DE69434498T2

DE69434498T2 - Denervierende muskelkinase (dmk), ein rezeptor der tyrosinkinase-superfamilie

Info

Publication number: DE69434498T2
Application number: DE69434498T
Authority: DE
Inventors: David M. Valenzuela; Eduardo A. Rojas
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-07-20
Filing date: 1994-07-20
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2014-07-21
Also published as: CA2195528A1; WO1996002643A1; AU710728B2; AU7364894A; DE69434498D1; EP0767835A1; CA2195528C; ATE305508T1; JPH10505489A; EP0767835B1

Description

1. EINLEITUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Orphan-Rezeptormoleküle und ihre Verwendung und Testsysteme bereit, die bei der Identifizierung von neuen Liganden von Nutzen sind, die mit diesen Rezeptoren wechselwirken.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Fähigkeit von Polypeptidliganden zur Bindung von Zellen und damit zum Hervorrufen einer phänotypischen Antwort wie Zellwachstum, Überleben oder Differenzierung in solche Zellen wird oft durch transmembrane Tyrosinkinasen vermittelt. Der extrazelluläre Teil jeder Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) ist im Allgemeinen der am meisten kennzeichnende Teil des Moleküls, da er das Protein mit seiner Liganden erkennenden Charakteristik ausstattet. Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne resultiert in der Signaltransduktion über eine intrazelluläre katalytische Domäne der Tyrosinkinase, die ein biologisches Signal auf intrazelluläre Zielproteine überträgt. Die spezielle Anordnung von Sequenzmotiven dieser cytoplasmatischen, katalytischen Domäne bestimmt ihren Zugang zu potentiellen Kinasesubstraten (Mohammadi, et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 11: 5068–5078; Fantl, et al., 1992, Cell, 69: 413–413).
Alle bekannten Wachstumsfaktor-RTKs scheinen nach der Ligandenbindung eine Dimerisierung zu erfahren (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sci. 13: 443–447; Ullrich und Schlessinger, 1990, Cell, 61: 203–212; Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9: 383–391); die molekularen Wechselwirkungen zwischen dimerisierenden Neuron 9: 383–391); die molekularen Wechselwirkungen zwischen dimerisierenden cytoplasmatischen Domänen führen zur Aktivierung der Kinasefunktion. In einigen Fällen wie bei dem Wachstumsfaktor von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) ist der Ligand ein Dimeres, das an zwei Rezeptormoleküle bindet (Hart, et al., 1988, Science, 240: 1529–1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905–8912), während zum Beispiel im Falle von EGF der Ligand ein Monomer ist (Weber, et al., 1984, J. Biol. Chem, 259: 14631–14636).
Die Gewebeverteilung eines speziellen Tyrosinkinase-Rezeptors in höheren Organismen stellt relevante Daten bezüglich der biologischen Funktion des Rezeptors bereit. Die Tyrosinkinase-Rezeptoren für einige Wachstums- und Differenzierungsfaktore, wie den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) werden verbreitet exprimiert und scheinen daher eine gewisse allgemeine Rolle beim Wachstum und der Erhaltung von Gewebe zu spielen. Die Mitglieder der Trk-RTK-Rezeptorfamilie (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol, im Druck) sind im Allgemeinen mehr auf Zellen des Nervensystems beschränkt, und die Neurotrophine, die diese Rezeptoren binden, fördern die Differenzierung verschiedener Gruppen von Neuronen im Gehirn und in der Peripherie (Lindsay, R. M, 1993, in Neurotrophic Factors, S. E. Loughlin & J. H. Fallon, Hrsg., S. 257–284 (San Diego, CA: Academic Press). Die Lokalisierung von einem solchen Rezeptor der Trk-Familie, trkB, in Gewebe stellte einen gewissen Einblick in die potentielle biologische Rolle dieses Rezeptors bereit, ebenso wie von Liganden, die an diesen Rezeptor binden (hier als Verwandte bezeichnet). So wurde zum Beispiel bei trkB in ausgewachsenen Mäusen gefunden, daß es vorzugsweise in Gehirngewebe exprimiert wird, obwohl auch in der Lunge, im Muskel und in den Eierstöcken signifikante Niveaus an trkB-mRNAs beobachtet wurden. Weiterhin wurden trkB-Transkripte in Embryos der mittleren und späten Schwangerschaft nachgewiesen. Die Analyse von 14 bis 18 Tage alten Mäuseembryonon mittels in situ-Hybridisierung zeigte, daß die trkB-Transkripte im zentralen und peripheren Nervensystem lokalisiert waren, einschließlich des Gehirns, des Rückenmarks, der spinalen und cranialen Ganglien, des paravertebralen Stamms des sympathischen Nervensystems und verschiedener Ionervationswege, was nahelegt, daß das trkB-Genprodukt ein Rezeptor sein kann, der in die Neurogenese und die frühe neuronale Entwicklung involviert ist, ebenso aber eine Rolle im ausgewachsenen Nervensystem spielt.
Die zelluläre Umgebung, in der eine RTK exprimiert wird, kann die biologische Antwort beeinflussen, die bei der Bindung des Liganden an den Rezeptor gezeigt wird. Wenn zum Beispiel eine neuronale Zelle, die einen Trk-Rezeptor exprimiert, einem Neurotrophin ausgesetzt wird, das diesen Rezeptor bindet, resultiert neuronales Überleben und Differenzierung. Wenn derselbe Rezeptor von einem Fibroblasten exprimiert wird, resultiert die Begegnung mit dem Neurotrophin in einer Proliferation des Fibroblasten (Glass, et al., 1991, Cell 66: 405–413). Es scheint somit, daß die extrazelluläre Domäne den entscheidenden Faktor bezüglich der Spezifität des Liganden bereitstellt, und nachdem die Signaltransduktion angestoßen ist, die zelluläre Umgebung das phänotypische Ergebnis dieser Signaltransduktion bestimmt.
Basierend auf den Sequenzhomolgien in ihrer intrazellulären Domäne wurden eine Reihe von RTK-Familien identifiziert. Zum Beispiel haben zwei Mitglieder der TIE (Tyrosinkinase mit Homologiedomänen mit Immunglobulin und EGF)-Familie, die als TIE-1 und TIE-2 bekannt sind, zu 79% Sequenzhomolgie in ihrer intrazellulären Region (Maisonpierre, et al., 1993, Oncogene 8: 1631–1637). Obwohl diese Rezeptoren in ihrer extrazellulären Domäne ähnliche Motive aufweisen, sind nur 32% der Sequenzen identisch; dies deutet auf potentiell unterschiedliche biologische Rollen hin, die sich in der Tatsache spiegeln, daß, während beide Gene in Endothelzellen von embryonalem und postnatalem Gewebe verbreitet exprimiert werden, signifikante Niveaus an tie-2-Transkripten auch in anderen embryonalen Zellpopulationen vorhanden sind, die Linsenepithel, Herzepikard und Regionen von Mesenchym umfassen.
Der Rezeptor und die Signaltransduktionswege, die von NGF verwendet werden, umfassen das Produkt des trk-Proto-Oncogens (Kaplan et al., 1991, Nature 350: 156–160; Klein et al., 1991, Cell 65: 189–197). Klein et al. (1989) EMBO J. 8: 3701–3709) berichteten von der Isolierung von trkB, das ein zweites Mitglied der Familie der Tyrosin-Proteinkinase-Rezeptoren codiert, bei dem gefunden wurde, daß es mit dem menschlichen trk-Protooncogen nah verwandt ist. TrkB bindet und vermittelt die funktionellen Antworten auf BDNF, NT-4 und in geringerem Maß NT-3 (Squinto, et al., 1991, Cell 65: 885–903; lp, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 3060–3064; Klein et al., 1992, Neuron 8: 947–956). Auf der Ebene der Aminosäuren wurde bei den Produkten von trk und trkB gefunden, daß sie in ihren extrazellulären Regionen 57 Prozent Homologie haben, einschließlich 9 von 11 Cysteinen, die bei trk vorhanden sind. Bei dieser Homologie wurde gefunden, daß sie innerhalb der jeweiligen katalytischen Domänen der Tyrosinkinase auf 88 Prozent steigt. Die Trk-Genfamilie wurde nun um den trkC-Locus erweitert, wobei NT-3 als der bevorzugte Ligand von trkC identifiziert wurde (Lamballe, et al., 1991, Cell 66: 967–979).
Zwei neue menschliche Gene, ror1 und ror2, codieren Proteine, die in ihrem cytoplasmatischen Teil eine Region haben, die homolog zu der Domäne des Tyrosinkinase-Rezeptors der Trk-Familie ist, während die Proteine sich in ihrem extrazellulären Teil beträchtlich von der Trk-Familie unterscheiden (Masiakowski und Carroll, 1992, J. Biol. Chem. 267: 26181–26190).
Ein anderer Rezeptor, der eine Kinase-Domäne hat, die mit der Trk-Familie verwandt ist, wurde in dem elektrischen Rochen Torpedo californica identifiziert, der eine Rolle bei von Motoneuronen induzierten Synapsen auf Muskelfasern spielen könnte. Jennings, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2895–2899 (1993). Diese Kinase wurde aus dem elektrischen Organ isoliert, einem Gewebe, das homolog zu Muskel ist. Wie bei den rors ist die Tyrosinkinasedomäne dieses Proteins verwandt mit der Trk-Familie, während die extrazelluläre Domäne etwas unterschiedlich von den Trks ist. Bei dem Protein wurde gefunden, daß es mit hohen Niveaus im Skelettmuskel von Torpedo exprimiert wird und mit deutlich niedrigeren Niveaus in Gehirn, Rückenmark, Herz, Leber und Hoden von ausgewachsenem Torpedo.
