DE69832156T2

DE69832156T2 - Zusammensetzungen des synaptischen Aktivierungsproteins und Verfahren

Info

Publication number: DE69832156T2
Application number: DE69832156T
Authority: DE
Inventors: F. Paul WORLEY; R. Paul BRAKEMAN
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2018-03-14
Also published as: CA2287591A1; WO1998040407A1; EP0970119B1; US6780600B2; JP4127861B2; AU733575B2; JP2001517217A; ES2255152T3; EP0970119A1; US20030027147A1; ATE308564T1; AU6702698A; US6294355B1; DE69832156D1; EP0970119A4; US7399830B2; EP0970119B9; US20040229274A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie von synaptisch aktivierten Proteinen und insbesondere ein Protein, das spezifisch an metabotrope Glutamatrezeptoren bindet oder deren Funktion verändert.
Referenzen

Ausubel, F. M., et al., in „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Media PA (1992);
Chevray, P. M., und Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5789-5792 (1992);
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Doyle, D. A., et al., Cell 85: 1067-1076 (1996);
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Stand der Technik
Die räumliche Lokalisierung und Cluster-Bildung von Membranproteinen sind für die Entwicklung von Neuronen und die synaptische Plastizität kritisch. Man nimmt an, dass Proteine, die mit Plasmamembranproteinen interagieren, die räumliche Verteilung solcher Membranproteine beeinflussen. Diese Wechselwirkungen sind möglicherweise in der Regulation der Funktion(en) von Membranproteinen wichtig, z.B. von Neurotransmitter-Rezeptoren, welche die synaptische Aktivität im Zentralnervensystem steuern.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung einer neuen Familie von Proteinen, die im Zentralnervensystem von Säugern angereichert sind und mit Proteinen interagieren, die an der synaptischen Funktion beteiligt sind. Dass diese Proteine an der synaptischen Funktion beteiligt sind, wird dadurch gezeigt, dass sie durch eine neuronale Aktivierung induziert werden, z.B. durch Krampfanfälle, eine visuelle Stimulation, eine akute Kokaingabe, ein Trauma und dergleichen. Diese Proteine werden zusammen als „synaptische Aktivierungsproteine" bezeichnet.
Ein neues dendritisches Protein, das mit „Homer" bezeichnet wird, stellt ein Beispiel der vorliegenden Erfindung dar. Dieses Protein enthält eine einzelne PDZ-ähnliche Bindungsdomäne und bindet spezifisch an den C-Terminus von metabotropen Glutamatrezeptoren. Metabotrope Glutamatrezeptoren setzen intrazelluläres Calcium frei, indem sie die Phospholipase C aktivieren, welche die Hydrolyse von Membran-Phosphoinositiden katalysiert. Jedoch hat das Homer-Protein mit bekannten PDZ-Proteinen, außer dass es eine PDZ-ähnliche Domäne enthält, keine anderen Gemeinsamkeiten und weist mit dem ähnlichsten PDZ-Protein eine Sequenzidentität von weniger als 10 % auf. Außerdem wird das Homer-Protein als ein unmittelbares frühes Gen reguliert. Diese dynamische Transkriptionskontrolle legt nahe, dass Homer einen neuen zellulären Mechanismus vermittelt, um die metabotrope Glutamat-Signalgebung zu regulieren.
Diese, für das Homer-Protein angegebenen Merkmale kennzeichnen eine neue Familie von Proteinen, die synaptischen Aktivierungsproteine, welche die Grundlage für die vorliegende Erfindung darstellen. Da diese Proteine an der synaptischen Funktion beteiligt sind, haben sie bestimmte Anwendungsmöglichkeiten, z.B. in Screening-Tests für Arzneistoffe, welche die synaptische Funktion beeinflussen und deshalb zentral wirksam sind, wie nachstehend noch weiter beschrieben wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie von Proteinen, die in dem Zentralnervensystem von Säugern vorliegen. Diese Proteine sind insbesondere gekennzeichnet durch (i) ihre erhöhte Expression im Gewebe des Zentralnervensystems von Säugern als Reaktion auf eine synaptische Aktivierung und (ii) eine neue PDZ-ähnliche Bindungsdomäne.
Die neue Proteinfamilie wird durch ein Rattenprotein beispielhaft dargestellt, das mit „Homer" bezeichnet wird (SEQ ID NO: 2). Andere Mitglieder der Familie haben eine Sequenz, die im Wesentlichen identisch ist (mit einer Sequenzidentität von 80 % oder größer) zu der des Rattenproteins oder zu den Familienmitgliedern von Mensch und Maus.
Familienmitglieder können durch eine Hybridisierung bei niedriger Stringenz, degenerierte PCR oder andere Verfahren identifiziert werden, die Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen nachweisen, welche zu mindestens 80 % zu SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 identisch sind.
Proteine der Erfindung sind besonders geeignet für die Verwendung in Screening-Tests auf zentral wirksame Arzneistoffe. Außerdem sind die Proteine geeignete Komponenten für diagnostische Tests zur Messung der Induktion einer synaptischen Aktivität, die als Antwort auf verschiedene, zu einer synaptischen Aktivierung führende Stimuli erfolgen kann. Genauso eigenen sich Peptidfragmente von solchen Proteinen, insbesondere Peptidfragmente, die von der Bindungsstelle zwischen solchen Proteinen und ihren synaptischen Effektor-Bindungspartnern hergeleitet sind, als Inhibitoren von Langzeitfolgen einer abnormen synaptischen Aktivierung.
In einer damit zusammenhängenden Ausführungsform umfasst die Erfindung wie vorstehend beschriebene Polypeptide, die jedoch weiterhin eine Fähigkeit aufweisen, selektiv an ein synaptisches Membranprotein zu binden, das eine C-terminale Peptidregion besitzt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SSSL und SSTL besteht.
Außerdem umfasst die Erfindung in einem damit zusammenhängenden Aspekt Nucleotidsequenzen, die Mitglieder der hier beschriebenen neuen Proteinfamilie codieren. Demgemäß sind sowohl Nucleotidsequenzen, die eine wesentliche Identität zu den offenbarten Homer-Protein-codierenden Sequenzen (z.B. SEQ ID NO: 1) aufweisen, als auch die offenbarten Sequenzen selbst in der Erfindung enthalten.
Außerdem stellen Vektoren, welche die vorstehend beschriebenen Polynucleotidsequenzen enthalten, einen Teil der Erfindung dar. Solche Vektoren sind z.B. für die Herstellung der beanspruchten Proteine durch Rekombinations-Techniken geeignet.
In einem damit zusammenhängenden Aspekt betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zum Selektieren einer Verbindung, welche die Bindung eines synaptischen Aktivierungsproteins an ein zelluläres Bindungsprotein im Zentralnervensystem eines Säugers stört. Das Verfahren umfasst das Zufügen einer Testverbindung zu einem Reaktionsgemisch, enthaltend (i) ein isoliertes synaptisches Aktivierungsprotein, das eine wesentliche Identität zu einem oder mehreren der Polypeptide aufweist, die die wesentliche Sequenzidentität zu dem Polypeptid aufweisen, das eine als SEQ ID NO: 2 dargestellte Sequenz hat, (ii) ein isoliertes Bindungsprotein, an das das synaptische Aktivierungsprotein bindet, und (iii) Mittel zum Nachweis der Bindung zwischen dem synaptischen Aktivierungsprotein und dem Bindungsprotein. Die Bindung des Bindungsproteins an das synaptische Aktivierungsprotein wird in Gegenwart einer Testverbindung gemessen und mit der Bindung verglichen, die in Abwesenheit der Testverbindung gemessen wird. Eine Testverbindung wird zur Verwendung als ein zentral wirksamer Arzneistoff ausgewählt, wenn ein solcher Vergleich einen wesentlichen Unterschied in der Bindung unter diesen Bedingungen zeigt.
In einer bestimmten Ausführungsform ist das Bindungsprotein in dem Testverfahren ein metabotropes Glutamatrezeptor-Polypeptid, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SSSL und SSTL besteht. In einer anderen bestimmten Ausführungsform ist das Bindungsprotein ein mGluR, der an Phosphoinositidase C gebunden ist. In einer weiteren Ausführungsform wird der mGluR in Zellen exprimiert, und die Bindung zwischen dem Rezeptor und dem Bindungsprotein wird gemessen, indem die Phosphoinositidase-C-Aktivität in den Zellen gemessen wird.
Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden noch deutlicher, wenn man die folgende genaue Beschreibung der Erfindung unter Beachtung der beigelegten Zeichnungen liest.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die codierende Nucleotidsequenz des offenen Leserasters (ORF) eines synaptischen Aktivierungsproteins, das von der Ratte stammt (SEQ ID NO: 1);
2 zeigt die hergeleitete Aminosäuresequenz der Ratte („Homer"; SEQ ID NO: 2) und vergleicht Aminosäuresequenzen, die von ESTs synaptischer Aktivierungsproteine des Menschen (SEQ ID NO: 3) und der Maus (SEQ ID NO: 4) stammen;
3 zeigt ein Computer-erzeugtes Bild eines Northern-Blots von Gesamt-RNA (10 μg) aus Rattengehirn (Hippocampus, Cortex) und anderen angegebenen Organen, wobei eine rasche und vorübergehende Induktion des (etwa) 6,5 kb großen mGluR-Bindungsproteins im Hippocampus und Cortex durch Anfälle zu sehen ist;
4 zeigt ein Computer-erzeugtes Bild einer Immunblot-Analyse der vollständigen Bindungsproteine, die in HEK-293-Zellen als ein 28-kDa-Protein (Bahn „Homer") und als eine 28/29-kDa-Doppelbande im Hippocampus von Anfallstimulierten Ratten exprimiert werden, hierauf wird durch den Pfeil hingewiesen;
5 zeigt ein Computer-erzeugtes Bild eines Immunblots von mGluR5 (140-kDa-Bande), exprimiert in HEK-293-Zellen (Bahn 2), im Vergleich zu Zellen, die mit dem Vektor alleine transfiziert waren (Bahn 1), von eluierten Fraktionen aus einer GST-Affinitätssäule (Bahn 4) und eluierten Fraktionen aus einer GST-Homer-Affinitätssäule (Bahn 5), wobei auf beide Säulen Hippocampus-Extrakte aufgetragen wurden (Bahn 3), wodurch deutlich gemacht wird, dass das eluierte Homer-Protein an mGluR5 bindet;
6 zeigt ein Computer-erzeugtes Bild eines Immunblots, wobei die Immunfällung von mGluR5 aus Hippocampus-Lysat (Bahn 1) durch Präimmunserum (Bahn 2), Anti-Homer-Protein-Antiserum (Bahn 3) und vorher absorbiertes Anti-Homer-Serum (Bahn 4) gezeigt wird, wodurch deutlich gemacht wird, dass das Homer-Protein und mGluR5 in vivo interagieren;
7A und 7B zeigen Computer-erzeugte Bilder einer Immunfärbung von Parietal-Cortex-Gewebe der Ratte unter Verwendung von Anti-Homer-Antiserum (7A) und Anti-mGluR5-Antiserum (7B) bei einer 100× Vergrößerung;
7C bis 7F zeigen die Homer-Protein-Immunreaktivität im Cortex erwachsener Ratten, nachgewiesen durch das Peroxidase-Verfahren, Kontrolle (C) und vier Stunden nach einem Anfall (D), wobei die Immunfärbung durch Anfall induziert und in Pyramidenzellen der Schichten II/III und V angereichert ist (Vergrößerung: 100×); (E) macht deutlich, dass eine Immunreaktivität entlang der dendritischen Schäfte (Pfeile) und in den Zellkörpern, nicht jedoch im Kern vorliegt (Pfeilspitze; Vergrößerung: 600×); distale Dendriten weisen Dorn-artige Profile auf (F, Vergrößerung: 1000×);
8A und 8B zeigen eine doppelte Immunfluoreszenz-Lokalisation von AMPA-Typ-Glutamatrezeptor, GluR1, und Homer in Neuronen einer primären Hippocampus-Kultur (Vergrößerung: 600×); wobei die Pfeile auf das punktförmige Muster der Homer-Färbung hindeuten, die an den gleichen Stellen wie bei GluR1 auftritt, wodurch deutlich gemacht wird, dass das Homer-Protein zielgerichtet zu exzitatorischen Synapsen hinsteuert;
9 (A bis E) zeigen die zehn C-terminalen Aminosäuren der metabotropen Glutamatrezeptoren mGluR1α (9A), mGluR2 (9B; SEQ ID NO: 6), mGluR3 (9C; SEQ ID NO: 7), mGluR4 (9D; SEQ ID NO: 8) und mGluR5 (9E; SEQ ID NO: 9);
10A bis 10D zeigen Computer-erzeugte Bilder einer Immunblot-Analyse der Homer-Protein-in vitro-Bindung der metabotropen Glutamatrezeptoren mGluR1 (10A), mGluR2 (10B), mGluR3 (10C), mGluR5 und eines verkürzten mGluR5 (10D) an das Homer-Protein, wodurch eine selektive Bindung des Homer-Proteins an mGluR1a und mGluR5 deutlich gemacht wird;
10E und 10F zeigen die Ergebnisse einer Immunblotanalyse von in vitro-Bindungstests, die durchgeführt wurden, um Deletionskonstrukte von GST-Homer auf eine Bindung an den myc-markierten mGluR5-C-Terminus (195 As) zu testen, exprimiert in HEK-293-Zellen, wobei an den Bahnen jeweils der Anteil des exprimierten Homer-Proteins angegeben ist, dabei wurde der in 10E dargestellte Immunblot auf myc immungeblottet und zeigt die Bindung von mGluR5 an das vollständige Homer-Protein (1 bis 186) und an das Fragment 1 bis 131, nicht jedoch an das Fragment 109 bis 186, und das in 10F dargestellte Bild stellt eine Coomassie-Färbung von Homer-Deletionskonstrukten dar;
11 zeigt ein Computer-erzeugtes Bild eines Northern-Blot (10 μg Gesamt-RNA), der einen postnatalen Anstieg in der Homer-mRNA im Vorderhirn der Ratte deutlich macht;
12 (A bis F) zeigen Computer-erzeugte Bilder von Koronarschnitten, die von im Dunkeln aufgezogenen Rattenjungen hergestellt wurden, die entweder im Dunkeln (12B, 12C) getötet wurden oder die getötet wurden, nachdem sie 30 Minuten dem Raumlicht ausgesetzt worden waren (12A, 12F), im Vergleich zu im Alter übereinstimmenden Kontrollratten, die unter Bedingungen der normalen Tagesperiodizität aufgezogen worden waren (12D, 12E), wobei sie einer in situ-Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Antisense-RNA-Sonde unterworfen wurden, die für die 3'-nicht-translatierte Region von Homer spezifisch ist;
13 zeigt ein Computer-erzeugtes Bild eines in situ-Hybridisierungsexperiments, das die Wirkung einer vor dem Töten erfolgte, monokulären Injektion von Tetrodotoxin (TTX) in das Auge von Ratten deutlich macht;
14 zeigt ein Computer-erzeugtes Bild, das ein in situ-Hybridisierungsexperiment darstellt, welches die Induktion von Homer-mRNA in Assoziation mit einer langfristigen Potenzierung („long term potentiation", LTP) deutlich macht, wobei der Pfeil auf die induzierte Expression von Homer-RNA in Hippocampus-Körnerzellen nach einem synaptischen Stimulus, der eine LTP produzierte, hindeutet;
15 zeigt ein Computer-erzeugtes Bild, das ein in situ-Hybridisierungsexperiment darstellt, welches die Induktion von Homer im Striatum durch die zwei Stunden vor dem Töten erfolgte, intraperitoneale Verabreichung von Kokain (10 mg/kg) deutlich macht.
Genaue Beschreibung der Erfindung
1. Definitionen
Der hier verwendete Begriff „Polynucleotid" bezieht sich auf ein polymeres Molekül, das ein Grundgerüst besitzt, das Basen trägt, die zur Wasserstoffbindung an typische Polynucleotide in der Lage sind, wobei das Polymer-Grundgerüst die Basen in einer Weise präsentiert, dass eine solche Wasserstoffbindung in einer Sequenz-spezifischen Art und Weise zwischen dem polymeren Molekül und einem typischen Polynucleotid (z.B. einer einzelsträngigen DNA) möglich ist. Solche Basen sind typischerweise Inosin, Adenosin, Guanosin, Cytosin, Uracil und Thymidin. Polymere Moleküle umfassen doppel- und einzelsträngige RNA und DNA sowie Grundgerüst-Modifikationen davon, z.B. Methylphosphonat-Verknüpfungen.
Der Begriff „Vektor" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die neue Nucleinsäuren aufnehmen und diese neuen Sequenzen in einem geeigneten Wirt vermehren kann. Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf rekombinante Plasmide und Viren. Der Vektor (z.B. ein Plasmid oder ein rekombinantes Virus), welcher die Nucleinsäure der Erfindung umfasst, kann in einem Träger, z.B. einem Plasmid, komplexiert an ein Protein, einem Plasmid, komplexiert mit Lipid-basierten Nucleinsäure-Transduktionssystemen, oder in anderen nicht-viralen Trägersystemen vorliegen.
Der hier verwendete Begriff „Polypeptid" bezieht sich auf eine Verbindung, die aus einer Einzelkette von Aminosäureresten besteht, die durch Peptidbindungen verbunden sind. Der Begriff „Protein" kann synonym zu dem Begriff „Polypeptid" sein, oder er kann sich zusätzlich noch auf einen Komplex von zwei oder mehreren Polypeptiden beziehen.
Die hier verwendeten Begriffe „wesentliche Homologie" oder „wesentliche Identität" und andere grammatikalische Formen davon beziehen sich auf die Übereinstimmung einer Aminosäuresequenz mit einer anderen Aminosäuresequenz oder einer Polynucleotidsequenz mit einer anderen Polynucleotidsequenz von mindestens 70 % oder vorzugsweise von mindestens 80 %, wenn solche Sequenzen so ausgerichtet werden, dass sie am besten übereinstimmen („Alignment"). Im Fall von Nucleotidsequenzen bedeuten die Begriffe auch, dass die in Frage kommende Nucleotidsequenz in einem Screening-Test durch eine Hybridisierungssonde, die von der als SEQ ID NO: 1 definierten Nucleotidsequenz (Homer-codierenden Sequenz) stammt, unter Bedingungen mittlerer Stringenz nachgewiesen werden kann (Ausubel).
Ein „Ausrichten" („Alignment") bezieht sich auf das Arrangieren von zwei oder mehreren Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenzen in einer Weise, dass Bereiche der Sequenzen, die gemeinsame Eigenschaften besitzen, aneinander ausgerichtet werden. Das Ausmaß der Verwandtschaft oder Homologie zwischen den Sequenzen wird durch Computer oder Statistik aufgrund von Gewichtungen vorausgesagt, die den zwischen den Sequenzen ausgerichteten Elementen zugeordnet werden.
Eine prozentuale (%) Identität, mit Bezug auf zwei Aminosäuresequenzen, bedeutet den prozentualen Anteil von Resten, die in den zwei Sequenzen identisch sind, wenn die Sequenzen optimal ausgerichtet sind. Ein optimales Ausrichten ist als ein Ausrichten definiert, bei dem der höchste Wert der prozentualen Identität erreicht wird. Solche Alignments können anhand des Programms „GENEWORKS" durchgeführt werden. Andererseits können Alignments auch unter Verwendung des lokalen Alignment Programms LALIGN mit einem ktup von 1, Standardparametern und dem Standard-PAM erfolgen. Wenn im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung festgestellt wird, dass ein Protein oder eine Nucleinsäure eine Identität von 80 % mit einer bestimmten Sequenz aufweist, dann ist gemeint, dass sich dies auf die gesamte Sequenz des längeren der zwei Proteine bezieht. Somit soll z.B. das hergeleitete Translationsprodukt eines EST, das zu der vollständigen SEQ ID NO: 2 auf der Länge des EST-Produkts identisch ist, wobei das EST-Produkt jedoch lediglich 25 % der Länge der vollständigen Sequenz ausmacht, nicht unter eine beanspruchte Sequenz fallen, die so definiert ist, dass sie eine Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 2 von 80 % oder mehr aufweist.
Der Begriff „PDZ-ähnliche" Bindungsdomäne bezieht sich auf einen Teil eines Polypeptids, der eine oder mehrere Sequenzwiederholungen der Aminosäuren GLGF und vorzugsweise eine davor liegende basische Aminosäure, z.B. ein Arginin, das vorzugsweise von GLGF durch einen bis zehn Reste getrennt ist, enthält.
Der hier verwendete Begriff „metabotroper Glutamatrezeptor" oder „mGluR" bezieht sich auf eine Glutamat-Bindungsstelle, die entweder an Adenylat-Cyclase (AC) oder an Phosphoinositidase C (PI-PLC) funktionell gebunden ist. Mindestens fünf neuronale metabotrope Glutamatrezeptoren wurden identifiziert: mGluR1 und mGluR5 sind an PLC gebunden; mGluR2 und mGluR4 regulieren die AC-Aktivität.
In der Verwendung hier bezieht sich der Begriff „metabotroper Glutamatrezeptor-Bindungsprotein" auf ein Polypeptid, das an einen oder mehrere metabotrope Glutamatrezeptoren bindet, wie durch gemeinsame Immunfällung des Bindungsproteins und des mGluR durch einen Anti-mGluR-Antikörper oder durch eine in vitro-Bindung im Vergleich zu einem nicht-relevanten Kontrollprotein gezeigt wird. Eine typische Bindungsaffinität für diese Wechselwirkung beträgt mindestens etwa 10^–6 M.
Der Begriff „Zentralnervensystem" (ZNS) bezieht sich auf das Gehirn und Rückenmark, umfassend die Cerebrospinalflüssigkeit (CSF).
Der Begriff „Spleißvariante" bezieht sich auf ein Protein, das durch ein gemeinsames Gen codiert ist, das jedoch eine Sequenz aufweist, die aufgrund einer anderen Spleißung der mRNA vor der Translation verändert ist.
Ein „exprimiertes Sequenz-Tag" („expressed sequence tag") oder EST ist ein von einer cDNA-Sequenz hergeleitetes, kurzes (typischerweise 200 bis 300 bp) Segment, dessen Sequenz einmalig ist, wie durch die Fähigkeit gezeigt wird, in einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung spezifischer Primer selektiv amplifiziert zu werden. ESTs stellen im Allgemeinen keine vollständigen Sequenzen dar.
Aminosäurereste werden hier durch ihre herkömmlichen Ein-Buchstaben-Bezeichnungen angegeben: A, Alanin; C, Cystein; D, Asparaginsäure; E, Glutaminsäure; F, Phenylalanin; G, Glycin; N, Histidin; I, Isoleucin; K, Lysin; L, Leucin; M, Methionin; N, Asparagin; P, Prolin; Q, Glutamin; R, Arginin; S, Serin; T, Threonin; V, Valin; W, Tryptophan; X, Hydroxyprolin; Y, Tyrosin.
II. Isolierung von Bindungsproteinen
Es ist die Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass die Aktivierung einer exzitatorischen synaptischen Aktivität im Gehirn zu einer erhöhten Expression einer neuen Familie von Proteinen führt, die hier als „synaptische Aktivierungsproteine" bezeichnet werden und die beispielhaft durch das hier als „Homer" bezeichnete Rattenprotein dargestellt sind. Dieses Protein definiert zusammen mit seinen Spleißvarianten und seinen Homologen aus anderen Arten die neue Familie von synaptischen Aktivierungsproteinen, die an bestimmte physiologische Effektoren (z.B. Rezeptoren, lonenkanäle, Transportproteine, Enzyme) im Zentralnervensystem binden und ihre Aktivität beeinflussen.
