DE69027542T2

DE69027542T2 - Solubilisierung und reinigung des rezeptors für das gastrin-freisetzende peptid

Info

Publication number: DE69027542T2
Application number: DE69027542T
Authority: DE
Inventors: Richard Feldman; James Jenson; Anne Larocca; Elaina Mann; James Wu
Original assignee: Berlex Laboratories Inc
Current assignee: Berlex Laboratories Inc
Priority date: 1989-10-24
Filing date: 1990-10-23
Publication date: 1996-12-12
Anticipated expiration: 2010-10-24
Also published as: EP0524173A1; AU7740691A; AU7039491A; JPH05506981A; JPH05505097A; ATE139565T1; AU641210B2; DE69027542D1; CA2069965A1; CA2067766A1; EP0524173B1; AU640480B2; ES2089182T3; EP0497866A1; WO1991006647A1; WO1991006646A1

Description

Wachstumsfaktoren spielen für zahlreiche physiologische und pathologische vorgänge eine Rolle. Es wurde eine steigende Anzahl kleiner Regulatorpeptide in den neuralen und neuroendokrinen Zellen von Säugergeweben entdeckt. Nach dem neuesten Erkenntnisstand tragen Neuropeptide zur der Regulation des Wachstums tierischer Zellen bei, und insbesondere haben mitogene Peptide eine Wirkung auf das Zellsystem Swiss 3T3. Eines der ersten untersuchten Neuropeptide war Tetradekapeptid-Bombesin, welches ursprünglich von Amphibienhaut isoliert wurde, Anastasi et al., Experientia 27:166-167 (1971). Bombesin ist in seiner Struktur mit mehreren endogenen Säugerpeptiden verwandt, von denen das erste, das charakterisiert wurde, das Gastrin-freisetzende Peptid war.
Das Gastrin-freisetzende Peptid (GFP) ist ein Peptid mit 27 Aminosäuren, das in Menschen die folgende Sequenz hat: Val- Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val -Leu-Thr-Lys -Met -Tyr-Pro- Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2. Das Gastrinfreisetzende Peptid ist von erheblichem Interesse, da vermutet wird, daß es die Fähigkeit besitzt, als autokriner Wachstumsfaktor bei der Krebs-Pathogenese zu wirken. Insbesondere wurde festgestellt, daß GFP das Wachstum von menschlichem kleinzelligen Lungenkarzinom (SCLC) fördert. Es wird angenommen, daß das sich an Rezeptoren der Zellenoberfläche bindende GFP das Zellenwachstum stimuliert, indem es die Hydrolyse von Phosphatidylinositiden fördert und die Protein-Kinase C aktiviert. Eine große Anzahl biologischer Antworten auf GFP wurden beobachtet, einschließlich Simulation von Na+/H+-Austausch, Mobilisierung von intrazellulärem Ca²+, transitorische Expression von c-fos und c-myc Proto-Onkogenen, Induktion der Tyrosin- Kinase-Aktivität, Erhöhung der DNA-Synthese und Förderung der Zellteilung.
Die Rolle von GFP bei der Aufrechterhaltung des Wachstums von SCLC legt nahe, daß effektive therapeutische Wirkstoffe entwickelt werden könnten, die den autokrinen Wachstumszyklus durch Deaktivierung von GFP oder Hemmung seines Rezeptors unterbrechen. Die aktive Stelle von GFP ist der C-terminale Bereich, der Rezeptoren mit hoher Affinität an SCLC-Membranen bindet. Eine Blockierung dieser Bindung kann das SCLC-Wachstum hemmen. Dies wurde bereits mit monoklonalen Antikörpern für Bombesin erreicht, die sich an der aktiven Stelle von GFP binden und somit das Peptid deaktivieren, Cuttitta et al., Nature 316:823 - 826 (1985).
Ein weiterer Ansatz zur Blockierung der Bindung von GFP an seinen Rezeptor und somit zur Behandlung von SCLC besteht darin, den Rezeptor selbst zu hemmen. Dies läßt sich durch Verwendung von Wirkstoffen durchführen, die sich an das GFP binden und als Antagonisten wirken. Antagonisten sind normalerweise zu finden, sobald der Rezeptor pharmakologisch definiert wurde, so wie es bei dem GFP-Rezeptor der Fall ist. Das Testen potentieller Rezeptor-Antagonisten ist mit der Entwicklung hochgradig automatisierter Assay-Verfahren weitaus einfacher geworden. Ein Nachteil hierbei ist es, daß für diese Systeme gereinigter GFP-Rezeptor in aktiver Form erforderlich ist, der nicht ohne weiteres zur Verfügung steht. Dieses Problem läßt sich durch Verwendung des rekombinierten Rezeptors überwinden. Abgesehen davon, daß hierdurch eine verbesserte stetig verfügbare Quelle des Rezeptors aus einer spezifischen Quelle zur Verfügung steht, bringt die Verwendung des rekombinierten GFP- Rezeptors beim Screening nach Wirkstoffen, die mit dem GFP- Rezeptor reagieren, folgende Vorteile: eine möglicherweise erhöhte Anzahl von Rezeptoren pro Zelle, was einen größeren Ertrag des Reagens und ein Signal/Rausch-Verhältnis in Assays ergibt; und eine Spezifität des Rezeptor-Subtyps (wodurch sich theoretisch eine größere biologische und krankheitsbezogene Spezifität ergibt).
Die Quervernetzung des GFP-Rezeptors mit gebundenem radioaktiv markiertem GFP wurde zur Sichtbarmachung des konjugierten GFP- Rezeptors und Liganden in einer Trägerelektrophorese auf Natrium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE-Elektrophorese) und zum Ableiten gewisser andere Merkmale des Rezeptors eingesetzt, Rosengurt et al., PCT/G888/00255. Bei der angewandten Technik fand jedoch keine Isolation des Rezeptors statt, sondern vielmehr eine Charakterisierung einer modifizierten Form des Rezeptorproteins. Nachteilig hierbei ist, daß zur Charakterisierung der strukturellen Eigenschaften des GFP- Rezeptors im einzelnen und zum Verständnis des Wirkungsmechanismus auf molekularer Ebene der Rezeptor gereinigt werden muß. Für einige Anwendungen ist es entscheidend, daß der Rezeptor in aktivem Zustand gereinigt wird, wodurch die Bindungsaktivität des Rezeptors aufrechterhalten wird. Derartige Anwendungen sind zum Beispiel die Erzeugung von Antikörpern gegenüber aktiven Rezeptor-Epitopen, strukturelle Studien des Ligandenbindungsortes und die Verwendung des gereinigten Rezeptors zum Screening von Agonisten und Antagonisten der GFP- Bindung.
In J. Biol. Chem. 263 (1988) 144 - 149 sind Verfahren zur Solubilisierung und Charakterisierung aktiver Neurotensin-Rezeptoren aus Mäusegehirn unter Verwendung von 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propan-sulfonat oder Sulfonsäure und Cholesterol-Hemisuccinat beschrieben.
In J. Biol. Chem. 262 (1987) 11215 - 11220; Zusammenfassung, ist der Rezeptor für das Bombesin- oder Gastrin-freisetzende Peptid (GFP) beschrieben und es ist darin offenbart, daß der Rezeptor ein Glykoprotein ist, das auf der Oberfläche der Zellen von Nagern und Menschen zu finden ist.
Bis heute wurden nur wenige Rezeptoren isoliert und in ihrer aktiven Form charakterisiert. Hierfür gibt es zwei Hauptgründe. Erstens ist die in den meisten Geweben vorhandene Rezeptormenge gering und zweitens muß der Rezeptor häufig aus Membranen mit Detergentien solubilisiert werden, die die Struktur des Proteins durcheinanderbringen können. Diese Probleme werden durch die unberechenbare Art von Rezeptoren noch verstärkt, da ein Verfahren zur erfolgreichen Solubilisierung des einen Proteinrezeptors bei einem anderen Proteinrezeptor vielleicht keine Erfolg hat.
Diese Erfindung betrifft die Solubilisierung des aktiven GFP- Rezeptors aus Zellmembranen, die Charakterisierung des Rezeptorverhaltens in Lösung, und die Reinigung des solubilisierten Rezeptors in aktiver Form, wobei der gewonnene Rezeptor noch über seine vollständige GFP-Bindeaktivität verfügt
Insbesondere betrifft diese Erfindung das Erhalten des solubilisierten und gereinigten, natürlich vorkommenden GFP-Rezeptors in sequenzierbarer Qualität, Bestimmen der ihm eigenen Aminosäuresequenz, Isolieren des cDNA für den GFP-Rezeptor, und Bestimmen der Nukleotidsequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Rezeptors.
Insbesondere betrifft diese Erfindung die Expression von DNA, die den GFP-Rezeptor in Wirtszellen kodiert, wodurch sie die Synthese von GFP-Rezeptor-Zusammensetzungen mit der Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden GFP-Rezeptors ermöglicht, welche vollkommen frei von anderen Proteinen der Ausgangsspezies sind und des weiteren die Synthese neuer mutierter GFP- Rezeptoren ermöglichen.
Ferner betrifft diese Erfindung die Verwendung von DNA, die den GFP-Rezeptor oder dessen Fragmente bei der Hybridisierungsdiagnose fehlerhafter GFP-Rezeptor-DNA oder -mRNA kodiert, und zum Erhalten von DNA aus natürlichen Ausgangsmatenahen, die den GFP-Rezeptor kodiert.
Insbesondere betrifft diese Erfindung die Verwendung des rekombinierten GFP-Rezeptors, und Zellinien, in welche Vektoren eingeführt sind, die die Expression des GFP-Rezeptors steuern, sowie Membranen aus diesen Zellinien, in Wirkstoff-Screening- Assays für Verbindungen, die eine passende Bindungsaffinität zum GFP-Rezeptor haben.
Spezifischer ausgedrückt, betrifft diese Erfindung den rekombinierten GFP-Rezeptor zusammen mit Proteinfragmenten des Rezeptors und auf diese gerichtete Antikörper, die in diagnostischen Assays zur Bestimmung nützlich sein können, ob ein Patient erhöhter Spiegel des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid hat. Assays, die auf die Bestimmung von Antikörpern für den GFP-Rezeptor und/oder die Bestimmung des GFP-Rezeptors selbst beruhen, können ebenfalls prognostischen Wert haben.
Außerdem betrifft diese Erfindung die Verwendung des rekombinierten GFP-Rezeptors oder dessen Fragmente oder Derivate, beispielsweise Antikörper für den Rezeptor oder Fragmente oder spezifische Rezeptor-Antagonisten, die in Screening-Assays definiert sind, als therapeutische Wirkstoffe.
Figur 1 zeige einen graphischen Vergleich der Fähigkeit mehrerer Detergentien zur Solubilisierung des GFP-Rezeptors und zeigt die Wirkung der Solubilisierung auf die Bindungsaktivi-
Figur 2 ist eine graphische Darstellung der GFP-Bindungsaktivität und der GFP-Rezeptor-Solubilisierung in Abhängigkeit von der Konzentration des Detergens (CHAPS);
Figur 3 ist eine graphische Darstellung der GFP-Rezeptor-Solubilisierung und -Aktivitat in Abhängigkeit von der Konzentration des Stabilisators des löslichen Cholesterylesters (CHS);
Figur 4 ist eine graphische Darstellung der GFP-Bindungsaktivität in Abhängigkeit von der Konzentration des Detergens (CHAPS);
Figur 5 zeigt eine Gelanzeige der SDS-PAGE-Analyse von ¹²&sup5;-I- GFP, das mit dem GFP-Rezeptor in einem löslichen Rohextrakt quervernetzt ist;
Fig. 6 zeigt eine mit Silber angefärbte Gelanzeige einer SDS- PAGE-Analyse des gereinigten GFP-Rezeptors;
Fig. 7 zeigt die Trennung von Trypsin-Fragmenten des GFP-Rezeptors durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) mit umgekehrten Phasen.
Fig. 8 zeigt die Nukleotidsequenz des GFP-Rezeptors und seine abgeleitete Aminosäuresequenz. Die expemMentell bestimmte Aminosäuresequenz des intakten GFP-Proteins und isolierter tryptischer Peptide an den Rezeptor ist durch Unterstreichung angegeben. Die mutmaßlichen Transmembransequenzen sind mit I bis VII markiert. Übereinstimmungssequenzen für N-verknüpfende Glykosylierung stehen in Kästchen.
Fig. 9 zeigt die Hydropathie-Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz des GFP-Rezeptors. Die Transmembransequenzen sind durch die Zahlen I bis VII angegeben;
Fig. 10 zeigt die Hybridisierungsanalyse nach Northern von mRNA aus Swiss 3T3-Zellen;
Fig. 11 ist ein Vergleich der Aminosäuresequenzen des GFP-Rezeptors und des Rezeptors für die Substanz K;
Fig. 12 zeigt die Hybridisierungsanalyse nach Northern von mRNA aus Lungenzellen menschlicher Foeten (HFL).
Fig. 13 zeigt die GFP-ligandenabhängige Induktion von Chloridstrom in einem xenopus-Oozyt, der ein in vitro-Transkript aus dem GFP-Rezeptor-cDNA-Klon exprimiert.
Diese Erfindung stellt die Aminosäuresequenz und DNA-Sequenz des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid (GFP) zur Verfügung, die nach Reinigung des GFP-Rezeptors und Bestimmung der Aminosäuresequenz tryptischer Fragmente des GFP-Rezeptors erhalten wurden.
Aus dem gereinigten GFP-Rezeptor erhaltene Aminosäure-Teilsequenzen wurden zur Ableitung von DNA-Sonden verwendet, die dann zur Isolation der GFP-Rezeptor-cDNA-Form des Gens eingesetzt wurden. Einige der Standardverfahren sind in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, U.S.A.) oder in F.M. Ausubel et al., Biology (Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY, U.S.A.) beschrieben oder erwähnt. Das Verfahren ist nachstehend in groben Zügen beschrieben.
Eine cDNA-Bank, die im Bakteriophagen Lambda gt10 aufgebaut wurde, wurde aus RNA hergestellt, die aus Swiss T3T-Zellen isoliert wurde. Mehrere Modifikationen und außergewöhnliche Techniken mußten eingesetzt werden, um Probleme im Zusammenhang mit der Isolation eines cDNA-Klons bei der Untersuchung der Bank mit Oligonukleotiden zu überwinden. Insbesondere war es notwendig, die Bank für cDNA-Spezies, die den GFP-Rezeptor kodieren, aufgrund der Unterrepräsentation derartiger Spezies in nicht -angereicherten cDNA-Banken anzureichern. Oligonukleotid-Sonden wurden hergestellt, die eine Nukleotidsequenz auf der Basis des wahrscheinlichsten Codon-Gebrauchs hatten. Die cDNA-Bank wurde ausplattiert, wodurch die im Phagen Lambda enthaltenen cDNA-Inserts ihre E. coli-Wirte lysieren und Plaques bilden konnten, von denen jedes individuelle cDNA-Inserts enthielt. Die Plaques wurden einem Screening auf GFP-Rezeptor-DNA-Sequenzen mit markierten Oligonukleotidproben unterzogen. Die GFP-Rezeptor-cDNA-Spezien wurden isoliert, diese kodierten jedoch nicht den gesamten GFP-Rezeptor.
Eine Polymerase-Kettereaktions-Technologie wurde verwendet, um zusätzliche cDNA-Spezies, die für Teile des GFP-Rezeptors kodierten, uhd deren Randbereiche 5' und 3' zu isolieren. Es wurde dann ein genspezifisches, von einem PmMer gesteuertes cDNA-Klonierungsverfahren eingesetzt, um eine einzige cDNA- Klonierung zu erhalten, die für das gesamte GFP-Rezeptor- Translationsprodukt kodierte. Die tatsächlichen, hierbei verwendeten Klonierungsverfahren sind im einzelnen in den Beispielen 12 und 13 ausgeführt.
War die cDNA für den GFP-Rezeptor aus dem Mäusegewebe erst einmal isoliert, wurde sie in Sequenzen aufgeteilt. Anhand der Nukleotidsequenz wurde die Aminosäuresequenz des primären Translationsprodukts des GFP-Rezeptors ermittelt, d.h. die Aminosäuresequenz vor irgendeiner post-translationalen Modifikation.
Die vollständige Aminosäuresequenz ist in Fig. 8 gezeigt. So, wie hier verwendet, soll der Begriff "GFP-Rezeptor" als ein Protein oder Peptid definiert sein, welches die in Fig. 8 dargestellte Aminosäuresequenz oder einen Teil dieser enthält. Der Begriff "GFP-Rezeptor" soll in seiner hier verwendeten Bedeutung ebenfalls die GFP-Rezeptoren von anderen Spezien als Mäusen enthalten, zum Beispiel von Menschen und anderen Säugern.
Diese Erfindung umfaßt ebenfalls Proteine oder Peptide, die eine erhebliche Homologie zur Aminosäuresequenz in Fig. 8 haben, auschließlich jedweden Proteins oder Peptids, das im wesentlichen dieselbe oder eine geringere Homologie aufweist als der Rezeptor der Substanz K. Dies ist in Fig. 11 dargestellt.
Eine Homologie wird durch Optimieren der Übereinstimmung von Resten bestimmt, indem je nach Bedarf Lücken eingefügt werden. Dies ändert sich, wenn konservative Substitutionen als übereinstimmungen betrachtet werden. Diese Definition soll ebenfalls natürliche alle Variationen in der GFP-Rezeptor-Sequenz einschließen. Typische homologe Proteine oder Peptide haben eine Homologie von 25-100% (wenn Lücken eingefügt werden können) bis zu 50-100% (wenn konservative Substitutionen enthalten sind) mit der Aminosäuresequenz aus Fig. 8. Einige homologe Proteine oder Peptide, beispielsweise Untertypen des GFP- Rezeptors, haben einen Teil ihrer biologischen Aktivität mit dem GFP-Rezeptor aus Fig. 8 gemeinsam. In der hierin verwendeten Bedeutung ist der Begriff "biologische Aktivität" so definiert, daß er ohne Einschränkung eine Bindung des Gastrinfreisetzenden Peptids, eine Quer-Reaktivität mit Anti-GFP-Rezeptor-Antikörpern, die im Vergleich zu GFP-Rezeptoren aus natürlichen Ausgangsmaterial erhöht ist, und eine Kopplung an Guanyl-Nukleotid-Regulatorproteinen einschließt.
Bei dieser Erfindung wird die Verwendung der isolierten DNA, die den GFP-Rezeptor oder dessen Fragment kodiert, zur Kddierung eines biologisch aktiven GFP-Rezeptor-Polypeptids erwogen. Außerdem deckt diese Erfindung isolierte DNA ab, die ein biologisch aktives Protein mit GFP-Rezeptor-Aktivität kodiert, welches in der Lage ist, mit der in Fig. 8 gezeigten DNA zu hybridisieren. Dieses biologisch aktive Protein kann der GFP- Rezeptor selbst sein und die in Fig. 8 gezeigte Aminosäuresequenz enthalten. Des weiteren umfaßt diese Erfindung die Verwendung isolierter DNA, die Proteine kodiert, die mit dem GFP- Rezeptor homolog sind und unter Verwendung von GFP-RezeptorcDNA als Sonde isoliert wurden. Die isolierte DNA kann die entsprechende Regulatorsequenzen an den 5'- und 3'-Enden enthalten.
Es wird erwartet, daß die DNA, die den Gastrin-freisetzenden Peptid-Rezeptor kodiert, besonders nützlich bei der Identifizierung von Genen, mRNA- und cDNA-Spezien ist, die verwandte oder homologe Rezeptoren kodieren, zusammen mit denjenigen, die GFP-Rezeptor-Subtypen und den GFP-Rezeptor im Gewebe unterschiedlicher Spezien kodieren. Es ist mindestens ein GFP- Rezeptor-Subtyp beschrieben, der mit einer unterschiedlichen Selektivität für Bombesin-artige Peptide ausgestattet ist. Es gibt wahrscheinlich auch andere. Verschiedene Subtypen des GFP-Rezeptors sollen angeblich hochgradig homolog sein. Selbst Rezeptorproteine, die mit dem GFP-Rezeptor entfernter verwandt sind und keine Fähigkeit zur Bindung von Gastrin-freisetzendem Peptid mehr haben, lassen sich jedoch unter Verwendung der GFP-Rezeptorsequeni problemlos isolieren, wenn sie ausreichend homolog sind.
Diese Erfindung umfaßt weiterhin Moleküle rekombinierter DNA mit einer DNA-Sequenz, die mit der hier beschriebenen isolierten DNA identisch ist.
Die isolierte DNA des GFP-Rezeptors läßt sich durch Nukleotid- Substitutionen, Nukleotid-Deletionen, Nukleotid-Insertionen und Inversionen von Nukleotid-Abschnitten problemlos modifizieren. Diese Modifikationen ergeben neuartige DNA-Sequenzen, die den GFP-Rezeptor, seine Derivate oder Proteine mit GFP- Rezeptoraktivität kodieren. Diese modifizierten Sequenzen können dazu verwendet werden, mutierten GFP-Rezeptor zu produzieren oder die Expression von GFP-Rezeptorspezien zu verbessern. Derartige GFP-Rezeptor-Derivate schließen die vorbestimmten oder ortsspezifischen Mutationen des GFP-Rezeptors oder seiner Fragmente ein. Ein mutierter GFP-Rezeptor soll hier als ein Polypeptid definiert sein, das ansonsten in die voranstehend beschriebene Homologie-Definition des GFP-Rezeptors fällt, jedoch eine Aminosäuresequenz hat, die sich von derjenigen des natürlich vorkommenden GFP-Rezeptors unterscheidet, sei es aufgrund von Deletion, Substitution oder Insertion. Insbesondere soll der ortsspezifische mutierte GFP-Rezeptor so definiert sein, daß er eine Homologie von mehr als 50% mit dem GFP-Rezeptor aus Fig. 8 hat und eine biologische Aktivität mit dem Rezeptor aus Fig. 8 gemeinsam hat.
