminosäuren langen Signalsequenz und einer 19 Aminosäuren langen Domäne zwischen den Resten 247 und 265 des reifen Proteins. Die Sequenz und ihre Aminosäuretranslation sind in 2 und 1 dargestellt. Ein Vergleich mit der Aminosäuresequenz der ähnlichsten bei einer Suche in GenBank gefundenen Moleküle zeigt eindeutig, daß sie zur Immunglobulin-Superfamilie gehört und daß die extrazelluläre Domäne zwei durch zwei Disulfidbrücken gebildete Ig-C2-Domänen-Schleifen enthält. Es handelt sich um ein membranendurchquerendes Proteinmolekül der Klasse Eins mit dem N-Terminus auf der Außenseite, das die Membran einmal durchquert. Die am engsten verwandten Moleküle gehören zur Klasse natürlicher Killerrezeptoren, die sowohl inhibierende als auch aktivierende Typen enthält. GPVI gehört eindeutig zur aktivierenden Unterklasse, nicht nur durch seine Funktion, sondern auch, weil es im Gegensatz zur inhibitorischen Klasse keine ITIM-Sequenzen in seiner cytoplasmatischen Domäne enthält. Ebenso enthält es keine Tyrosinreste, die an der Phosphorylierung beteiligt sein könnten. Es gibt einige Threonin- und Serinreste in dieser Domäne, doch passen diese zu keinen Kriterien für Kinase-Konsensussequenzen. Wie die aktivierende Klasse der NK-Rezeptoren enthält GPVI einen Argininrest als dritte Aminosäure der membrandurchquerenden Domäne, die an der Komplexbildung mit der Fcγ-Untereinheit beteiligt ist. Die cytoplas matische Domäne enthält 51 Aminosäuren und zeigt nur eine geringe Ähnlichkeit (im Bereich unmittelbar unterhalb der Membran) mit den cytoplasmatischen Domänen anderer Mitglieder dieser Familie. Dies läßt darauf schließen, daß diese Domäne in GPVI mit anderen Arten von cytoplasmatischem Molekül als die anderen Familienmitglieder assoziiert sein kann. GPVI enthält nur eine einzige mutmaßliche N-Glycosylierungsstelle an Asn69. Die Domäne unmittelbar oberhalb der Membran nach dem Ende der Beta-Faltblätter der Ig-Domänen ist jedoch reich an Threonin- und Serinresten, die O-Glycosylierungsstellen bereitstellen könnten, wie sie etwa in GPIbα und GPV angetroffen werden. Die Hauptfunktion dieser O-Glycosylierung scheint darin zu liegen, die Rezeptorstrukturen in weitem Abstand von der Plättchenoberfläche zu präsentieren, um die Wechselwirkungen mit ihren sperrigen Liganden zu erleichtern. Da GPVI bereits zuvor als ein Sialoglycoprotein bestimmt wurde, muß der Unterschied in der Molekülmasse zwischen der theoretischen Aminosäuremasse (37 kDa) und der durch Gelelektrophorese bestimmten Masse (65 kDa, reduziert) an dieser Glycosylierung liegen.
Die Struktur natürlicher Killerrezeptoren der beiden Domänentypen wurde über röntgenkristallografische Untersuchungen ermittelt, wobei gezeigt werden konnte, daß die beiden Ig-Domänen einen spitzen Winkel mit der Rezeptorstelle für die peptidtragenden HLA-Antigene, auf der Außenseite des Ellbogens liegend, bilden. Ein direkter Vergleich der Struktur der HLA-Peptidbindungsstelle mit der von Kollagen zeigt sofort, warum diese Rezeptoren einen gemeinsamen Ursprung besitzen, da die Mehrfach-Alphahelixstrukturen der HLA-Bindungsstelle und des darin enthaltenden Peptids stark der Triplehelixstruktur. von Kollagen ähneln. Man geht davon aus, daß die natürlichen Killerrezeptoren über einen Dimerisierungsmechanismus mit zwei Rezeptoren, die zwei getrennte HLA-Stellen auf der Zelle, die von der natürlichen Killerzelle untersucht wird, erkennen, arbeiten. Diese Dimerisierung ist möglicherweise Teil des Aktivierungs- bzw. Deaktivierungsmechanismus, je nach Rezeptorklasse. Im Fall von GPVI könnte es ebenso möglich sein, daß zwei GPVI-Moleküle mit einem Fcγ assoziieren, da die beiden Monomere des Fcγ-Dimers jeweils eine Erkennungssequenz aufweisen. Allerdings ist die Stöchiometrie noch nicht bekannt und auf der Grundlage der Struktur von Kollagenen, kollagenähnlichen Peptiden, die über GPVI und Convulxin wirken, scheint es wahrscheinlich zu sein, daß die Stärke des Signals mit der Anzahl an GPVI/Fcγ-Komplexen, die zusammen in Cluster vorliegen, in Verbindung steht. Zu weiteren Plättchenrezeptoren, die zu dieser Ig-Familie gehören, zählen ICAM-2 (CD102) und PECAM (CD31).