1. Isolierung von codierenden Nucleotidseauenzen für synaptische Aktivierungsproteine
a. Identifizierung einer codierenden Sequenz:
Als Beispiel wurde das hier als Ratten-Homer-Protein bezeichnete Rattenprotein anfangs durch ein differenzielles Screening auf der Basis seiner raschen Induktion der Expression während der exzitatorischen synaptischen Aktivität im Hippocampus und Cortex identifiziert. Weitere synaptische Aktivierungsproteine können durch dieses Verfahren oder durch die im nachstehenden Abschnitt 2 beschriebenen Homologie-Screening-Verfahren identifiziert werden.
In Beispiel 1 finden sich die Einzelheiten des Verfahrens eines differenziellen Screenings, das zum Identifizieren des Homer-Proteins der Ratte eingesetzt wurde. Kurz gesagt wurde Poly(A)⁺-RNA aus den Gehirnen von Tieren mit aktiven Anfällen extrahiert und zum Herstellen von cDNA verwendet. Diese stimulierte cDNA wurde mit einem Überschuss an RNA aus den Gehirnen von nicht-stimulierten Kontrolltieren hybridisiert. Anschließend wurde die aus der subtrahierten mRNA hergestellte cDNA eingesetzt, um eine Bank zu konstruieren, aus der das Homer-Protein der Ratte identifiziert wurde. Wie hier beschrieben hat dieses Protein bestimmte Sequenzmerkmale und Bindungseigenschaften, anhand derer eine Familie von synaptischen Bindungs- oder Aktivierungsproteinen definiert wird.
In einem differenziellen Screening-Verfahren wurden insgesamt 16 neue, unabhängige Clone identifiziert, bei denen sich zeigte, dass sie im stimulierten Ratten-Hippocampus höhere Spiegel aufwiesen als im Kontroll-Ratten-Hippocampus. Die differenzielle mRNA-Expression wurde durch eine herkömmliche Northern-Analyse bestätigt. Das Homer-Protein der Ratte wurde als Translationsprodukt von einem dieser differenziell exprimierten Clone hergestellt. Die Northern-Analyse zeigte, dass die Homer-mRNA eine Länge von etwa 6,5 kB aufweist. Mehrere vollständige cDNAs des Homer-Proteins der Ratte wurden durch Screening einer Phagenbank (λ Zap II) identifiziert, die insbesondere so hergestellt wurde, dass sie große cDNAs enthält. Beide Stränge von zwei unabhängigen Clonen wurden sequenziert und ein offenes Leseraster (ORF) von 558 Nucleotiden identifiziert. Das ORF wurde bestätigt, indem die Größe des Proteinprodukts, das durch in vitro-Transkription und Translation einer in vitro-mRNA, hergestellt aus den mutmaßlichen vollständigen Clonen, erzeugt worden war, analysiert wurde und das Ergebnis mit dem Protein verglichen wurde, das mit einer mRNA aus Clonen hergestellt worden war, denen das Start-Methionin fehlte. Außerdem wurde das ORF bestätigt, indem polyclonale Kaninchen-Antiseren gegen entweder ein bakterielles Fusionsprotein des vollständigen Homer oder gegen ein synthetisches Peptid hergestellt wurden, welches den C-Terminus des Homer-Proteins darstellte. Diese Antiseren wurden eingesetzt, um das Vorliegen eines Proteins mit geeigneter Größe im Gehirn zu bestätigen, das nach maximalen Elektro-Krampfanfälle („maximal electroconvulsive seizures", MECS) rasch induziert wird.
Die codierende Nucleotidsequenz des Homer-Proteins, isoliert aus dem Gehirn von Ratten, ist in 1 als SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die codierende Sequenz hat ein offenes Leseraster (ORF) von 558 Nucleotiden (1A, SEQ ID NO: 1). Wie vorstehend erwähnt, codiert eine von dieser DNA hergeleitete 6,5-kb-mRNA ein aus 186 Aminosäuren bestehendes Protein (2A, SEQ ID NO: 2). Eine lange 3'-UTR (GENBANK Hinterlegungsnummer: U92079) codiert mehrere AUUUA-Wiederholungseinheiten, wie sie mit der mRNA-Destabilisierung von unmittelbaren frühen Genen („immediate early genes", IEG) in Zusammenhang gebracht wurden. Aus der Aminosäuresequenz lässt sich ein löslichen Protein voraussagen, das eine einzelne GLGF-Sequenz und ein davor liegendes Arginin, eine sogenannte „PDZ-ähnliche Domäne", enthält (2), für die man aufgrund ihrer Charakterisierung in unterschiedlichen, nicht verwandten Proteinen, z.B. PSD-95, voraussagen kann, dass sie bestimmte Bindungseigenschaften besitzt. Ansonsten ist die Homer-Proteinsequenz neu und nicht aus kürzeren Sequenzen, z.B. ESTs, voraussagbar. Die Aminosäuresequenz-Identität zwischen Ratten-Homer und beschriebenen Mitgliedern der PDZ-Familie liegt unter 10 % (Doyle et al., 1996).
Exprimierte Sequenz-Tags (ESTs) von Mensch (Z17805) und Maus (AA166092 und AA013888) wurden identifiziert, die zu 84 % und 72 % zu Regionen der codierenden ORF-Sequenzen für das Homer-Protein identisch sind (2; Mensch, SEQ ID NO: 3, und Maus, SEQ ID NO: 4). Die Translation der ESTs macht deutlich, dass die Aminosäuresequenzen der Maus- und Mensch-ESTs in ihrer begrenzten überlappenden Region miteinander identisch sind, dass sich jedoch die ESTs der Maus von dem Homer-Protein der Ratte in dieser Region unterscheiden, dies legt nahe, dass die ESTs Homologe von weiteren Familienmitgliedern darstellen. Aufgrund der vorliegenden Entdeckung des Ratten-Homer können die Proteinsequenzen von Mensch und Maus so erweitert werden, dass sie die Rattensequenz und/oder konservative Substitutionen davon wie hier beschrieben enthalten. Solche erweitere Sequenzen liegen dann innerhalb der Definition eines Mitglieds der Familie der synaptischen Aktivierungsproteine, wie hier definiert.
Weitere Mitglieder der Familie der synaptischen Aktivierungsproteine können identifiziert werden, indem ein differenzielles Screening-Protokoll, ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben, zusammen mit Sonden, die auf den hier beschriebenen Sequenzen beruhen, gemäß Verfahren verwendet wird, die dem Fachmann bekannt sind. Alternativ oder zusätzlich werden solche Proteine identifiziert durch (i) eine wesentliche Homologie auf Ebene der Nucleotid- oder Proteinsequenz zu der Ratten-Homer-codierenden Sequenz oder zu dem Ratten-Homer-Protein, (ii) die Fähigkeit, an Effektor-Proteine im ZNS, z.B. metabotrope Glutamatrezeptoren, zu binden und ihre Aktivität zu beeinflussen, (iii) die Bindungsspezifität für eine bestimmte Bindungssequenz, und (iv) das Vorliegen einer Homer-PDZ-ähnlichen Domäne in der Sequenz. Wie durch seine differenzielle Expression in einem stimulierten Rattengehirn wie vorstehend diskutiert angedeutet wird und wie nachstehend noch weiter beschrieben wird, wird die Expression des Gens durch eine exzitatorische synaptische Aktivität stimuliert. Diese Merkmale von synaptischen Aktivierungsproteinen werden in den folgenden Abschnitten beschrieben.
b. Identifizierung von Homologen von synaptischen Aktivierungsproteinen:
Anhand der vorliegenden Beschreibung der codierenden Sequenz und der Polypeptidsequenz des Ratten-Homer können weitere Mitglieder der Homer-Polypeptid-Familie mit einer wesentlichen Homologie zu dem Homer durch eines oder mehrere der Verfahren identifiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind und nachstehend diskutiert werden.
Z.B. werden die Familienmitglieder unter Venrwendung von Nucleotidsonden, die von SEQ ID NO: 1 hergeleitet sind, durch Durchmusterung geeigneter Banken identifiziert. Insbesondere können Hybridisierungssonden, die von Nt. 558 bis Nt. 1127 der fast vollständigen cDNA hergeleitet sind, mitgeteilt an Genbank (Hinterlegungsnummer: U92079), auf im Handel verfügbaren DNA-Synthesizern (z.B. Applied Biosystems Modell 381A) anhand herkömmlicher Techniken synthetisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind (Ausubel et al., 1992). Eine besonders gut geeignete Bank ist eine ZNS- oder Gehirn-Bank, z.B. die menschlichen Gehirn-Banken, die im Handel von Stratagene (La Jolla, CA) und InVitrogen (San Diego, CA) verfügbar sind. Die Sonde wird typischerweise bei 65°C hybridisiert und bei 55°C gewaschen (Durchmusterung bei mittlerer Stringenz). Die durch dieses Verfahren identifizierten Clone werden isoliert und ihre codierenden Sequenzen bestimmt, wobei Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Clone werden weiter selektiert, wenn ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen mindestens eine Region der Homer-PDZ-ähnlichen Domäne wie vorstehend beschrieben enthalten.
Die weitere Charakterisierung der selektierten Clone wird durchgeführt, indem die isolierten codierenden Regionen in Vektoren eingefügt werden, so dass sie in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert werden können, z.B. in einem oder mehreren der in Beispiel 3 beschriebenen Systeme oder in anderen geeigneten Systemen, die dem Fachmann bekannt sind. Anschließend werden translatierte Produkte isoliert, z.B. durch die in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, und auf die Fähigkeit, an spezifische Zielproteine im ZNS zu binden, und auf die Bindungsspezifität für eine bestimmte Peptid-Bindungssequenz getestet, z.B. die Sequenz SSTL oder SSSL, wie im nachstehenden Abschnitt III.C diskutiert.
Weiterhin ist es so zu verstehen, dass unter Verwendung der Proteinsequenzen, die als SEQ ID NO: 2 (Ratten-Homer), SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 dargestellt sind, wie in den 2 (A bis C) zu sehen ist, als Matrizen weitere Familienmitglieder identifiziert werden können, und zwar aufgrund (i) einer Sequenzvariation zwischen und unter den Polypeptiden und (ii) einer konservativen Substitution von Aminosäuren innerhalb der Sequenzen.
Somit ist es offensichtlich, wenn man die N-terminale Region der Polypeptide in Betracht zieht, wie in 2 dargestellt, dass die ersten 30 Aminosäuren bei den drei Sequenzen gleich sind. Jedoch unterscheiden sich die Positionen 31 bis 34. Die Rattensequenz stellt AVTV dar, während die Proteine von Mensch und Maus die gemeinsame Sequenz GHRF aufweisen. Aus dieser Variation kann man Polypeptide konstruieren, bei denen die Positionen 31 bis 34 die variablen Sequenzen A/G V/H T/R V/F aufweisen. Weitere Regionen mit Variabilität ergeben sich bei der Untersuchung der ausgerichteten Sequenzen. Bestimmte Regionen des Ratten-Homer-Proteins wurden im Zusammenhang mit seiner Funktion als signifikant identifiziert. Z.B. kann die PDZ-ähnliche Domäne, die Sequenz GLGF und das davor liegende Arginin an den Positionen 87 bis 90 bzw. 81, eine „Bindungstasche" bilden, die auf der bekannten Bindungstasche des synaptischen Bindungsproteins PSD95 beruht (Kornau et al., 1995). Gemäß den vorstehend bezüglich einer Substitution gemachten Angaben ist diese Region bei den drei beispielhaften synaptischen Aktivierungsproteinen gleich und sollte somit in beliebigen, von diesen Proteinen hergeleiteten Sequenzen konserviert bleiben.