Weil es scheint, daß RTKs eine Reihe von wichtigen Funktionen während der Entwicklung übernehmen, kann die Identifizierung und Isolierung von neuen RTKs als Mittel für die Identifizierung neuer Liganden verwendet werden, die bei der Entwicklung eine entscheidende Rolle spielen können. Oft werden solche neuen RTKs durch Suche nach zusätzlichen Mitgliedern der bekannten Familien von Tyrosinkinase-Rezeptoren identifiziert und isoliert, unter Verwendung von zum Beispiel PCR-basierten Durchmusterungen unter Einschluß bekannter Regionen an Homologie unter Trk-Familienmitgliedern. (Vgl. zum Beispiel Maisonpierre, et al., 1993, Oncogene 8: 1631–1637). Die Isolierung solcher sogenannter "Orphan"-Tyrosinkinase-Rezeptoren, für die kein bekannter Rezeptor existiert, und die anschließende Bestimmung der Gewebe, in denen solche Rezeptoren exprimiert werden, stellt Einblick in die Regulierung des Wachstums, der Proliferation und der Regeneration von Zellen in Zielgeweben bereit. Weiterhin können solche Rezeptoren zur Isolierung der verwandten Liganden verwendet werden, die dann zur Regulierung des Überlebens, des Wachstums und der Regeneration von Zellen verwendet werden können, die den Rezeptor exprimieren.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Tyrosinkinase bereit, die als "Dmk" für denervierte Muskelkinase bezeichnet wird, die in normalem und denerviertem Muskel exprimiert wird, ebenso wie in anderen Geweben einschließlich Herz, Milz und Retina. Das Protein scheint mit der Trk-Familie von Tyrosinkinasen verwandt zu sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ein im Wesentlichen gereinigtes rekombinantes Nucleinsäuremolekül bereit, das (a) die Nucleinsäuresequenz umfaßt, wie sie in 1 dargestellt ist, die das Dmk-Tyrosinkinase-Rezeptorprotein codiert oder (b) einen Teil davon, der die extrazelluläre Domäne, den Transmembranteil oder die intrazelluläre Domäne der Aminosäuresequenz codiert, die in 1 dargestellt ist, oder (c) einen Teil davon, der die extrazelluläre Domäne, den Transmembranteil und die intrazelluläre Domäne der Aminosäuresequenz codiert, die in 1 dargestellt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein im Wesentlichen gereinigtes Protein bereit, das

a) die Dmk-Tyrosinkinase-Rezeptorprotein-Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie in 1 dargestellt ist; oder
b) einen Teil des Proteins von a) umfaßt, der die extrazelluläre Domäne, den Transmembranteil oder die intrazelluläre Domäne umfaßt; oder
c) einen Teil des Proteins von a) umfaßt, der die extrazelluläre Domäne, die Transmembrandomäne und die intrazelluläre Domäne umfaßt.

Die Erfindung stellt weiterhin Vektoren, die regulatorische Sequenzen für die Expression umfassen und ein Nucleinsäuremolekül gemäß der Erfindung oder ein Nucleinsäuremolekül, das ein Protein gemäß der Erfindung codiert, bereit. Solche Vektoren können verwendet werden, um Dmk in Bakterien, Hefe und Säugerzellen zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung des Dmk-Rezeptors oder seiner extrazellulären oder intrazellulären Domäne bei der Durchmusterung auf Wirkstoffe bereit, die mit Dmk wechselwirken. Neue Mittel, die an den/die hier beschriebenen Rezeptoren) binden, können das Überleben und die Differenzierung in Zellen vermitteln, die den Rezeptor natürlicherweise exprimieren, und können auch das Überleben und die Proliferation vermitteln, wenn sie zur Behandlung von Zellen verwendet werden, die so verändert wurden, daß sie den Rezeptor exprimieren. In spezifischen Ausführungsformen wird die extrazelluläre Domäne (der lösliche Rezeptor) von Dmk bei der Durchmusterung auf verwandte Liganden verwendet.
Somit stellt die Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung eines Liganden bereit, der das Protein der Erfindung bindet, umfassend:

a) die Transfektion einer von einem Wachstumfaktor abhängigen Zelle, die in serumfreiem Medium nicht überlebt, mit einer Nucleinsäure oder einem Expressionsvektor, wie hier vorstehend definiert;
b) die Züchtung der so transfizierten Zelle in einem serumfreiem Medium in der Gegenwart eines potentiellen Dmk bindenden Liganden; und
c) die Identifizierung eines solchen Liganden, der das Überleben der transfizierten Zelle in einem serumfreiem Medium unterstützt.

Die vorliegende Erfindung hat auch diagnostische und therapeutische Anwendungen. In speziellen Ausführungsformen der Erfindung können Verfahren zum Nachweis von Abweichungen in der Funktion oder Expression des hier beschriebenen Rezeptors bei der Diagnose von muskulären oder anderen Störungen verwendet werden. In andern Ausführungsformen kann die Manipulation des Rezeptors oder Agonisten, die diesen Rezeptor binden, bei der Behandlung von neurologischen Erkrankungen, Erkrankungen des Muskels oder Störungen der neuromuskulären Einheit, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit, der amyotrophen Lateralsklerose (Lou Gehrig v-Krankheit) und der idiopathischen Torsionsdystonie, verwendet werden. In weiteren Ausführungsformen wird die extrazelluläre Domäne des Rezeptors als blockierendes Mittel verwendet, das die Bindung des Rezeptors an die Zielzelle blockiert.
Die Erfindung stellt somit in einer Ausführungsform ein ex vivo-Verfahren für die Diagnose einer muskulären oder anderen Störung in einem Patienten bereit, welches den Vergleich der Niveaus an Expression eines Dmk-Proteins der Erfindung in einer Probe des Patienten mit dem Niveau an Expression eines Dmk-Proteins der Erfindung in einer vergleichbaren Probe von einer gesunden Person umfaßt, wobei der Unterschied in den Niveaus an Expression des besagten Dmk-Proteins in dem Patienten im Vergleich mit der gesunden Person anzeigt, daß eine Störung in dem Patienten primär oder sekundär mit dem Dmk-Metabolismus zusammenhängen kann.
Die Erfindung stellt zur Verwendung bei einem Verfahren der Behandlung des Körpers eines Menschen oder eines Tieres, der/das an einer muskulären oder anderen Störung leidet, auch ein Protein der Erfindung oder ein Peptidfragment des besagten Proteins bereit.
Die Erfindung stellt des weiteren noch die Verwendung eines Proteins der Erfindung oder eines Peptidfragments davon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei einem Verfahren der Diagnose oder der Behandlung eines Menschen oder eines Tieres, der das an einer muskulären Störung leidet, bereit.
Die Erfindung stellt des weiteren noch ein Verfahren der Clonierung zumindest eines Teils eines Tyrosinkinase-Rezeptorgens bereit, umfassend:

(i) die Amplifikation von Tyrosinkinase codierenden Nucleinsäuresequenzen durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung einer Sammlung von cDNA-Molekülen als Matrize und unter Verwendung einer Kombination von Oligonucleotidprimern, umfassend: a) degenerierte Primer basierend auf SEQ ID. NR. 3; und b) degenerierte Primer basierend auf einer Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID. NR. 5, SEQ ID. NR. 7, SEQ ID. NR. 9, SEQ ID. NR. 11 und SEQ ID. NR. 13 umfaßt; oder eine Kombination von Oligonucleotiden, die Primer umfaßt, die die folgenden Sequenzen haben: c) SEQ ID NR. 4; und d) eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ ID. NR. 6, SEQ ID. NR. 8, SEQ ID. NR. 10, SEQ ID. NR. 12 und SEQ ID. NR. 14 umfaßt; und
(ii) die Clonierung der amplifizierten Nucleinsäure in einen geeigneten Vektor.

4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Nucleinsäure- und abgeleitete Aminosäure (Einbuchstabencode)-Sequenzen von dmk. Die Nucleotidsequenz, die reifes Dmk codiert, beginnt etwa bei Nucleotid 192.
2. Northern Blot, der die Verteilung von Dmk während der frühen Entwicklung zeigt. Spur 1: Gesamter Embryo E9; Spur 2: Gesamter Embryo E11; Spur 3: Plazenta E11; Spur 4: Embryokopf E12; Spur 5: Embryokörper E12; Spur 6: Embryorückenmark E12; Spur 7: Plazenta E12; Spur 8: Embryokopf E13; Spur 9: Embryokörper E13; Spur 10: Embryogehirn E17; Spur 11: Embryogehirn P1; Spur 12: Embryogehirn P10; Spur 13: Embryogehirn P19; Spur 14: ausgewachsenes Gehirn; Spur 15: ausgewachsener Muskel; Spur 16: ausgewachsener denervierter Muskel; wobei der Tag der Spermapositivität als Tag E1 bezeichnet wird und der Tag der Geburt als Tag P1.
3. Northern Blot, der die Verteilung von Dmk in ausgewachsenen Geweben zeigt. Spur 1: Gehirn; Spur 2: Geruchskolben; Spur 3: Cortex; Spur 4: Hippocampus; Spur 5: Thalamus/Hypothalamus; Spur 6: Mittelhirn; Spur 7: Hinterhirn; Spur 8: Cerebellum; Spur 9: Rückenmark; Spur 10: Thymus; Spur 11: Milz; Spur 12: Leber; Spur 13: Niere; Spur 14: Lunge; Spur 15: Ischiasnerv; Spur 16: Retina; Spur 17: Herz; Spur 18: Eierstock; Spur 19: Muskel; Spur 20: denervierter Muskel.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Tyrosinkinasemolekül bereit, das mit der trk-Familie von Tyrosinkinasen verwandt ist. Die Sequenz des Proteins ist in 1 als SEQ ID NO: 1 dargestellt. Wir glauben, daß die codierende Region des reifen Proteins bei oder etwa bei Serin-Glycin-Threonin bei oder etwa bei Position 20 der codierten Region beginnt.