Obgleich Mutationsstellen vorbestimmt sind, ist dies keine Bedingung. Zur Optimierung der Leistung von Mutanten an einer vorgegebenen Rest-Position kann zum Beispiel eine beliebige Mutagenese am Ziel-Codon vorgenommen werden, und die exprimierten GFP-Rezeptor-Mutanten können dann einem Screening auf die gewünschte Aktivität hin unterzogen werden. Verfahren zur Herstellung von Substitutions-Mutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA mit einer bekannten Sequenz sind im Stand der Technik wohlbekannt, beispielsweise die M13-PmMer-Mutagenese.
Eine GFP-Rezeptor-Mutagenese läßt sich durch Aminosäure-Insertionen oder -Deletionen vornehmen. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder eine Unterkombination können kombiniert werden, um zu einem endgültigen Aufbau zu gelangen. Insertionen enthalten endständige Amino- oder Carboxyl-Fusionen. Die Mutationen in der DNA dürfen die Kodierungssequenzen nicht aus dem Leseraster heraus verschieben und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die hybridisieren könnten, um eine sekundäre mRNA-Struktur, wie beispielsweise eine Schlaufe oder eine Haarnadelschleife zu produzieren.
Die DNA, die den GFP-Rezeptor oder dessen Fragmente kodiert, läßt sich durch chemische Synthese, Screening von cDNA-Banken, oder durch Screening von Genom-Banken, die aus einer großen Anzahl von Zellinien oder Gewebeproben hergestellt wurden, erhalten.
Diese DNA kann von vielen Wirtszellen für die Synthese des Rezeptors in seiner Gesamtlänge oder von Fragmenten des Rezeptors, welche wiederum beispielweise zur Erzeugung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper verwendet werden können; für die Konstruktion und Expression modifizierter Rezeptormoleküle; und für Struktur/Funktions-Studien exprimiert werden. Der GFP- Rezeptor oder seine Fragmente können in Wirtszellen exprimiert werden, die mit geeigneten Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert sind. Diese Moleküle können im wesentlichen frei von Protein oder zellulären Verunreinigungen sein, abgesehen von denjenigen, die sich vom rekombinierten Wirt herleiten, und sie sind daher besonders nützlich in pharmazeutischen Zusammensetzungen, wenn sie mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Verdünnungsmittel kombiniert sind. Der Rezeptor oder dessen Abschnitte können als Fusionen mit anderen Proteinen exprimiert werden.
Expressionsvektoren sind selbst-replizierende DNA- oder RNA- Konstrukte, die das GFP-Rezeptorgen oder seine Fragmente enthalten, welche üblicherweise funktionell mit geeigneten genetischen Steuerelementen verknüpft sind, die in einer geeigneten Wirtszelle erkannt werden. Diese Steuerelemente sind in der Lage, die Expression innerhalb eines geeigneten Wirtes zu beeinflussen. Der spezifische Typ von Steuerelementen, der zur Bewirkung einer Expression erforderlich ist, hängt von der letztendlich verwendeten Wirtszelle ab. Im allgemeinen können genetische Steuerelemente ein prokaryotisches Promotorsystem oder ein eukaryotisches Promotorexpressions-Steuersystem sein, und eine transkriptionalen Promotor, einen optionalen Promotor zur Steuerung des Beginns der Transkription, Transkriptions- Verbesserer zur Erhöhung des mRNA-Expressionsgrades, eine Sequenz, die einen passenden Ribosomen-Bindungsort kodiert, und Sequenzen, die Transkription und Translation terminieren, einschließen. Expressionsvektoren enthalten üblicherweise auch einen Replikationsursprung, der dem Vektor eine Replikation unabhängig von der Wirtszelle ermöglicht.
Die Vektoren dieser Erfindung enthalten DNA, die den GFP-Rezeptor oder ein Fragment davon, das ein biologisch aktives GFP-Rezeptor-Polypeptid kodiert, kodieren. Die DNA kann unter der Steuerung eines viralen Promotors stehen und einen Selektionsmarker kodieren. Diese Erfindung sieht ferner die Verwendung derartiger Expressionsvektoren vor, die in der Lage sind, eine eukaryotische cDNA-Kodierung für den GFP-Rezeptor in einem prokaryotischen oder einem eukaryotischen Wirt zu exprimieren, wobei der Vektor mit dem Wirt kompatibel ist, und wobei die für den GFP-Rezeptor kodierende eukaryotische cDNA in den Vektor eingesetzt wird, so daß die in Rede stehende cDNA durch Wachsen des den Vektor enthaltenden Wirts exprimiert wird. Brauchbare Expressionsvektoren müssen jedoch nicht immer in ihren Wirtszellen replizieren. Üblicherweise sind Expressionsvektoren für eine stabile Replikation in ihren Wirtszellen oder für eine Amplifikation, die die Gesamtzahl an Kopien des gewünschten Gens pro Zelle erhöht, ausgelegt. Die Bedingung, daß ein Expressionsvektor sich in einer Wirtszelle repliziert, ist jedoch nicht immer erforderlich. Es ist jedoch möglich, eine vorübergehende Expression des GFP-Rezeptors oder seiner Fragmente in verschiedenen Wirten unter Verwendung von Vektoren, die keinen Replikationsstartpunkt enthalten, der von der Wirtszelle erkannt wird, zu bewirken. Es ist ebenfalls möglich, Vektoren zu verwenden, die eine Integration des GFP- Vektors oder seiner Fragmente in die Wirts-DNA durch Rekombination bewirken.
Vektoren umfassen Plasmide, Viren, Bakteriophagen, integrierbare DNA-Fragmente und andere Transportmittel, die die Integration von DNA-Fragmenten in das Genom des Wirts ermöglichen. Expressionsvektoren sind spezialisierte Vektoren, die genetische Steuerelemente enthalten, die eine Expression von funktionell verknüpften Genen bewirken. Plasmide sind die am häufigsten verwendete Form von Vektor; alle anderen Formen von Vektoren, die einer äquivalente Funktion dienen und die im Stand der Technik bekannt sind oder werden, sind zur Verwendung hierfür geeignet.
Transformierte Zellen sind Zellen, vorzugsweise von Säugern, die mit GFP-Rezeptor-Vektoren, die unter Verwendung von rekombinierter DNA-Techniken konstruiert wurden, transformiert oder transfiziert wurden. Transformierte Wirtszellen exprimieren üblicherweise den GFP-Rezeptor oder seine Fragmente; für die Zwecke der Klonierung, Amplifikation und Manipulation seiner DNA müssen sie jedoch nicht den GFP-Rezeptor exprimieren. Diese Erfindung sieht des weiteren die Züchtung transformierten Zellen in einem Nährstoffmedium vor, wodurch sich der GFP-Rezeptor in der Kultur ansammeln kann. Der GFP-Rezeptor kann dann gewonnen werden, und zwar zunächst aus der Kultur und dann aus dem Kulturmedium.
Für die Zwecke dieser Erfindung werden DNA-Sequenzen funktionell verknüpft, wenn sie funktional miteinander verwandt sind. Zum Beispiel wird die DNA für eine Vorsequenz oder einen Sekretions-Leader funktionell an ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Vorprotein exprimiert wird oder an der Lokalisierung des Polypeptids an der Zellmembran oder an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt. Ein Promotor wird funktionell mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription des Polypeptids steuert; ein Ribosomenbindungsort wird funktionell mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er so positioniert ist, daß eine Translation möglich ist. Üblicherweise bedeutet verbunden zusammenhängend und im Leserahmen; bestimmte genetische Elementen, beispielsweise Repressorgene, sind jedoch nicht zusammenhängend verbunden, sondern binden sich noch immer an Operatorsequenzen, die wiederum die Expression steuern.
Geeignete Wirtszellen sind unter anderem Prokaryonten, niedere Eukaryonten und Hefen oder höhere Eukaryonten. Prokaryonten schließen sowohl gramnegative als auch grampositive Organismen ein, beispielsweise E. coli und B. subtilis. Niedere Eukaryonten schließen Hefen ein, zum Beispiel S. cerevisiae und Pichia, und Spezien wie Dictyostelium. Höhere Eukaryonten schließen etablierte Gewebekulturzellinien aus tierischen Zellen ein, sowohl nicht-säugerischer Herkunft wie Insektenzellen, als auch säugerischer Herkunft, beispielsweise von Menschen, PmMaten und Nagern.
Prokaryotische Wirtsvektorensysteme schließen eine große Vielzahl von Vektoren für viele verschiedene Spezien ein. In ihrer Verwendung hierin sind E. coli und ihre Vektoren generisch verwendet und schließen aquivalente Vektoren für andere Prokaryonten ein. Ein repräsentativer Vektor zur Amplifikation von DNA ist PBR322 oder ein beliebiges seiner Derivate. Vektoren, die zur Expression des GFP-Rezeptors oder seiner Fragmente verwendet werden können, schließen solche Vektoren (aber nicht ausschließlich) wie diejenigen ein, die den lac-Promotor (pUC- Reihe); den trp-Promotor (pBR322-trp); den Ipp-Promotor (die pIN-Reihe); den lambda-pP- oder den pR-Promotor (pOTS); oder hybride Promotoren wie ptac (pDR540). Siehe Brosius et al., "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp derived Promoters", in "Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, (eds. Raymond L. Rodriguez and David T. Denhardt), Buttersworth, Boston, 1988, Kapitel 10, Seiten 205-236.
Niedere Eukaryonten, wie beispielsweise Hefen und Dictyostelium, können mit GFP-Rezeptor enthaltenden Vektoren transformiert werden. Für die Zwecke dieser Erfindung ist der üblichste niedere eukaryotische Wirt die Backhefe, Saccharomyces cerevisiae, die verwendet wird, um niedere Eukaryonten generisch zu vertreten, obgleich eine Anzahl anderer Stämme und Spezies ebenfalls verfügbar sind. Hefevektoren bestehen aus einem Replikationsstartpunkt (es sei denn, sie sind vom Integrationstyp), einem Selektionsgen, einem Promotor, DNA, die den GFP-Rezeptor oder seine Fragmente kodiert, Sequenzen zur Translation-Termination, Polyadenylation- und Transkription- Termination. Geeignete Expressionsvektoren für Hefe sind unter anderem konstitutive Promotoren wie 3-Phosphoglycerat-Kinase und verschiedene andere Glykolyse-Enzym-Gen-Promotoren oder induzierbare Promotoren wie der Alkohol-Dehydrogenase 2-Promotor oder der Metallothionin-Promotor. Geeignete Vektoren schließen Derivate der folgenden Typen ein: selbst-replizierende mit niederer Kopienanzahl (beispielsweise die YRp-Sene), selbst-replizierende mit hoher Kopienanzahl (beispielsweise die YEp-Serie); integrierende Typen (beispielsweise die YIp-Serie), oder Mini-Chromosomen (beispielsweise die YCp-Sene).
Höhere eukaryotische Gewebekulturzellen sind die bevorzugten Wirtszellen für die Expression des funktional aktiven GFP-Rezeptor-Proteins. Im Prinzip ist jede Zellinie einer beliebigen eukaryotischen Gewebekultur verwendbar, sei es von einer Vertrebrat- oder einer Invertrebrat-Quelle. Säugerzellen sind jedoch bevorzugt. Die Transformation oder Transfektion und Vermehrung derartiger Zellen ist zu einem Routinevorgang geworden. Beispiele brauchbarer Zellinien sind unter anderem HeLa-Zellen, Zellinien aus Eierstöcken von Chinahamstern (CHO), Zellinien aus Nieren von Rattenbabies (BRK), Insekten- Zellinien und Affen- (COS) Zellinien. Expressionsvektoren für derartige Zellinien enthalten üblicherweise einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor, einen Ribosomen-Bindungsort, RNA-Spleißstellen (bei Verwendung von Genom-DNA), eine Polyadenylationsstelle und eine Transkription-Terminationsstelle. Diese Vektoren enthalten auch üblicherweise ein Selektionsgen oder ein Amplifikationsgen. Geeignete Expressionsvektoren können Plasmide, Viren oder Retroviren sein, die Promotoren tragen, und welche von Ausgangssubstanzen wie Adenovirus, SV40, Parvoviren, Vacciniavirus oder Zytomegalovirus abstammen. Repräsentative Beispiele geeigneter Expressionsvektoren sind unter anderem pCDNA1; pCD (Okayama et al., Mol. Cell Biol. 5:1136-1142, 1985); pMC1neo PolyA (Thomas et al, Cell 51:503- 512, 1987); und ein Baculovirus-Vektor wie pAC 373 oder pAC 610.
Der GFP-Rezeptor kann aus Membranen in aktiver Form solubilisiert werden, und ohne Aktivitätsverlust mit den nachstehend beschriebenen Verfahren gereinigt werden. Das Ausgangsmaterial des GFP-Rezeptors kann ein eukaryotischer oder prokaryotischer Wirt sein, der den rekombinierten GFP-Rezeptor exprimiert, wie es voranstehend beschrieben ist. Das Ausgangsmaterial kann auch eine Zellinie, beispielweise Swiss 3T3 Fibroblasten von Mäusen sein; andere Säuger-Zellinien sind jedoch ebenfalls für diese Erfindung brauchbar, wobei die bevorzugte Zellinie menschlicher Herkunft ist.
Der aktive GFP-Rezeptor wurde unter Verwendung eines Stabihsators und eines Detergens aus den GFP-Rezeptor enthaltenden Membranen solubilisiert. Der Stabilisator ist vorzugsweise ein löslicher Cholesterylester. Besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung von Cholesteryl-Hemisuccinat (CHS) erzielt. Das Detergens kann nichtionisch, zwitterionisch oder dergleichen sein. Besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung des zwitterionischen Detergens 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) erhalten.
Den GFP-Rezeptor enthaltende Zellmembranen werden durch Lyse eines gezüchteten GFP-Rezeptors, der eine Zellinie wie Swiss 3T3 Fibroblasten enthielt, mit anschließender Zentrifugation hergestellt. Die resultierenden Pellets werden durch Resuspension gewaschen und erneut zentrifugiert.
Wurden die Membranen erst einmal aus einer geeigneten Zellinie wie oben und in Beispiel 1 beschrieben erhalten, wird die endgültige Konzentration des Proteins eingestellt. Eine geeignete endgültige Proteinkonzentration liegt bei ca. 15 mg/ml.
Die Membranen werden dann vor der Solubilisierung des GFP-Rezeptors mit Salzlösung gewaschen. Die Membranen werden zweimal, mit Puffer(lösung) und NaCl, gewaschen, dann mit einer Solubilisierungs-Pufferlösung gewaschen und schließlich in der Solubilisierungs-Pufferlösung mit einer eingestellten Proteinkonzentration suspendiert. Eine geeignete Pufferlösungszusammensetzung für die erste beiden Waschvorgänge umfaßt ein Medium wie 50 mM4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure (HEPES), pH 7,5, einen Komplexbildner wie 2 mM Ethlendiamintetraessigsäure (EDTA) und Protease-Inhibitoren. Eine geeignete NaCl-Konzentration ist 1,0 M. Die Solubilisierungspufferlösung, sowohl zum Waschen als auch für die Suspension, kann im typischen Fall aus 50 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM EDTA, einem weiteren Komplexbildner wie 1 mM [Ethylenbis-(oxethylennitriol)]tetraessigsäure (EGTA), 100 mM NaCl und Proteaseinhibitoren zusammengesetzt sein. Die Proteinkonzentration wird auf einen Wert von zum Beispiel ca. 7 mg/ml eingestellt. Dieser Verfahrensschritt des Waschens mit Salzlösung ergibt eine zweifache Reinigung. Ähnliche Ergebnisse können durch Waschen der Membranen mit 2 M Harnstoff, hohen pH-Puffern (pH 10) oder chaotropen Salzen wie KI erzielt werden. Durch diesen Vorgang wird auch die Stabilität des GFP-Rezeptors im Extrakt erhöht. Andere Bestandteile der Pufferlösungen können zum Beispiel Saccharose einschließen, und geeignete Protease-Inhibitoren sind unter anderem ohne Einschränkung Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin, Bacitrin und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF).
Eine Mischung aus Detergens (CHAPS) und Stabilisator des löslichen Cholesterylesters (CHS) wird dann langsam der Membransuspension zugegeben, um eine eingestellte endgültige Detergenskonzentration zu erhalten. Das Gewichtsverhältnis Detergens zu löslichem Cholesterylester kann im Bereich von ca. 200:1 bis 5:2 liegen, und beträgt vorzugsweise ca. 10:1. Alternativ kann das Detergens der Membransuspension zugegeben werden, unter anschließender Zugabe des löslichen Cholesterylesters. In diesem Fall wird von 100 % Detergens ausgegangen und die Zugabe des löslichen Cholesterylesters erfolgt, bis das Gewichtsverhältnis von Detergens zu Ester im Bereich von ca. 200:1 bis 5:2 liegt, und vorzugsweise ca. 10:1 beträgt. Zur Solubilisierung des GFP-Rezeptors sollte die Konzentration von Detergens 0,4 bis 3,0 % (Gewichtsteil) betragen, und sie ist mit ca. 0,75 % (Gewichtsteil) für eine Membrankonzentration (vor den Verfahrensschritten des Waschens der Membran) von ca. 15 mg/ml optimal eingestellt. Ähnlich liegt die Konzentration des löslichen Cholesterylesters im Bereich von ca. 0,0015 % bis 1,2 % (Gewichtsteil). Ebenso beträgt bei einer Membrankonzentration von ca. 15 mg/ml die Konzentration des löslichen Cholesterylesters vorzugsweise ca. 0,075 % (Gewichtsteil).
Der Extrakt wird dann bei einer Temperatur im Bereich von ca. 0º bis 37ºC, typischerweise Raumtemperatur wie 21ºC, inkubiert und anschließend auf 0º bis 21ºC, typischerweise 4ºC, abgekühlt, und das unlösliche Material mit hohen Geschwindigkeiten, vorzugsweise dem ca. 100000fachen der Schwerkraft, in einer Standard-Zentrifuge über eine geeignete Zeitspanne, die vom vorliegenden Volumen abhängig ist, zentrifugiert, um einen Extrakt zu erhalten, der den solubilisierten Rezeptor (d.h. einen löslichen Extrakt) enthält.
Bei der hohen Detergens-Konzentration (0,4 bis 3,0 %) ist der Rezeptor nicht aktiv. Bei Verdünnung mit einer Pufferlösung wird der Rezeptor jedoch reaktiviert. Das Vorhandensein des löslichen Cholesterylesters, der als Stabilisator fungiert, ist erforderlich, damit der Rezeptor bei der niedrigen Detergenskonzentration reaktiviert wird. Damit Assays, in denen den aktiven solubilisierten GFP-Rezeptor verwendet wird, eine Bindungsaktivität aufweisen, sollte die Endkonzentration des Detergens in der Suspension auf einen Wert im Bereich von ca. 0,025 bis 0.2 % (Gewichtsteil) verdünnt werden. Das Gewichtsverhältnis von Detergens zu löslichem Cholesterylester wird noch auf einen Wert im Bereich von ca. 200:1 bis 5:2, vorzugsweise ca. 10:1, gehalten. Daher ist für den löslichen Cholesterylester ca. 0.000125 % bis 0,08 % (Gewichtsteil) ein geeigneter Bereich. Die bevorzugten Assaykonzentrationen sind 0.075 % (Gewichtsteil) Detergens und ca. 0,0075 % (Gewichtsteil) löslicher Cholesterylester.
Der solubilisierte Rezeptor in seiner aktiven Form wird dann gereinigt und von kontaminierenden Proteinen befreit. Die Reinigung des GFP-Rezeptors erfolgt in mehreren Schritten, die auch die folgenden Schritten umfassen, welche sich an den voranstehend beschriebenen Solubilisierungsvorgang anschließen:
(1) Fällen von Polyethylenglykol. Der GFP-Rezeptor wird unter Zugabe von Polyethylenglykol (PEG) aus dem löslichen Extrakt gefällt. Die Zugabe von PEG erfolgt vorzugsweise um eine Endkonzentration von 20 % (Gewichtsteil) zu erhalten. Der Niederschlag wird dann durch Zentrifugierung gewonnen und in einer Pufferlösung resuspendiert. Die Pufferlösung kann typischerweise aus 25 mM HEPES, pH 7,5, 25 mM Tris/Cl, 2 mM EDTA, 0,075 (Gewichtsteil) Detergens, 0,0075 % (Gewichtsteil) löslichem Cholesterylester und Protease-Inhibitoren zusammengesetzt sein. Das Endvolumen der Suspension beträgt vorzugsweise 25 % des ursprünglichen löslichen Extrakts. Proteine, die in der Suspension unlöslich bleiben, werden durch Zentrifugierung entfernt. Durch diesen Verfahrensschritt ergibt sich eine zweifache Reinigung und die Stabilität des Rezeptors wird verbessert.