Alle Mikroorganismen, Zellinien, Expressionssysteme, Expressionswirte, Plasmide, Promotoren, Resistenzmarker, Replikationsursprünge, Restriktionsstellen oder andere Fragmente oder Teile von Vektoren, die in der Beschreibung nicht direkt in Verbindung mit der beanspruchten Erfindung erwähnt sind, sind kommerziell oder sonstwie allgemein erhältlich. Vorausgesetzt, daß keine anderen Hinweise gegeben werden, werden sie lediglich als Beispiele verwendet und sind nicht essentiell in bezug auf die Erfindung und lassen sich durch andere geeignete Werkzeuge bzw. biologische Materialien ersetzen.
Die erfindungsgemäß essentiellen Techniken sind ausführlich nachfolgend und oben beschrieben. Andere Techniken, die nicht ausführlich beschrieben sind, entsprechen bekannten Standardverfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, bzw. sind ausführlicher in den zitierten Literaturangaben und Patentanmeldungen sowie in der Standardliteratur beschrieben (z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor; Harlow, Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor).
BEISPIELE
Beispiel 1: Materialien – Protein-A-Sepharose, Peroxidase-konjugierte Ziege-Anti-Maus – und -Anti-Kaninchen-Antikörper, Rinderserumalbumin, Crotalus durissus terrificus-Gift, Weizenkeimagglutinin (WGA [wheat germ agglutinin]), durch Chlorameisensäure-N-hydroxysuccinimidylester aktivierte quervernetzte 4%-Agarosebeads und Triton X-114 stammten von Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO), Octanoyl-N-methylglycamid (ONMG) sowie Nonanoyl-N-methylglucamid (NNMG) stammten von Oxyl Chemie (Bobingen, Deutschland).
Beispiel 2: GPVI-Isolierung aus Plättchen – Membranglycoproteine wurden aus Plättchen wie zuvor beschrieben isoliert. In Kürze: Plättchen (aus 40 Buffy Coats) wurden gewaschen und in 2% Triton X-114 in Gegenwart von Proteaseinhibitoren lysiert. Das Triton X-114 und die wäßrigen Phasen wurden getrennt, und die Detergentienphase wurde dann auf eine Säule von an Sepharose 4B gekoppelten Weizenkeimagglutinin geladen. Die Plättchenglycoproteine wurden mit 10 mM Tris HCl, pH 7,4, 30 mM NaCl, 0,2% Octanoyl-N-methylglucamid (ONMG) und 2% N-Acetylglucosamin eluiert. Nach Dialyse und Aufkonzentration wurde die Lösung von Glycoproteinen auf eine Säule von an mit N-Hydroxylsuccinamidyl-p-nitrophenylchlorformat aktivierten quervernetzten 4%-Agarosebeads gebundenem Convulxin (1 mg/ml) geladen. Die Säule wurde mit 4 Volumen 10 mM Tris HCl, pH 7,4, 30 mM NaCl, 0,2% Nonanoyl-N-Methylglucamid (NNMG) und danach mit 4 Volumen 10 mM Tris HCl, pH 7,4, 30 mM NaCl und 2% NNMG gewaschen. GPVI wurde mit 0,08% Signaldatensequenz in 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, eluiert. Die Lösung wurde aufkonzentriert und auf ein präparatives Gel aus 8,5% Polyacrylamid unter Verwendung der Model 491 Prep Cell (BioRad, CA) aufgetragen. Die präparative Elektrophorese wurde unter nichtreduzierten Bedingungen nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Dabei eluierte GPVI als eine Einzelbande bei 65 kDa. Die Fraktionen wurden vereinigt, im Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) aufkonzentriert und in 10 mM Tris/HCl, pH 7,4 und 0,1% ONMG resuspendiert.
Beispiel 3: Aminosäureanalyse von GPVI – GPVI wurde mit den Endoproteinasen LysC und AspN (Boehringer Mannheim, Deutschland) verdaut. Die 10 erzeugten Peptide wurden über Umkehrphasen-HPLC getrennt und am Pulsed-Liquid-Phase-Proteinsequenziergerät Modell 477A (Applied Biosystems) mit einem On-Line-Phenylthiohydantoin-Aminosäureanalysator Modell 120A sequenziert.