Bei der neuen Tyrosinkinase, die hier beschrieben wird, wurde gefunden, daß sie in denerviertem Muskel induziert wird. Dementsprechend wurde sie versuchsweise als Dmk bezeichnet (denervierte Muskel-Kinase). Außer daß sie in Muskel, sowohl normalem als auch in denerviertem, und insbesondere im Herzen gefunden wird, wurde von Dmk auch gefunden, daß sie beträchtlich in der Milz, den Eierstöcken und der Retina vorliegt, aber nicht darauf beschränkt zu sein scheint. Sie scheint während der frühen Entwicklung vorhanden zu sein, wird aber auch in ausgewachsenem Gewebe gefunden.
Dmk kann mit der RTK von Torpedo verwandt sein, die von Jennings, et al., vorstehend identifiziert wurde. Sie unterscheidet sich jedoch dadurch, daß sie in denerviertem Muskel induziert zu sein scheint, wohingegen eine solche Induktion bezüglich der RTK von Torpedo nicht berichtet wurde. Darüber hinaus hat die RTK von Torpedo eine extrazelluläre Kringle-Domäne, während Dmk eine solche nicht hat. Diese Kinasen können jedoch Mitglieder derselben oder verwandter Familien sein.
Das Gen, das Dmk codiert, wurde cloniert und die DNA-Sequenz wurde bestimmt (1; SEQ ID NR: 2). Von der extrazellulären Domäne des reifen Proteins glaubt man, daß sie von der Nucleinsäuresequenz codiert wird, die bei oder etwa bei Position 192 beginnt und bei oder etwa bei Position 1610 endet. Vom Transmembranteil des Proteins glaubt man, daß er von der Nucleinsäuresequenz codiert wird, die bei oder etwa bei Position 1611 beginnt und bei oder etwa bei Position 1697 endet. Von der intrazellulären Domäne glaubt man, daß sie von der Nucleinsäuresequenz codiert wird, die bei oder etwa bei Position 1698 beginnt und bei oder etwa bei Position 2738 endet. Ein cDNA-Clon, der Dmk codiert, wurde bei der American Type Culture Collection am 13. Juli 1993 hinterlegt und ihm wurde die Zugangsnummer ATCC 75498 zugeteilt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Protein oder Peptid bereit, das die extrazelluläre Domäne von Dmk umfasst, und die Nucleinsäure, die die extrazelluläre Domäne codiert. Von der extrazellulären Domäne des Proteins glaubt man, daß sie aus den Aminosäuren bei oder etwa bei den Positionen 20 bis 492 der codierten Region besteht, die in SEQ ID NR: 1 dargestellt ist.
Dmk in der Maus kann unter Verwendung der hier beschriebenen Materialien und Verfahren zur Suche in menschlichen Bibliotheken, vorzugsweise vom Muskel abgeleitet, zur Identifikation des vergleichbaren Proteins im Menschen verwendet werden. Außerdem legt die Ähnlichkeit zwischen Dmk und RTK von Torpedo die Verwendung von Regionen von Sequenzhomologien innerhalb dieser Gene zur Entwicklung von Primern nahe, die für die Suche nach weiteren verwandten RTKs von Nutzen sind.
Stringente Bedingungen, wie sie hier verwendet werden, sind diejenigen, die (1) für das Waschen eine niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur verwenden, zum Beispiel 0,15 M NaCl/0,015 M Natriumcitrat/0,1% NaDodSO₄ bei 50°C, oder (2) während der Hybridisierung ein denaturierendes Mittel wie Formamid verwenden, zum Beispiel 50% (Vol./Vol.) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1 Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C.
Wenn Nucleotidsequenzen, die einen Teil der oder die gesamte Dmk gemäß der Erfindung codieren, zur Isolierung neuer Familienmitglieder von Dmk von anderen Arten verwendet werden, sollte die Länge der Sequenz mindestens ausreichend sein, um in der Lage zu sein, mit der endogenen mRNA der eigenen dmk des Wirbeltiers zu hybridisieren. Typischerweise wird eine ausreichende Sequenzgröße etwa 15 aufeinanderfolgende Basen sein (DNA oder RNA).
Strategien für die Identifizierung von neuen RTKs unter Verwendung von degenerierten Oligodesoxyribonucleotid-Primern, die Proteinregionen entsprechen, die Aminosäuren umgeben, die bei Tyrosinkinasen konserviert sind, wurden zuvor beschrieben (Wilks, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 1603–1607; Partanen, J., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 8913–8917; Lai und Lemke, 1991, Neuron 6: 691–704; Masiakowski und Carroll, 1992, J. Biol. Chem. 267: 26181–26190). Die Entdeckung der Verwandtschaft zwischen Dmk und der RTK von Torpedo durch die Anmelder hat zu der Identifizierung von bisher unbekannten Homologieregionen geführt, die bei Durchmusterungsstrategien verwendet werden können.
Der folgende Primer, basierend auf der Aminosäure-Homologiedomäne Asp-Val-Trp-Ala-Tyr-Gly (SEQ ID NO: 3) zwischen Dmk und RTK von Torpedo, kann in Kombination mit zusätzlichen Primern verwendet werden, die bekannten Homologieregionen entsprechen, die charakteristisch für RTKs sind, um verwandte Tyrosinkinasen zu isolieren, d.h. andere Familienmitglieder [alle Codes, die hier verwendet werden, die Aminosäuren und Nucleotide repräsentieren, sind wie in 37 C. F. R. &1.822(b) dargestellt]:
Die zusätzlichen Primer, die bekannten Homologieregionen entsprechen, die charakteristisch für RTKs sind, umfassen die folgenden:
Alternativ können Homologieregionen, die von Dmk und Mitgliedern verwandter Familien wie der Trk-Familie geteilt werden, in Strategien zur Isolierung von neuen RTKs verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin im Wesentlichen gereinigte Proteinmoleküle bereit, die die Aminosäuresequenz umfassen, wie sie im Wesentlichen in 1 für Dmk dargestellt ist (SEQ ID NO: 1), oder funktionell äquivalente Moleküle. Funktionell äquivalente Moleküle umfassen diejenigen, bei denen Aminosäurereste innerhalb der Sequenz für Reste ersetzt sind, die in einer stillen Veränderung resultieren. Zum Beispiel können eine oder mehrer Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität ersetzt werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt, was in einer stillen Veränderung resultiert. Substitutionen für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Zum Beispiel umfassen die nicht polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Im Umfang der Erfindung ebenfalls eingeschlossen sind Proteine oder Fragmente oder Derivate davon, die während oder nach der Translation unterschiedlich modifiziert werden, z.B. durch Glycosylierung, proteolytische Spaltung, Verknüpfung mit einem Antikörpermolekül oder einem anderen zellulären Liganden, usw.
Das hier beschriebene Dmk-Protein ist von Nutzen bei 1) Durchmusterungsstrategien, 2) Reinigungsstrategien und 3) diagnostischen Anwendungen. Bezüglich der Durchmusterungsstrategien stellen Expressionclonierungsstrategien, die auf dem Überleben von Zellen und Proliferationsstests beruhen, ein Verfahren zur Durchmusterung auf verwandte Liganden bereit (Glass, et al., (1991) Cell 66: 405–413). Da Liganden, die Dmk binden, an die Membran gebunden sein können, können andere Strategien für die Identifizierung solcher Rezeptoren geeigneter sein (Armitage, et al., 1992, Nature 357: 80–82; Smith, et al., 1993, Cell 73: 1349–1360). Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die extrazelluläre Domäne von Dmk mit einem Marker fusioniert, um ein chimäres Protein zu bilden, welches die Identifizierung und Reinigung der extrazellulären Domäne erlaubt, wenn sie an einen verwandten Liganden gebunden ist.
Wenn zum Beispiel der verwandte Ligand an eine Membran gebunden ist, wie von Smith et al., vorstehend, beschrieben, kann der extrazelluläre Teil von Dmk mit verkürzten schweren Ketten von Immunglobulinen (Fc) fusioniert sein. Das Fusionsprodukt kann dann verwendet werden um zum Beispiel mittels Durchflußcytometrie Zellen zu identifizieren, die einen Oberflächenliganden exprimieren, der den Rezeptor bindet. Alternativ können andere Markierungen wie myc, das verwendet wird, um die extrazelluläre Domäne von Dmk zu markieren, auch bei der Durchmusterung auf und der Reinigung von Dmk bindenden Liganden von Nutzen sein (Davis, et al., 1991, Science 253: 59–63; Squinto, et al., 1990, Neuron 5: 757–766).
Bei anderen Ausführungsformen wird der extrazelluläre Teil von RTKs, der bekannte Liganden bindet, durch den extrazellulären Teil von Dmk ersetzt. Meßbare Effekte wie Veränderungen beim Phänotyp oder die Induktion von Genen der frühen Antwort, die normalerweise mit der Bindung des bekannten Liganden an den Rezeptor assoziiert sind, können verwendet werden, um auf verwandte Liganden zu durchmustern, die vergleichbare Effekte induzieren.