(2) Weizenkeim-Agglutinin-Chromatografie. Der lösliche Extrakt wird auf eine Weizenkeim-Agglutinin-Affinitätssäule aufgebracht, die mit einer Pufferlösung äquilibriert ist, welche sich typischerweise aus 50 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,25 % (Gewichtsteil) Detergens, 0.025 % (Gewichtsteil) Cholesterylester und Protease-Inhibitoren zusammensetzt. Die Säule wird mit Säulenpufferlösung und 5 mM N-N'-N"-triacetyl-Chitotriose eluiert. Den GFP-Rezeptor enthaltende Fraktionen werden dann durch ¹²&sup5;I-GFP-Bindungsassays identifiziert. Durch diesen Verfahrensschritt wird eine fünffache Reinigung durch Entfernung von Proteinen, die kein Kohlenhydrat enthalten, erzielt. Um eine gute Ausbeute zu erhalten, muß die Säule mit Chitotriose oder Chitobiose eluiert werden. Die Ausbeute läßt sich auch unter Beibehaltung der Detergens-Konzentration auf einem Wert von über ca. 0,2 % Detergens und 0,02 % löslichem Cholesterylester steigern.
(3) GFP-Affinitäts-Chromatografie. Das Eluat aus der Weizenkeim-Agglutinin-Säule wird auf einer GFP-Affinitätssäule weiter fraktioniert. In der bevorzugten Ausführungsform enthält die Säule eine Perlenmatrix, an die das menschliche Peptid [1e14,27]GFP13-27 (dem C-terminalen Bereich von GFP) mit 2 mg Peptid/ml Füllkörper-Gel gebunden ist. Die Säule ist mit einer Lösung äquilibriert, die sich üblicherweise aus 25 mM Tris, 25 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,075 % (Gewichtsteil) CHAPS, 0,0075 % (Gewichtsteil) CHS und Protease-Inhibitoren zusammensetzt. Die Detergens-Konzentration in dem Eluat der Weizenkeim-Agglutininsäule ist durch verdünnung mit einer Lösung aus üblicherweise 25 mM HEPES, 25 mM Tris, pH 7,5, 2 mM EDTA und Protease-Inhibitoren vorzugsweise auf 0,075 % (Gewichtsteil) eingestellt. Nach Aufbringen der Probe und ausgiebigem Waschen der Säule wird gebundenes Protein mit einem Salz mit einer Konzentration von über 0,2 M eluiert. Besonders geeignet ist 0,5 M NaCl. Fraktionen, die den GFP-Rezeptor enthalten, werden dann durch ¹²&sup5;I-GFP-Bindungsassays identifiziert. Das verwendete GFP-Peptid (GFP13-27) ist ein Analogon, das von der Triton Biosciences Inc. (Alameda, Kalifornien, USA) hergestellt wird und gegenüber Oxidation resistent ist. Andere GFP- Peptide und Matrizen, die ebenfalls verwendbar sind, sind unter anderem uneingeschränkt GFP1-27, GFPT4-27 und [Lys3]Bombesin. Hierbei können sich jedoch die Ausbeute und die Elutionsbedingungen ändern. Die Elution des gebundenen Proteins mit Salz ist wichtig, da die Rezeptorbindungsaktivität beibehalten wird, und eine gute Ausbeute erzielt wird. Die Konzentration des Detergens in der Probe, mit der die Säule beschickt ist, ist für den Erhalt optimaler Ergebnisse wesentlich. Der geeignete Bereich an Detergens ist ca. 0,025 % bis 0,2 % (Gewichtsteil). Das Verhältnis von Detergens zu Stabilisator ist ebenfalls gleich, nämlich 200:1 bis 5:2, vorzugsweise 10:1.
(4) Zweite Affinitätssäule. Fraktionen, die den GFP-Rezeptor enthalten und aus der Affinitätssäule eluiert wurden, werden entsalzt, und die Probe wird auf eine zweite GFP-Affinitätssäule aufgebracht und wie in Verfahrensschritt (3) beschrieben eluiert. Den Rezeptor enthaltende Fraktionen werden dann durch Bindungsassays identifiziert. Die Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Affinitätssäulen in diesem Verfahrensschritt ist notig, um einen hohen Reinheitsgrad zu erhalten.
(5) Gelfiltration. Dies ist ein fakultativer Verfahrensschritt, durch den sich ein etwas reineres Produkt erhalten läßt. Der Verfahrensschritt der Gelfiltration ist ebenfalls nützlich zur Entfernung von Protease-Inhibitoren, Salz und restlichem Detergens aus dem Rezeptor.
Im allgemeinen bindet der solubilisierte, ungereinigte und solubilisierte, gereinigte GFP-Rezeptor dieser Erfindung Gastrin-freisetzendes Peptid mit einer Affinität von mindestens KD=10 nM. Der erfindungsgemäße GFP-Rezeptor aus einer Fibroblasten-Zellinie Swiss 3T3 von Mäusen hatte nachweislich folgende Eigenschaften:
verläuft als breite Bande in einer Trägerelektrophorese auf Natrium-Dodecylsulphat-Polyacrylarnidgel (SDS-PAGE- Elektrophorese) mit einem scheinbaren Molgewicht von ca. 70 bis 100 Kilodalton;
bindet sich selektiv an Polypeptide des Bombesin-Typs;
hat einen KD-Wert von ca. 10-100 pM;
enthält keine gekoppelten G-Proteine;
enthält N-gebundene Kohlenhydrate;
hat im entglykolisierten Zustand ein scheinbares Molgewicht von 36±5 Kilodalton in der Trägerelektrophorese auf Natrium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgel; und
hat eine Teil-Aminosäuresequenz in der Nähe der N-terminalen Aminosäure von:
-Leu-Asn-Leu-Asp-Val-Asp-Pro-Phe-Leu-Ser-.
Da nunmehr die Sequenz bekannt ist, lassen sich der GFP-Rezeptor oder dessen beliebige Fragmente durch herkömmliche Verfahren zur Synthese von Peptiden herstellen. Diese sind unter anderem Verfahren wie in John M. Stewart und Janis D. Young, Solid Phase Peptide Svnthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984), M. Bodanszky und A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, New York, 1984), und M. Bodanszky, The Princidles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, New York, 1984) beschrieben. Es können zum Beispiel ein Azid- Verfahren, ein Säurechlond-Verfahren, ein Säureanhydrid-Verfahren, ein Mischanhydrid-Verfahren, ein Aktivester-Verfahren (beispielsweise p-Nitrophenylester, N-Hydroxysuccinimidester oder Cyanomethylester), ein Carbodiimidazol-Verfahren, ein oxidatives-reduktives Verfahren oder ein DCC/additives Verfahren eingesetzt werden. Synthesen mit fester und flüssiger Phase sind jeweils auf die voranstehend genannten Verfahren anwendbar.
Der GFP-Rezeptor wird geeigneterweise gemäß den voranstehend erwähnten Verfahren hergestellt, wie sie typischerweise bei der Peptid-Synthese angewandt werden, allgemein entweder in einem sogenannten schrittweisen Verfahren, das die Kondensation einer Aminosäure zur terminalen Aminosäure umfaßt, nacheinander in der Sequenzreihenfolge, oder durch Koppeln von Peptidfragmenten mit der terminalen Aminosäure. Aminogruppen, die nicht in der Kopplungsreaktion verwendet werden, müssen geschützt werden, um eine Kopplung an einer falschen Stelle zu verhindern.
Wird eine Synthese mit fester Phase angewandt, wird die C-terminale Aminosäure über ihre Carboxylgruppe an einen unlöslichen Träger oder eine unlösliche Trägersubstanz gebunden. Der unlösliche Träger ist nicht besonders eingeschränkt, solange er eine Bindungsfähigkeit an eine reaktive Carboxylgruppe aufweist. Beispiele derartiger unlöslicher Träger sind Halomethylharze, beispielsweise Chloromethylharze oder Bromomethylharz, Hydroxymethylharze, Phenolharze, Tert.-Alkyloxycarbonylhydrazidierte Harze und dergleichen.
Eine aminogruppengeschützte Aminosäure wird in Sequenz durch Kondensation ihrer aktivierten Carboxylgruppe und der Reaktivaminogruppe des zuvor gebildeten Peptids oder der zuvor gebildeten Kette gebunden, um das Peptid Schritt für Schritt synthetisch herzustellen. Nach der Synthese der kompletten Sequenz wird das Peptid vom unlöslichen Träger abgespalten, um das Peptid herzustellen. Dieser Festphasen-Ansatz ist allgemein in Merrifield et al., in J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963) beschrieben.
Der hergestellte Rezeptor und dessen Fragmente können mittels Peptidtrennung, beispielsweise durch Extraktion, Fällung, Elektrophorese und verschiedener Formen von Chromatografie und dergleichen, aus dem Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt werden. Der erfindungsgemäße Rezeptor kann in Abhängigkeit von seiner gewünschten Verwendung in verschiedenen Reinheitsgraden erhalten werden. Die Reinigung kann unter Verwendung der hier beschriebenen Proteinreinigungsverfahren oder durch Verwendung der hier beschriebenen Antikörper mittels einer Immunoabsorptions-Affinitätschromatografie erfolgen. Bei dieser Immunoabsorptions-Affinitätschromatografie werden zunächst die Antikörper an eine feste Trägersubstanz gebunden, und dann werden die gebundenen Antikörper mit solubilisierten Lysaten kleinzelliger Lungenkrebszellen, Lysaten anderer Zelle, die den GFP-Rezeptor exprimieren, oder Lysaten oder übersehenden Flüssigkeiten von Zellen, die den GFP-Rezeptor als Ergebnis der nachstehend beschriebenen DNA-Techniken produzieren, in Kontakt gebracht.
Hier eingeschlossene Derivate des GFP-Rezeptor sind unter anderem Sequenzmutanten von Aminosäuren, Glykosylierungsvarianten und kovalente oder aggregierte Konjugate mit anderen chemischen Anteilen. Kovalente Derivate können durch Bindung von funktionellen Gruppen durch Mittel, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, an Gruppen hergestellt werden, die sich in den Aminosäure-Seitenketten des GFP-Rezeptors oder im N- oder C-terminalen Bereich befinden. Diese Derivate können ohne Einschränkung aliphatische Ester oder Amide des endständigen Carboxylbereiches oder Reste, die Carboxyl-Seitenketten enthalten, O-Acyl-Derivate hydroxylgruppenhaltiger Reste und N-Acyl- Derivate der aminoterminalen Aminosäure oder aminogruppenhaltige Reste sein, zum Beispiel Lysin oder Arginin. Acylgruppen sind aus der Gruppe von Alkyleinheiten ausgewählt, die C3- bis C18-n-Alkyl einschließen, wodurch Alkanoyl-Spezien gebildet werden.
Eine Hauptgruppe von Derivaten sind kovalente Konjugate des GFP-Rezeptors oder dessen Fragmente mit anderen Proteinen von Polypeptiden. Diese Derivate können in rekombinierter Kultur, wie beispielsweise in N- oder C-terminalen Fusionen, oder durch Verwendung von im Stand der Technik aufgrund ihrer Nützlichkeit bei der Quervernetzung von Proteinen durch reaktive Seitengruppen bekannten Mitteln synthetisch hergestellt werden. Bevorzugte GFP-Derivatisierungsstellen mit Quervernetzungsmitteln sind an freien Aminogruppen, Kohlenhydrateinheiten und Cysteinresten.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird auch die Verwendung von Derivaten des GFP-Rezeptors erwogen, bei denen es sich nicht um Variationen der Aminosäuresequenz oder Glykosylierung handelt. Derartige Derivate sind durch kovalente oder aggregierte Assoziation mit chemischen Einheiten gekennzeichnet. Die Derivate fallen allgemein in drei Klassen: (1) Salze, (2) kovalente Modifikationen der Seitenkette und des terminalen Rests, und (3) Adsorptionskomplexe, zum Beispiel mit Zellmembranen. Derartige kovalente oder aggregierende Derivate sind als Immunogene, als Reagens in Immunoassays oder in Reinigungsverfahren, beispielsweise zur Affinitätsreinigung von Gastrin-freisetzendem Peptid oder anderen Bindungsliganden brauchbar. Der GFP-Rezeptor kann zur Verwendung im Assay oder bei der Reinigung von Anti-GFP-Rezeptor-Antikörpern oder Gastrin-freisetzendem Peptid beispielsweise durch kovalente Bindung mit einem festen Träger, zum Beispiel Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose mittels im Stand der Technik wohlbekannter Verfahren immobilisiert werden, oder an Polyolefinoberflächen mit oder ohne Glutaraldehyd-Quervernetzung adsorbiert werden. Der GFP-Rezeptor kann zur Verwendung in Diagnoseassays auch mit einer nachweisbaren Gruppe markiert werden, zum Beispiel radioaktiv jodiert durch das Chloramin-T-Verfahren, an Chelatkomplexen der seltenen Erden kovalent gebunden oder mit einem anderen fluoreszierenden Teil konjugiert sein.
Der solubilisierte GFP-Rezeptor dieser Erfindung kann als Immunogen zur Herstellung von Antisera oder Antikörpern, die für den Rezeptor oder dessen Fragmente spezifisch sind, verwendet werden. Der gereinigte Rezeptor kann zum Screening monoklonaler Antikörper verwendet werden, die durch Immunisierung mit verschiedenen Formen unreiner, den GFP-Rezeptor enthaltenden Präparate hergestellt wurden. Der gereinigte Rezeptor kann ebenfalls als Reagens zum Nachweis von Antikörpern verwendet werden, die als Reaktion auf das Vorliegen von erhöhten Mengen an Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid oder von den GFP-enthaltenden Zellfragmenten produziert werden. Außerdem können GFP-Rezeptor-Fragmente ebenfalls als Immunogene zur Erzeugung der Antikörper der vorliegenden Erfindung dienen. Für diese Erfindung kommen zum Beispiel Antikörper in Betracht, die eine Bindungsaffinität für die in Fig. 8 dargestellte Aminosäuresequenz oder für eines ihrer Fragmente haben oder auf diese ansprechen. Insbesondere kommen für diese Erfindung Antikörper in Betracht, die eine Bindungsaffinität für spezifische Fragmente haben, welche voraussichtlich außerhalb der Lipid-Doppelschicht liegen, oder auf diese ansprechen. Diese Fragmente schließen die folgende, aus zehn Aminosäuren bestehende Sequenz (einschließlich Reste 9-18) ein, die sich in der Nähe des N-terminalen Bereiches befindet:
9 18
-Leu-Asn-Leu-Asp-Val -Asp-Pro-Phe-Leu-Ser-
Außerdem deckt diese Erfindung, wie bereits oben erwähnt, Fragmente des GFP-Rezeptors ab, die sich voraussichtlich auf der extrazellulären Seite der Membran befinden: Reste 1-39, einschließlich; Reste 98-115, einschließlich; Reste 176-209, einschließlich; und Reste 288-300, einschließlich; sowie die folgenden Abschnitte des Rezeptors, die sich voraussichtlich auf der intracellulären Seite der Membran befinden: Reste 64- 77, einschließlich; Reste 138-157, einschließlich; Reste 236- 266, einschließlich; und Reste 330-385, einschließlich.
Antikörper können für den GFP-Rezeptor und dessen Fragmente sowohl in seiner natürlich vorkommenden Form als auch in seiner rekombinierten Form gebildet werden. Außerdem können Antikörper für den GFP-Rezeptor sowohl in seiner aktiven Form als auch in seiner inaktiven Form gebildet werden, wobei der Unterschied darin liegt, daß Antikörper für den aktiven Rezeptor mit höherer Wahrscheinlichkeit Epitope erkennen, die nur im aktiven Rezeptor vorhanden sind.
Antikörper gegen vorbestimmte Fragmente des GFP-Rezeptors können durch Immunisierung von Tieren mit Konjugaten der Fragmente mit immunogenen Proteinen gebildet werden. Monoklonale Antikörper werden aus Zellen hergestellt, die den gewünschten Antikörper ausscheiden. Diese Antikörper können einem Screening auf ihre Bindung an normale oder defekte GFP-Rezeptoren hin, oder einem Screening auf eine agonistische oder antagonistische GFP-Rezeptor-Aktivität unterzogen werden.
Die Antikörper dieser Erfindung können von erheblichem therapeutischen Wert sein. Sie können wirksame Antagonisten sein, die sich an den GFP-Rezeptor binden und die Liganden-Bindung an den Rezeptor hemmen oder die Fähigkeit des Gastrin-freisetzenden Peptids, eine biologische Antwort hervorzurufen, hemmen. Sie können ebenfalls als nicht-neutralisierende Antikörper von Nutzen sein und an Toxine oder Radionuklide gekoppelt werden, so daß, wenn sich der Antikörper an den Rezeptor bindet, die Zelle selbst abgetötet wird. Ferner lassen sich diese Antikörper zu Arzneimitteln oder anderen therapeutischen Wirkstoffen, entweder direkt oder indirekt mittels eines Linkers konjugieren.
Die Antikörper gemäß dieser Erfindung lassen sich ebenfalls zu Diagnosezwecken einsetzen. Als Capture- oder nicht-neutralisierende Antikörper können sie sich an den GFP-Rezeptor binden, ohne eine Ligand-Bindung zu hemmen. Als neutralisierende Antikörper können sie sinnvoll in kompetitiven Bindungsassays verwendet werden.
Rezeptorfragmente können mit anderen Materialien, insbesondere Polypeptiden, als fusionierte oder kovalent verbundene Peptide zur Verwendung als Immunigens verbunden werden. Der GFP-Rezeptor und seine Fragmente können mit einer Vielzahl von Immunogens fusioniert oder kovalent verbunden werden, beispielsweise keyhole limpet Hemocyanin, Rinderserumalbumin, Tetanustoxoid etc. Siehe beispielsweise Microbiolocy, Hoeber Medical Division (Harper and Row, 1969), Landsteiner, Specificity of Serological Reactions (Dover Publications, New York, 1962) und Williams et al, Methods in Immunolocy and Immunochemistry, Band 1 (Acdemic Press, New York, 1967), zur Beschreibung von Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antisera. Bei einem typischen Verfahren findet eine HypemMmunisierung eines Tiers mit einem Antigen statt. Das Blut des Tiers wird dann kurz nach den wiederholten Immunisierungen entnommen und das Gammaglobulin wird isoliert.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Säuger-Wirten herzustellen, beispielsweise Mäusen, Nagern, PmMaten, Menschen etc. Eine Beschreibung der Techniken zur Herstellung derartiger monoklonaler Antikörper findet sich in Stites et al., Herausgeber, Basic and Clinical Immunobgy, (Lange Medical Publications, Los Altos, Kalifornien, USA, 4. Ausgabe) und den darin angegebenen Literaturstellen, und insbesondere in Kohler und Milstein in Nature 256:495-497 (1975), in der ein Verfahren zur Erzeugung monoklonaler Antikörper beschrieben ist. Kurz zusammengefaßt wird bei diesem Verfahren ein Tier mit einem Immunogen injiziert. Das Tier wird dann getötet, und Zellen werden aus seiner Milz entnommen, die anschließend mit Myelomzellen fusioniert werden. Das Ergebnis ist eine Hybridzelle oder ein "Hybridom", das zur in vitro Reproduktion in der Lage ist. Die Hybridompopulation wird dann einem Screening unterzogen, um individuelle Klone zu isolieren, von denen jeder eine einzige Antikörper- Spezies gegen das Immunogen abscheidet. Auf diese Weise sind die individuellen erhaltenen Antikörper-Spezien die Produkte einzelner B-Zellen aus dem immunen Tier, die als Reaktion auf einen spezifischen Ort, der auf der immunogenen Substanz erkannt wurde, erzeugt wurden.
Die Antikörper gemäß dieser Erfindung können auch für eine Affinit"ts-Chromatografie zur Isolation des Rezeptors verwendet werden. Säulen können hergestellt werden, in denen die Antikörper mit einem festen Träger, z.B. mit Part-ikeln wie Agarose, Sephadex oder dergleichen, verbunden werden, wobei ein Zell-Lysat durch die Säule geschickt werden kann, die Säule gewaschen wird, gefolgt von erhöhten Konzentrationen eines milden Stoffes, der eine Denaturierung auslöst, wodurch das gereinigte Rezeptorprotein freigesetzt wird.
Sowohl die natürlich vorkommende als auch die rekombinierte Form des GFP-Rezeptors gemäß dieser Erfindung sind besonders nützlich in Kits und in Assayverfahren, die zum Screening von Verbindung auf eine Bindungsaktivität an den GFP-Rezeptor in der Lage sind. Mehrere Verfahren zur Automatisierung von Assays wurden in den letzten Jahren entwickelt, um ein Screening von zehntausenden Verbindungen pro Jahr zu ermöglichen. Die Entwicklung geeigneter Assays läßt sich durch die Verfügbarkeit großer Mengen des gereinigten, löslichen Rezeptors in aktivem Zustand, wie er durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden kann, stark vereinfachen.