Eine weitere Substitution an den identifizierten variablen Positionen kann anhand von konservativen Aminosäuresubstitutionen durchgeführt werden. D.h., wenn die zwei oder mehr der möglichen Aminosäuren an einer variablen Position in einer gemeinsamen Substitutionsklasse liegen, bleiben die Konformation und die Funktion des Polypeptids bei einer Substitution an dieser Position durch eine Aminosäure innerhalb dieser Klasse möglicherweise erhalten. Herkömmliche Substitutionsklassen, die in dieser Analyse eingesetzt werden können, sind die sechs Klassen, die auf gemeinsamen Eigenschaften von Seitenketten und auf den höchsten Substitutionshäufigkeiten in homologen Proteinen in der Natur beruhen, wie z.B. durch eine herkömmliche Dayhoff-Austauschhäufigkeits-Matrix („standard Dayhoff frequency exchange matrix") bestimmt wurde (Dayhoff, 1972). Die Klassen sind Klasse I: C; Klasse II: S, T, P, X, A und G, welche kleine aliphatischen Seitenketten und OH-Gruppe-Seitenketten darstellen; Klasse III, N, Q, D und C, welche neurale und negativ geladene Seitenketten darstellen, die zur Bindung von Wasserstoffbindungen in der Lage sind; Klasse IV: H, R und K, welche basische polare Seitenketten darstellen; Klasse V: I, V und L, welche verzweigte aliphatische Seitenketten darstellen, und Met; und Klasse VI: F, Y und W, welche aromatische Seitenketten darstellen. Außerdem kann jede Gruppe verwandte Aminosäureanaloga umfassen, z.B. Ornithin, Homoarginin, N-Methyllysin, Dimethyllysin oder Trimethyllysin in Klasse IV, und Cyclohexylalanin oder ein halogeniertes Tyrosin in Gruppe VI. Weiterhin können die Klassen sowohl L- als auch D-Stereoisomere einschließen, wobei jedoch L-Aminosäuren für Substitutionen bevorzugt sind.
Polypeptidsequenzen, die gemäß den vorstehenden Angaben entworfen werden, können z.B. durch eine rekombinante Expression hergestellt werden. Das ausgewählte ORF wird als eine Fusion mit Glutathion-S-Transferase (GST) cloniert und in Bakterien exprimiert. Andererseits kann das ORF in einen Säuger-Expressionsvektor cloniert und in Säugerzellen exprimiert werden, wobei Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
c. Herstellung von Oligonucleotiden/Vektoren von synaptischen Aktivierungsproteinen:
Aufgrund der durch die vorstehenden Analyse aufgeklärten Proteinsequenzen können Nucleotide entworfen werden, die synaptische Aktivierungsproteine codieren, wobei Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Wie nachstehend beschrieben, wird bei einem solchen Entwurf möglicherweise auch der Typ von Zellen berücksichtigt werden, in denen das Protein exprimiert werden soll.
Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können gentechnisch verändert werden, so dass die Protein-codierenden Sequenz geändert wird, dies kann mehrere Gründe haben, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Änderungen, welche die Clonierung, Prozessierung und/oder Expression des Genprodukts modifizieren. Z.B. können Änderungen anhand von Verfahren eingeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind, z.B. durch eine positionsgerichtete Mutagenese, um neue Restriktionsstellen einzuführen, die Glykosylierungsmuster zu verändern, die Codonpräferenz zu verändern, Spleißvarianten zu erzeugen usw.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung rekombinante Konstrukte, die eine oder mehrere der vorstehend ausführlich beschriebenen Sequenzen enthalten. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, z.B. ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung in Vorwärts- oder Rückwärts-Orientierung eingefügt wurde. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Ausführungsform umfasst das Konstrukt weiterhin regulatorische Sequenzen, einschließlich z.B. eines Promotors, die mit der Sequenz funktionell verbunden sind. Zahlreiche geeignete Vektoren und Promotoren sind dem Fachmann bekannt und kommerziell erhältlich. Außerdem sind geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren, die bei prokaryotischen und eukaryotischen Wirten eingesetzt werden können, in Sambrook et al., 1989, beschrieben.
Wie in Beispiel 2 ausführlich beschrieben, wurde ein Säuger-Expressionskonstrukt des vollständigen Ratten-Homer-Proteins hergestellt, indem das 5'-EcoRI-Fragment (1,6 kb) in den Säuger-Expressionsvektor pRK5 cloniert wurde. Der Vektor wurde sodann für die Transfektion von eukaryotischen Zellen eines Säugers (menschliche embryonale Nierenzellen; HEV-293-Zellen) eingesetzt.
Andere Vektoren können für die Transfektion anderer Zelltypen verwendet werden. Z.B. wurde für die Expression eines Fusionsproteins, welches das an GST fusionierte Ratten-Homer-Polypeptid enthält, das Homer-ORF in die bakteriellen Vektoren pGEX cloniert. Für die Expression in einem Hefesystem wurde das Homer-ORF in pPC86 cloniert.
2. Produktion von synaptischen Aktivierungsproteinen
a. Expression von synaptischen Aktivierungsproteinen:
Synaptische Aktivierungsproteine können durch verschiedene Verfahren, die für die Expression von Proteinen verfügbar sind, rekombinant erzeugt werden. Z.B. werden in Beispiel 3 Verfahren bereitgestellt, die für die Expression des Ratten-Homer-Proteins in einem zellfreien Transkriptions-/Translationssystem verwendet wurden.
Für eine Produktion in größerem Maßstab kann die Expression des Homer-Proteins und von Homologen von Mitgliedern der Familie der synaptischen Aktivierungsproteine in verschiedenen zellulären Expressionssystemen durchgeführt werden. Mögliche Wirtszellen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen. Es ist so zu verstehen, dass die Expression in einem bestimmten System optimiert werden kann, indem Codons auf einen bestimmten Zelltyp, in dem die Expression erfolgen soll, maßgeschneidert werden. Somit sollen die in der vorliegenden Erfindung enthaltenen Polynucleotide auch Polynucleotide umfassen, welche das Protein von Interesse codieren und die entsprechend für eine optimale Expression in einem bestimmten Expressionssystem modifiziert sind, ohne dass auf die Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 1 insgesamt Rücksicht genommen wird. Ein solches Entwerten („Designing") kann anhand von Codonverwendung- oder Codonpräferenz-Tabellen erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Wie in 5 dargestellt, wurde mGluR5 in HEK-293-Zellen exprimiert (Bahn 2), und zum Vergleich dienten Zellen, die mit dem Vektor alleine transfiziert worden waren (Bahn 1). Hier wandert mGluR5 als eine etwa 140 kDa Hauptbande mit einem sekundären mutmaßlichen Spaltfragment von 50 kDa. In Extrakten von Hippocampus (Bahn 3) erscheint die obere Bande (mit höherem Molekulargewicht) als eine Doppelbande. In diesen Experimenten wurden Hippocampus-Extrakte außerdem über Affigel-Gel-Säulen laufen gelassen, die entweder GST oder GST-Homer-Fusionsprotein enthielten, und mit SDS-Auftragepuffer eluiert (Bahnen 4 und 5). Ein positives Immunblotting mit Anti-GluR5-Antikörper macht die Assoziation des Ratten-Homer-Proteins mit dem mGluR5-Rezeptor im Extrakt deutlich.
b. Reinigung des Ratten-Homer-Proteins aus Zellextrakten:
Das Homer-Protein und seine Analoga können aus Zellextrakten anhand von herkömmlichen präparativen Verfahren gereinigt werden. Eine endgültige Reinigung kann durch verschiedene Standardverfahren durchgeführt werden, umfassend eine Reinigung über Immunaffinitäts-Säule unter Verwendung von Antikörpern, die gegen das Homer-Protein oder Fragmente davon induziert wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben.
3. Gewebelokalisation von synaptischen Aktivierungsproteinen
In Experimenten, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde bestimmt, dass die Expression von synaptischen Aktivierungsproteinen im Zentralnervensystem stark erhöht ist. Wie z.B. mit den in 3 dargestellten Ergebnissen gezeigt wird, wurde mRNA von Ratten-Homer fast ausschließlich im Gewebe des Zentralnervensystems gefunden.
Weiterhin wird die Expression der Homer-mRNA im Hippocampus durch eine Anfall-induzierte neuronale Aktivierung stark nach oben reguliert. Die Peak-mRNA- Expression im Hippocampus erfolgt innerhalb von einer Stunde nach dem Anfall (3). Das Homer-Protein ist in Extrakten des Hippocampus angereichert und wandert als eine Doppelbande mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 28/29 kDa (3), die durch einen Anfall rasch induziert wird.
Beispiel 6 stellt beispielhafte Verfahren bereit, die zum Messen der Expressionsraten des Homer-Proteins eingesetzt werden können. Anatomische und zelluläre Muster der Expression des Ratten-Homer-Proteins wurden durch immunhistochemische Analysen untersucht, die am Gehirn der erwachsenen Ratte durchgeführt wurden. Die Immunfärbung des Homer-Proteins im Cortex nahm, übereinstimmend mit seiner Regulation als ein IEG, vier Stunden nach einem Anfall deutlich zu (4).
III. Zelluläre Bindungseigenschaften von synaptischen Aktivierungsproteinen
Gemäß einem wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung binden Mitglieder der Familie der synaptischen Aktivierungsproteine spezifisch an Rezeptoren des Zentralnervensystems oder Bindungspartner und modifizieren die Funktion solcher Proteine. Als Beispiel, und wie nachstehend diskutiert, bindet das Ratten-Homer-Protein an zwei Subtypen des metabotropen Glutamatrezeptors (mGluR), die im Zentralnervensystem gefunden werden, nämlich mGluR1α und mGluR5.
Weitere Bindungspartner des Zentralnervensystems für spezifische synaptische Aktivierungs-Bindungsproteine, die wie im vorstehenden Abschnitt II beschrieben identifiziert wurden, können anhand der im nachstehenden Abschnitt A beschriebenen Verfahren identifiziert werden. In den Abschnitten B und C werden Verfahren beschrieben, anhand derer die Wechselwirkung eines spezifischen synaptischen Aktivierungs-Bindungsproteins mit seinem (seinen) zellulären Bindungsparter(n) charakterisiert wird.
1. Identifizierung von zellulären Bindungsstellen für synaptische Aktivierungsproteine im Zentralnervensystem
Bindungsstellen der synaptischen Aktivierungsproteine im Gewebe des Zentralnervensystems können anhand eines Zwei-Hybridprotein-Wechselwirkungs-Tests identifiziert werden (Ausubel et al., 1992). Dieses Testverfahren stellt eine einfache und empfindliche Methode bereit, mit der die Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen in lebenden Zellen nachgewiesen werden können. Ein solcher Test, der in Beispiel 5 beschrieben wird, wurde eingesetzt, um die funktionellen Bindungspartner für das Ratten-Homer-Protein zu identifizieren. Entsprechende Tests werden verwendet, um die zellulären Bindungsstellen der Maus- und Mensch- Proteine und anderer homologer Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung zu bestimmen.
Das Zwei-Hybrid-Screeningsystem beruht auf der Feststellung, dass eine Protein-Protein-Wechselwirkung nachgewiesen werden kann, wenn zwei möglicherweise interagierende Proteine als Fusionen oder Chimäre exprimiert werden. Ein erstes Fusionsprotein enthält das eine Protein von einem Paar von interagierenden Proteinen, das an eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist, und ein zweites Fusionsprotein enthält das andere Protein von einem Paar von interagierenden Proteinen, das an eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne fusioniert ist. Die zwei Fusionsproteine werden in der gleichen Zelle unabhängig voneinander exprimiert, und die Wechselwirkung zwischen den „interagierenden Protein"-Teilen der Fusionen stellen die Funktion des Transkriptions-Aktivierungsfaktors wieder her, der durch Aktivierung der Transkription eines Reportergens nachgewiesen wird. Bei Verwendung in der vorliegenden Erfindung enthält das erste Fusionsprotein das synaptische Aktivierungs-Bindungsprotein. Das zweite Fusionsprotein enthält ein bestimmtes Protein von einer exprimierten Bank von Zentralnervensystemspezifischen Proteinen, wie nachstehend beschrieben.