Zum Beispiel können eine Zelllinie, die den eingebrachten Dmk-Rezeptor enthält, oder ein chimäres Protein, das die extrazelluläre Domäne von Dmk fusioniert mit der Transmembrandomäne und der intrazellulären Domäne einer anderen RTK (Dmk-chimärer Rezeptor) enthält, ebenso wie die ursprüngliche Zelllinie ohne den Rezeptor irgendeiner potentiellen Quelle eines Mittels ausgesetzt werden, das durch den Rezeptor wirken könnte; alle spezifischen Effekte (z.B. auf das Überleben der Zelle oder die Proliferation) bei der Zelle, die den Rezeptor oder die Chimäre trägt, können verwendet werden, um Mittel zu identifizieren, die auf diesen Rezeptor wirken, und um schließlich ein solches Mittel zu reinigen. Wenn einmal ein spezielles Rezeptor/Liganden-System definiert ist, kann eine Vielzahl von zusätzlichen spezifischen Testsystemen verwendet werden, um zum Beispiel zusätzliche Agonisten oder Antagonisten von Dmk zu suchen.
Gemäß der Erfindung können Dmk oder ein chimärer Dmk-RTK-Rezeptor, wenn sie in Zellen eingebracht wurden, die normalerweise diesen Rezeptor nicht exprimieren, verwendet werden, um Liganden, die den Rezeptor binden, basierend auf der unterscheidbaren Antwort der Zelle zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung erwägt, daß die Art der hervorgerufenen Antwort von der verwendeten Zelle abhängt und nicht vom spezifischen Rezeptor, der in die Zelle eingebracht wurde. So kann zum Beispiel die Expression des Dmk-Rezeptors in PC12-Phäochromocytom-Zellen beim Einwirken eines Liganden, der den Rezeptor bindet, in der Differenzierung der PC12-Zellen resultieren, während derselbe Rezeptor in Fibroblasten als Antwort auf einen Dmk bindenden Liganden sowohl das Überleben als auch die Proliferation vermitteln kann. Geeignete Zelllinien können ausgesucht werden, um eine Antwort von größtem Nutzen für den Test zu ergeben, ebenso wie für das Auffinden von Mitteln, die auf Tyrosinkinase-Rezeptoren einwirken können. "Mittel" betrifft jedes Molekül/alle Moleküle, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Peptidmoleküle und nicht peptidische Moleküle, die in Systemen wirken werden, die in einer Rezeptor-abhängigen Art beschrieben werden können.
Eines der nützlicheren Systeme, das benutzt werden kann, umfaßt die Einbringung des gewünschten Rezeptors in eine von Wachstumfaktoren abhängige Fibroblasten-Zelllinie; ein solcher Rezeptor, der normalerweise nicht proliferative Antworten vermittelt, kann nach Einbringung in Fibroblasten trotzdem mittels einer Vielzahl von gut etablierten Verfahren getestet werden, die verwendet werden, um die Effekte von Fibroblasten-Wachstumfaktoren zu quantifizieren (z.B. Thymidineinbau oder andere Arten von Proliferationstests; vgl. van Zoelen, 1990, "The Use of Biological Assays For Detection Of Polypeptide Growth Factors" in Progress in Factor Research, Bd. 2, S. 131–152; Zhan und M. Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol., Bd. 6, S. 3541–5344). Diese Tests haben den zusätzlichen Vorteil, daß jede Präparation sowohl mit der Zelllinie, die den eingebrachten Rezeptor enthält, ebenso wie mit der ursprünglichen Zelllinie ohne den Rezeptor getestet werden kann; nur spezifische Effekte auf die Zelllinie mit dem Rezeptor würden als durch den eingebrachten Rezeptor vermittelt angesehen werden.
Eine Zelle, die einen Orphan-Rezeptor exprimiert, der hier beschrieben ist, kann diesen Rezeptor entweder natürlicherweise exprimieren oder gentechnisch so verändert sein, daß sie dies tut. Zum Beispiel können Nucleinsäuresequenzen, die, wie in Abschnitt 6 oder 8 nachstehend beschrieben, erhalten wurden, durch Transfektion, Transduktion, Mikroinjektion, Elektroporation, über ein transgenes Tier, usw. unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannten Verfahrens in eine Zelle eingebracht werden.
Die spezifische Bindung eines Testmittels an den Orphan-Rezeptor kann mittels einer Reihe von Wegen gemessen werden. Zum Beispiel kann die aktuelle Bindung eines Testmittels an Zellen nachgewiesen oder gemessen werden, indem man nachweist oder mißt (i) Testmittel, das an die Oberfläche von intakten Zellen gebunden ist; (ii) Testmittel, das mit dem Rezeptorprotein in Zelllysaten verknüpft ist; oder (iii) Testmittel, das an den Rezeptor in vitro gebunden ist. Die spezifische Wechselwirkung zwischen Testmittel und dem Rezeptor kann unter Verwendung von Reagentien bewertet werden, die die einzigartigen Eigenschaften dieser Wechselwirkung demonstrieren.
Alternativ kann die spezifische Bindung des Testmittels an den Rezeptor durch die Bewertung der sekundären biologischen Effekte der Bindung Rezeptor/Ligand gemessen werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, der Induktion der Sprossung von Neuriten, der sehr frühen Genexpression oder der Phosphorylierung des Rezeptors. Zum Beispiel kann die Fähigkeit eines Testmittels zur Induktion der Sprossung von Neuriten in Zellen getestet werden, denen der Rezeptor fehlt, und in vergleichbaren Zellen, die zum Beispiel einen chimären Rezeptor exprimieren, der die extrazelluläre Domäne von Dmk und die intrazelluläre Domäne eines Mitglieds der Trk-Familie umfaßt; die Sprossung von Neuriten in Rezeptor exprimierenden Zellen, aber nicht in den vergleichbaren Zellen, denen der Rezeptor fehlt, wäre ein Indiz einer spezifischen Wechselwirkung Testmittel/Rezeptor. Eine ähnliche Analyse könnte durch Nachweis der Induktion von sehr frühen Genen (z.B. fos und jun) in Rezeptor- minus und Rezeptor-plus Zellen durchgeführt werden, oder durch den Nachweis der Phosphorylierung des Rezeptorproteins unter Verwendung von Standard-Phosphorylierungtests, die im Stand der Technik bekannt sind.
In ähnlicher Weise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung eines Mittels bereit, das Signaltransduktionsaktivität hat, umfassend (i) die Begegnung einer Zelle, die einen Tyrosinkinase-Rezeptor exprimiert, wie er hier beschrieben ist, mit einem Testmittel und (ii) Nachweis der spezifischen Bindung des Testmittels an den Rezeptor, wobei die spezifische Bindung an den Rezeptor mit der Signaltransduktionsaktivität positiv korreliert. Die spezifische Bindung kann entweder durch Testung auf die direkte Bindung nachgewiesen werden oder auf die sekundären biologischen Effekte der Bindung, wie vorstehend diskutiert. Ein solches Verfahren kann insbesondere bei der Identifizierung neuer neurotropher Faktoren oder von Faktoren, die eine andere pharmazeutische Aktivität wie cardioprotektive Aktivität haben, oder in der pharmazeutischen Industrie bei der Durchmusterung eines großen Satzes von peptidischen und nicht peptidischen Mitteln (d.h. Peptidomimetika) auf solche Aktivitäten von Nutzen sein.
Bei einer bevorzugten, spezifischen, nicht einschränkenden Ausführungsform der Erfindung kann ein großes Gitter an Kulturmulden hergestellt werden, die in abwechselnden Reihen PC12 (oder Fibroblasten, siehe nachstehend)-Zellen enthalten, die entweder Rezeptor-negativ sind oder verändert wurden, so daß sie Rezeptor-positiv sind. Eine Vielzahl an Testmitteln kann dann zugegeben werden, so daß jede Säule des Gitters oder ein Teil davon ein verschiedenes Testmittel enthält. Jede Mulde könnte dann auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Sprossung von Neuriten überprüft werden. Auf diese Weise könnte eine extrem große Zahl an Testmitteln auf Signaltransduktionsaktivität durchmustert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Testsysteme bereit, die gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden können. Solche Testsysteme können in vitro-Präparationen von Rezeptor enthalten, z.B. fixiert an einen festen Träger, oder sie können vorzugsweise Zellen umfassen, die die hier beschriebenen Rezeptorproteine exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Wirtszellen und Mikroorganismen und Vektoren bereit, die die vorstehend beschriebenen rekombinanten Nucleinsäuremoleküle enthalten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Dmk. Zellen, die Rezeptorprotein exprimieren, können durch Transfektion, Transduktion, Elektroporation, Mikroinjektion, über ein transgenes Tier, usw. mit Nucleinsäure, die Dmk codiert, in einem geeigneten Expressionsvektor gentechnisch verändert werden, damit sie Rezeptor produzieren, wie vorstehend beschrieben. In speziellen Ausführungsformen ist die Wirtszelle, die die rekombinante Nucleinsäure enthält, eine tierische Zelle, wie COS. Bei anderen Ausführungsformen ist die Wirtszelle ein Bakterium, vorzugsweise Escherichia coli.