Ein Kit zur Bestimmung der Bindungsaffinität einer Testverfindung an den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid würde im typischen Fall folgendes umfassen: eine Testverbindung; eine markierte Verbindung, zum Beispiel einen Ligand oder Antikörper mit bekannter Bindungsaffinität für den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid; eine Quelle für den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid (natürlich vorkommend oder rekombiniert); und ein Mittel zum Trennen gebundener von freier markierter Verbindung, wie beispielsweise eine feste Phase zur Immobilisierung des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid.
Wurden die Verbindungen erst einmal einem Screening unterzogen, können diejenigen mit einer geeigneten Bindungsaffinität an den GFP-Rezeptor mit geeigneten biologischen Assays, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, ausgewertet werden, um festzustellen, ob sie als Agonisten oder als Antagonisten wirken.
Diese Erfindung ist besonders nützlich zum Screening von Verbindungen unter Verwendung des rekombinierten GFP-Rezeptors in einer Technik einer Vielzahl von Arzneimittel-Screeningtechniken. Die Vorteile einer Verwendung des rekombinierten GFP-Rezeptors zum Screening auf GFP-Rezeptor-reaktive Arzneimittel sind unter anderem folgende: (a) eine verbesserte wiederverwendbare Quelle des Rezeptors aus einer spezifischen Quelle; (b) eine potentiell höhere Anzahl von Rezeptoren pro Zelle, was sich in einem höheren Signal-/Rausch-Verhältnis in Assays niederschlägt; und (c) eine Rezeptor-Subtypen-Spezifität (was theoretisch eine höhere biologische und krankheitsbezogene Spezifität ergibt).
Ein Verfahren zum Screening von Wirkstoffen verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die stabil mit rekombinierten DNA-Molekülen transformiert werden, welche den GFP- Rezeptor exprimieren. Derartige Zellen, sei es in beweglicher oder in fixierter Form, können für Standard-Rezeptor/Ligand- Bindungsassays verwendet werden. Kompetitive Assays sind besonders nützlich, wenn die Zellen (Quellen des GFP-Rezeptors) mit einem markierten Ligand, der eine bekannte Bindungsaffinität an den GFP-Rezeptor, beispielsweise ¹²&sup5;-I-GFP, hat und einer Testverbindung, deren Bindungsaffinität an den GFP-Rezeptor gemessen wird, in Kontakt gebracht und inkubiert werden. Der gebundene Ligand und der freie Ligand werden dann getrennt, um den Grad der Ligandenbindung zu ermitteln. Der Grad der Bindung der Testverbindung ist umgekehrt proportional zum Grad der gemessenen Bindung des markierten Liganden. Jede beliebige einer Vielzahl von Techniken kann zur Trennung von gebundenem von freiem Ligand verwendet werden, um den Grad der Liganden- Bindung zu beurteilen. Bei diesem Verfahrensschritt der Trennung könnte typischerweise eine Adhäsion an einen Filter unter anschließendem Waschen, eine Adhäsion an Kunststoff unter anschließendem Waschen, oder eine Zentrifugierung der Zellmembranen erfolgen. Lebende Zellen könnten auch in einem Screening auf die Auswirkungen von Wirkstoffen auf Funktionen, die vom GFP-Rezeptor herbeigeführt werden, verwendet werden, zum Beispiel sekundärer Messenger (Ca) -Konzentrationen, Proliferation etc.
Bei einem weiteren Verfahren werden Membranen aus transformierten eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszellen als Quelle des GFP-Rezeptors verwendet. Diese Zellen werden mit DNA-Vektoren, die die Expression des GFP-Rezeptors steuern, stabil transformiert. Im wesentlichen würden die Membranen aus den Zellen hergestellt und in jedem beliebigen Rezeptor/Li gand-Bindungsassay, zum Beispiel dem voranstehend beschriebenen kompetitiven Assay, verwendet.
Ein weiterer Ansatz besteht in der Verwendung solubilisierter, ungereinigter oder solubilisierter, gereinigter Rezeptoren aus transformierten eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszellen. Dies ermöglicht einen wirklichen "molekularen" Bindungsassay mit den Vorteilen einer erhöhten Spezifität, einer Automatisierungsfähigkeit und einer erhöhten Durchführungszahl an Wirkstofftests.
Eine weitere Technik zum Screening von Arzneimitteln besteht in einem Ansatz, der ein Screening mit hoher Durchsatzmenge auf Verbindungen hin, die eine geeignete Bindungsaffinität an den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid haben, zur Verfügung stellt und im einzelnen in Geysen, WO-A-84/03564 beschrieben ist. Als erstes werden große Mengen verschiedener Testverbindungen kleinerer Peptide auf einem festen Substrat wie Kunststoffstifte oder einer anderen Oberfläche synthetisch hergestellt. Dann werden alle Stifte mit solubilisiertem, ungereinigten bzw. solubilisiertem, gereinigten GFP-Rezeptor umgesetzt und gewaschen. Im nächsten Schritt erfolgt der Nachweis von gebundenem GFP-Rezeptor.
Gereinigter GFP-Rezeptor kann zur Verwendung in den voranstehend beschriebenen Wirkstoff-Screeningtechniken direkt aufplattiert werden. Nicht-neutralisierende Antikörper gegen den GFP-Rezeptor können jedoch als Einfang-Antikörper zur Immobilisierung des GFP-Rezeptors auf der festen Phase verwendet werden.
Für diese Erfindung wird auch die Verwendung kompetitiver Wirkstoff-Screeningassays erwogen, in denen neutralisierende Antikörper gegen den Rezeptor oder Rezeptorfragmente mit einer Testverbindung zur Bindung an den Rezeptor konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper zum Nachweis des Vorhandensein irgendeines Polypeptids herangezogen werden, der einen oder mehrere Bindungsorten des GFP-Rezeptors teilt und ebenfalls zur Belegung von Bindungsorten auf dem Rezeptor, die anderenfalls von Gastrin-freisetzendem Peptid eingenommen werden, verwendet werden kann.
Außerdem können neutralisierende Antikörper gegen den Rezeptor und lösliche Fragmente des Rezeptors, die den Ligandbindungsort hoher Affinität enthalten, zur Hemmung der Funktion des Rezeptors für Gastrin-freisetzendes Peptid in karzinomatösen Geweben eingesetzt werden.
Für die Zwecke dieser Erfindung wird auch die Verwendung des GFP-Rezeptors, Fragmente des Rezeptors, von Peptiden und ihren Fusionsprodukten in einer Vielzahl von Diagnosekits und Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid erwogen.
Ein Kit zur Bestimmung der Konzentration des Rezeptors für Gastrin-freisetzendes Peptid in einer Probe würde im typischen Fall folgendes umfassen: eine markierte Verbindung (Ligand oder Antikörper) mit einer bekannten Bindungsaffinität an den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid, eine Quelle des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid (natürlich vorkommend oder rekombiniert) und ein Mittel zum Trennen von gebundener von freier markierter Verbindung, beispielsweise eine feste Phase zur Immobilisierung des Rezeptors für das Gastrinfreisetzende Peptid.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Rezeptors für Gastrin-freisetzendes Peptid in einer Probe würde im typischen Fall folgende Verfahrensschritte umfassen: (1) Herstellen von Membranen aus einer Probe aus einer Quelle eines Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid; (2) Waschen dieser Membranen und Suspendieren dieser Membranen in einer Pufferlösung; (3) Solubilisieren des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid durch Inkubieren der Membranen in einem Kulturrnedium, dem ein Detergens und ein löslicher Cholesterylester zugegeben wurde; (4) Einstellen der Detergens-Konzentration des solubilisierten Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid; (5) in Kontakt bringen und Inkubieren der Verdünnung mit radioaktiv markiertem GFP zur Bildung von Komplexen von GFP:GFP-Rezeptor; (6) Gewinnen der Komplexe, beispielsweise durch Filtration durch mit Polyethylenimin behandelten Filtern; und (7) Messen der Radioaktivität der gewonnenen Komplexe.
Für den Rezeptor oder Rezeptorfragmente spezifische Antikörper sind in der Diagnose zum Nachweis des Vorhandenseins erhöhter Mengen des Rezeptors und/oder seiner Fragmente brauchbar. Bei derartigen Diagnoseassays können Lysate, fixierte Zellen, Immunofluoreszenz verwendet werden, und ferner der. Nachweis von Antigenen bezüglich des GFP-Rezeptors im Serum oder dergleichen erbracht werden. Diagnoseassays können homogen (ohne einen Verfahrensschritt der Trennung zwischen freiem Reagens und Rezeptor-Ligand-Komplex) oder heterogen sein (mit einem Trennschritt). Verschiedene Assays sind im Handel erhältlich, beispielsweise Radioimmunassay (RIA), enzymverbundener Immunoadsorptionsassay (ELISA), Enzym-Immunassay (EIA), Mehrenzym-Immunassay (EMIT), substratmarkierter fluoreszierender Immunassay (SLFIA) und dergleichen. Unmarkierte Antikörper können zum Beispiel durch Verwendung eines zweiten Antikörpers, der markiert ist und der den Antikörper gegen den GFP-Rezeptor oder ein bestimmtes Fragment des Rezeptors erkennt, verwendet werden. Diese Assays sind ebenfalls ausgiebig in der Fachliteratur erläutert.
Häufig werden die Reagentien für Diagnoseassays in Kits geliefert, um die Sensibilität des Assays zu optimieren. Für die vorliegende Erfindung wird in Abhängigkeit vom Charakter des Assays, des Protokolls und der Markierung, entweder markierter oder unmarkierter Antikörper, oder markierter Rezeptor bereitgestellt, üblicherweise in Verbindung mit anderen Zusätzen, beispielsweise Puffern, Stabilisatoren, für die Signalerzeugung erforderliche Materialien wie Substrate für Enzyme und dergleichen. Vorzugsweise stehen die Reagentien in Form eines trockenen Pulvers zur Verfügung, wobei die Reagentien in einem wäßrigen Medium mit geeigneten Konzentrationen zur Durchführung des Assays aufgelöst werden können.
Jeder der voranstehend erwähnten Bestandteile der Arzneimittel-Screening- und Diagnosearrays kann unmodifiziert verwendet werden oder auf vielerlei Art und Weise modifiziert werden. Beispielsweise indem diese dahingehend markiert werden, daß sie eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung mit einer Teileinheit eingehen, der direkt oder indirekt ein erfaßbares Signal ergibt. In jedem dieser Assays können der Ligand, die Testverbindung, der GFP-Rezeptor, oder Antikörper gegen diesen entweder direkt oder indirekt markiert werden. Möglichkeiten zur direkten Markierung sind unter anderem Markierungsgruppen, die folgende einschließen: radioaktive Marker wie 1251, Enzyme (U.S.-Pat. Nr. 3,645,090) wie Peroxidase und Alkaliphosphatase, sowie fluoreszierende Marker (U.S.-Pat. Nr. 3,940,475), die in der Lage sind, die Veränderung der Fluoreszenzintensität, eine Wellenlängenverschiebung oder eine Fluoreszenzpolarisation zu überwachen. Möglichkeiten zur indirekten Markierung sind Biotinylierung eines Bestandteils unter anschließender Bindung an Avidin, das an einer der voranstehend genannten Markierungsgruppen gekoppelt ist.
Es gibt auch zahlreiche Verfahren zum Trennen des gebundenen vom freien Liganden, oder alternativ der gebundenen von der freien Testverbindung. Der Rezeptor kann auf verschiedenen Matrizen immobilisiert und anschließend gewaschen werden. Geeignete Matrizen sind unter anderem Kunststoffe, wie beispielsweise eine ELISA-Platte, Filter und Perlen. Verfahren zur Immobilisierung des Rezeptors auf einer Matrix sind u.a. eine direkte Adhäsion an Kunststoff, die Verwendung eines Einfang-Antikörpers, eine chemische Kopplung, und Biotin-Avidin. Im letzten Schritt dieses Ansatzes erfolgt die Fällung des Rezeptor/Ligand-Komplexes durch eines der verschiedenen Verfahren, einschließlich derjenigen, bei denen ein organisches Lösungsmittel wie Polyethylenglykol oder ein Salz wie Ammoniumsulfat verwendet wird. Andere geeignete Trenntechniken sind, ohne Einschränkung, das Fluorescein-Antikörper-Verfahren mit magnetisierbaren Teilchen, wie in S.J. Rattle et al., Clin. Chem. 30 (9): 1457-1461 (1984) beschrieben, und die Doppel-Antikörper-Magnetpartikel-Trennung, wie im U.S.-Patent-Nr. 41659,678 beschrieben.
Die Verfahren zum Verknüpfen der Proteinrezeptoren oder ihrer Fragmente mit den verschiedenen Markern sind in der Fachliteratur ausgiebig beschrieben und bedürfen daher keiner weiteren detaillierten Ausführung hierin. Bei vielen dieser Techniken ist die Verwendung aktivierter Carboxylgruppen entweder durch Verwendung von Carbodiimid oder aktiven Estern zur Bildung von Peptidbindungen, die Bildung von Thioethern durch Reaktion einer Mercaptogruppe mit einem aktivierten Halogen wie Chloracetyl, oder einem aktivierten Olefin wie Maleinsäureimid, zur Verbindung oder dergleichen vorgesehen.
Ein weiterer diagnostischer Aspekt dieser Erfindung sieht die Verwendung von Oligonukleotid- und Polynukleotidsequenzen vor, die der GFP-Rezeptorsequenz entnommen sind, die als Sonden zum Nachweis von Konzentrationen des Rezeptors für das Gastrinfreisetzende Peptid in Patienten mit Verdacht auf Krebs eingesetzt werden können. Der Herstellung sowohl von RNA- als auch DNA-Nukleotidsequenzen, die Markierung der Sequenzen und die bevorzugten Längen der Sequenzen wurden umfangreiche Beschreibungen und Erläuterungen in der Fachliteratur gewidmet. Normalerweise sollte eine Oligonukleotidprobe mindestens ca. 14 Nukleotiden enthalten, üblicherweise mindestens ca. 18 Nukleotiden, und die Polynukleotidsonden können bis zu mehreren Kilobasen haben. Verschiedene Marker können verwendet werden, im üblichsten Fall Radionukliden, insbesondere 32P. Andere Techniken können jedoch ebenfalls angewandt werden, beispielsweise die Verwendung Biotin-modifizierter Nukleotide zur Einführung in einen Polynukleotid. Das Biotin dient dabei als der Ort, an dem Avidin oder Antikörper gebunden werden, die mit einer großen Vielzahl von Markern markiert werden können, beispielsweise Radionukliden, fluoreszierenden Stoffen, mit Enzymen oder dergleichen. Alternativ können Antikörper verwendet werden, die spezifische Doppelstränge erkennen können, einschließlich DNA-Doppelstränge, RNA-Doppelstränge, DNA-RNA-Hybrid-Doppelstränge oder DNA-Protein-Doppelstränge. Die Antikörper können wiederum markiert, und der Assay durchgeführt werden, wenn der Doppelstrang an eine Oberfläche gebunden ist, so daß bei Bildung eines Doppelstrangs auf der Öberfläche das Vorhandensein von an den Doppelstrang gebundenem Antikörper nachgewiesen werden kann. Die Verwendung von Sonden für die neuartige antisinn RNA kann mittels beliebiger herkömmlicher Techniken erfolgen, zum Beispiel Nucleinsäure-Hybridisierung, plus und minus Screening, rekombinierter Sonden, hybrid-freisetzende Translation (ERT) und hybrid-arretierte Translation (HART). Dies umfaßt auch Amplifikationstechniken wie die Polymerase- Kettenreaktion (PCR).
Diese Erfindung ist von erheblichem therapeutischen Wert. Es ist zu erwarten, daß sich der GFP-Rezeptor (natürlich vorkommend oder rekombiniert), Rezeptor-Fragmente und Antikörper gegen diesen, zusammen mit Verbindungen, bei denen eine Bindungsaffinität an den GFP-Rezeptor identifiziert wurde, bei der Behandlung von karzinomatösem Gewebe wie Prostata- und Pankreastumoren und bei der Behandlung von kleinzelligem Lungenkrebs als nützlich erweisen. Es wird außerdem des weiteren angenommen, daß diese Erfindung von therapeutischem Wert für jede Krankheit oder Störung ist, die mit einer abnormalen Expression oder abnormalen Triggerung des GFP-Rezeptors in Zusammenhang steht. Es wird zum Beispiel angenommen, daß der GFP-Rezeptor bei neurologischen Funktionen eine Rolle spielt und sich auf Gastromtestinal-, Pulmonal- und Zerebralgewebe auswirken kann.
Rekombinierter GFP-Rezeptor oder GFP-Rezeptor-Antikörper können gereinigt und anschließend zur therapeutischen Verwendung mit herkömmlichen pharmazeutischen akzeptablen Trägern oder Verdünnungsmitteln, allein mit physiologisch harmlosen Stabilisatoren und Bindemitteln kombiniert werden. Diese Kombinationen können dann einer sterilen Filtration unterzogen und in Dosierungsformen gefüllt werden, zum Beispiel durch Lyophilisation in Dosierungs-Phiolen oder Lagerung in stabilisierten wäßrigen Präparaten. Für diese Erfindung wird auch die Verwendung von Antikörpern erwogen, die keine komplementäre Bindung bewirken.
Ein Screening von Wirkstoffen unter Verwendung des GFP-Rezeptors oder Rezeptor-Fragmenten kann zur Identifizierung von Verbindungen mit einer Bindungsaffinität an den GFP-Rezeptor durchgeführt werden. Anschließende biologische Assays können dann eingesetzt werden um zu bestimmen, ob die Verbindung eine intrinsische stimulierende Aktivität hat und daher ein Blocker oder Antagonist ist, da sie die Aktivität des Gastrin-freisetzenden Peptids blockiert. Ebenso kann eine Verbindung mit intrinsischer stimulierender Aktivität den Rezeptor aktivieren und daher ein Agonist sein, da sie die Aktivität des Gastrinfreisetzenden Peptids stimuliert. Für diese Erfindung wird des weiteren die therapeutische Verwendung von Antikörpern gegen den GFP-Rezeptor als Antagonisten erwogen.
Der GFP-Rezeptor (rekombinant), Rezeptor-Fragmente, und Antikörper gegen den Rezeptor oder seine Fragmente, Antagonisten und Agonisten können dem zu behandelnden Wirt direkt verabreicht werden, oder, in Abhängigkeit von der Größe der Verbindungen, kann es wünschenswert sein, sie vor ihrer Verabreichung zu Trägerproteinen wie Ovalbumin oder Serumalbumin zu konjugieren. Therapeutische Formulierungen können in jeder herkömmlichen Dosierungsformulation verabreicht werden. Obgleich der aktive Inhaltsstoff auch allein verabreicht werden kann, ist es vorzuziehen, ihn als pharmazeutische Formulierung bereitzustellen. Formulierungen umfassen mindestens einen aktiven Inhaltsstoff wie voranstehend definiert zusammen mit einem oder mehreren akzeptablen Trägern für diesen. Jeder Träger muß sowohl pharmazeutisch als auch aus physiologisch akzeptabel sein, d.h. er muß mit den anderen Inhaltsstoffen kompatibel und für den Patienten unschädlich sein. Unter derartige Formulierungen fallen diejenigen, die zur oralen, rektalen, nasalen oder parenteralen (einschließlich der subkutanen, intramuskularen, intravenösen und intradermalen) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen lassen sich bequem in Einheitsdosierungsform bereitstellen und können in verschiedenen, im pharmazeutischen Stand der Technik wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Die Therapie gemäß vorliegender Erfindung läßt sich mit anderen chemotherapeutischen oder chemopräventiven Wirkstoffen kombinieren oder in Verbindung mit diesen verwenden.
Der breite Umfang der Erfindung ergibt sich am besten anhand folgender Beispiele, die die Erfindungen in keinster Weise einschränken sollen.

