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EINFÜHRUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verstärkung der biologischen Aktivität von löslichen
Formen von Liganden zur Verfügung,
die Proteine binden, die zur Eph-Unterfamilie
von rezeptorähnlichen
Protein-Tyrosin-Kinasen wie die Ehks (umfassend Ehk-1, Ehk-2 und
Ehk-3), Eck und Elk gehören.
Sie bezieht sich auch auf biologisch aktive, geclusterte Formen
des Liganden und auf einen neuen Liganden, der den Ehk-1-Rezeptor
bindet.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Fähigkeit
von Polypeptid-Liganden, Zellen zu binden und dadurch eine phänotypische
Antwort wie Zellwachstum, -überleben
oder -differenzierung auszulösen,
wird oft durch transmembrane Tyrosin-Kinasen vermittelt. Der extrazelluläre Abschnitt
jeder Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) ist im Allgemeinen der auffälligste Abschnitt
des Moleküls,
da es das Protein mit seiner Liganden erkennenden Eigenschaft darstellt.
Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne ergibt eine Signalübertragung
durch eine intrazelluläre
katalytische Domäne
einer Tyrosin-Kinase, die ein biologisches Signal an intrazelluläre Zielproteine überträgt. Die
besondere Anordnung von Sequenzmotiven dieser cytoplasmatischen
katalytischen Domäne
bestimmt ihren Zugang zu potenziellen Kinase-Substraten (Mohammadi,
et al., 1990. Mol. Cell. Biol. 11: 5068–5078; Fantl, et al., 1992,
Cell, 69:413–413).
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Die
RTKs scheinen nach der Ligandenbindung eine Dimerisierung oder eine ähnliche
Konformationsänderung
zu durchlaufen (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sci. 13:443–447; Ulrich
und Schlessinger, 1990, Cell, 61:203–212; Schlessinger und Ullrich,
1992, Neuron 9:383–391);
molekulare Interaktionen zwischen dimerisierenden cytoplasmatischen
Domänen
führen
zur Aktivierung der Kinasefunktion. In manchen Fällen, wie zum Beispiel dem
Wachstumsfaktor Plättchen-abgeleiteter
Wachstumsfaktor (PDGF) ist der Ligand ein Dimer, das zwei Rezeptor-Moleküle bindet
(Hart et al., 1988, Science, 240:1529–1531; Heldin, 1989, J. Biol.
Chem. 264:8905–8912)
wohingegen der Ligand im Falle von EGF ein Monomer ist (Weber et
al., 1984, J. Biol. Chem., 259:14631–14636).
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Bei
höheren
Organismen stellt die Gewebeverteilung eines bestimmten Tyrosin-Kinase-Rezeptors wichtige
Daten hinsichtlich der biologischen Funktion des Rezeptors zur Verfügung. Die
Tyrosin-Kinase-Rezeptoren für
einige Wachstums- und
Differenzierungsfaktoren wie dem Fibroblasen-Wachstumsfaktor (FGF) werden
im großen
Maßstab
exprimiert und scheinen somit eine allgemeine Rolle beim Wachstum
und Erhalt von Gewebe zu spielen. Angehörige der Trk-RTK-Familie (Glass & Yancopoulos,
1993, Trends in Cell Biol. 3:262–268) von Rezeptoren sind allgemeiner
auf Zellen des Nervensystems beschränkt und die Nerven-Wachstumsfaktor-Familie,
die aus NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5 (bekannt als die Neutrophine)
bestehen, die diese Rezeptoren binden, fördern die Differenzierung diverser
Neuronengruppen im Gehirn und in der Peripherie (Lindsay, R. M.,
1993, in Neurotrophic Factors, S.E. Loughlin & J.H. Fallon, Hrsg., S. 257–284 (San Diego,
CA: Academic Press). Die Lokalisierung eines derartigen Trk-Familien-Rezeptors
trkB in Gewebe gewährte
einigen Einblick in die potenzielle biologische Rolle dieses Rezeptors
ebenso wie die Liganden, die diesen Rezeptor binden (hierin als
Verwandte bezeichnet). Demnach wurde herausgefunden, dass trkB z.B. in adulten Mäusen vorzugsweise
im Hirngewebe exprimiert wurde, obwohl signifikante Mengen an trkB-mRNAs auch in Lunge,
Muskel und Eierstöcken
beobachtet wurden. Des Weiteren wurden trkB-Transkripte
auch in Embryonen der mittleren bis späten Gestation nachgewiesen.
Die in-situ-Hybridisierungsanalyse von 14 und 18
Tagen alten Mausembryonen zeigte, dass trkB-Transkripte
in den zentralen und peripheren Nervensystemen, umfassend Gehirn,
Rückenmark,
spinalen und cranialen Ganglien, paravertebralem Stamm des sympathischen
Nervensystems und verschiedenen Innervierungswegen lokalisiert wurden,
was nahe legt, dass das trkB-Genprodukt
ein Rezeptor sein kann, der in der Neurogenese und der frühen neuralen
Entwicklung beteiligt ist ebenso wie es eine Rolle im adulten Nervensystem
spielen kann.
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Die
zelluläre
Umgebung, in der ein RTK exprimiert wird, kann die biologische Antwort,
die bei der Bindung eines Liganden an den Rezeptor gezeigt wird,
beeinflussen. Demnach ergibt sich, zum Beispiel, wenn eine Nervenzelle,
die einen Trk-Rezeptor exprimiert, einem Neurotrophin, das an den
Rezeptor bindet, ausgesetzt wird, neuronales Überleben und Differenzierung.