Jedes der Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet für die Inserierung von DNA-Fragmenten in einen Vektor bekannt sind, können für die Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die den Rezeptor codieren. Diese Verfahren können rekombinante in vitro-DNA- und synthetische Techniken und in vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination) umfassen. Die Expression von Nucleinsäuresequenzen, die das Rezeptorprotein oder ein Peptidfragment codieren, kann von einer zweiten Nucleinsäuresequenz reguliert werden, so daß das Rezeptorprotein oder -peptid in einem Wirt exprimiert wird, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist. Zum Beispiel kann die Expression des Rezeptors durch jedes Promotor/Enhancer-Element kontrolliert werden, das im Stand der Technik bekannt ist. Promotoren, die für die Kontrolle der Rezeptorexpression verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die lange terminale Wiederholung, wie beschrieben von Squinto et al., (1991, Cell 65: 1–20); die frühe SV40 Promotorregion (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), den CMV-Promotor, die 5''-terminale Wiederholung von M-MuIV, den Promotor der in der 3' langen terminalen Wiederholung vom Rous-Sarcoma-Virus enthalten ist (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787–797), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 144–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42); prokaryontische Expressionsvektoren wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727–3731) oder den tac-Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21–25), vgl. auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94; Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen wie den Gal 4-Promotor, den ADH (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, den PGK (Phosphoglycerin-Kinase)-Promotor, den Promotor der alkalischen Phosphatase und die folgenden tierischen Transkriptionskontrollregionen, die Gewebespezifität zeigen und in transgenen Tieren verwendet wurden: Elastase I-Genkontrollregion, die in azinösen Zellen des Pankreas aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38: 639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425–515); die Kontrollregion des Insulingens, die in pankreatischen beta-Zellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 314: 115–122); die Kontrollregion des Immunglobulingens, die in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444), die Kontrollregion des Brustkrebsvirus der Maus, die in Hoden-, Brust-, lymphoiden und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45: 485–495), die Kontrollregion des Albumingens, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268–276), die Kontrollregion von alpha-Fetoprotein, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53–58), die Kontrollregion des alpha 1-Antitrypsingens, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171), die Kontrollregion des beta-Globingens, die in myeloiden Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338–340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89–94); die Kontrollregion des Gens für das basische Myelin Protein, die in Oligodendrocytenzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712); die Kontrollregion des Gens für die leichte Kette-2 von Myosin, die in Skelettmuskel aktiv ist (Sani, (1985), Nature 314: 283–286) und die Kontrollregion des Gens für Gonadotropin freisetzendes Hormon, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234: 1372–1378).
Expressionsvektoren, die Rezeptor codierende Geninserierungen enthalten, können mittels drei allgemeiner Wege identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und (c) die Expression von inserierten Sequenzen. Beim ersten Weg kann die Anwesenheit eines fremden Gens, das in einen Expressionsvektor inseriert ist, unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, die zu dem inserierten Gen homolog sind, mittels DNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen werden. Beim zweiten Weg kann das rekombinante Vektor/Wirt-System basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit gewisser "Marker"-Genfunktionen (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformations-Phänotyp Bildung von Einschlußkörpern in Baculovirus, usw.) identifiziert und selektiert werden, die durch die Inserierung von fremdem Genen in den Vektor verursacht werden. Wenn zum Beispiel das den Rezeptor codierende Gen in die Markergensequenz des Vektors inseriert ist, können die Rekombinanten, die die Geninserierung enthalten, durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden. Beim dritten Weg können rekombinante Expressionsvektoren durch Test auf fremde Genprodukte identifiziert werden, die durch den rekombinanten Vektor exprimiert werden. Solche Test können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Rezeptor codierenden Genprodukts beruhen, zum Beispiel der Bindung des Rezeptors an einen neurotrophen Faktor oder an einen Antikörpern, der den Rezeptor direkt erkennt. Die Zellen der vorliegenden Erfindung können die Rezeptoren oder Teile davon transient oder vorzugsweise konstitutiv und permanent exprimieren.
Bei bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Zellen bereit, die die hier beschriebenen Rezeptoren oder Teile davon exprimieren und die auch eine rekombinante Nucleinsäure enthalten, die einen unmittelbaren frühen Genpromotor enthalten [z.B. die fos- oder jun-Promotoren (Gilman et al., 1986 Mol. Cell. Biol. 6: 4305–4316)]. Wenn eine solche Zelle einem Liganden ausgesetzt wird, der an den Rezeptor bindet, induziert die Bindung sekundär die Transkription durch den sehr frühen Promotor. Eine solche Zelle kann durch Messung der Transkriptionsaktivität des sehr frühen Genpromotors durch zum Beispiel nukleäre Run-oft-Analyse, Northern Blot-Analyse oder durch Messung des Niveaus eines Gens, das durch den Promotor kontrolliert wird, zum Nachweis der Bindung Rezeptor/Ligand verwendet werden. Der sehr frühe Promotor kann zur Kontrolle der Expression von fos oder jun oder von jedem nachweisbaren Genprodukt verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, jedes bekannten Reportergens, wie eines Gens, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Murphy und Efstratiadis, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 8277–8281), Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), Neomycin-Phosphotransferase (neo), beta-Galactosidase, beta-Glucuronidase, beta-Galactosidase, usw., des Nachweises oder der Messung der Neurotrophin-Aktivität.
Darüber hinaus können die Zellen, die bei den Testsystemen der Erfindung verwendet werden, Zellen des Nervensystems sein oder auch nicht. Zum Beispiel können bei einer spezifischen, nicht beschränkenden Ausführungsform der Erfindung von Wachstumsfaktor abhängige Fibroblasten als Basis für ein Signaltransduktions- Testsystem verwendet werden. Eine Fibroblastenzelllinie, die in serumfreien Medien von Wachstumsfaktor abhängig ist (z.B. wie beschrieben von Zham und Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 3541–3544), kann mit einem Rezeptor codierenden Gen, zum Beispiel unter Verwendung eines CaPO4-Transfektionsprotokolls, mit 5 Mikrogramm DNA eines Expressionsvektors auf der Basis des CMV-Promotors, der das dmk-Gen umfaßt, und einem Mikrogramm eines das Hygromycin-Resistenzgen enthaltenden Expressionsvektors transfiziert werden. Nach etwa 48 Stunden können die Zellen dann gemäß ihrer Hygromycin-Resistenz selektiert werden, um positive Transfektanten zu selektieren. Die Zellen können dann etwa 3 Wochen in der Gegenwart von Hygromycin gezüchtet werden und dann können die resistenten Kolonien vereint werden. Diese Zellen können dann auf Gewebekulturplatten ausplattiert werden, die mit poly-D-Lysin und mit menschlichem Fibronectin beschichtet sind, und man lässt sie etwa vier Stunden in DMEM plus 10% Kälberserum wachsen, um die Bindung der Zellen an die Platten zu erlauben. Das Serum enthaltende Medium kann dann abgesaugt werden und die Zellen können etwa dreimal mit PBS gewaschen werden, um jegliches restliche Serum zu entfernen. Die Zellen können dann mit einem serumfreien definierten Medium aufgenommen werden (ein 3:1-Gemisch an DMEM und Hams F12, ergänzt mit 8 mM Natriumbicarbonat, 15 mM HEPES, 4 × 10^–6 M MnCl₂, 3 mM Histidin, 10^–5 M Ethanolamin, 10^–7 M Natriumselenit, 5 mg Transferrin pro Liter, 200 mg Rinderserumalbumin-Linolsäure-Komplex pro Liter, Gentamicin, Penicillin und Streptomycin, 20 mM L-Glutamin). Von auf diese Weise produzierten Zellen, die dann mit einem Faktor inkubiert werden, der fähig ist, an Dmk zu binden, kann man nach etwa 5 Tagen in Kultur (bei Ersatz des Mediums und der Wachstumsfaktoren alle 48 Stunden) erwarten, daß sie wachsen und proliferieren; Zellen, die mit einem nicht verwandten Liganden mit 100 ng/ml behandelt wurden, oder in serumfreiem Medium vorliegen, sollten jedoch nicht proliferieren.
Ein weiterer Einblick in die physiologische Rolle von Dmk wird von der Definition seines Liganden kommen. Weil die Kinasedomäne des Dmk-Proteins mit anderen Rezeptortyrosinkinasen verwandt zu sein scheint, ist es wahrscheinlich, daß dieses Protein in die Signaltransduktion von Zellen involviert ist, in denen es exprimiert wird. Dementsprechend können Dmk bindende Liganden, die unter Verwendung des hier beschriebenen Rezeptors gefunden wurden, verwendet werden, um die Signaltransduktion in natürlicherweise vorkommenden, Dmk exprimierenden Zellen zu induzieren, welche Zellen, die in Muskelgewebe gefunden werden, ebenso wie im Herz, in der Milz, den Eierstöcken und der Retina, ebenso wie Zellen einschließen, die so verändert wurden, daß sie das Dmk-Protein exprimieren. Es wird angenommen, daß solche Liganden das Wachstum oder das Überleben solcher Zellen fördern können.