BEISPIEL 1

Herstellung von Membranen aus Maus-3T3-Fibroblasten

Swiss 3T3-Fibroblasten von Mäusen wurden bis zur Konfluenz in modifiziertem Eagles-Medium von Dublecco, dem 10 Vol.-% Kalbsfoetenserum, in T-850 rotierbaren Glaskolben (jeweils 100 Stück), zusätzlich zugesetzt war, bei 37ºC in einer Umgebung von 10 % CO&sub2;/90 % Luft gezüchtet. Nach der Ernte wurde das Medium abgegossen, und jeder Glaskolben zweimal mit 50 ml Calcium/Magnesium-freier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS-CMF) gespült. Die Zellen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 25-30 ml 0,04 % (Gewichtsteil) EDTA in PBS-CMF (auf 37ºC erwärmt) inkubiert. Die Zellen wurden dann durch festes Abklopfen entfernt und in konische 250 ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis einpipettiert. Zellen aus sechs rotierbaren Glaskolben wurden in jedem Zentrifugenröhrchen kombiniert. Die rotierbaren Glaskolben wurden ein letztes Mal mit 25 ml PBSCMF gespült. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 4ºC in einer Zentrifuge des Typs Sorvall RC-38 mit einer Drehzahl von 1800 Umdrehungen pro Minute zu Pellets geformt. Jedes Pellet wurde bei 4ºC in 50 ml frischer PBS-CMF resuspendiert. Zellen aus 2- 3 Zentrifugenröhrchen wurden kombiniert, zu Pellets geformt und mit zusätzlichen 120 ml PBSCMF gespült. Die endgültigen Zell-Pellets wurden in 200 ml Lysepuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM MgCl&sub2;, 1 mM EGTA, 50 µg/ml Leupeptin, 2,5 µg/ml Pepstatin, 10 µg/ml Aprotinin und 0,5 mM Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (PMSF)) resuspendiert. Die Zellen wurden durch N&sub2;-Kavitation lysiert. Kurz gesagt, 100 ml der Zellsuspension wurden in einem abgedichteten Behälter aus rostfreiem Edelstahl auf Eis gelegt, welcher auf einen Wert von 900 psi von N&sub2; unter Druck gesetzt wurde. Die Suspension wurde durch eine kleine Öffnung langsam in ein Sammelröhrchen abgelassen, was eine schnelle Dekompression und Lyse der Zellen zur Folge hatte. Die Lyse der Zellen erschien bei mikrokopischer Betrachtung als abgeschlossen. Die Membranen wurden mit 390000-facher Gravitation 30 Minuten lang bei 4ºC pelletiert, in Lysepuffer resuspendiert und wiederum pelletiert. Das Pellet wurde in einer Konzentration von 15 mg Membranprotein/ml in einem Puffer zur Aufbewahrung (50 mM HEPES, pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,25 M Saccharose, 50 µg/ml Leupeptin, 2,5 µg/ml Pepstatin, 10 µg/ml Aprotinin und 0,5 mM PMSF) suspendiert. Die Membranen wurden in ahquote Volumen von 1 und 5 ml aufgeteilt, in flüssigem N&sub2; schockgefroren und bei -80ºC gelagert.

BEISPIEL 2

Vergleich der Detergentien zur Solubilisierung des GFP-Rezeptors

Mehrere Detergentien, die zur Rezeptor-Extraktion in anderen Systemen verwendet wurden, wurden zur Messung ihrer Fähigkeit zur Solubilisierung von GFP-Rezeptor aus Swiss 3T3-Fibroblasten-Membranen getestet. Digitonin, Triton X-100, CHAPS und CHAPS mit CHS wurden verwendet, um Membranen bei einer Detergenskonzentration von 0,50 % zu extrahieren, und alle bewirkten eine zuverlässige Solubilisierung des Rezeptors, ** der durch Quervernetzung an ¹²&sup5;I-GFP radioaktiv markiert worden war. Die Bindung von ¹²&sup5;I-GFP (0,02 nM), die als Anzahl der Bindungen pro Minute gemessen wurde, wurde in Anwesenheit des zur Extraktion verwendeten Detergens (0,1 %) und mehrerer Konzentrationen der unmarkierten 14-27 C-terminalen Aminosäuren von GFP (GFP14-27) untersucht, wie in Fig. 1 gezeigt. Nur bei einer Extraktion mit CHAPS zusammen mit CHS ergab sich eine nachweisbare Bindungsaktivität. Da alle Detergentien den GFP- Rezeptor wirkungsvoll solubilisierten, war die Tatsache, daß bei Extrakten, die mit Digitonin, Triton X-100 und CBAPS hergestellt wurden, keine Bindungsaktivität zu beobachten war, auf die Inaktivierung des Rezeptors während des Solubilisierungsvorgangs zurückzuführen. Es wurde jedoch festgestellt, daß eine teilweise Reaktivierung des mit CHAPS (ohne CHS) extrahierten Rezeptors durch anschließende zugabe von CHS erzielt werden konnte. Hieraus ergab sich, daß CHS als Stabilisator bei der Promotion des aktiven GFP-Rezeptors dient.

Vergleich der Detergenskonzentration für die Solubilisierung des GFP-Rezeptors

Die in Beispiel 1 hergestellten Swiss 3T3 Fibroblasten-Membranen wurden mit verschiedenen Konzentrationen des Detergens CHAPS inkubiert. Nach Abtrennung des unlöslichen Materials durch Zentrifugieren wurde die Bindungsaktivität von löslichem GFP in der überstehenden Flüssigkeit gemessen. Bei Verwendung von 0,75 Vol.-% CHAPS zur Solubilisierung des GFP-Rezeptors wurde eine in Fig. 2 gezeigte maximale Rezeptorbindung beobachtet. Um eine maximale Solubilisierung von Protein zu erhalten, war jedoch eine CHAPS-Konzentration von 1,0 Vol,-% oder mehr erforderlich. Die GFP-Rezeptor-Bindung nahm bei höheren Detergenskonzentrationen stetig ab. Um eine spezifische GFP- Bindung an durch CHAPS solubilisierte Rezeptoren beobachten zu können, mußte der Stabilisator CHS enthalten sein. Das Verhältnis CHAPS:CHS wurde sowohl unter Extraktions- als auch unter Assay-Bedingungen auf einem Wert von 10:1 gehalten.

Vergleich der Stabilisatorkonzentration zur Solubilisierung des GFP-Rezeotors

Die in Beispiel 1 hergestellten Swiss 3T3-Fibroblasten-Membranen wurden mit 0,75 Vol.-% CHAPS in Anwesenheit verschiedener Mengen Cholesterylhemisuccinat (CHS) solubilisiert. Nach dem Entfernen des unlöslichen Materials durch Zentrifugieren wurde die Bindungsaktivität an den GFP-Rezeptor bei einer CBAPS-Konzentration von 0,075 Vol.-% und bei einer 10fach geringeren CHS-Konzentration als die, die im Verfahrensschritt der Solubilisierung verwendet wurde, in der überstehenden Flüssigkeit gemessen. Wie in Fig. 3 gezeigt, betrug das optimale Verhältnis von CHAPS zu CHS ca. 10:1.

Vergleich der Detergenskonzentration für die Bindungsaktivität des solubilisierten GFP-Rezeptors

Die Abhängigkeit der Bindungsaktivität von der Konzentration des Detergens wurde untersucht. Wie in Fig. 4 gezeigt, hat die GFP-Bindung an den Rezeptor einen engeren optimalen Bereich zwischen 0,075 % und 0,1 -00 CHAPS, und die spezifische Bindung nimmt bei CHAPS-Konzentrationen von mehr als 0,4 % drastisch ab. Detergens-Anteile mit einer Konzentration von 0,4 % bewirken ebenfalls eine starke Zunahme des unspezifischen Hintergrunds im Assay, was möglicherweise auf die Bildung von-Detergens-Aggregaten zurückzuführen ist. Während sich der GFP-Rezeptor bei Detergens-Anteilen, die hochgradig inhibierend sind (0,75 %), maximal aus Membranen extrahieren läßt, schien die Inaktivierung von Rezeptormolekülen durch CHAPS reversibel zu sein. Eine vollständige Bindungsaktivität des in 0,75 % CHAPS und 0,15 % CHS inkubierten Rezeptors stellte sich nach Verringerung der Detergenskonzentration durch Dialyse ein.

Optimaler pH-Wert zur GFP-Bindung

Die ¹²&sup5;I-GFP-Bindung wurde in 500 ml 20 mM MES, 20 tmM CHES, 20 mM HEPES, 2 mM EDTA, 10 mg/ml BSA, 30 µg/ml Bacitracin, 0.02 nM ¹²&sup5;I-GFP und 5 µg CHAPS extrahierten Membranproteins mit mehreren pH-Werten im Bereich von pH 5-10 bestimmt. Nach einer Inkubation bei 15ºC für 30 Minuten wurden Proben auf Eis gekühlt. Anschließend erfolgt eine Zugabe von 5,0 mL 50 mM HEPES, pH 7,5, um den pH-Wert vor der Trennung von gebundenem und freiem Ligand zu normalisieren. Eine optimale Rezeptor- Bindung wurde bei einem pH-Wert von 7,5 festgestellt. Der Rezeptor konnte jedoch eine Inkubation bei einem pH-Wert von 10 für mindestens 24 Stunden bei 4ºC ohne Aktivitätsverlust aushalten. Im Gegensatz dazu bewirkte eine Inkubation des Rezeptors mit einem Puffer mit pH-Wert 5 bei 4ºC einen schnellen Verlust der Bindungsaktivität.