Es gibt mehrere mögliche Konfigurationen des Zwei-Hybrid-Screeningtests, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können (Ausubel et al., 1992). In einer davon, einem Hefe-GAL4-Zwei-Hybrid-System, werden Protein-Protein-Wechselwirkungen aufgrund der Wiederherstellung der Funktion von GAL4, einem Transkriptions-Aktivator aus Hefe, durch Aktivierung eines GAL1-lacZ-Reportergens nachgewiesen. Wie mehrere andere Transkriptions-Aktivierungsfaktoren enthält GAL4 zwei getrennte Domänen, eine DNA-Bindungsdomäne und eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne. Jede Domäne kann unabhängig voneinander als ein Teil eines Fusionsproteins exprimiert werden, das aus der Domäne und einem zweiten interagierenden „Köder"-Protein zusammengesetzt ist. Die zwei Fusionsproteine werden sodann unabhängig voneinander in einer Zelle zusammen exprimiert. Wenn die zwei GAL4-Domänen durch eine Bindungs-Wechselwirkung zwischen dem „Köder"- und dem „Bindungs"-Protein zusammen gebracht werden, wird die Transkription eines Reportergens unter der transkriptionellen Kontrolle von GAL4 initiiert. Das Reportergen weist typischerweise einen Promotor auf, der GAL4-Protein-Bindungsstellen enthält (GAL-stromaufwärts liegende Aktivierungssequenzen, UAS_G). Beispiele für Reportergene sind die Reportergene GAL1-lacZ und GAL1-HIS3.
In einem zweiten Zwei-Hybrid-System, das ausführlich von Ausubel et al., (1992), beschrieben ist, wird ein natives E. coli-LexA-Repressor-Protein verwendet, das an geeignete Operatoren fest bindet. Ein Plasmid wird verwendet, um ein Protein von einem Paar von interagierenden Proteinen (das „Köder"-Protein, z.B. das Homer-Protein) als eine Fusion mit LexA zu exprimieren. Das Plasmid, welches das LexA-fusionierte Köderprotein exprimiert, wird eingesetzt, um einen Reporterstamm von Hefe, z.B. EGY48, der pSH18-34 enthält, zu transformieren.
In diesem Stamm liegen die Bindungsstellen für LexA stromaufwärts von zwei Reportergenen. Im ersten Reportersystem sind die stromaufwärts liegenden Aktivierungssequenzen des chromosomalen LEU2-Gens – erforderlich im Biosynthese-Stoffwechselweg für (Leu) Leucin – in EGY48 durch lexA-Operatoren ersetzt, so dass eine Selektion auf Lebensfähigkeit möglich wird, wenn die Zellen auf einem Medium ohne Leu plattiert werden. Im zweiten Reportersystem enthält EGY48 ein Plasmid, pSH18-34, das ein lexA-Operator-IacZ-Fusionsgen umfasst, wodurch eine Unterscheidung aufgrund von Farbe möglich wird, wenn die Hefe auf einem Xgal-enthaltenden Medium gezüchtet wird (Ausubel et al., 1992).
Die LexA-Bank verwendet den induzierbaren Hefe-GAL1-Promotor, um Proteine als Fusionen mit einer sauren Domäne („saurer Klecks", „acid blob"), die als ein tragbares Transkriptions-Aktivierungsmotiv funktioniert („act"), und mit anderen geeigneten Einheiten zu exprimieren. Die Expression von Bank-codierten Proteinen wird induziert, indem die Transformanten auf einem Galactose- (Gal-) enthaltenden Medium plattiert werden, so dass Hefezellen, welche Proteine der Bank enthalten, die nicht spezifisch mit dem Köderprotein interagieren, in Abwesenheit von Leu nicht wachsen können. Dagegen bilden Hefezellen, welche Proteine der Bank enthalten, die mit dem Köderprotein interagieren, innerhalb von zwei bis fünf Tagen Kolonien, und die Kolonien werden blau, wenn die Zellen auf einem Xgal-enthaltenden Medium ausgestrichen werden. Die Plasmide werden isoliert und durch eine Reihe von Tests charakterisiert, um die Spezifität der Wechselwirkung mit dem ursprünglichen Köderprotein zu bestätigen. Diejenigen, die sich als spezifisch erwiesen haben, können sodann weiter analysiert werden (z.B. durch Sequenzierung).
In Experimenten, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden und die hier im Beispiel 5 beschrieben sind, wurde das Hefe GAL4-Zwei-Hybrid-System verwendet, um Bindungspartner des Ratten-Homer-Proteins in einer cDNA-Bank des Rattengehirns zu identifizieren (Chevray und Nathans, 1992). Ein PCR-Produkt des vollständigen Homer-ORF mit flankierenden Smal-Stellen wurde in den Hefe-Expressionsvektor pPC97 subcloniert. Eine zufällig geprimte cDNA-Bank („random primed cDNA library") wurde aus einem Anfall-stimulierten Hippocampus der erwachsenen Ratte hergestellt und in den Hefe-Expressionsvektor pPC86 cloniert. Die Bank enthält 2 × 10⁶ unabhängige cDNAs. Insgesamt wurden 1,5 × 10⁶ Clone durchgemustert. Interagierende Proteine wurden identifiziert, indem sie auf Platten, denen Leucin, Tryptophan und Histidin fehlten, selektiert, erneut ausgestrichen und unter Verwendung eine β-Galactosidase-Tests bestätigt wurden.
Eine der in diesem Test identifizierten interagierenden cDNAs codiert die 195 C-terminalen Aminosäuren von mGluR5. Diese Region von mGluR5 ist cytosolisch und wurde mit der Phospholipase C- (PLC-) vermittelten Signalgebung in Neuronen in Verbindung gebracht. Die Bestätigung und die weitere Charakterisierung der Bindung erfolgten wie im nachstehenden Abschnitt B beschrieben.
2. Bindung von synagtischen Aktivierungsproteinen an zelluläre Komponenten
Gemäß der Entdeckung der vorliegenden Erfindung binden synaptische Aktivierungsproteine an zelluläre Komponenten, z.B. solche, die anhand der im vorstehenden Abschnitt A beschriebenen Verfahren identifiziert werden. Nachdem der Kandidat für einen zellulären Bindungspartner bestimmt wurde, kann das synaptische Aktivierungsprotein noch weiter in einem oder mehreren in vitro-Bindungstests wie nachstehend beschrieben auf eine Bindung an den Kandidaten getestet werden.
Z.B. wurde das bakteriell exprimierte GST-Homer-Fusionsprotein auf eine Bindung an natives mGluR5 in Detergensextrakten von Hippocampus in einem in vitro-Bindungstest getestet, der in Beispiel 7A ausführlich beschrieben ist. Wie in 5 dargestellt, bindet mGluR5 an das GST-Homer-Fusionsprotein, nicht jedoch an GST alleine.
Ein weiteres Verfahren, mit dem eine Bindung in vitro festgestellt werden kann, wird durch einen Co-Immunfällungstest bereitgestellt, in dem ein Antikörper, der gegen eines der Proteine gerichtet ist, verwendet wird, um festzustellen, ob die zwei Proteine in Lösung einen Bindungskomplex bilden. 6 zeigt die Ergebnisse von Tests, mit denen die Co-Immunfällung von mGluR5 zusammen mit Homer aus dem Hippocampus gemäß den in Beispiel 7B ausführlich beschriebenen Verfahren getestet wird. Hier wurden Extrakte von Hippocampus entweder mit Präimmunserum, Anti-Homer-Serum oder Anti-Homer-Serum, vorbehandelt mit GST-Homer, immungefällt. Wie dargestellt kommt es zu einer Co-Immunfällung von mGluR5 mit Homer-Antiserum, nicht jedoch mit Präimmunserum. Außerdem wurde eine Co-Immunfällung durch eine vorherige Adsorption von Antiseren mit Homer-Antigen blockiert (Bahn 4), wodurch die Spezifität der Antiseren für das Homer-Protein der Ratte gezeigt wird.
Weiterhin kann das Potential für eine natürliche Wechselwirkung zwischen dem synaptischen Aktivierungsprotein und dem Kandidaten für einen Bindungspartner in situ und durch Immunfärbung von Schnitten von Gehirngewebe mit Antikörpern, die gegen jedes der Proteine gerichtet sind, bestimmt werden. Das Ziel dieser Analyse besteht darin, festzustellen, dass beide Proteine in den gleichen Regionen der Zelle exprimiert werden. Z.B. zeigen die 7A und 7B eine Immunfärbung des Ratten-Homer-Proteins mit Anti-Homer-Antiserum (7A) und die Immunfärbung von mGluR5 mit Anti-mGluR5-Antikörpern (7B) im Parietal-Cortex der erwachsenen Ratte. Aus diesen Experimenten lässt sich feststellen, dass die mGluR5- und die Homer-Immunfärbung beide in apikalen Dendriten von Pyramidenzellen der Lage V angereichert sind. Diese Ergebnisse sprechen vom anatomischen Standpunkt für die in vivo-Wechselwirkung zwischen dem Homer-Protein und mGluR5.
Das anatomische und zeitliche Muster der Homer-Immunfärbung läuft genau parallel zur Expression seiner mRNA, wie im nachstehenden Abschnitt IV beschrieben wird. Pyramidenzellen der Cortex-Lagen II/III und V zeigten die intensivste Immunfärbung, die typischerweise das Soma ausfüllte und sich in apikale Dendriten in einem punktförmigen Muster am Rand des Dendrits entlang ausbreitete (7C). Dorn-artige Profile waren häufig in distalen Dendriten zu sehen (7D). Im Kern lag keine Homer-Immunreaktivität vor. Das punktförmige Muster der Homer-Immunfärbung wurde in Primärkulturen von Neuronen des Hippocampus bestätigt (8A, 8B). Außerdem war Homer deutlich an den gleichen Stellen zu sehen, die auf den Glutamatrezeptor GluR1 immungefärbt wurden, wodurch gezeigt wird, dass Homer an exzitatorischen Synapsen angereichert ist. Das anatomische Muster der Expression von Homer stimmt gut überein mit Berichten über die Immunreaktivität von mGluR5. Die Immunreaktivität von mGluR5 ist in Dendriten von Cortex-Pyramidenzellen und außerdem in zahlreichen anderen Nervenzellenpopulationen, die Homer exprimieren, erhöht, und sie liegt in exzitatorischen Synapsen vor. Die starke gemeinsame Verteilung von Homer-Protein und mGluR5 in den Dendriten von Pyramidenzellen und exzitatorischen Synapsen sprechen zusammen mit der deutlichen Spezifität ihrer physikalischen Wechselwirkung für die Vorstellung, dass diese Proteine physiologische Partner sind. Das Ratten-Homer-Protein wird außerdem in Purkinje-Zellen des Cerebellums stark exprimiert. Diese Zellen exprimieren mGluR1a stark, dies legt eine physiologische Partnerschaft zwischen den zwei Proteintypen in diesen Neuronen nahe.