Wie vorstehend beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung einen Tyrosinkinase-Rezeptor, der in denerviertem Muskel exprimiert zu sein scheint. Gemäß der vorliegenden Erfindung können Sonden, die in der Lage sind, diese Rezeptoren zu erkennen, verwendet werden, um durch Messung veränderter Niveaus des Rezeptors in Zellen oder Geweben Krankheiten oder Störungen zu identifizieren. Solche Krankheiten oder Störungen können wiederum unter Verwendung von Liganden, die an diese Rezeptoren binden, behandelbar sein. Solche Störungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, diejenigen, bei denen eine atrophische oder dystrophische Veränderung von Muskel der grundlegende pathologische Befund ist. Zum Beispiel kann Muskelatrophie von Denervierung wegen Nerventrauma resultieren (Verlust des Kontakts des Muskels mit seinem Nerv); von degenerativer, metabolischer oder entzündlicher Neuropathie (z.B. Guillian-Barre-Syndrom), von peripherer Neuropathie oder von Schädigung von Nerven, die durch Umgebungstoxine oder Drogen hervorgerufen werden. In einer anderen Ausführungsform resultiert die Muskelatrophie von Denervierung wegen einer Motoneuronopathie. Solche Motoneuronopathien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die adulte Motorneuronkrankheit, einschließlich Amyotropher Lateralsklerose (ALS oder Lou Gehrig v-Disease); infantile und juvenile muskuläre Atrophien des Rückgrats und die Autoimmun-Motoneuronopathie mit multifocalem Leitungsblock. Bei einer anderen Ausführungsform resultiert die Muskelatrophie von chronischer Nichtverwendung. Eine solche Atrophie wegen Nichtverwendung kann von Zuständen herrühren wie: Paralyse wegen Schlaganfall, Rückgratverletzung; Skelettimmobilisierung wegen Trauma (wie Bruch, Verrenkung oder Dislokation) oder längerer Bettruhe, sind aber nicht darauf beschränkt. Bei noch einer anderen Ausführungsform resultiert die Muskelatrophie von metabolischem Streß oder unzureichender Ernährung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kachexie wegen Krebs und anderen chronischen Krankheiten, Fasten oder Rhabdomyolyse, endokrine Störungen wie Störungen der Thymusdrüse und Diabetes, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Muskelatrophie kann auch auf ein muskuläres Dystrophiesyndrom zurückzuführen sein, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, des Duchenne-, Becker-, myotonischen, Fascioscapulohumeral-, Emery-Dreyfuss-, oculopharyngealen, scapulohumeralen, limb girdle- und congenitalen Typs, und die Dystrophie, die als Vererbbare Distale Myopathie bekannt ist. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Muskelatrophie auf eine congenitale Myopathie zurückzuführen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Gutartiger Congenitaler Hypotonie, Central Core-Krankheit, Nemalin-Myopathie und Myotubuläre (centronukleäre) Myopathie. Außerdem können Dmk und seine assoziierten Liganden bei der Behandlung von erworbenen (toxischen oder entzündlichen) Myopathien von Nutzen sein. Myopathien, die als Folge einer entzündlichen Krankheit des Muskels auftreten, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Polymyositis und Dermatomyositis. Toxische Myopathien können aufgrund von Mitteln auftreten, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Adiodaron, Chloroquin, Clofibrat, Colchicin, Doxorubicin, Ethanol, Hydroxychloroquin, Organophosphate, Perihexilin und Vincristin.
Obwohl wir nicht durch eine Theorie gebunden sein wollen, hat die vorläufige Kartierung von Dmk in der Maus ergeben, daß das Gen auf dem Chromosom 4 der Maus lokalisiert ist, in einer Region der Homologie mit dem Chromosom 9q des Menschen. Mutationen bei Mäusen, die mit dieser Region des Chromosoms 4 assoziiert sind, umfassen die "wi"-Mutation (whirler), die in Symptomen des Schüttler („shaker")-Syndroms resultieren, einschließlich Taubheit, Kopfwälzen, Drehen und Hyperaktivität (Lane, P. W. 963, J. Hered. 54: 263–266). Eine andere Mutation bei Mäusen, die mit dieser Region von Chromosom 4 assoziiert ist, ist die "vc"-Mutation (Schwankende), die mit Symptomen von heftigem Zittern beim Laufen und mit Schwanken des Hinterteils assoziiert ist (Sirlin, J. L., 1956, J. Genet. 54: 42–48).
Beim Menschen ist die Krankheit, die als idiopathische Torsionsdystonie (ITD) bekannt ist, mit einem Gen assoziiert, das durch Kopplungsanalyse auf dem menschlichen Chromosom 9q Bande 34 kartiert wurde. Diese Krankheit ist charakterisiert durch anhaltende, nicht gewollte Muskelkontraktionen, die häufig Verwinden und wiederholte Bewegungen mit anomaler Haltung verursachen.
Sollte gefunden werden, daß ein Defekt bei dmk mit diesen Krankheiten assoziiert ist, kann sich die vorliegende Erfindung bei der Gentherapie für den Ersatz eines solchen Gens in situ von Nutzen erweisen. Alternativ können Sonden, die ein einzelnes Segment des Dmk-Gens verwenden, sich bei der Diagnose solcher Krankheiten als nützlich erweisen.
Die Erfindung stellt ein ex vivo-Verfahren für die Diagnose einer neurologischen oder anderen Störung in einem Patienten bereit, welches den Vergleich der Niveaus an Expression von Dmk in einer Probe des Patienten mit dem Niveau an Expression von Dmk in einer vergleichbaren Probe von einer gesunden Person umfaßt, wobei ein Unterschied in den Niveaus an Expression von Dmk in dem Patienten im Vergleich mit der gesunden Person anzeigt, daß eine Störung in dem Patienten primär oder sekundär mit dem Dmk-Metabolismus zusammenhängen kann. Eine Patientenprobe kann jede Zelle, jedes Gewebe oder jede Körperflüssigkeit sein, ist aber vorzugsweise Muskelgewebe oder cerebrale Rückenmarksflüssigkeit.
Eine Art von Sonde, die verwendet werden kann, ist ein anti-Dmk-Antikörper oder Fragmente davon, die die bindende Domäne des Antikörpers enthalten.
Das Dmk-Protein oder Fragmente davon können als ein Immunogen zur Erzeugung von anti-Dmk-Antikörpern verwendet werden. Durch die Bereitstellung der Produktion von relativ reichlichen Mengen an Dmk-Protein unter Verwendung von rekombinanten Techniken für die Proteinsysnthese (basierend auf den Dmk-Nucleinsäuresequenzen der Erfindung) wurde das Problem der beschränkten Mengen an Dmk überwunden.
Um die Wahrscheinlichkeit der Produktion einer anti-Dmk-Immunantwort weiter zu verbessern, kann die Aminosäuresequenz von Dmk analysiert werden, um Teile des Moleküls zu identifizieren, die mit erhöhte Immunogenität assoziiert sein können. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz einer Computeranalyse unterworfen werden, um Oberflächenepitope zu identifizieren, die vom Computer erzeugte Darstellungen der Hydrophilie, Oberflächenwahrscheinlichkeit, Flexibilität, des antigenen Index, von amphiphiler Helix, von amphiphiler Blattstruktur und sekundärer Struktur von Dmk sind. Alternativ könnten die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Dmk von verschiedenen Arten verglichen werden und relativ nicht homologe Regionen identifiziert werden; diese nicht homologen Regionen wären wahrscheinlicher immunogen über verschiedene Arten hinweg.
Für die Herstellung von monoclonalen Antikörpern, die gegen Dmk gerichtet sind, kann jede Technik verwendet werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur bereitstellt. Zum Beispiel sind die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Köhler und Milstein entwickelt wurde (1975, Nature 256: 495–497), ebenso wie die Triomtechnik, die Hybridomtechnik mit menschlichen B-Zellen (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Herstellung von menschlichen monoclonalen Antikörpern (Cole et al., 1985, in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc. S. 77–96) und dergleichen im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die monoclonalen Antikörper für die therapeutische Verwendung können menschliche monoclonale Antikörper oder chimäre monoclonale Mensch-Maus (oder andere Arten)-Antikörper sein. Menschliche monoclonale Antikörper können mittels einer einer Reihe von Techniken gemacht werden, die im Stand der Technik bekannt sind (z.B. Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 7308–7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72–79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92: 3–16). Chimäre Antikörpermoleküle können so hergestellt werden, daß sie eine Antigen bindende Domäne der Maus zusammen mit konstanten Regionen des Menschen enthalten (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851, Takeda et al., 1985, Nature 314: 452).
Verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, können für die Produktion von polyclonalen Antikörpern gegen Epitope von Dmk verwendet werden. Für die Produktion von Antikörper können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit Dmk-Protein oder einem Fragment oder Derivat davon immunisiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten usw. Verschiedene Adjuvantien können zur Erhöhung der Immunantwort verwendet werden, in Abhängigkeit von der Art des Wirts, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Freund's (vollständig und unvollständig), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, KLH („Keyhole Limpet Hemocyanines"), Dinitrophenol und potentiell nützliche menschliche Adjuvantien wie BCG (Bacillus Calmette-Guérin) und Corynebacterium parvum.
Ein molekularer Clon eines Antikörpers gegen ein Dmk-Epitop kann mittels bekannter Techniken hergestellt werden. Die rekombinante DNA-Technik (vgl. z.B. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) kann verwendet werden, um Nucleinsäuresequenzen zu konstruieren, die ein Molekül eines monoclonalen Antikörpers oder seine Antigen bindende Region codieren.
Antikörpermoleküle können mittels bekannter Techniken gereinigt werden, z.B. Immunabsorptions- oder Immunaffinitätschromatographie, chromatographischen Verfahren wie HPLC (Hochleistungsflüssigchromatographie) oder einer Kombination davon, usw.
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können mittels bekannter Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel umfassen solche Fragmente, sind aber nicht beschränkt auf: das F(ab')₂-Fragment, das durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls produziert werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduzierung der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können; und die Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpers mit Papain und einem reduzierenden Mittel hergestellt werden können.