BEISPIEL 3

Solubilisierung des GFP-Rezeptors für Assays

Die in Beispiel 1 hergestellten Swiss 3T3 Fibroblasten-Membranen wurden mit einem Gehalt von 15 mg Protein/ml in 50 mM HEPES, pH 7,5, 1,0 mM EGTA, 100 mM NaCl, 0,25 M Saccharose, 50 µg/ml Leupeptin, 5 µg/ml Pepstatin, 10 µg/ml Aprotinin, 30 µg/ml Bacitracin und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid suspendiert. Ein Gemisch aus 3-{(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) und Cholesteryl-Hemisuccinat (CHS) in einem Verhältnis von 10:1 wurde langsam zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,75 % CHAPS zu erhalten. Der Extrakt wurde bei 21ºC 30 Minuten lang inkubiert, auf 4ºC gekühlt und das unlösliche Material wurde durch Zentrifugierung bei 100,000-facher Gravitation 60 Minuten lang entfernt. Die klare überstehende Flüssigkeit wurde in flüssigem N&sub2; gefroren und bei -80ºC ohne Aktivitätsverlust gelagert.

BEISPIEL 4

Ligand-Bindungsassays

Spezifisches ¹²&sup5;I-GFP (3- (¹²&sup5;Iodotyrosyl15) Gastrin-freisetzen des Peptid, 1900-2000 Ci/mmol), das an intakte oder in Detergens solubilisierte Membranen bindet (20-50 µg, wie in Beispiel 3 hergestellt) wurde in 50 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM EDTA, 10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 30 µg/ml Bacitracin und 0,02 mM ¹²&sup5;I-GFP untersucht. Für Assays von in Detergens solubilisierten Membranextrakten wurde die endgültige CHAPS-Detergens-Konzentration auf einen Wert zwischen 0,050 % und 0,20 % eingestellt. Die Konzentration von CHS wurde auf einen Wert von 1/5 bis 1/10 der Konzentration von CHAPS gehalten. Proben wurden ebenfalls ohne BSA hergestellt. Nach einer Inkubation bei 15ºC für 30 Minuten wurden die Proben auf 0ºC abgekühlt. Gebundener Ligand (¹²&sup5;I-GFP:GFP-Rezeptor-Komplex) wurde durch schnelle Filtration durch mit Polyethylenimin behandelte Filter vom Typ Whatman GF/B und anschließendem viermaligen Waschen mit 4 ml eiskaltem Tris-Puffer (50 mM Tris/Cl, pH 7,5) gewonnen. Die Filter wurden in einem Gammazähler des Typs Isodata 500 gezählt. Unspezifische Hintergrunde wurden durch Einbringung von 100 mM unmarkiertem GFP, das um spezifische Bindungsorte konkurriert, im Assay bestimmt und stellten im typischen Fall 1,5-2% der spezifischen Radioaktivitätsbindung dar. Die unspezifische Bindung ließ sich auf einen geringen Bindungsgrad des ¹²&sup5;I-GFP an die Filter zurückführen. Es wurde festgestellt, daß die Bindungsaktivität des solubilisierten Rezeptors in hohem Umfang von der Konzentration des Detergens abhangig ist. Wie in Fig. 4 gezeigt, liegt die GFP-Bindung an den Rezeptor in einem engen optimalen Bereich zwischen 0,075 % CHAPS/0,015% CHS und 0,10% CHAPS/0,02% CHS, und die spezifische Bindung sinkt drastisch bei CHAPS/CHS-Konzentrationen von mehr als 0,4%/0,08%. Detergens-Anteile von mehr als 0,4% CHAPS mit 0,08% vorhandenem CHS führen ebenfalls zu einer starken Zunahme des unspezifischen Hintergrunds, möglicherweise aufgrund der Bildung von Detergens-Aggregaten. Da der Rezeptor bei Detergens-Anteilen, die hochgradig inhibierend wirken (0,75% CHAPS) maximal extrahiert wird, schien eine Inaktivierung des Rezeptors durch CHAPS reversibel zu sein. In der Tat ließ sich eine vollständige Bindungsaktivität von in 0,75% CHAPS zusammen mit 0,15% CHS inkubiertem Rezeptor erhalten, indem die Detergenskonzentration durch Dialyse verringert wurde.

BEISPIEL 5

Rezeptor-Kinetik

Assays wurden für verschiedene Inkubationszeiten durchgeführt, und BSA (10 mg/ml) war entweder im Assay enthalten oder wurde weggelassen. Die ¹²&sup5;I-GFP-Bindung an den löslichen Rezeptor bei 15ºC pegelte sich nach 20 Minuten ein und blieb bis zu 2 Stunden lang konstant. Ein Weglassen des BSAS, das zur Verhinderung einer Proteolyse des Ligands hinzugegeben worden war, hatte keine bedeutende Auswirkung auf die Bindungskinetik.

BEISPIEL 6

G-Protein-Komplex

Es wurde festgestellt, daß der GFP-Rezeptor in Swiss 3T3-Fibroblasten-Membranen an das G-Protein gekoppelt ist. Deshalb wurde die Auswirkung von Guanylnukleotiden auf die ¹²&sup5;I-GFP- Bindung an lösliche Rezeptoren studiert. Die endgültige Detergenskonzentration betrug 0,075 % CPAPS in Anwesenheit von 0,015% CHS. Die Kopplung an das G-Protein des GFP-Rezeptors in intakten Swiss 3T3 Fibroblasten-Membranen wurde aus der Beobachtung geschlossen, daß sich die Ligandenaffinität des Rezeptors in Anwesenheit der Nukleotide GDP und GTP und dem nichthydrolysierbaren GTP-Analog GMPPNP ungefähr um das 10-fache verringerte. Es wird angenommen, daß Guanylnukleotide in Anwesenheit von Mg&spplus;² die Ablösung von G-Proteinen aus dem Temärkomplex, bestehend aus einem Liganden mit hoher Affinität/einem Rezeptor/dem G-Protein, bewirken, was zu einer Bildung des Liganden/Rezeptor-Komplexes mit geringerer Affinität führt. Bei dem durch CHAPS aus Membranen extrahierte GFP-Rezeptor zeigte sich keine Veränderung ihrer Ligand-Bindungseigenschaften in Anwesenheit von Mg&spplus;² und GTP oder GMPPNP bei Anteilen, die eine GFP-Bindung an Membranen um ca. 80% verringern. Die fehlende Wirkung von GFP auf die GFP-Bindung in Anwesenheit von Mg&spplus;² deutet darauf hin, daß eine Wechselwirkung des Rezeptors mit seinem G-Protein im Detergens-Extrakt nicht aufrechterhalten wird. Die Vergleichsprobe in der nachfolgenden Tabelle enthält MgCl&sub2;. Guanylnukleotid solubilisierte Membranen Anzahl der Bindungen/Minute gemessen in % der Gesamtzugabe Vergleichsprobe Guanylnukleotid Intakte Membranen Anzahl der Bindungen/Minute gemessen in % der Gesamtzugabe Vergleichsprobe

BEISPIEL 7

Scatchard-Analyse der löslichen GFP-Rezeptoren

Es wurde eine Scatchard-Analyse der ¹²&sup5;I-GFP-Bindung an intakte und solubilierte Swiss 3T3-Membranen durchgeführt. Ein bestimmtes Experiment ist nachstehend erläutert, bei dem die Bindungsparameter der solubilisierten und der Membran-gebundenen Form des Rezeptors unter ähnlichen Bedingungen bestimmt werden. Assays wurden bei 15ºC bestimmt. Für Assays solubilisierter oder intakter Membranen wurden die Bindungsreaktion bei 30 bzw. 180 Minuten abgebrochen. Im folgenden sind die Bindungsparameter angegeben, wobei KD die Ablösungskonstante ist und Bm die maximale Bindungskapazität darstellt:
KD (intakte Membranen) = 37 pM
KD (solubilisierte Membranen) = 10 pM
Bm (intakte Membranen) = 0,79 pmol/mg Protein
Bm (solubilisierte Membranen) = 1,0 pmol/mg Protein
Aus der Scatchard-Analyse ergab sich die Anwesenheit eines Bindungsortes hoher Affinität Ein gewisses Maß an Nichtlinearität und Streuung in den Daten wurde bei niedrigen Werten gebundenen/freien Ligands beobachtet, wobei eine Bestimmung genauer Bindungsdaten am schwierigsten ist. Die Ablösungskonstante der Ligandbindung an die löslichen Rezeptoren (10 pM) war geringer als diejenige bei den Rezeptoren in intakten Membranen (37 pM), trotz des beobachteten Fehlens der G-Protein- Kopplung an die löslichen Rezeptoren. Wie voranstehend ausgeführt, wirkt sich eine derartige G-Protein-Kopplung erhöhend auf die Größenordnung der Affinität der Membranrezeptoren aus. Der Assay wurde jedoch unter Bedingungen durchgeführt, die für eine GFP-Bindung an den löslichen Rezeptor optimiert worden waren, was den Affinitätsverlust durch G-Protein-Wechselwirkungen kompensiert haben kann. In anderen Experimenten wurde die Ablösungskonstante des löslichen Rezeptors auf einen Bereich von 10 pM bis 30 pM berechnet. Aus den Daten ging hervor, daß die funktionale Konformation des Rezeptor-Bindungs- Ortes in Detergens-Lösung aufrechterhalten wurde.
Die Scatchard-Daten aus diesem Experiment zeigten auch, daß 0,79 pmol Rezeptoren/mg Protein in rohen Swiss 3T3 Zellmembranen enthalten waren und ca. 50 % der Rezeptor-Bindungsorte durch Extrahieren der Membranen mit Detergens solubilisiert wurden. Einige der Faktoren, die sich für die wirksamste Solubilisierung der Rezeptoraktivität als erforderlich erwiesen haben, waren das Vorhandensein von NaCl (> 100 nM) 1 eine Eliminierung zweiwertiger Kationen sowie die Extraktion von Membranen bei Raumtemperatur. Obgleich NaCl für die optimale Solubilisierung der Rezeptoren erforderlich war, inhibierte das Salz die GFP-Bindung sowohl an Swiss 3T3 Fibroblasten-Membranen als auch an durch Detergens solubilisierten Rezeptor (IC&sub5;&sub0; = ca. 50 mM). Die Inhibition der Rezeptoren durch NaCl bei Konzentrationen von bis zu 1,0 M hat sich jedoch als vollkommen reversibel herausgestellt.

BEISPIEL 8

Ligand-Spezifität von GFP-Bindungsorten in löslichen Membranextrakten

Die Bindung von ¹²&sup5;I-GFP an solubilisierten 3T3-Membranen wurde in Anwesenheit von verschiedenen unmarkierten Kompetitor-Peptiden in einem Assay untersucht. Die acht C-terminalen Aminosäuren von GFP (GFP20-27) erwiesen sich als grundlegend für eine Bindung hoher Affinität an die GFP-Rezeptoren in ganzen Zellen. Die vollständige GFP-Sequenz (GFPT27), des N-terminalen Abschnitts von GFP (GFP1-16), der Substanz P, des Antagonisten der Substanz P, Physalemin (alle genannten Substanzen sind von der Firma Peninsula Laboratories, Belmont, Kalif., Ver. St. von Amerika erhältlich) und der C-terminale Abschnitt von GFP mit Norleucin, das für Methionin substituiert wurde mit der Bezeichnung [Nle14,27]GFPL3-27 (d.h. Lys-Nle-Tyr-Pro- Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nle-NH&sub2;) wurden auf ihre Fähigkeit getestet, um die ¹²&sup5;I-GFP-Bindung an löslichen 3T3 Fibroblasten-Membranen-Extrakt zu konkurrieren. Die Konzentration von [Nle14,27]GFP13-27, die erforderlich ist, um eine 50 % Inhibition der ¹²&sup5;I-GFP-Bindung am löslichen Rezeptor (IC&sub5;&sub0; = 0,3 mM) zu bewirken, war geringfügig höher als die von GFP1-27 (IC&sub5;&sub0; = 0,1 nM). Im Gegensatz dazu war der N-terminale Abschnitt (GFP1-16) nicht in der Lage, mit ¹²&sup5;I-GFP um eine Bindung an den löslichen Rezeptor zu konkurrieren. Außerdem hatten die Substanz P, der Antagonist der Substanz P und Physalemin keine inhibitorische Wirkung bei den getesteten Konzentrationen (bis zu 1000 nM). Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denen, die ähnliche Untersuchungen an ganzen Zellen und isolierten Membranen ergeben hatten.

BEISPIEL 9

Quervernetzung von ¹²&sup5;I-GFP-Rezeptoren

Das Molekulargewicht des GFP-Rezeptors in solubilisierten Swiss 3T3 Membranen wurde mittels dessen kovalenter Quervernetzung mit gebundenem ¹²&sup5;I-GFP über das homobifunktionelle Quevernetzungs-Reagens Bis (sulfosuccinimidyl)-Suberat (BS³) und durch Analysieren der Affinität von markiertem Rezeptor mittels SDS-PAGE (Trägerelektrophorese auf Natrium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgel) beurteilt. Dieses Quervernetzungsmittel ist für primäre Animogruppen spezifisch. Lösliches 3T3 Fibroblasten-Membranprotein (40 µg) wurde 30 Minuten lang bei 15ºC in einem Endvolumen von 500 ml eines Gemischs aus 50 mM HEPES, 2 mM EDTA, 0,075 % CHAPS, 0,015 % CHS, 30 µg/ml Bacitracin, und 0,2 nM ¹²&sup5;I-GFP inkubiert. Die Bindungsreaktion wurde auf 0ºC abgekühlt, und BS³ wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 3 mM zu erhalten. Die Quervernetzung wurde durch Zugabe von 0,10 ml von Tris-Puffer (1,0 M Tris/Cl, pH 7,5) gequencht. Nach einer weiteren zehnminütigen Inkubation wurden 0,1 ml TCA (100 %) zugegeben, und die Lösung bei 0ºC 30 Minuten lang weiter inkubiert. Gefällte Substanz wurde durch Zentrifugieren gewonnen, mit eiskaltem Aceton gespült und 3 Minuten lang bei einer Temperatur von 95ºC in SDS-PAGE-Probenpuffer erhitzt. Die Proben wurden einer SDS-PAGE-Elektrophorese auf einem 7,5 % Gel unterzogen und das Gel wurde einer Röntgendurchleuchtung unterzogen. Eine detaillierte Beschreibung der SDS-PAGE-Technik ist in Laemmli et al., Nature 227:680 (1970) angegeben, die durch diese Bezugnahme miteingeschlossen sein soll. In Fig. 5 ist die Gelanzeige dargestellt. Laufspur Zusammensetzung keine Zugabe unmarkiertes GFP
Eine stark markierte Spezies verläuft als diffuse Bande mit einem scheinbaren Mr-Wert von ca. 75-100 kda. Durch niedrige Anteile von unmarkiertem GFP wurde die Markierung dieser Spezies inhibiert, was darauf schließen läßt, daß die Markierung hochgradig spezifisch ist. Die Breite der markierten Bande läßt sich mit der Tatsache vereinbaren, daß der der GFP-Rezeptor nachweislich kohlenhydrathaltig ist. Das markierte Produkt ist demjenigen sehr ähnlich, welches aus einer ganzen Zelle oder einem Membran-Quervernetzungsexperiment erhalten wurde. Die N-Glycanase-Behandlung von Proben, die aus quervernetzten ganzen Zellen abstammen, ergab, daß das markierte Protein N- verknüpfte Kohlenhydrate enthielt. Das deglykosylierte Protein zeigte einen scheinbaren Mr-Wert von 38 KDA in einer SDS-PAGE- Elektrophorese.

BEISPIEL 10

Reinigung des GFP-Rezeptors

Solubilisierung des GFP-Rezeptors

Die in Beispiel 1 hergestellten Swiss 3T3 Fibroblasten-Membranen (2-3 g Protein) wurden in 200 ml Pufferlösung zur Aufbewahrung suspendiert (siehe Beispiel 1). Die Membranen wurden mit 50 ml NaCl (5,0 M) gemischt, wobei die NaCl-Konzentration auf ca. 1 M gebracht wurde, durch 30-minütiges Zentrifugieren mit 40,000-facher Gravitation pelletiert, und zweimal bei 4ºC mit 200 ml eines Puffers mit hohem Salzgehalt gespült (50 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM EDTA, 1,0 M NaCl, 25 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 2,5 µm/ml Pepstatin und 0,5 mM PMSF). Die Membranen wurden dann mit einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt (50 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM EDTA, 25 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 2,5 µg/ml Pepstatin und 0,5 mM PMS) gespült und in 200 ml 50 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaCl, 0,03 mg/ml Bacitracin, 25 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 2,5 µg/ml Pepstatin und 0,5 mM PMSF resuspendiert. Eine Stammlösung, die ein Gemisch aus CHAPS und CHS enthielt, wurde langsam den Membranen zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,75 % CBAPS und 0,075 % CHS zu erhalten. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 21ºC inkubiert, auf 4ºC gekühlt und bei 100,000 x g 60 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit enthielt den solubilisierten GFP-Rezeptor.

Fällung durch Polyethylen-Glykol

Diesem solubilisiertem Extrakt (190 ml) wurden 126 ml eiskalten Poylethylen-Glykols (PEG) 8000 (50 Vol.-% in H&sub2;O) zugegeben. Nach gründlichem Mischen wurde der gebildete Niederschlag durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 100000 x g gewonnen. Das Pellet wurde in 25 mM HEPES, 25 mM Tris, pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,075 % CHAPS, 0,0075 % chs, 5 µg/ml Leupeptin und 10 µg/ml Bacitracin in einem Gesamtvolumen von 50 ml mit Hlfe einer Homogenisiervorrichtung des Typs Potter-Elvehjem suspendiert. Die Suspension, die ein gewisses Maß an unlöslichem Protein enthielt, wurde bei 69,000 x g 10 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet verworfen.

Weizenkeim-Agglutinin-Chromatografie

Im Anschluß an die Fällung mit PEG wurde der GFP-Rezeptor weiter durch Lektin-Affinitäts-Chromatografie gereinigt. Eine Säule (1,6 x 9 cm), die ein Weizenkeim-Agglutinin-Agarose-Harz (3-5 mg Lektin/mg feuchten Gels) enthielt (E-Y Laboratories, San Mateo, Kalif., Ver. St. von Amerika) wurde mit 50 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,25 % CHAPS, 0,025 % CHS, 5 µg Leupeptin und 10 µg Bacitracin bei 4ºC äquilibriert. Der lösliche Extrakt wurde mit einem Volumen Säulenpuffer verdünnt, und die endgültige Detergens-Konzentration wurde auf 0,25 % CHAPS und 0,025 % CHS eingestellt. Die Probe wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/min auf die Lektin-Säule aufgebracht. Die Säule wurde dann mit ca. 10 Säulenvolumen eines Puffers gespült und mit Säulenpuffer und 5 mM n,N',N"-Triacetylchitotriose eluiert. Fraktionen, die die GFP-Rezeptor-Bindungsaktivität enthielten, wurden gesammelt und mit 2,3 Volumen 25 mM HEPES, 25 mM Tris, pH 7,5, 2,0 mM EDTA, 5 µg/ml Leupeptin und 10 µg/ml Bacitracin verdünnt.