Beispiel 4: Amplifikation eines 221 bp großen, für einen Teil GPVI codierenden Fragments aus einer λgt11 cDNA-Bibliothek –
Eine Probe (10¹⁰ pfu) (Plaque Forming Units [plaquebildende Einheiten]) aus einer Bibliothek von menschlichem Knochenmark (Clonetech, Palo Alto, CA) wurde unter Verwendung von 2 Kombinationen aus 4 degenerierten Primern amplifiziert. Die Primerendkonzentrationen betrugen jeweils 2 μM, die dNTP-Konzentration betrug 200 μM, und es wurden 2 U AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Rotkreuz, Schweiz) pro 100 μl Reaktionsansatz verwendet. Die PCR-Bedingungen bestanden aus 5 Zyklen bei 37°C und anschließend 30 Zyklen bei 44°C. Über das sense-19mer 5' TYATHCCNGCNATGAARMG 3' und das antisense-20mer 5' TTRTANARNGCRAAYTGRTC 3' wurde ein 221 bp großes Fragment amplifiziert, das in Bluescript KS* (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert und unter Verwendung des T7-Sequinase-Kits (Amersham, Schweiz) sequenziert wurde.
Beispiel 5: Screening der λgt11-cDNA-Bibliothek mit der 221 bp großen GPVI-Sonde – Das 221 bp große Fragment wurde aus dem Plasmid ausgeschnitten, gereinigt und mit α³²P-ATP (20 MBq/50μl, Hartmann Analytik, Braunschweig, Deutschland) unter Verwendung des High Prime Labelling-Kits (Boehringer Mannheim, Schweiz) markiert. Die Bibliothek von menschlichem Knochenmark wurde einem Screening nach den Anweisungen des Herstellers unterzogen. Positive Phagen wurden kultiviert, deren DNA isoliert und in BlueScript unter Verwendung von entweder EcoRI- oder Sal I-Stellen subkloniert und sequenziert. Die Sequenzierung wurde mit dem ABS-System von RACE durchgeführt. Plättchen-Poly-A-RNA wurde wie zuvor beschrieben präpariert (Power et al., Cytokine 7, 479–482, 1995). Reverse Transkription (30 μl) wurde unter Verwendung von 5 μg Poly-A-RNA mit dem Primer 5' TGAATGAGACGGTCAGTTCAGC 3' (20 μM), dNTP (1 mM), RNAsin (40 U), 1 × AMV-Puffer und 20 U AMV-reverse-Transkriptase 20 min bei 45°C und danach 20 min bei 52°C durchgeführt. Der Reaktionsansatz wurde mit 2 μl 6N NaOH 30 min bei 65°C behandelt, mit 2 μl 6N Essigsäure neutralisiert und in einem Centricon 30 (Amicon) aufkonzentriert. Ein Anker wurde an die Erststrang-DNA nach der Vorschrift von Aptes und Siebert (BioTechniques 15: 890–893, 1993) ligiert. Nested-PCR wurde unter Verwendung eines zum Anker komplementären Primers sowie des Primers 5' TTGTACAGAGCAAATTGGTC 3' (35 Zyklen, 55°C) und anschließend mit dem Primer 5' GACCAGAGGCTTCCGTTCTG 3' (30 Zyklen bei 53°C) durchgeführt. Die höchste Bande (350 bp) wurde mittels Agaroseelektrophorese von den niedrigeren Banden getrennt, in BlueScript subkloniert und sequenziert.