Die vorstehend mit Bezug auf das Ratten-Homer-Protein beschriebenen Studien dienen als Beispiel für die Arten von Experimenten, die an Kandidaten für Mitglieder der Familie der synaptischen Aktivierungsproteine durchgeführt werden können, um ihre Zugehörigkeit zu der Familie zu verifizieren. Nach der Identifizierung des bestimmten Bindungspartner-Proteins, an welches das synaptische Aktivierungsprotein bindet, werden geeignete Funktionstests eingesetzt, um zu bestimmen, ob eine solche Bindung die biologische Funktion des Bindungspartner-Proteins stört oder steigert. Z.B. ist im Fall von Ratten-Homer-Protein bekannt, dass mGluR1 und mGluR5 sich an die Phospholipase C koppeln und die Phosphoinositid-Hydrolyse über die Phosphoinositidase C (PI-PLC) regulieren, während mGluR2 und –4 die Adenylat-Cyclase negativ regulieren (Nakanishi, 1994; Pin und Duvoisin, 1995). Um also weiterhin zu bestimmen, ob das Ratten-Homer-Protein diese funktionelle Aktivität stört oder steigert, wird deshalb ein Test eingesetzt, mit dem die mGluR5-abhängige PI-PLC-Aktivität in Abwesenheit oder in Gegenwart von zugefügtem Ratten-Homer-Protein überwacht werden kann.
3. Peptidseguenz-Spezifität der Bindungs-Wechselwirkung
Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass Mitglieder der Familie der synaptischen Aktivierungsproteine, für die das Ratten-Homer-Protein als Beispiel dient, an spezifische Peptidsequenzen binden. Eine solche Sequenzspezifität kann durch die PDZ-Domäne oder durch andere Domänen bestimmt werden, die in dem synaptischen Aktivierungsprotein vorliegen.
In Studien, die zur Rechtfertigung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde die Spezifität der Wechselwirkung zwischen dem Ratten-Homer-Protein und den metabotropen Glutamatrezeptoren mGluR5 und mGluR1a anhand von in vitro-Bindungstests untersucht.
Metabotrope Glutamatrezeptoren besitzen in einzigartiger Weise lange cytoplasmatische C-terminale Schwänze, die über die letzen 55 Aminosäuren zu 67 % identisch sind und in ähnlichen Sequenzen enden: -RDYTQSSSSL bzw. -RDYKQSSSTL (9A bis 9E). Um die Bindungs-Wechselwirkung zu messen, wurden mGluR5 und mGluR1a in HEK-293-Zellen exprimiert. Die Zellextrakte wurden zuerst mit dem Perlen-gekoppelten GST-Homer gemischt und dann mit SDS-Auftragepuffer eluiert. Sowohl das vorübergehend (transient) exprimierte vollständige mGluR1a als auch mGluR5 binden an das Ratten-Homer-Fusionsprotein, wie in den 10A und 10D gezeigt wird. Wenn die vier C-terminalen Aminosäuren von mGluR5 fehlten, war die Bindung des mGluR5 an Homer um mehr als 70 % verringert (10D, Bahnen 3 und 4). Der Vergleich der C-terminalen Sequenzen von anderen metabotropen Glutamatrezeptoren zeigt, dass mGluR2- und mGluR3-Rezeptoren einen ähnlichen C-Terminus, -TSSL, gemeinsam haben (8), obwohl sie sich von mGluR1 α und mGluR5 außerhalb dieser Region unterscheiden. Weder mGluR2 noch mGluR4 bindet an das Homer-Protein (10B, 10C). Außerdem wurde ein damit nicht verwandtes Protein, von dem bekannt war, dass es den C-Terminus TSSL besaß (RSK1), auf Bindung getestet, jedoch band dieses Protein nicht an Homer. Aufgrund dieser Ergebnisse nimmt man an, dass die letzten vier Aminosäuren zwar wichtig, jedoch nicht ausreichend für eine Bindung sind.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass das Homer-Protein spezifisch mit PI-PLC-gebundenen metabotropen Glutamatrezeptoren interagiert und dass die Bindungsspezifität, zumindest zum Teil, durch die vier C-terminalen Aminosäuren dieser Rezeptoren bestimmt wird. Spezifische Bindungsstellen für weitere synaptische Aktivierungsproteine weisen möglicherweise ähnliche oder andere Aminosäuresequenzen auf, die anhand von ähnlichen Verfahren wie die vorstehend beschriebenen empirisch bestimmt werden können.
Die Wirkung von Deletionsmutationen des Homer-Proteins auf seine Bindung an mGluR5 wurde untersucht, indem die Bindung des vollständigen Homer-GST-Fusionsproteins an ein mGluR5-Fragment der 195 C-terminalen Aminosäuren mit myc-Tag, das aus HEK-293-Zellen exprimiert wurde, gemessen wurde. Genauso banden Deletionskonstrukte, denen 55 C-terminale Aminosäuren fehlten, an mGluR5. Im Gegensatz dazu hob die Deletion der 108 N-terminalen Aminosäuren des Homer-Proteins, welche die Sequenz GLGF umfasst, die Bindung an mGluR5 auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Region GLGF in der Bindung an die C-terminale Sequenz von mGluR5 eine Rolle spielt.
IV. In vivo-Regulation der Expression
Es ist eine Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass synaptische Aktivierungsproteine, die zu der Familie gehören, für die das Ratten-Homer-Protein als Beispiel dient, durch neuronale Aktivität dynamisch reguliert werden können, umfassend Anfallsaktivität und akute Kokainverabreichung, – wie vorstehend besprochen. Außerdem zeigen die zur Rechtfertigung der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente, dass das Ratten-Homer-Protein entwicklungsgemäß reguliert wird, wobei eine Peak-Expression im Ratten-Vorderhirn von der dritten bis zur fünften Woche postnatal zu sehen ist (11). Während dieses Zeitraums der entwicklungsgemäßen Peak-Expression wird die mRNA des Homer-Proteins in der Hirnrinde von im Dunkeln aufgezogenen Ratten innerhalb von 30 Minuten des ersten visuellen Erlebnisses deutlich induziert (12A bis 12F). Außerdem bewirkt ein monokularer Entzug durch Blockade der Netzhautaktivität mit Tetrodotoxin eine rasche Reduktion der Homer-mRNA in der Sehrinde der Gegenseite (13). Diese Beobachtungen zeigen, dass die entwicklungsgemäße Expression des synaptischen Aktivierungsproteins Homer im Cortex durch die natürliche synaptische Aktivität reguliert wird. Man kann davon ausgehen, dass weitere Mitglieder der Familie der synaptischen Aktivierungsproteine auch diese oder sehr ähnliche Expressionsmerkmale aufweisen.
Im erwachsenen Tier wird die Homer-mRNA im Hippocampus von wachen, sich normal verhaltenden Ratten durch NMDA-abhängige synaptische Stimuli, welche eine langfristige Potenzierung induzieren, rasch induziert (14). Die deutlichste Induktion erfolgt in Körnerzellen des Hippocampus und ist in der Größenordnung ähnlich wie die Induktion durch einen Anfall. Außerdem wird das Homer-Protein im Striatum durch Kokain rasch induziert (15), dies legt eine Regulation durch Dopamin-Rezeptor-Mechanismen nahe. Diese Studien zeigen, dass das Homer-Protein, anders als andere bekannte PDZ-Proteine, durch verschiedene Formen der physiologischen neuronalen Aktivität rasch reguliert wird.
Die zahlreichen neuen Merkmale des Ratten-Homer-Proteins lassen vermuten, dass Homer und sein menschliches Analogon in der glutamatergen synaptischen Plastizität eine wichtige Rolle spielen.
V. Nutzen
Die Polynucleotid- und Polypeptidzusammensetzungen, welche einen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, eignen sich als Hauptkomponenten von diagnostischen Tests und Screening-Tests zum Identifizieren von Arzneistoffen, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen synaptischen Aktivierungsproteinen und ihren zellulären Bindungsstellen zu verstärken oder zu hemmen. Spezifische Beispiele solcher Tests und Angaben, wie sie verwendet werden können, finden sich in den folgenden Abschnitten.
1. Screening-Tests
Die hier beschriebenen synaptischen Aktivierungsproteine können in Screening-Tests eingesetzt werden; um Verbindungen zu identifizieren, welche die Bindung des Proteins Homer an mGluR5 oder mGluR1a, und somit die PI-gekoppelte mGluR-Aktivität, stören oder modulieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung können Verbindungen, die durch diesen Screening-Test identifiziert werden, als Arzneistoffe zur Behandlung von Epilepsie, einer abnormen Gehirnentwicklung, einer Nervenverletzung, eines Traumas und von bestimmten chemischen Abhängigkeiten verwendet werden.
Testformate zum Messen der Protein-Protein-Wechselwirkung sind dem Fachmann bekannt. Z.B. kann gereinigtes synaptisches Aktivierungsprotein an eine feste Phase, z.B. eine Mikrotiterplatte, beschichtet werden, worauf die Blockierung von offenen Bindungsstellen auf der Platte folgt, wobei Standardverfahren eingesetzt werden. Danach wird mGluR zu der Platte in Abwesenheit oder in Gegenwart der Testverbindung zugefügt. Der Nachweis von mGluR, der an das synaptische Aktivierungsprotein gebunden ist, wird durch eine direkte Markierung des mGluR oder durch den anschließenden Zusatz eines markierten mGluR-spezifischen Reagens, z.B. eines Antikörpers, erreicht. Das Bindungsreagens kann radiomarkiert werden, z.B. mit ¹²⁵I, oder es kann mit einem fluoreszierenden Farbstoff, einem Enzym, das ein Signal erzeugen kann (z.B. Meerrettich-Peroxidase), Gold oder Biotin gemäß Verfahren markiert werden, die dem Fachmann bekannt sind (Howard, 1993). Anschließend erfolgt der Nachweis der Bindung anhand von Verfahren, die für das erzeugte Signal geeignet sind. Eine Testverbindung wird für die Arzneistoffentwicklung ausgewählt, wenn sie die Bindung zwischen den Proteinen signifikant verändert.
Demgemäß können Polynucleotide, die einen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, in der Produktion von synaptischen Aktivierungsproteinen im großen Maßstab für die vorstehend beschriebenen Screening-Tests eingesetzt werden.
2. Diagnostische Tests
Unter Verwendung der Wechselwirkung zwischen der Ratten- oder der Mensch-Form des synaptischen Aktivierungsproteins Homer mit mGluR5 als Beispiel kann ein diagnostisches Testkit hergestellt werden, mit dem die Induktion des synaptischen Aktivierungsproteins gemessen werden kann. Es ist so zu verstehen, dass die Induktion des synaptischen Aktivierungsproteins als ein Maß für die Gehirnaktivierung, z.B. die Anfallsaktivität, in Gewebe des Zentralnervensystems dienen kann. Hier kann die Messung der Spiegel des synaptischen Aktivierungsproteins als ein Indikator für das Ausmaß der Anfallsaktivität und/oder die Nervenschädigung als Folge einer solchen Aktivität dienen. Eine solche Messung kann auch als ein Indikator des Spiegels einer akuten Kokain-Intoxikation dienen (vgl. den vorstehenden Abschnitt IV).
Diagnostische Kits, mit denen die Spiegel des synaptischen Aktivierungsproteins gemessen werden, können in Form eines Radioimmuntests vorliegen, wobei die Spiegel eines Probenproteins durch die Verdrängung eines markierten Kontrollproteins von einem spezifischen Antikörper gemessen werden. Alternativ können Proteinspiegel in einem ELISA-Sandwich-Test gemessen werden, wobei ein monoclonaler Antikörper, der gegen ein spezifisches Epitop des synaptischen Aktivierungsproteins gerichtet ist, an die feste Phase gekoppelt wird. Danach wird eine Testprobe zugegeben, worauf ein nachweisbarer monoclonaler Antikörper folgt, der gegen ein anderes Epitop des synaptischen Aktivierungsproteins gerichtet ist. Das nachweisbare Signal ist proportional zu der in der Probe vorliegenden Menge des synaptischen Aktivierungsproteins.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung, wobei sie jedoch in keiner Weise die vorliegende Erfindung einschränken sollen.