GFP-Affinitätschromatografie

Actigel-Superflow Harz (10 ml) (Sterogene, San Gabriel, Kalif., Ver. St. v. Amerika) wurde mit 5 Volumen 100 mM KPO4, pH 7,0 gespült. Das Harz wurde mit 10 ml eines Gemischs aus 100 mM KPO4, 100 mM NaCNBH3, pH 7,0, mit einem Gehalt von 2 mg/ml [Nle14,27]GFP13-27 2 Stunden lang unter sanftem Schütteln inkubiert. Das Harz wurde mit 100 mM KPO4, pH 7,0 gespült und anschließend abwechselnd mit 100 mM KAC, pH 4,0, 0,5 NaCl und 100 mM Tris, pH 8,0, 0,5 M NaCl gespült. Eine Säule des Harzes (1,6 x 5 cm) wurde mit 25 mM Tris, 25 mM HEPES, pH 7,5, 2,0 mM EDTA, 0,075 % CHAPS, 0,0075 % CHS, 5 µg/ml Leupeptin und 10 µg/ml Bacitracin bei 4ºC äquilibriert. Der rohe, aus der Lektin-Säule eluierte GFP-Rezeptor wurde mit 0,1 ml/min auf die GFP-Affinitätssäule aufgebracht. Die Säule wurde dann mit ca. 20 Volumen des Äquilibrierungspuffers gespült. Der gebundene Rezeptor wurde aus der Säule mit Äquilibrierungspuffer und 0,5 M NaCl mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min eluiert. Die den Rezeptor enthaltenden Fraktionen wurden durch Assays der ¹²&sup5;1-GFP-Bindungsaktivität identifiziert und gesammelt (10- 13 ml). Der Elutionspool wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Geräts des Typs Centriprep-10 (Amicon, Danvers, MA, Ver. St. v. Amerika) auf ca. 1 ml konzentriert. Die Probe wurde anschließend durch Verdünnung der Probe mit 15 Volumen Affinitätssäulen-Äquilibrierungspuffer ausgesal zen und wieder auf 1ml rekonzentriert. Der Aussalzungsschritt wurde wiederholt und die erhaltene 1 ml Probe wurde mit Affinitätssäulen-Äquilibrierungspuffer auf 5 ml verdünnt. Durch eine PAGE-Analyse des gereinigten GFP-Rezeptors wurde das Vorhandensein eines erheblichen Gehalts an Verunreinigungen festgestellt.
Diese halb-reine Rezeptorlösung wurde mit 1,8 ml/h auf eine zweite [Nle14,27]GFP13-27-Actigel Superflow-Säule (1,0 x 3 cm) aufgebracht, die wie oben beschrieben hergestellt wurde. Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffers gespült und der gebundene Rezeptor zusammen mit 0,5 M NaCl mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,1 ml/min eluiert. Fraktionen, die die GFP-Rezeptorbindungsaktivität enthielten, wurden gesammelt und durch Ultrafiltration auf 0,3 ml konzentriert.

Gelfiltration

Der gereinigte Rezeptor wurde durch Chromatografie auf einer Superose-6 HR 10/30 Säule (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ, Ver. St. von Amerika) ausgesalzen. Die Säule wurde mit 20 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,075 % CHAPS, 0,0075 % CHS und 100 mM NaCl äquilibriert Der Rezeptor wurde mit 0,4 ml/min chromatografiert. Ca. 2 ml Rezeptor wurden von der Säule eluiert.

Charakterisierung des gereinigten GFP-Rezeptors

Die Gesamtausbeute des reinen GFP-Rezeptors aus dem solubilisierten Rohextrakt lag in einem Bereich von 10-20 %, bezogen auf die Gewinnung einer ¹²&sup5;I-GFP-Bindungsaktivität mit hoher Affinität. Aus einer Scatchard-Analyse von Bindungsdaten, die aus dem gereinigten Rezeptor erhalten wurden, ergab sich, daß seine Affinität zu GFP (Kd = 10-30 pM) im wesentlichen dieselbe wie die des Rezeptors in dem durch Detergens solubilisierten Rohextrakt war. Aus diesen Daten geht hervor, daß 30-50 pmol der Rezeptororte typischerweise in den endgültigen gereinigten Fraktionen des Rezeptors erhalten werden, wie es in diesem Beispiel ausgeführt ist. Dies entspricht ca. 1-2 µg Rezeptorprotein, wobei zu beachten ist, daß der deglykosylierte Rezeptor ein scheinbares Molgewicht von 36%5 Kilodalton auf SDS- PAGE-Gelen hat.
Ein mit Silber angefärbtes SDS-PAGE-Gel des Rezeptor-Präparats zeigte eine einzige intensiv gefärbte, diffuse Bande mit einem scheinbaren Molgewicht von 70-100 kD. Das Rezeptorpräparat war im wesentlichen frei von Verunreinigungen. In Fig. 6 ist die mit Silber angefärbte Anzeige des gereinigten GFP-Rezeptors dargestellt. Der relative Grad der Silberfärbung des GFP-Rezeptors wurde mit bekannten Proteinmengen verglichen, um die ungefähre Menge von auf dem Gel befindlichen Rezeptorprotein zu bestimmen. Der erhaltene Rohwert lag im Bereich desjenigen, der durch Scatchard-Analyse von ¹²&sup5;-IGFP-Bindungsdaten als vorhanden bestimmt wurde, was bestätigte, daß die intensiv gefärbte Bande auf dem Gel der GFP-Rezeptor war. Ferner entsprach das scheinbare Molgewicht des gereinigten GFP-Rezeptors demjenigen, das bei Affinitäts-markiertem Rezeptor erhalten wurde. Dies wurde durch eine Bindung von ¹²&sup5;I-GFP an den Rezeptor in ganzen Zellen, intakten Membranen oder löslichen Rohextrakten, und Quervernetzung des Rezeptor-Ligand-Komplexes mit einem homobifunktionalen Ververnetzungs-Reagens erhalten.
Der diffuse Charakter der GFP-Rezeptor-Bande auf SDS-PAGE ist charakteristisch für kohlenhydrathaltige Proteine. Ein kleiner Teil des gereinigten Rezeptors wurde durch lodierung mit ¹²&sup5;I- NaI in Anwesenheit von lodogen (Pierce, Rockford, IL, Ver. St. v. Amerika) radioaktiv markiert, um den Nachweis des Rezeptors auf Gelen zu verbessern. Durch eine Behandlung des radioaktiv markierten Rezeptors mit N-Glycanase ergab sich ein Wegfallen der 70-100 kD-Bande sowie die Erzeugung einer neuen Bande bei 36±5 Kilodalton, die den deglykosylierten Rezeptor darstellte.

Bestimmung einer Teil-Aminosäuresecuenz des GFP-Rezedtors

Eine Teilsequenz in der Nähe der N-terminalen Aminosäure des gereinigten GFP-Rezeptors wurde durch sequentielle Degradation nach Edman bestimmt. Die für die Teste 8-17 erhaltene Sequenz war:
-Leu-Asn-Leu-Asp-ValAsp-Pro-Phe-Leu-Ser-

BEISPIEL 11

Trysinisierung des gereinigten GFP-Rezeptors und Isolation von Trypsinfragmenten

Gereinigter GFP-Rezeptor wurde gemäß Beispiel 10 hergestellt. Nach einer Superose-6-Chromatografie wurden 40 Picomol Rezeptor erhalten, bezogen auf die Scatchard -Analyse von ¹²&sup5;I-GFP- Bindungsdaten. Dies entsprach ca. 1,6 µg Protein. Die Probe (3 ml) wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Geräts des Typs Centricon-10 (Amicon) auf ca. 100 µl konzentriert. Anschließend wurde die Probe mit 2 ml H&sub2;O verdünnt und auf 100 µl konzentriert. Dann wurde die Probe nochmals mit 2 ml H&sub2;O verdünnt und auf 100 µl konzentriert, und schließlich mit 1 ml H&sub2;O verdünnt und auf 138 µl konzentriert. Zur Digestion des Rezeptors mit Trypsin erfolgte eine Zugabe von 0,1 µg Trypsin und eine Inkubation der Probe bei 37ºC. Nach 2 Stunden wurden zusätzliche 0,1 µg Trypsin zugegeben, gefolgt von weiteren 0,2 µg Trypsin nach einer Inkubationszeit von 5 Stunden. Nach 22 Stunden bei 37ºC wurde die Probe in flüssigem N&sub2; schnellgefroren und bei -80ºC gelagert.
Trypsin-digerierter GFP-Rezeptor wurde auf Raumtemperatur aufgetaut und 30 Minuten lang bei 37ºC mit Dithiothreitol (DTT) auf eine Endkonzentration von 10 mM reduziert. Das gesamte DTT-behandelte digerierte Trypsin wurde dann mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) mit umgekehrten Phasen unter Verwendung einer 2,1 mm x 3 cm C4 Säule (Brownlee, Aquapore Butyl, mit einer Porengröße von 300 Ångstrom ) und einem linearen Gefälle von 0,05 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (Lösungsmittel A) auf 0,05 % TFA in 100 % Acetonitril (Lösungsmittel B) fraktioniert (Fig. 7). Die Bedingungen für das HPLC-Gefälle waren 0% Lösungsmittel B bis 100 % Lösungsmittel B in 60 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml pro Minute. Die ausfließenden Fraktionen wurden bei 215 nm nachgewiesen, in einminutigen Intervallen gesammelt und bei 4ºC gelagert.
Für eine Peptidsequenzanalyse wurden Folgefraktionen gesammelt und auf einem Speed Vac (Savant, Farmingdale, NY, Ver. St. v. Amerika) auf ein Endvolumen von ca. 50 µl konzentriert. Die Probe wurde in ihrer Gesamtheit auf einen Glasfaserfilter geladen, der mit Biobrene (Applied Biosystems (ABI), Foster City, Kalif., Ver. St. v. Amerika) behandelt und vorgeformt (precycled) worden war. Eine automatische Analyse der Aminosäuresequenz wurde auf einem Gasphasen-Sequenzer des Typs ABI Modell 475A (Hewick et al., J.Biol.Chem. 256:7990-7997, 1981) durchgeführt, der mit einem HPLC-System mit Online-Anzeige des Typs ABI Modell 120A zur Identifizierung von Pheylthiohydantom- (PTH-) Aminosäuren ausgestattet war. Eine quantitative Bestimmung von PTH-Aminosäuren wurde mit einem Datensystem des Typs ABI Modell 900 unter Verwendung von 60 Picomol eines bekannten PTH-Aminosäurestandardsatzes (ABI) durchgeführt. Auf diese Weise ergaben die kombinierten Trypsin-HPLC-Fraktionen 56 bis 59 die Aminosäuresequenz MASFLVFYVIPLAII (als T56/59 bezeichnet); die Trypsin-HPLC-Franktion 44 ergab die Aminosäuresequenz QLTSVGVSV (als T44 bezeichnet) und die Trypsin-HPLC- Fraktion 50 ergab die Aminosäuresequenz PNLFISXLALG (als T50 bezeichnet), wobei X einen Rest bezeichnet, der nicht identifiziert werden konnte.
Eine Analyse der NH&sub2;-terminalen Sequenz wurde am intakten gereinigten GFP-Rezeptor im Anschluß an das Spülen mit H&sub2;O und Konzentration der Probe auf einem Ultrafiltrationsgerät des Typs Centricon 10 (Amicon, Danvers, MA, Ver. St. v. Amerika) vorgenommen. Die Probe (95 % oder ungefähr 95 µl) wurden auf einen vorgeformten Glasfilter des Typs Biobrene (ABI) gebracht und eine Analyse der NH&sub2;-terminalen Sequenz über 30 Zyklen einer automatisierten Degradation nach Edman auf einem Gasphasen-Sequenzer vom Typ ABI 475A (Hewick et al.) durchgeführt. Es erfolgte eine Identifizierung und quantitative Bestimmung der PTH-Aminosäuren unter Verwendung eines PTH-Aminosäurenanalysegeräts vom Typ ABI 120A und eines Datensystems ABI 900. Im Anschluß an zwei getrennte Durchläufe der NH&sub2;-terminalen Sequenz auf zwei gereinigten Präparaten des GFP-Rezeptors wurde die folgende übereinstimmende NH&sub2;-terminale Aminosäuresequenz für 17 Reste erhalten, wobei X einen Rest bezeichnet, für den eine genaue Zuordnung einer spezifischen Aminosäure nicht durchgeführt wurde:

BEISPIEL 12

Identifizierung des cDNA-Klons

Kodierung des Swiss 3T3-GFP-Rezeptors

Vorläufige Untersuchungen haben ergeben, daß eine Fibroblasten-Zellinie (Balb 3T3) aus Mausembryonen ein Repertoir von mRNAS exprimiert, die in ihrer Fülle und Verteilung der den GFP-Rezeptor exprimierenden Swiss 3T3 Maus-Fibroblasten-Zellinie sehr ähnlich sind, die jedoch keine in Standard-Bindungsassays nachweisbaren GFP-Rezeptoren an der Zelloberfläche aufweisen (Kris et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:7616-7620, 1985). Diese Beobachtungen legen nahe, daß die GFP-Rezeptor RNRNA ein Transkript einer begrenzten Anzahl von Transkripten ist, die zwar in Swiss 3T3 vorhanden ist, aber nicht in Balb 3T3 mRNA. Polyadenylierte mRNA wurde unter Verwendung einer veröffentlichten Vorgehensweise (Timlin et al., Nuc.Acids.Res. 18:1587-1593, 1990, deren Offenbarung durch diese Bezugnahme hier mitaufgenommen sein soll) sowohl aus Swiss 3T3 als auch aus Balb 3T3 Zellinien isoliert und zur Erzeugung einer Swiss 3T3 subtrahierten cDNA-Bank verwendet, die mit cDNAS angereichert war, die von Swiss 3T3 mRNA abstammen, aber nicht in Balb 3T3 mRNA vertreten waren. Die cDNA-Inserts, deren Länge 300 Basenpaare überstieg, wurden mit dem cDNA-Klonierungsvektor des Bakteriophagen Lambda gt10 verbunden und die Bank unter Verwendung etablierter Verfahren vergrößert (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Company, New York, 1986).
Die Bank wurde mit einer Oligonukleotidprobe gescreent, deren Sequenz auf der Aminosäuresequenz eines internen Trypsinfragments (T 56/59) beruhte, die durch HPLC aus einem Trypsin-Digest des gereinigten GFF-Rezeptorproteins gereinigt wurde. Die Aminosäuresequenz (MASFLVFYVIPLAII) des internen Peptids wurde zum Aufbau eines langen nicht-degenerierten anti-sinn Oligonukleotids verwendet, dessen Sequenz auf der optimalen Häufigkeit der Codonverwendung beruhte, wie in der Fachliteratur beschrieben (Lathe, Mol.Biol. 183:1-12, 1985), was eine 44 Basen lange Probe ergab, die als 13: (5'AT- GATGGCAGGGGGATCACATAGAAGACCAGGAAGGAGGCCAT 3,) bezeichnet wird. Die 13-Probe wurde unter Verwendung von Gamma-32P-ATP und Polynukleotid-Kinase und mit bekannten Techniken (Davis et al.) durch Phosphorylation des 5'-Endes markiert. Die markierte Probe wurde zum Screenen von 100000 Klonen aus der subtrahierten Bank unter Verwendung der voranstehend beschriebenen Hybridisierungs- und Spülbedingungen (Wood, Kapitel 48 in Methods in Enzymology 152:443-447, 1987) verwendet. Durch Doppelscreenings wurden fünf positive Klone identifiziert, die plaquegereinigt wurden. Die EcoRI-Inserts der fünf Klone wurden zu dem Plasmidvektor PGEM 4 (Promega) subkloniert, und die Nukleotidsequenz der hybridisierenden Inserts wurde unter Verwendung des Sequenase 2,0 Doppelstrang-Sequenzerkits (US Biochemical) bestimmt. Zwei der fünf Klone (T1 und T2) hatten einen identischen Bereich einer sich überschneidenden DNA-Sequenz, die das interne Peptid kodierte, das zum Aufbau der Oligonukleotidprobe verwendet wurde. Das Fragment wurde durch EcoRI-Digerierung aus dem Plasmid-Vektor entfernt und durch Gel-Elektrophorese und Elektroelution wie beschrieben (Davis et al.) gereinigt. Die gereinigten Insert-Fragmente wurden durch eine beliebige Primer-Extension unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits und Beachtung der Empfehlungen der Vertriebsfirma (Bethesda Research Laboratories) markiert, um eine Probe zur Identifizierung anderer sich überschneidender cDNA-Klone aus der subtrahierten Bank in einem zweiten Screening der 100000 Elemente der Bank zu erzeugen. Eine Nukleotidsequenzanalyse der neun zusätzlichen identifizierten Klone ergab ein einziges langes offenes Leseraster, dessen vorhergesagtes Translationsprodukt die interne Trypsin-Fragment-Aminosäuresequenz enthielt, die in einem Terminationscodon innerhalb der zusammengesetzten Sequenz endete. Das aminoterminale Ende des offenen Leserasters war in keinem der aus der subtrahierten Bank isolierten Klone enthalten.
Um das 5' Ende der cDNA und das aminoterminale Ende des offenen Leserasters zu erhalten, wurde ein in vitro Polymerase- Kettenreaktions-Aktivierungs (PCR) cDNA-Klonierungsverfahren (5'RACE) im wesentlichen wie in Frohman et al., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 85:8998-9002, 1988) beschrieben durchgeführt, unter Verwendung von zwei ineinandergesetzten genspezifischen Oligonukleotiden (EXT 3: 5, GGGGAGCCAGCAGAAGGC 3'; EXT 2: 5, CCATGGAATGGATTTTA), die von der bekannten Nukleotidsequenz der zuvor analysierten cDNA-Klone abgeleitet wurden. EXT 3 wurde als genspezifischer Primer für eine umgekehrte Transkription von Swiss 3T3 RNRNA verwendet, und EXT 4 wurde als genspezifischer Primer für Taq-DNA-Polymerase-katalysierte PCR verwendet. Neunzehn 5, RACE cDNAS wurden isoliert und charakterisiert, und fünf der Klone, die sich über die längste Strecke erstreckten, wurde wie voranstehend beschrieben sequenziert. In einer Nukleotidsequenzanalyse ergab sich eine Erweiterung des langen offenen Leserasters, das die interne Trypsin-Peptid-Aminosäuresequenz kodiert, beginnend mit einem Methionin- Initiatorcodon. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz des offenen Leserasters wurde mit der aus dem gereinigten GFP-Rezeptor abgeleiteten aminoterminalen Sequenz (Beispiel 11) verglichen. Die im Experiment bestimmte Aminosäuresequenz enthielt nicht das Methionin an Position 1 der abgeleiteten Sequenz, sondern korrespondierte gut mit den Resten 2-18. Die abgeleiteten Aminosäuren 2-4 und 8-18 (Fig. 8A) waren identisch. Die Aminosäuren, die nicht paßten (Aminosäuren 5-7, Fig. 8A), waren in der ursprünglichen Aminosäuresequenz mehrdeutig, was unter Umständen darauf zurückzuführen ist, daß sie sich an einem N-gekoppelten Glykosylierungsort befinden (Asn-Cys-Ser). Außerdem entsprach die Aminosäuresequenz der internen Trypsin-Peptide T44 (QLTSVGVSV) und T50 (PNLFISXLALG), die aus dem gereinigten Swiss 3T3 GFP-Rezeptor abgeleitet wurden (Beispiel 11), Segmenten innerhalb des langen offenen Leserasters der zusammengesetzten GFP-Rezeptor-cDNA.
Eine genspezifische primer-gesteuerte cDNA-Klonierung wurde eingesetzt, um einen einzigen cDNA-Klon zu erhalten, der das gesamte ununterbrochene offene Leseraster kodiert. Bei diesem Vorgang wurde ein genspezifischer Oligonukleotid (EXT 7: 5, TACTTTGAGATACAATGG 3'), der zu einem 18 Nukleotid-Segment des 3' nichttranslatierten Bereichs der GFP-Rezeptor-mRNA komplementär war, zum PmMen der Synthese der cDNA mit dem ersten Strang durch umgekehrte MuLV-Transkriptase verwendet. Es wurde eine doppeisträngige cDNA erzeugt, und unter Verwendung von Standardverfahren (Davis et al.) zu Lambda gt10 kloniert. Fünfhunderttausend Klone wurden mit einer cDNA-Fragment-Probe gescreent, die aus einem der 5' RACE cDNA-Klone abgeleitet wurde, welche sich in den 5' nichttranslatierten Bereich der cDNA erstreckten. Über zwanzig Klone wurden identifiziert und zehn wurden plaquegereinigt und durch Standardverfahren (Davis et al.) zu Plasmid-Vektoren subkloniert. In einer Nukleotidsequenzenanalyse bestatigte sich, daß die Klone das gesamte ununterbrochene offene Leseraster des GFP-Rezeptorproteins enthielten. Die DNA-Sequenz des GFP-Rezeptors und seiner abgeleiteten Aminosäuresequenz ist in Fig. 8 dargestellt.
Eine Analyse der Nukleotidsequenz des offenen Leserasters ergab mehrere interessante Merkmale des vorbestimmten Proteins. Das vorbestimmte Molgewicht des Proteins beträgt ca. 43100 Dalton, was gut mit dem für das N-Glykanase-reduzierte GFP- Bindungsprotein von Swiss 3T3-Zellen korrespondiert, wie in Beispiel 10 beschrieben. In einer Hydrophobizitäts-Analyse wird das Vorhandensein von sieben mutmäßlichen Transmembran-Bereichen (Fig. 9) vorhergesagt, was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt, daß der GFP-Rezeptor an ein Guanin-Nukleotid-Bindungsprotein (G-Protein) gekoppelt ist (Fischer et al., J. Biol. Chem. 263:28082816, 1988). Die Überfamilie von G-Protein-gekoppelten Rezeptorgenen teilt sich typischerweise gewisse erhaltene Reste innerhalb oder in der Nähe der sieben Transmembran-Bereiche (Masu et al, Nature 329:836-838, 1987). Diese erhaltenen Aminosäuren finden sich an den vorhergesagten Stellen innerhalb des offenen Leserasters der GFP-Rezeptorsequenz (Figur 8). Fünf potentielle Stellen für N-verknüpfte Glykosylierung (Asn-X-Ser/Thr) werden festgestellt (Figur 8), was mit der Beobachtung übereinstimmt, daß der GFP-Rezeptor stark glykosyliert ist, und daß eine N-Glykanase-Behandlung des GFP-Rezeptor-Glykoproteins das scheinbare Molekulargewicht des Proteins in SDS-Polyacrylamid-Gelen von ca. 70-100 Kilodalton auf ca. 38±5 Kilodalton verringert (Beispiel 10).
Es wurde eine Northern-Blot-Analyse (Davis et al.) durchgeführt, um den Charakter der den Swiss 3T3-GFP-Rezeptor kodierenden Transkripte zu identifizieren (Fig. 10). Ein Mikrogramm polyadenylierter mRNA, das aus Swiss 3T3 und Balb 3T3 Zellen abgeleitet wurde, wurde gereinigt und durch Elektrophorese auf einem Formaldehyd-haltigen einprozentigen Agarosegel aufgelöst, das anschließend auf ein Nitrocellulose-Filter übertragen wurde. Das Filter wurde mit einer cDNA-Fragmentprobe einer Länge von 450 Basenpaaren hybridisiert, die die Carboxy-terminalen Transmembran-Bereiche 5, 6 und 7 sowie einen Teil der 3' nichttranslatierten Sequenzen kodiert. Die Probe wurde mit 32P auf eine spezifische Aktivität 500 cpm/Picogramm unter Verwendung eines im Handel erhältlichen beliebigen PmMer-Verlängerungs-Kits (Bethesda Research Laboratories) markiert. Zwei mRNAs, die auf die Probe spezifisch hybridisiert wurden, deren Größen auf 7,2 kb und 3,0 kb durch Vergleich mit Maus-28S- (5,0 kb) und 18S- (2,0 kb) Markern (Fig. 10) geschätzt wurden. Wie erwartet wurden die zwei mRNA-Formen lediglich in mRNA aus Swiss 3T3 nachgewiesen, wobei keine GFP-Rezeptor-Transkripte in mRNA aus Balb 3T3-Zellen beobachtet wurden.