Die vorstehend erwähnten Sonden können experimentell zur Identifizierung von Zellen und Geweben verwendet werden, von denen bis jetzt nicht gezeigt worden war, daß sie Dmk exprimieren. Darüber hinaus können diese Verfahren verwendet werden, um die Expression von Dmk in anormalen Geweben wie bösartigen Geweben zu identifizieren. Bei zusätzlichen Ausführungsformen können diese Verfahren dignostisch verwendet werden, um die Expression von Dmk in Zellen, Flüssigkeiten oder Gewebe von einem Patienten, der an einer Störung leidet, mit vergleichbaren Zellen, Flüssigkeiten oder Gewebe von einer gesunden Person zu vergleichen. Flüssigkeit ist so zu verstehen, daß sie jede Körperflüssigkeit betrifft, aber insbesondere Blut oder Rückenmarksflüssigkeit. Eine Differenz bei den Niveaus der Expression von Dmk in dem Patienten im Vergleich mit einer gesunden Person kann anzeigen, daß die Störung des Patienten primär oder sekundär mit dem Dmk-Metabolismus zusammenhängen kann. Eine Erhöhung bei den Niveaus von Dmk könnte zum Beispiel entweder andeuten, daß die Störung des Patienten mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber normalen Niveaus an Dmk bindendem Liganden assoziiert ist oder kann alternativ nahe legen, daß die Niveaus an Dmk bindendem Liganden des Patienten niedrig sind, so daß die Zahl an Rezeptoren zur Kompensation erhöht ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung von löslichem Rezeptor (der extrazellulären Domäne) bereit, um der Wirkung von einem Liganden auf Dmk exprimierenden Zellen zu begegnen. Eine solche Blockierung wäre zum Beispiel dann wünschenswert, wenn man finden würde, daß das verwandte Mittel unerwünschte mitogene Eigenschaften hat.
6. BEISPIEL: CLONIERUNG DER cDNA, DIE Dmk CODIERT
6.1 MATERIALIEN UND METHODEN
Die Homologiedomänen von Tyrosinkinase wurden auf der Basis der Aneinanderlagerungen von Hanks et al. (1988) Science 241, 42–52, identifiziert. Die hoch konservierten Regionen Asp-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn (SEQ ID NR: 7) und Asp-Val-Trp-Ser-Tyr-Gly (SEQ ID NR: 13) wurden durch den Entwurf der folgenden degenerierten Oligonucleotidprimer verwendet:
mit denen unter Verwendung von cDNAs von deneviertem Muskel PCR-Reaktionen durchgeführt wurden. Die resultierenden amplifizierten DNA-Fragmente wurden durch Inserierung in Plasmide cloniert, sequenziert und die DNA-Sequenzen wurden mit denen aller bekannten Tyrosinkinasen vergleichen. Durch reverse Transkription wurden unter Verwendung von Oligo-d(T)-Primern cDNA-Matrizen von RNAs von deneviertem Muskel hergestellt. Die PCR-Reaktionen wurden bei Primeranlagerungstemperaturen von 40°C durchgeführt. Teilmengen der PCR-Reaktionen wurden der Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen.
Die größensortierten amplifizierten DNA-Fragmente von diesen PCR-Reaktionen wurden wie folgt in Plasmide cloniert: jede PCR-Reaktion wurde, wie vorstehend beschrieben, erneut amplifiziert, mit XhoI und SacI verdaut, um Stellen in den Termini der Primer zu spalten (vgl. nachstehend). Mit XhoI/SacI geschnittene DNAs wurden mit dem Magic PCR-Kit (von Promega) gereinigt und in kompatible XhoI/SacI-Stellen in dem Bluescript II SK(+)-Plasmid cloniert, dieses wurde durch Elektroporation in E. coli DH108 eingebracht, gefolgt von Ausplattieren der Transformanten auf selektivem Agar. Ampicillin-resistente bakterielle Kolonien von der PCR-Transformation wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Mulden inokuliert und unter Verwendung der Vektorprimer (T3 und T7), die die Tyrosinkinaseinserierung flankieren, für die PCR verwendet, und diese PCR-Fragmente wurden durch Sequenzierung analysiert.
Eine der clonierten Fragmentsequenzen enthielt ein Segment einer neuen Tyrosinkinasedomäne, die als Dmk bezeichnet wurde. Die Sequenz des von der PCR abgeleiteten Fragments, das Dmk entspricht, wurde verwendet, um PCR-Primer herzustellen, um mittels des RACE-Verfahrens längere, Dmk-spezifische Fragmente zu erhalten. Diese längeren Dmk-Sonden wurden als Hybridisierungssonden zur Gewinnung von Dmk-cDNA-Clonen voller Länge aus einer cDNA-Bibliothek von denerviertem Skelettmuskel der Ratte verwendet. Die DNA wurde unter Verwendung eines ABI 373A-DNA-Sequenziergeräts und des Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert. Die Sequenz von Dmk (1; SEQ ID NR: 1) hat ein hohes Maß an Homologie mit Mitgliedern der trk-Familie von Proteinen. Es wurde auch gefunden, daß sie der in Muskel gefundenen Torpedo-RTK von Jennings et al. ähnlich ist.
6.2 RESULTATE UND DISKUSSION
Oligonucleotidprimer, die den konservierten Regionen von bekannten Tyrosinkinasemolekülen entsprechen, wurden für die Amplifikation und Clonierung von DNA-Sequenzen verwendet, die neue Orphan-Tyrosinkinase-Rezeptormoleküle codieren. Die Aminosäuresequenzen von Vertretern von Zweigen der Tyrosinkinase-Familie und die Homologieregionen innerhalb der katalytischen Domäne von diesen Proteinen wurden zur Planung von degenerierten Oligonucleotidprimern verwendet. Diese Primer wurden zum Primen von PCR-Reaktionen unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek von denerviertem Muskel der Ratte als Matrize verwendet. Die resultierenden amplifizierten DNA-Fragmente wurden dann in das Bluescript II SK(+)-Plasmid cloniert, sequenziert und die DNA-Sequenzen mit denen von bekannten Tyrosinkinasen verglichen. Die Sequenz eines PCR-Fragments, das eine neue Tyrosinkinase codierte, die als Dmk bezeichnet wurde, wurde verwendet, um mehr benachbarte DNA-Sequenzen zu erhalten. Ein DNA-Fragment, das Dmk-Sequenzen enthielt, wurde als Sonde zur Gewinnung eines cDNA-Clons aus einer Bibliothek aus denerviertem Skelettmuskel verwendet. Dieser Clon codiert einen neuen Tyrosinkinase-Rezeptor mit einem hohen Maß an Homologie mit Mitgliedern der trk-Proteinfamilie. Es wurde auch gefunden, daß er mit der Torpedo-RTK von Jennings et al. homolog ist.
1 stellt die Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 2) des Dmk-Clons dar.
7. BEISPIEL: IDENTIFIZIERUNG ZUSÄTZLICHER TYROSINKINASEN
Die Neue Dmk-Sequenz wird verwendet, um homologe Segmente von anderen Rezeptortyrosinkinasen zu erhalten, die nun in Kombination mit anderen homologen Segmenten verwendet werden können. Zum Beispiel zeigt die Aneinanderlagerung der mit trk verwandten Kinase von Torpedo und von DmK das folgende konservierte Proteinsegment:
Diese Homologie-"Box" ist bei keinem anderen Tyrosinkinaserezeptor des Säugers vorhanden. Degenerierte Oligonucleotide, die im Wesentlichen auf dieser "Box" basieren, können in Kombination mit entweder schon bekannten oder neuen Tyrosinkinase-Homologiesegmenten zur Identifizierung von neuen Tyrosinkinase-Rezeptoren verwendet werden.
7.1 MATERIALIEN UND METHODEN
Die hoch konservierten Regionen zwischen Dmk und Torpedo-TRK Asp-Val-Trp-Ala-Tyr-Gly (SEQ ID NR: 3) ebenso wie zusätzliche Primer, basierend auf bekannten Homologieregionen, wie die SEQ ID NRS 5, 7, 9 oder 11 werden bei der Planung von degenerierten Oligonucleotidprimern verwendet, welche zum Primen von PCR-Reaktionen unter Verwendung von cDNAs verwendet werden können. cDNA-Matrizen werden durch reverse Transkription von Gewebe-RNAs unter Verwendung von Oligo-d(T) oder anderen geeigneten Primern erzeugt. Teilmengen der PCR-Reaktionen werden einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen. Die resultierenden amplifizierten DNA-Fragmente werden durch Inserierung in Plasmide cloniert, sequenziert und die DNA-Sequenzen wird, mit denen aller bekannten Tyrosinkinasen verglichen.
Die größensortierten DNA-Fragmente von diesen PCR-Reaktionen werden wie folgt in Plamide cloniert: jede PCR-Reaktion wurde wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, erneut amplifiziert, mit XhoI und SacI verdaut, um Stellen in den Termini der Primer zu spalten (vgl. nachstehend). Mit XhoI/SacI geschnittene DNAs werden in kompatible XhoI/SacI-Stellen in einem Plasmid cloniert, dieses wird durch Elektroporation in E. coli eingebracht, gefolgt von Ausplattieren der Transformanten auf selektivem Agar. Ampicillin-resistente bakterielle Clone von der PCR-Transformation werden in Mikrotiterplatten mit 96 Mulden inokuliert und individuelle Kolonien von diesen PCR-Clonen werden durch Sequenzierung von Plamid-DNAs analysiert, die mittels Standard-Plasmid-Miniprep-Verfahren gereinigt werden.
Die clonierten Fragmente, die ein Segment einer neuen Tyrosinkinasedomäne enthalten, werden als eine Hybridisierungssonde verwendet, um cDNA-Clone voller Länge aus einer cDNA-Bibliothek zu erhalten.