Beispiel 1
Clonierung des synaptischen Aktivierungsproteins Homer durch differenzielles Screening
Die Über-Induktion („superinduction") von IEBs im Hippocampus wurde erreicht, indem Ratten mit Cycloheximid vorbehandelt und 15 Minuten später innerhalb eines Zeitraums von drei Stunden wiederholt maximale elektrische Krampfanfälle („maximal elektroconvulsive seizures", MECS), insgesamt 12 MECS, verabreicht wurden.
Die Gesamt-RNA wurde aus dem Hippocampus von Ratten isoliert, die mit MECS und Cycloheximid behandelt worden waren. Die Poly(A)⁺-RNA wurde durch eine Oligo-dT-Säulenchromatographie selektiert. Danach wurde die RNA unter Verwendung eines Oligo-dT/Xhol-Primers zu cDNA umgewandelt und in λ Zap II (Stratagene, La Jolla, CA) in einer Richtung cloniert, wobei gemäß dem Protokoll des Herstellers vorgegangen wurde. Die Komplexität dieser Bank betrug etwa 1 × 10⁶ unabhängige Clone. Anschließend wurde diese stimulierte parentale Bank dazu verwendet, eine subtrahierte Bank herzustellen, in der Gene angereichert sind, die im Hippocampus nach einem Anfall induziert werden. Die stimulierte Bank wurde mit einer Dichte von 50 000 pfu pro Schale (insgesamt 40 Schalen) plattiert, und die Phagen-DNA wurde isoliert. Diese DNA wurde am 3'-Ende des cDNA-Inserts unter Verwendung von Xhol linearisiert und anschließend als Matrize in Gegenwart von T3-RNA-Polymerase verwendet, um große Mengen von „in vitro"-cRNA zu synthetisieren. Um unvollständige Transkripte und Vektorsequenzen zu entfernen, wurde eine Poly(A)⁺-cRNA aus der cRNA durch Oligo-dT-Säulenchromatographie isoliert. Die cRNA wurde zu cDNA umgewandelt, indem ein Oligo-dT/Xhol-Primer und Superscript-reverse-Transkriptase (Gibco BRL, Ground Island, NY) verwendet wurden. Die RNA-Matrize wurde durch Basen-Denaturierung und anschließende Säulenchromatographie auf „SEPHADEX G-50" (Pharmacia, Piscataway, NJ) entfernt, und diese cDNA wurde von der aus normalen erwachsenen Rattengehirn isolierten Poly(A)⁺-RNA subtrahiert. Für die Subtraktion wurde die Gehirn-„Treiber"-(„driver"-) Poly(A)⁺-RNA unter Verwendung von „PHOTOPROBE" (langer Arm) Biotin (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) biotinyliert. Für die erste Subtraktionsrunde wurde ein 20-facher Überschuss der biotinylierten Treiber-Gehirn-RNA (200 μg) mit der stimulierten cDNA (10 μg) für 48 Stunden bei 68°C hybridisiert. Nicht-differenzielle cDNA/bioRNA-Hybride wurden entfernt, indem Streptavidin (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) zugegeben wurde und sodann eine Phenolextraktion durchgeführt wurde, wobei die einzelsträngige cDNA in der wässrigen Phase gewonnen wurde. Die erste Subtraktionsrunde entfernte 80 % der ursprünglichen cDNA, und die restliche einzelsträngige cDNA wurde weitere 48 Stunden bei 68°C mit einem 100-fachen Überschuss von biotinylierter Treiber-Leber-RNA (200 μg) hybridisiert. Diese zweiten Subtraktionsrunde entfernte weitere 16 % der ursprünglichen stimulierten cDNA. Das restliche Material wurde durch Säulenchromatographie auf „SEPHADEX G-50" (Pharmacia, Piscataway, NJ) größenfraktioniert, um gespaltene und kleine cDNAs zu entfernen. Die „stimulierte" subtrahierte einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung der „SEQUENASE" DNA-Polymerase (USB) und des SK-Primers (Stratagene, La Jolla, CA) zur doppelsträngigen Form umgewandelt. Nach der Spaltung mit EcoRI und XhoI und der Größenfraktionierung durch Säulenchromatographie wurde die subtrahierte cDNA direkt in λ ZAPII cloniert (subtrahiert/MECS und Cycloheximid/Hippocampus). Die Komplexität dieser subtrahierten cDNA-Bank betrug etwa 5 × 10⁶ unabhängige Clone. Diese Phagenbank wurde sodann mit einer Dichte von etwa 1000 Phagen pro 15-cm-Schale plattiert und Replika-Abklatschpräparte („replica lifts") hergestellt. Anschließend wurden die Abklatschpräparate mit ³²P-dCTP-radiomarkierter cDNA hybridisiert, die aus Poly(A)⁺-RNA von Hippocampus entweder aus naiven Kontrollratten oder aus Ratten, die eine MECS/Cycloheximid-Stimulation erhalten hatten, hergestellt worden war. Die einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von „SUPERSCRIPT" gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Nach der Basen-Denaturierung der RNA-Matrize wurde die cDNA durch das Random-Priming-Verfahren auf eine spezifische Aktivität von 4 × 10⁹ cpm/μg radiomarkiert. Die Filter wurden zwei Tage bei 65°C mit der subtrahierten cDNA-Sonde hybridisiert und anschließend mit 0,5 × SSC/0,2 % SDS bei 65°C gewaschen und danach bei –80°C einem Röntgenfilm mit Verstärkungsschirmen ausgesetzt.
Beispiel 2
Herstellung von Oligonucleotiden und Vektoren des Homer-Proteins
Ein Säuger-Expressionskonstrukt des vollständigen Homer wurde hergestellt, indem das 5'-EcoRI-Fragment (1,6 kb) in pRK5 (Genentech, South San Francisco, CA) gemäß Verfahren cloniert wurde, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiel 3
Synthese des Homer-Proteins
Das Homer-Protein wurde in menschlichen embryonalen Nierenzellen (IDEK293) exprimiert. Der eukaryotische Homer-Expressionsvektor (sRK5 Homer) wurde durch ein herkömmliches Calciumphosphat-Fällungs-Verfahren in HEK-293-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion geerntet.
1. Zellfreie Translation
Das Homer-Protein wurde anhand verschiedener Strategien exprimiert. Zuerst wurde das Homer aus der in pBSKS (Stratagene, La Jolla, CA) clonierten cDNA exprimiert, indem T3-Polymerase und das in vitro-Transkriptions- und Translationsverfahren nach den Anweisungen des Herstellers (Promega Biotech, Madison, WI) verwendet wurden. Dieses Verfahren wurde eingesetzt, um die Größe von Homer abzuschätzen (Homer wandert auf SDS-PAGE mit einer offensichtlichen Molekülmasse von 28 kDa), wodurch die durch das ORF vorausgesagte Größe bestätigt wurde. Dieses Verfahren kann auch für die Herstellung von Homer-Protein für andere, hier beschriebene Anwendungen eingesetzt werden.
2. Zelluläre Expression
Bakterielle Fusionsproteine von Homer wurden hergestellt, indem das ORF in pTrkHis (InVitrogen, San Diego, CA) und pGEX (Pharmacia, Piscataway, NJ) cloniert wurde. Fusionsproteine wurden in Bakterien exprimiert und über die geeignete Affinitätssäule gereinigt, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden.
Homer wurde in eukaryotischen Zellen (menschlichen embryonalen Nierenzellen, American Type Culture Collection, Rockville, MD) exprimiert, indem ein 2 kb großes EcoRI-Restriktionsfragment, welches das ORF enthielt, in den Vektor pRK5 (Genentech, South San Francisco, CA) gemäß Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, cloniert wurde. Der eukaryotische Expressionsvektor (pRK4 Homer) wurde durch Standard-Calciumphosphat-Fällungsverfahren in HEK-293-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion geerntet. Die aus diesen Zellen isolierten Proteine wurden in Bindungstests eingesetzt, und außerdem wurden sie dazu verwendet, die Größe des nativen Proteins zu bestätigen.
Homer wurde auch in Hefe exprimiert. Das ORF wurde in pPC86 (Chevray und Nathans, 1992) cloniert und zur Durchmusterung nach Proteinen eingesetzt, die mit Homer interagieren. Anhand dieser Durchmusterung wurde zuerst bestimmt, dass Homer mit dem metabotropen Glutamatrezeptor Typ 5 interagiert.
Beispiel 4
Immunaftinitätsreinigung des Homer-Proteins
Monoclonale Antikörper werden an Protein A- oder G- (abhängig vom Ig-Isotyp) Perlen (kommerziell verfügbar von Pharmacia, Piscataway, NJ) gemäß den Anweisungen des Herstellers gekoppelt und die Perlen-Komplexe in einer Immunaffinitätssäule gesammelt. Geklärte Ganzzellen-Lysate werden vorher an die Agaroseperlen adsorbiert, durch die Immunaftinitätssäule passiert und mit mehreren Volumina Waschpuffer gewaschen, und anschließend wird das Protein von Interesse aus der Säule eluiert, indem vorher bestimmte Pufferbedingungen verwendet werden. Üblicherweise werden für eine solche Elution Bedingungen mit hoher Salzkonzentration eingesetzt.
Alternativ können Antikörper direkt an ein Chromatographie-Festphasen-Reagens, z.B. „SEPHAROSE 4B-200" (Pharmacia, Piscataway, NJ), gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gekoppelt werden (Garvey et al., 1977).
Beispiel 5
Zwei-Hybrid-Protein-Bindungstest
Ein vollständiges Homer-ORF mit flankierenden Smal-Stellen wurde in den Hefe-Expressionsvektor pPC97 subcloniert. Eine Zufalls-geprimte cDNA-Bank wurde aus einem Anfall-stimulierten erwachsenen Ratten-Hippocampus hergestellt und in den Hefe-Expressionsvektor pPC86 cloniert. Die Bank enthält 6 × 10⁶ unabhängige cDNAs, wobei insgesamt 1,5 × 10⁶ durchgemustert wurden. Interagierende Proteine wurden durch Kolonieselektion auf Platten, auf denen Leucin, Tryptophan und Histidin fehlten, identifiziert und anhand eines β-Galactosidase-Tests bestätigt (Ausubel et al., 1992). Alternativ kann ein kommerziell verfügbares Zwei-Hybrid-Nachweissystem verwendet werden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen nachzuweisen, z.B. „HYBRID HUNTER" (InVitrogen, San Diego, CA).
Beispiel 6
Messung von Expressionsraten
1. Herstellung von Antiseren
Polyclonale Kaninchen-Antiseren für die mGluR-Rezeptoren wurden erzeugt gegen C-terminale Peptide; mGluR1 wie früher beschrieben, mGluR2/3 (Chemicon International Inc.), mGluR4 (Wyeth-Ayerst Research, Princeton, NJ) und mGluR5 gegen ein C-terminales 21-As-Peptid. Gegen Homer gerichtete polyclonale Kaninchen-Antiseren wurden erzeugt, indem entweder das vollständige Homer-ORF als eine GST-Fusion oder ein C-terminales 18-As-Peptid verwendet wurde. Beide Antiseren wiesen ein 28-kDa-Protein, wenn Homer in HEK-293-Zellen exprimiert wurde, und ein Anfall-induziertes 28/29-kDa-Doppelbanden-Protein im Hippocampus nach.
2. Immunblot-Analyse
Proteingemische wurden durch SDS-PAGE gemäß Standardverfahren aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel gründlich gewaschen und die Proteine anschließend auf Nitrocellulose überführt, indem Verfahren verwendet wurden, die dem Fachmann bekannt sind (Ausubel et al., 1992). Danach wurde die Nitrocellulose mit dem gegen mGluR5 gerichteten, polyclonalen Kaninchen-Antiserum inkubiert, das gemäß vorher bestimmten Nachweiskriterien verdünnt worden war. Der Blot wurde gewaschen und anschließend mit radiomarkiertem oder Enzym-gekoppeltem Anti-Kaninchen-Antiserum inkubiert. Die getrockneten Gele wurden einer Autoradiographie unterworfen.