BEISPIEL 13

menschliche mRNA-Sdezies, die homolog zu Maus-GFP-Rezeptor-cDNA sind

Es wurde eine Northern-Blot-Analyse zur Bestimmung des Homologiegrades zwischen dem in Lungenzellen menschlicher Foeten exprimierten GFP-Rezeptor (Kris et al., J.Biol.Chem. 262:1121511220, 1987) und dem Swiss 3T3 Zell-Rezeptor durchgeführt. Polyadenylierte mRNA wurde aus Lungenzellen menschlicher Foeten isoliert und einer Northern-Analyse unterzogen, wie in Beispiel 12 beschrieben, wobei dasselbe cDNA-Fragment einer Länge von 450 Basenpaaren des GFP-Rezeptors von Swiss 3T3 Zellen als Probe verwendet wurde, mit der Ausnahme, daß die Strenge der Spülschritte der Hybridisierungsfilter verringert wurde. Zwei mRNA-Spezien von ca. 7,2 und 3,0 kb wurden in der menschlichen Zellinie nachgewiesen, die mit den in mRNA aus Swiss 3T3-Maus-Zellen beobachteten korrespondierten (Fig. 12). Auf der Grundlage der Bedingungen, die für den Blot verwendet wurden, waren die identifizierten mRNA-Spezien mindestens 80 % homolog zu der GFP-Rezeptor-Probe aus Swiss 3T3- Zellen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß die in Beispiel 12 beschriebene cDNA aus Maus-GFP-Rezeptor für eine problemlose Identifizierung von cDNAS oder Genom-DNA-Fragmenten, die den GFP-Rezeptor in anderen Säuger-Spezien, einschließlich Menschen, kodieren, verwendet werden kann.

BEISPIEL 14

Expression des Maus-GFP-Rezeptors, der aus dem cDNA-Klon von Xenopus-Oozyten abstammt, um die Rezedtor-Funktion aufzuzeigen

Ein gleichsinniges in vitro-Transkript wurde aus dem Kodierungsbereich für Maus-GFP-Rezeptor-cDNA-Protein (Fig. 8) hergestellt, der im Transkriptionsvektor PGEM 4 (Promega) kloniert wurde, unter Verwendung von sp6 RNA-Polymerase und bekannten Verfahren (Davis et al., 1986). Das synthetisierte Transkript (ca. 20 Nanogramm) wurde Xenopus-Oozyten injiziert. Sechzehn Stunden später wurden die Oozyten durch Spannung fixiert und in einer Lösung mit 10&supmin;&sup9; M GRP gebadet. Wie in Fig. 13 gezeigt, entstand ein GFP-Ligand-abhängiger Chloridstrom (von einer größe von ca. 160 Nanoampere) gleichzeitig mit der Zugabe des Ligand. Diese Ergebnisse zeigen die Expression eines von einem in vitro-Transkript abhängigen GFP-Rezeptors auf der Zelloberfläche des Xenonus-Oozyten auf, die über G-Proteine mit einem Ca&spplus;&spplus; abhängigen Chloridkanal gekoppelt ist. Der Ligand-abhangige Chloridstrom wurde in Kontroll-Oozyten, denen ein anti-sinn in vitro-Transkript injiziert worden war, nicht beobachtet, was die Spezifität der Reaktion aufzeigt.

Claims

1. Verfahren zur Solubilisierung des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid in aktiver Form, folgende Schritte umfassend:

(1) Herstellen von Membranen aus einem Ausgangsmaterial eines Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid;

(2) Waschen dieser Membranen und Suspendieren dieser Membranen in einer Pufferlösung;

(3) Solubilisieren des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid durch Inkubieren der Membranen in einer Lösung, der ein Detergens und ein löslicher Cholesterylester zugegeben wurde; und

(4) Einstellen der Detergens-Konzentration des solubilisierten Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ausgangsmaterial des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid ein eukaryotischer oder prokaryotischer Wirt ist, der einen rekombinierten, Gastrin-freisetzenden Peptid-Rezeptor exprimiert.

3. Verfahren zur Solubilisierung und Reinigung des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid in aktiver Form, folgende Schritte umfassend:

(2) Waschen der Membranen und Suspendieren der Membranen in einer Pufferlösung;

(3) Solubilisieren des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid durch Inkubieren der Membranen in einer Lösung, der ein Detergens und ein löslicher Cholesterylester zugegeben wurde, um einen löslichen Extrakt zu bilden;

(4) Fällen des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid aus dem löslichen Extrakt aus Verfahrensschritt (3), Gewinnung des Niederschlags durch Zentrifugierung und Resuspendierung des Niederschlags in einer Pufferlösung, die das Detergens und den löslichen Cholesterylester enthält, um einen löslichen Extrakt zu bilden;

(5) Aufbringen des löslichen Extrakts aus Verfahrensschritt (4) auf eine Weizenkeim-Agglutinin-Affinitätssäule unter Bildung eines Eluats;

(6) weiteres Fraktionieren des Eluats der Weizenkeim- Agglutinin-Säule aus Verfahrensschritt (5) auf einer Affinitätssäule für das Gastrin-freisetzende Peptid unter Bildung eines Eluats; und

(7) Dialysieren des Eluats der Affinitätssäule für das Gastrin-freisetzende Peptid aus Verfahrensschritt (6) und Aufbringen dieses Eluats auf eine zweite Affinitätssäule für Gastrin-freisetzendes Peptid.

4. Verfahren nach Anspruch 3, das weiterhin den Verfahrensschritt einer Gelfutration im Anschluß an Verfahrensschritt (7) umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Ausgangsmaterial des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid eine Zell- Linie eines Säugers ist.

6. Solubilisierter Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid in aktiver Form.

7. Rezeptor nach Anspruch 6, der in folgenden Schritten solubilisiert wird:

(3) Solubilisieren des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid durch Inkubieren dieser Membranen in einer Lösung, der ein Detergens und ein löslicher Cholesterylester zugegeben wurde; und

(4) Einstellen der Detergens-Konzentration des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid.

8. Rezeptor nach Anspruch 71 wobei das Ausgangsmaterial des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid ein eukaryotischer oder prokaryotischer Wirt ist, der den rekombinierten Gastrin-freisetzenden Peptid-Rezeptor exprimiert.

9. Rezeptor nach Anspruch 7, wobei das Ausgangsmaterial des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid eine Zell- Linie eines Säugers ist.

10. Rezeptor nach Anspruch 7, wobei das Detergens 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat ist und der lösliche Cholesterylester Cholesterylhemisuccinat ist.

11. Rezeptor nach Anspruch 6, der Gastrin-freisetzendes Peptid mit einer Affinität von mindestens KD=¹&sup0; µM bindet.

12. Rezeptor nach Anspruch 6, mit den folgenden Eigenschaften:

verläuft als breite Bande in einer Trägerelektrophorese auf Natrium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE- Elektrophorese) mit einem scheinbaren Molgewicht von ca. 70 bis 100 Kilodalton;

bindet sich selektiv an Polypeptide des Bombesin-Typs;

hat einen KD-Wert von ca. 10-100 pM;

enthält keine gekoppelten G-Proteine;

enthält N-gebundene Kohlenhydrate;

hat im entglykolisierten Zustand ein scheinbares Molgewicht von 36±5 Kilodalton in der Trägerelektrophorese auf Natrium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgel; und

hat eine Teil-Aminosäuresequenz in der Nähe der N-terminalen Aminosäure von:

-Leu-Asn-Leu-Asp-Val-Asp-Pro-Phe-Leu-Ser-.

13. Solubilisierter und gereinigter Rezeptor für Gastrinfreisetzendes Peptid in aktiver Form, der im wesentlichen frei von kontaminierenden Verunreinigungen ist.

14. Rezeptor nach Anspruch 13, der in folgenden Schritten solubilisiert und gereinigt wird:

(3) Solubilisieren des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid durch Inkubieren dieser Membranen in einer Lösung, der ein Detergens und ein löslicher Cholesterylester zugegeben wurde, um einen löslichen Extrakt zu bilden;

15. Rezeptor nach Anspruch 14, der durch den weiteren Schritt einer Gelfiltration im Anschluß an Verfahrensschritt (7) solubilisiert und gereinigt wird.

16. Rezeptor nach Anspruch 13, mit den folgenden Eigenschaften:

verläuft als breite Bande in der Trägerelektrophorese auf Natrium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgel mit einem scheinbaren Molgewicht von ca. 70 bis 100 Kilodalton;

bindet sich selektiv an Polypeptide des Bombesin-Typs; hat einen KD-Wet von ca. 10-100 pM;

enthält keine gekoppelten G-Proteine; enthält N-gebundene Kohlenhydrate;

hat eine Teil-Aminosäuresequenz in der Nähe der N-terminalen Aminosäure von:

-Leu-Asn-Leu-Asp-Val-Asp-Pro-Phe-Leu-Ser-.

17. Antikörper mit einer Bindungsaffinität an einen in der Natur vorkommenden Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid.

18. Antikörper nach Anspruch 17, die auf den GRP-Rezeptor oder Fragmente davon ansprechen.

19. Antikörper nach Anspruch 17, die mit Radionukliden konjugieren.

20. Screeningverfahren für Verbindungen, die eine Bindungsaffinität an den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid haben, wobei das Verfahren die Verwendung eines Ausgangsmaterials eines Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid, die löslich und aktiv und im wesentlichen frei von anderem Bindungsprotein für Gastrin-freisetzendes Peptid ist, in einem Bindungsassay Rezeptor/markierte Verbindung umfaßt, mit folgenden Verfahrensschritten:

(1) in Kontakt bringen und Inkubieren des Ausgangsmaterials des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid mit einer markierten Verbindung, die eine bekannte Bindungsaffinität an den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid hat, und einer Testverbindung, deren Bindungsaffinität an den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid ausgewertet werden soll;

(2) Trennen gebundener von freier markierter Verbindung; und

(3) Messen des Bindungsgrades der markierten Verbindung, wobei dieser Wert umgekehrt proportional zum Betrag der Bindung der Testverbindung ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Ausgangsmaterial des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid eine eukaryotische oder prokaryotische Wirtszelle ist, die mit Molekülen rekombinierter DNA unverändert transformiert wurde, die den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid exprimieren.

22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Ausgangsmaterial des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid Membranen aus einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zelle sind, die mit DNA-Vektoren unverändert transformiert wurde, welche die Expression des Rezeptors für das Gastrinfreisetzende Peptid steuern.

23. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der solubilisierte Rezeptor gereinigt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die markierte Verbindung ein Ligand oder ein Antikörper ist.

25. Kit zur Bestimmung der Bindungsaffinität einer Testverbindung an den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid&sub1; umfassend eine markierte Verbindung, deren Bindungsaffinität an den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid bekannt ist, den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid in aktiver Form, der im wesentlichen frei von anderem Bindungsprotein für das Gastrin-freisetzende Peptid ist, und ein Mittel zum Trennen gebundener von freier markierter Verbindung.

26. Kit nach Anspruch 25, wobei das Mittel zum Trennen eine feste Phase zur Immobilisierung des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid ist.

27. Kit nach Anspruch 25, wobei die markierte Verbindung ein Ligand oder ein Antikörper ist.

28. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid in einer Probe, folgende Schritte umfassend:

(1) Herstellen von Membranen aus einer Probe, die aus einem Ausgangsmaterial eines Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid besteht;

(3) Solubilisieren des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid durch Inkubieren der Membranen in einer Lösung, der ein Detergens und ein löslicher Cholesterylester zugegeben wurde;

(4) Einstellen der Detergens-Konzentration des solubilisierten Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid;

(5) in Kontakt bringen und Inkubieren der verdünnten Lösung mit radioaktiv markiertem Gastrin-freisetzenden Peptid zur Bildung von Komplexen aus Gastrinfreisetzendem Peptid: Gastrin-freisetzender Peptid- Rezeptor;

(6) Gewinnen dieser Komplexe; und

(7) Messen der Radioaktivität der gewonnen Komplexe.

29. Kit zur Bestimmung der Konzentration eines Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid in einer Probe, umfassend eine markierte Verbindung mit einer bekannten Bindungsaffinität an den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid, den Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid in aktiver Form und im wesentlichen frei von anderem Bindungsprotein für das Gastrin-freisetzende Peptid sowie ein Mittel zur Trennung gebundener von freier markierter Verbindung.

30. Kit nach Anspruch 29, wobei das Mittel zum Trennen eine feste Phase zur Immobilisierung des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid ist.

31. Kit nach Anspruch 29, wobei die markierte Verbindung ein Ligand oder ein Antikörper ist.

32. Antikörper mit Bindungsaffinität an in der Natur vorkommenden Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit oder einer Störung, die mit einer abnormalen Expression oder abnormalem Triggern des Rezeptors für das Gastrin-freisetzende Peptid einhergeht.

33. Antikörper nach Anspruch 32, wobei der Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid in aktiver Form solubilisiert ist und die Antikörper Epitope erkennen, die nur im aktiven Rezeptor für das Gastrin-freisetzende Peptid vorhanden sind.