Beispiel 6: Herstellung von Anti-GPVI Fab und F(ab')₂-Polyklonale Antiseren gegen menschliches GPVI wurden in Kaninchen erzeugt. IgG wurde aus Kaninchen-Anti-GPVI-Antiserum wie beschrieben aufgereinigt. Die Verdauung von IgG mit immobilisiertem Papain (Pierce) zur Erzeugung von Fab-Fragmenten wurde nach der Standardvorschrift der Lieferfirma durchgeführt. Fab-Fragmente wurden von unverdautem IgG und Fc-Fragmenten mittels einer Säule von immobilisiertem Protein A (Sigma) getrennt. Der Durchfluß wurde in ein Dialyseröhrchen überführt, unter Verwendung von festem Polyethylenglycol 20.000 aufkonzentriert, gründlich gegen 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, 4 mM KCl, pH 7,4 dialysiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert. F(ab')₂-Fragmente wurden durch Pepsinverdauung von IgG bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:50 (w/w) 18 Std. in 0,5 M Acetatpuffer, pH 4,0 bei 37°C hergestellt. Der pH-Wert wurde auf 7,4 mit verdünnter NaOH korrigiert und die Probe gegen 20 mM Phosphat, pH 7,4, dialysiert. F(ab')₂-Fragmente wurden von unverdautem IgG und Fc-Fragmenten mittels Protein-A-Chromatographie getrennt. Der Durchfluß wurde in ein Dialyseröhrchen überführt, unter Verwendung von festem Polyethylenglycol 20.000 aufkonzentriert, intensiv gegen 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, 4 mM KCl, pH 7,4 dialysiert und in Portionen bei –20°C gelagert. Die gewaschenen Plättchen wurden in Triton X-114 lysiert, und die Phasentrennung erfolgte an löslichem Material vor der Isolierung der mit Triton-X-114-Phase assoziierten Membranglycoproteine mittels Affinitätschromatographie an Weizenkeimagglutinin-Sepharose 4B, wie zuvor beschrieben. Da GPVI nur eine sehr kleine Fraktion der vereinigten Plättchenmembranglycoproteine darstellt, wurde die Spezifität des Schlangen-C-Typ-Lectin-Convulxins für die Isolierung dieses Rezeptors verwendet. Die Affinitätschromatographie an an Sepharose 4B gekoppeltem Convulxin ergab ein 65 kDa großes Protein als Hauptprodukt. Allerdings coeluierte nichtcharakterisieres Material mit sowohl höherem als auch geringerem Mr mit GPVI und konnte durch gründliches Waschen der Säule nicht abgetrennt werden. Als letzter Schritt der Aufreinigung wurde eine präparative Gelelektrophorese an 8,5% Polyacrylamid hinzugefügt. GPVI enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und ergaben eine Einzelbande bei der nochmaligen Analyse. Gereinigtes GPVI wurde auf seine Fähigkeit zur Blockierung der Plättchenaggregation durch Kollagen getestet. Ein leicht hemmender Effekt wurde beobachtet, wenn Portionen der GPVI-Lösung zu der Plättchensuspension gegeben wurden. Jedoch konnte durch Vorinkubieren von GPVI mit Kollagen vor Zugabe des Gemischs zu der Plättchensuspension die Aggregation in einer dosisabhängigen Weise gehemmt werden. Diese Plättchen aggregierten noch, wenn frisches Kollagen zugegeben wurde. Unter nichtreduzierenden Bedingungen wies das isolierte Protein ein Mr von 62 kDa auf, wobei unter reduzierenden Bedingungen eine Verschiebung zu einem etwas höherem Mr (65 kDa) stattfand. Das sich herausstellte, daß der Aminoterminus von GPVI blockiert war, wurde das Protein mit den Enzymen LysC und LysC/AspN verdaut, wodurch 4 bzw. 6 Peptide produziert wurden, von denen die Sequenz ermittelt wurde. Diese Peptide wurden über Umkehrphasen-HPLC an einer C4-Säule getrennt und mit dem Edman-Verfahren sequenziert. Die Aminosäuresequenzen dieser Peptide sind in der translatierten cDNA-Sequenz unterstrichen (1). SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA, codierend für Glykoprotein VI.
DNA mit der Sequenz in 2.
DNA gemäß Anspruch 1 oder 2, codierend für Glykoprotein VI, das die Aminosäuresequenz in 1a und 1b umfaßt.
Rekombinantes menschliches Glykoprotein VI, umfassend die Aminosäuresequenz in 1b, zur Verwendung als Arzneimittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Protein nach Anspruch 4 sowie ein pharmazeutisch unbedenkliches Verdünnungs-, Träger- oder Hilfsmittel dafür, zur Verwendung als Arzneimittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, zusätzlich umfassend eine pharmakologisch wirksame Verbindung.
Verwendung von rekombinantem GPVI zur Herstellung eines Arzneimittels auf dem Gebiet der Therapie thrombotischer und kardiovaskulärer Krankheiten und Störungen in Verbindung mit Plättchen-Kollagen-Wechselwirkungen.
In-vitro-Verwendung von Veränderungen bei der Bindung und dem Grad der Aktivierung von Blutplättchen durch GPVI-spezifische Schlangengiftproteine, wie etwa Convulxin, oder von Veränderungen bei der Bindung durch die N-terminale GPVI-Domäne erkennende monoklonale oder polyklonale Antikörper als Marker für das Plättchenalter.
Verwendung von Veränderungen gemäß Anspruch 8 als Marker für sich auf das Knochenmark oder das Immun system auswirkende Krankheiten.