Beispiel 7
Bindung des synaptischen Aktivierungsproteins Homer-Protein an mGluR5
1. Bindung eines bakteriell exprimierten GST-Homer-Fusionsproteins in bakteriellen Extrakten
Ein Hippocampus-Lysat wurde hergestellt, indem die Hippocampi von 21 Tage alten Ratten in PBS und 1 % Triton mit Protease-Inhibitoren beschallt wurden (dreimal zehn Sekunden), zehn Minuten bei 15 000 g zentrifugiert wurden und mit CL-4B Sepharose-Perlen (Pharmacia, Piscataway, NJ) vorgeklärt wurden. Homer-Affinitätssäulen wurden zubereitet, indem das Homer-GST-Fusionsprotein irreversibel an Affigel-Agarose-Perlen vernetzt wurde (1 mg Homer-Protein pro 1 ml Bettvolumen; Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Anschließend wurden 40 ml der Perlen mit Lysat aus einem einzigen Hippocampus eine Stunde bei 4°C inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und das gebundene mGluR5 durch Kochen in 3×-Auftragepuffer eluiert.
2. Bindung des Ratten-Homer-Proteins an metabotrope Glutamatrezeptoren
Für Experimente zur Untersuchung der Spezifität der Homer-Bindung an metabotrope Glutamatrezeptoren wurden HEK-293-Zellen mit mGluR1a-, mGluR2-, mGluR4- oder mGluR5-Expressionskonstrukten transient transfiziert, in PBS plus 1 Triton ×100 abgeschabt, zweimal zehn Sekunden beschallt, zehn Minuten bei 15 000 g bei 4°C zentrifugiert und vorgeklärt. Das Lysat von der Hälfte einer 10-cm-Platte wurde mit 50 μl Perlen, an die 250 ng Protein gekoppelt waren, inkubiert und wie vorstehend gewaschen. Die Proben wurden durch Western-Blot-Analyse analysiert, wobei der geeignete polyclonale mGluR-Antikörper verwendet wurde. Deletionskonstrukte von Homer wurden durch PCR hergestellt und als Fusionskonstrukte mit GST in pGEX cloniert (Pharmacia, Piscataway, NJ).
C. Co-Immunfällung von Homer-Protein und mGluR5
Ein Hippocampus-Lysat wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. Anti-Homer-Serum oder Präimmunserum des Kaninchens wurde irreversibel an „AFFIGEL"-Agarose-Perlen (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) gekoppelt und gründlich mit PBS gewaschen. 50 μl Perlen wurden mit Lysat aus einem einzigen Hippocampus über Nacht bei 4°C inkubiert, zweimal mit PBS mit 1 % Triton und zweimal mit PBS gewaschen, in 3× SDS-Auftragepuffer resuspendiert und durch Gel-Elektrophorese und Western-Blot-Analyse analysiert. In Kontrollexperimenten wurde die Co-Immunfällung von mGluR5 durch eine Vorinkubation der Anti-Homergekoppelten Perlen mit 50 μg des Homer-GST-Fusionsproteins für eine Stunde bei 4°C blockiert.
Beispiel 8
Immunhistochemie
Sechs Wochen alte Ratten wurden anästhesiert und mit 4 % Paraformaldehyd perfundiert. Die ganzen Gehirne wurden entnommen und eine Stunde in das Fixiermittel und sodann 72 Stunden in 30 % Saccharose gelegt. 35-μm-Schnitte wurden anhand eines Schiebe-Mikrotoms geschnitten, blockiert und eine Stunde in 1 % Milchpulver und 5 % normalem Ziegenserum in PBS mit 0,1 % Triton permeabilisiert. Die Schnitte wurden in dem primären Antikörper 24 Stunden inkubiert, gewaschen und eine Immun-Peroxidase-Färbung mit einem Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) durchgeführt. Wenn man die primäre oder vorherige Adsorption von Homer- oder mGluR5-Antiseren mit den immunogenen Peptiden wegließ, war die Färbung vollständig blockiert. Primäre Hippocampus-Kulturen wurden aus Rattenjungen vier Tage nach der Geburt hergestellt. Die GluR1-Färbung erfolgte unter Verwendung eines Cy3-markierten FAB-Fragments eines Antikörpers, der gegen ein synthetisches Peptid, welches den Aminosäuren 251 bis 269 entsprach, hergestellt worden war. Die Zellen wurden in 4 % Paraformaldehyd eine Stunde fixiert, mit 0,1 % Triton permeabilisiert und mit affinitätsgereinigtem Anti-Homer-Antiserum über Nacht bei 4°C inkubiert. Homer wurde durch einen FITC-gekoppelten Anti-Kaninchen-Antikörper der Ziege nachgewiesen (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA).
Beispiel 9
Testkits
A. Herstellung von monoclonalen Antikörpern
Balb/c-Mäuse werden durch Pentobarbital-Injektion anästhesiert. Nachdem das Fell im Bereich der Milz geschoren wurde, wird die Stelle mit 70 % Ethanol abgetupft und mit einem mit steriler isotonischer Kochsalzlösung getränkten Mull abgedeckt. Sodann wird entlang der linken „midcapsular" Linie ein etwa ein cm langer Schnitt durch die Haut gemacht, sodann erfolgt eine abdominale Inzision durch das Peritoneum. Mit Hilfe einer Pinzette wird eine Nitrocellulosescheibe, die aus einem Nitrocellulose-Blot eines das abgetrennte Homer-Protein enthaltenden Gels ausgeschnitten wurde, durch den Schlitz in die Milz eingelegt und sorgfältig distal in Richtung des kaudalen Endes bewegt, bis die Scheibe vollständig im Milzgewebe eingebettet ist. Alternativ wird das extrahierte Protein in einem Volumen von weniger als 5 μl in die Milz oder intraperitoneal gemäß Standardverfahren injiziert. Die Milz wird beobachtet, um sicherzustellen, dass keine zu starke Blutung erfolgt, dann wird sie wieder in die Peritonealhöhle zurückgeschoben. Die Bauchdecke und die Haut werden getrennt mit 4-0 Seide-Einzelstichnaht vernäht. Acht bis zehn Tage später wird den Mäusen Blut abgenommen und im Serum der Antikörpertiter gegen Proteine mit passendem Molekulargewicht getestet, die durch präparative SDS-Elektrophorese fraktioniert wurden (Western-Blot). Wenn der Antikörpertiter niedrig ist, wird die Prozedur wiederholt.
Danach wird ein Antikörper-produzierendes Hybridom anhand von Standardverfahren hergestellt. Z.B. werden p3×63-Ag8.653-Myelomzellen, die von Balb/c-Mäusen (nicht-sekretierendes Myelom, 8-Azaguanin-resistent, HPRT) stammen, gemäß einem herkömmlichen PEG4000- (Merck, Philadelphia, PA) Fusionsprotokoll mit immunisierten Splenocyten bei einem Verhältnis von Myelom:Lymphocyt von 10:1 fusioniert und die Zellen in Mikroplatten in Medium plattiert, das HAT und 10 % konditioniertes Medium aus der mit LPS gepulsten murinen Makrophagenlinie J774.1 enthält.
Relevante Polypeptide, die durch präparative SDS-PAGE aufgetrennt und hieraus eluiert wurden, werden eingesetzt, um die Spezifität der erzeugten monoclonalen Antikörper zu testen. Üblicherweise wird das Eluat, das 30 bis 80 μg/ml des teilweise gereinigten Proteins enthält, in Mikrotitervertiefungen eingebracht und z.B. zwei Stunden bei 37°C und anschließend zwei Stunden bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen wird der Überstand aus jeder Hybridomvertiefung zugefügt und eine Stunde bei 4°C inkubiert und anschließend mehrmals mit PBS gewaschen. Anschließend wird das Fluorescein-markierte Anti-Maus-Immunglobulin der Ziege als der „zweite" Antikörper zugefügt, danach wird gewaschen und die Bindung durch Fluorometrie überwacht.
Positive Hybridomclone werden expandiert, erneut cloniert und in Pristanbehandelte Balb/c-Mäuse injiziert, so dass eine Produktion des Antikörpers im großen Maßstab erfolgt (Aszitesflüssigkeit). Die Antikörper aus der Aszitesflüssigkeit werden auf Protein-A- oder G-Säulen (gemäß dem Ig-Isotyp) gereinigt.
b. Festphasen-Immuntest
Gereinigtes Ratten-Homer wird in einem herkömmlichen Beschichtungs-Verdünnungspuffer, z.B. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), verdünnt und an eine Festphase, z.B. eine Mikrotiterplatte, beschichtet, hierauf folgt die Blockierung der offenen Bindungsstellen auf der Platte mit einem nicht damit verwandten Protein, z.B. Rinderserumalbumin oder Casein, gemäß Standardverfahren. Danach wird mGluR zur Platte in Gegenwart oder in Abwesenheit einer Testverbindung zugegeben. Der Nachweis des an ein synaptisches Aktivierungsprotein gebundenen mGluR erfolgt durch eine direkte Markierung des mGluR oder durch die anschließende Zugabe eines markierten, mGluR-spezifischen Bindungsreagens, z.B. eines für mGluR spezifischen monoclonalen oder polyclonalen Antikörpers. Eine Testverbindung wird für die Arzneistoffentwicklung ausgewählt, wenn sie die Bindung zwischen den Proteinen signifikant verändert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, gekennzeichnet durch (i) erhöhte Expression während synaptischer Aktivität im Säugergehirn, (ii) Anwesenheit einer PDZ-ähnlichen Bindungsdomäne, und (iii) eine Sequenz, die zu mindestens 80% identisch ist zu SEQ ID NO: 2.
Polypeptid nach Anspruch 1, das ferner eine Fähigkeit aufweist, selektiv an ein synaptisches Membranprotein zu binden, das eine C-terminale Peptidregion besitzt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SSSL und SSTL.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Identität der Sequenz mindestens etwa 90% ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polypeptid die Sequenz SEQ ID NO: 2 hat.
Polynucleotid, das fähig ist, ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zu codieren.
Vektor, der ein Polynucleotid, wie in Anspruch 5 definiert, enthält.
Vektor nach Anspruch 6, wobei das Polynucleotid die Sequenz SEQ ID NO: 1 hat.
Verfahren zum Auswählen einer Verbindung, die die Bindung eines synaptischen Aktivierungsproteins an ein zelluläres Bindungsprotein im Zentralnervensystem eines Säugers beeinflusst, umfassend (a) Zusatz einer Testverbindung zu einem Reaktionsgemisch enthaltend (i) ein synaptisches Aktivierungsprotein, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 4, (ii) ein Bindungsprotein, an das das synaptische Aktivierungsprotein bindet, und (iii) Mittel zum Nachweis der Bindung zwischen dem synaptischen Aktivierungsprotein und dem Bindungsprotein; (b) Messen der Bindung zwischen dem synaptischen Aktivierungsprotein und dem Bindungsprotein, und (c) Auswählen der Verbindung, wenn die gemessene Bindung größer oder kleiner ist als die in Abwesenheit der Testverbindung gemessene Bindung.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Bindungsprotein ein metabotropischer Glutamat rezeptor ist, der eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SSSL und SSTL, beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das mG1uR-Bindungsprotein in Zellen exprimiert wird, und die Bindung zwischen dem Rezeptor und dem Bindungsprotein durch Messung der Phosphoinositidase-C-(PI-PLC)- Aktivität in den Zellen gemessen wird.
Kit umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ein Polynucleotid nach Anspruch 5 oder einen Vektor nach Anspruch 7.
Kit nach Anspruch 11, das ein diagnostisches Kit ist.
Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 11 oder 12 zur Messung der Spiegel des synaptischen Aktivierungsproteins oder zur Identifizierung von Arzneistoffen, die zur Verstärkung oder Hemmung der Wechselwirkung zwischen synaptischen Aktivierungsproteinen und ihren zellulären Bindungsstellen fähig sind.