8. BEISPIEL: GEWEBESPEZIFISCHE EXPRESSION VON Dmk
8.1 MATERIALIEN UND METHODEN
Ein Fragment von 680 nt, das die Tyrosinkinasedomäne von Dmk enthält, wurde radiomarkiert und bei der Northern-Analyse von verschiedenen Rattengewebe-spezifischen RNAs verwendet. Die Rattengewebe-spezifischen RNAs wurden mittels Elektrophorese durch ein 1%-iges Agarose-Formaldehyd-Gel fraktioniert, gefolgt von Kapillar-Transfer auf eine Nylonmembran mit 10 × SSC. Die RNAs wurden durch Aussetzen gegenüber ultraviolettem Licht mit den Membranen verknüpft und bei 65°C mit der radiomarkierten Dmk-Sonde in der Gegenwart von 0,5 M NaPO₄ (pH-Wert 7), 1% Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma), 7% SDS, 1 mM EDTA und 100 ng/ml ultraschallbestrahlter, denaturierter Lachssamen-DNA hybridisiert. Das Filter wurde bei 65°C mit 2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen und 5 Tage der Autoradiographie mit einem Verstärkerschirm und einem Röntgenfilm bei –70°C unterworfen. Die Anfärbung des Gels mit Ethidiumbromid zeigte, daß gleiche Niveaus an Gesamt-RNA für die verschiedenen Proben getestet wurden.
8.2 ERGEBNISSE
Die Dmk-Sonde hybridisierte in ausgewachsenem Gewebe stark (2) mit einem Transkript von 7 kb von denerviertem Skelettmuskel und schwach mit normalem Muskel, Retina, den Eierstöcken, dem Herz und der Milz. Schwächere Niveaus an Expression konnten auch in der Leber, den Nieren und der Lunge gefunden werden. Sie hybridisiert auch schwach mit einem kürzeren Dmk-Transkript von etwa 6 kb im Gehirn, dem Rückenmark und dem Cerebellum.
In embryonalem Gewebe (3) können Dmk-Transkripte im Körper, dem Rückenmark, der Placenta und dem Kopf bei E12 und E13 gefunden werden.
Die hohe Expression von menschlichem Dmk in Muskel und neuralem Gewebe legt nahe, daß die vorliegende Erfindung oder der Ligand, der mit Dmk assoziiert ist, zur Behandlung von Störungen des Nervensystems verwendet werden kann, spezifisch für den großen Bereich von neurologischen Störungen, die Motorneuronen (vgl. vorstehende Diskussion) und die neuromuskuläre Verbindung betreffen. Außerdem legt die hohe Expression von Dmk im Herzen nahe, daß die vorliegende Erfindung oder der Ligand, der mit Dmk assoziiert ist, zur Behandlung von Erkrankungen des Herzens verwendet werden kann, und zum Beispiel eine prophylaktische Verwendung bei der Verhinderung von Muskelverlust während oder nach einem Herzereignis haben kann (vgl. vorstehende Diskussion). Die Expression von Dmk in Retinagewebe legt nahe, daß die vorliegende Erfindung zur Behandlung von Störungen, die mit der Retina zusammenhängen, verwendet werden kann, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Retinitis pigmentosus. Die Expression von Dmk in den Eierstöcken legt nahe, daß Dmk oder der Ligand, der mit Dmk assoziiert ist, bei der Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die mit den Eierstöcken zu tun haben, von Nutzen sein können. Letztendlich legt die Expression von Dmk in der Milz nahe, daß Dmk oder der Ligand, der mit Dmk assoziiert ist, bei der Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die mit den Milz zu tun haben, von Nutzen sein können.
95. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Der folgende Clon wurde am 13. Juli 1993 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt

HINTERLEGUNGSNUMMER pBluescript SK-enthaltend dmk ATCC 75498
Die vorliegende Erfindung wird in ihrem Umfang nicht durch die spezifischen Ausführungsformen beschränkt, die hier beschrieben werden. In der Tat werden dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet aufgrund der vorstehenden Beschreibung und der begleitenden Figuren verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen offensichtlich sein. Solche Modifikationen sind so zu betrachten, daß sie innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche liegen.
Hier werden verschiedene Referenzen zitiert, deren Offenbarung durch Bezugnahme vollständig eingeschlossen wird.

Claims

Im wesentlichen aufgereinigtes rekombinantes Nucleinsäuremolekül, umfassend (a) die Nucleinsäuresequenz wie in 1 dargestellt, codierend ein Dmk-Tyrosinkinase-Rezeptorprotein; oder (b) einen Teil davon, der die extrazelluläre Domäne, den transmembranen Teil oder die intrazelluläre Domäne der Aminosäuresequenz wie in 1 dargestellt, codiert; oder (c) einen Teil davon, der die extrazelluläre Domäne, den transmembranen Teil und die intrazelluläre Domäne der Aminosäuresequenz wie dargestellt in 1, codiert.
Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, umfassend: (a) die Nucleotide 192 bis 1610 der 1; (b) die Nucleotide 1611 bis 1697 der 1; (c) die Nucleotide 1698 bis 2738 der 1; oder (d) die Nucleotide 192 bis 2738 der 1.
Nucleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2, wie enthalten im hinterlegten Mikroorganismus ATCC 75498.
Im wesentlichen gereinigtes Protein (a) umfassend die Dmk-Tyrosinkinase-Rezeptorprotein-Aminosäuresequenz wie in 1 dargestellt; oder (b) umfassend einen Teil des Proteins von (a), umfassend die extrazelluläre Domäne, den transmembranen Teil oder die intrazelluläre Domäne; oder (c) umfassend einen Teil des Proteins von (a), umfassend die extrazelluläre, transmembrane und intrazelluläre Domäne.
Protein gemäß Anspruch 4, umfassend die Aminosäuresequenz 20 bis 492 von 1.
Expressionsvektor, umfassend die Expression regulierende Sequenzen, funktionell verknüpft mit einem Nucleinsäuremolekül, das ein Protein gemäß Anspruch 4 oder 5 codiert.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 6, umfassend die Expression regulierende Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, 2 oder 3.
Vektor gemäß Anspruch 6 oder 7, umfassend einen unmittelbar frühes Gen-Promotor.
Vektor gemäß Anspruch 8, in dem der unmittelbar frühes Gen-Promotor der fos-Promotor oder der jun-Promotor ist.
Mikroorganismus, der einen Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 trägt.
Zelle, die einen Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 trägt.
Zelle gemäß Anspruch 11, die einen Vektor gemäß Anspruch 8 oder 9 trägt, wobei sich die Zelle aus der PC12-Zelllinie oder der NIH 3T3-Zelllinie ableitet.
Zelle gemäß Anspruch 12, ferner umfassend ein Gen, das einen nachweisbaren Marker codiert, der zur Expression unter der Kontrolle eines unmittelbar frühes Gen-Promotors fähig ist.
Fibroblasten-Zelllinie, die in Serum-freien Medien Wachstumsfaktor-abhängig ist und die einen Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 beinhaltet.
Verfahren zur Identifizierung eines Liganden, der das Protein gemäß Anspruch 4 oder 5 bindet, umfassend: (a) das Transfizieren einer Wachstumsfaktor-abhängigen Zelle, die in Serum- freiem Medium nicht überlebt, mit einer Nucleinsäure gemäß Anspruch 1 oder einem Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9; (b) das Züchten der so transfzierten Zelle in einem Serum-freien Medium in Gegenwart eines potentiellen Dmk-bindenden Liganden; und (c) das Identifizieren solch eines Liganden, der das Überleben der transfizierten Zelle in einem Serum-freien Medium unterstützt.
Ex vivo-Verfahren zum Diagnostizieren einer muskulären oder anderen Störung in einem Patienten, umfassend das Vergleichen der Grade der Expression eines Dmk-Proteins gemäß Anspruch 4 oder 5 in einer Patienten-Probe mit dem Grad der Expression eines Dmk-Proteins gemäß Anspruch 4 oder 5 in einer vergleichbaren Probe von einer gesunden Person, in der ein Unterschied in den Graden der Expression des Dmk-Proteins in dem Patienten, verglichen mit der gesunden Person, anzeigt, dass eine Störung in dem Patienten primär oder sekundär mit dem Dmk-Stoffwechsel zusammenhängen könnte.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Störung idiopathische Torsionsdystonie ist.
Protein gemäß Anspruch 4 oder 5 oder ein Peptid-Fragment dieses Proteins zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers, der an einer muskulären oder einer anderen Störung leidet.
Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 4 oder 5, oder eines Peptid-Fragments davon, für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose oder Behandlung eines Menschen oder Tiers, der/das an einer muskulären Störung leidet.
Verfahren zum Clonieren von mindestens einem Teil eines Tyrosinkinaserezeptorgens, umfassend: (i) das Amplifizieren von Tyrosinkinase-codierenden Nucleinsäuresequenzen durch Polymerasekettenreaktion, unter Verwendung einer Sammlung von cDNA-Molekülen als Matrize und unter Verwendung einer Kombination von Oligonucleotidprimern, umfassend: (a) degenerierte Primer basierend auf SEQ ID NR.: 3; und (b) degenerierte Primer basierend auf einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR.: 5, SEQ ID NR.: 7, SEQ ID NR.: 9, SEQ ID NR.: 11 und SEQ ID NR.: 13; oder einer Kombination von Oligonucleotiden, umfassend Primer mit den folgendenden Sequenzen: (c) SEQ ID NR.: 4; und (d) eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR.: 6; SEQ ID NR.: 8; SEQ ID NR.: 10, SEQ ID NR.: 12 und SEQ ID NR.: 14; und (ii) das Clonieren der amplifizierten Nucleinsäure in einen geeigneten Vektor.
Mikroorganismus mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 75498.