Wird derselbe Rezeptor durch einen Fibroblasten exprimiert, so ergibt
ein Aussetzen zum Neurotrophin eine Vermehrung des Fibroblasten
(Glass, et al., 1991, Cell 66:405–413). Es scheint demnach so,
dass die extrazelluläre
Domäne
hinsichtlich der Ligandenspezifität den bestimmenden Faktor darstellt,
und ist die Signaltransduktion erst einmal initiiert, wird die zelluläre Umgebung das
phänotypische
Ergebnis dieser Signaltransduktion bestimmen.
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Eine
Anzahl von RTK-Familien wurden basierend auf Sequenzhomologien in
ihrer intrazellulären
Domäne
identifiziert. Die Rezeptor- und Signaltransduktionswege, die durch
NGF benutzt wurden, beteiligen das Produkt des trk-Proto-Onkogens (Kaplan et al., 1991,
Nature 350:156–160;
Klein et al., 1991, Cell 65:189–197).
Klein et al. (1989, EMBO J. 8:3701–3709) berichteten von der
Isolierung von trkB, welches
ein zweites Mitglied der Tyrosin-Proteinkinase-Rezeptorfamilie codiert,
von denen herausgefunden wurde, dass sie mit dem menschlichen trk-Protoonkogen
stark verwandt sind. TrkB bindet und vermittelt die funktionalen Antworten
auf BDNF, NT-4 und, in geringerem Maße, NT-3 (Squinto, et al.,
1991, Cell 65:885–903;
lp, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3060–3064; Klein,
et al., 1992, Neuron, 8:947–956).
Auf Ebene der Aminosäuren
wurde herausgefunden, dass die Produkte von trk und trkB eine
57%ige Homologie in ihren extrazellulären Regionen teilen, einschließlich 9
der 11 in trk vorliegenden
Cysteine. Es wurde herausgefunden, dass diese Homologie in ihren
jeweiligen katalytischen Domänen
für Tyrosinkinase
bis zu 88 % ansteigt. Die Trk-Genfamilie wurde nun erweitert und
umfasst nun den trkC-Genort,
wobei NT-3 als bevorzugter Ligand für trkC identifiziert wurde
(Lamballe, et al., 1991, Cell 66:967–979; Valenzuela, et al., 1993,
Neuron 10:963–974).
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Die
Eph-verwandten transmembranen Tyrosinkinasen umfassen die größte bekannte
Familie rezeptorähnlicher
Tyrosinkinasen, wobei viele Mitglieder eine spezifische Expression
beim sich entwickelnden und beim adulten Nervensystem zeigen. Zwei
neue Mitglieder der Eph-RTK-Familie, genannt Ehk (eph-Homologiekinase) –1 und –2 wurden
unter Verwendung einer auf Polymerase-Kettenreaktion basierenden Durchmusterung
von Genen, die im Gehirn exprimiert werden, identifiziert (Maisonpierre,
et al., 1993, Oncogene 8:3277–388).
Es scheint so, als würden
diese Gene ausschließlich
im Nervensystem exprimiert werden, wobei die Ehk-1-Expression früh in der
neuralen Entwicklung beginnt. Kürzlich
wurde ein neues Mitglied dieser Gruppe von verwandten Rezeptoren,
Ehk-3 cloniert (Valenzuela, et al. im Druck).
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Das
elk-Gen codiert eine rezeptorähnliche
Protein-Tyrosin-Kinase, die ebenfalls zur eph-Unterfamilie gehört und die
fast ausschließlich
im Gehirn (und in geringeren Mengen in den Hoden) exprimiert wird
(Lewin, et al., 1988, Oncogene 3:621–678; Lhotak, et al., 1991;
Mol. Cell. Biol. 11: 2496–2502.
Basierend auf seinem Expressionsprofil wird erwartet, dass der Elk-Rezeptor
und sein verwandter Ligand in Zell-Zell-Interaktionen im Nervensystem
eine Rolle spielen.
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Anders
als die Ehks und die Elk-Rezeptoren scheint der eng verwandte Eck-Rezeptor in einer
eher pleiotropen Weise zu funktionieren.; er wurde in neuralen,
epithelialen und Skelett-Geweben identifiziert und er scheint bei
der Gastrulation, an craniofacialen und Gliedmaßenknospen der Musterbildung
im Mausembryo beteiligt zu sein (Ganju, et al., 1994, Oncogene 9:1613–1624).
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Die
Identifikation einer großen
Anzahl an Rezeptor-Tyrosin-Kinasen hat die Identifikation ihrer
verwandten Liganden bei weitem überstiegen.
Bestenfalls liefert die Bestimmung der Gewebe, in welchen solche Rezeptoren
exprimiert werden, einen Einblick in die Regulierung des Wachstums,
der Vermehrung und der Regeneration von Zellen in Zielgeweben. Da
es so scheint, als würden
RTK's eine Vielzahl
an wichtigen Funktionen während
der Entwicklung vermitteln, werden ihre verwandten Liganden zweifellos
eine bedeutende Rolle in der Entwicklung spielen.
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Wir
fanden eine Reihe verwaister rezeptorähnlicher Tyrosin-Kinasemoleküle, umfassend
fünf solcher Moleküle, die
zu dem trk-Rezeptor und der
Insulin-Rezeptorfamilie
homolog sind und weitere vier Moleküle, welche zu CSF1R/PDGFR/kit;
beziehungsweise ret; eck-alpha (nun als Ehk-2 bekannt) und eck-beta
(Ehk-1) homolog sind, werden beschrieben. Darin werden Verfahren
beschrieben, in welchen Zelllinien, die Ehk-1 und Ehk-2 exprimieren,
zum Testen verwendet wurden, um ihre verwandten Liganden zu identifizieren.
Da es scheint, als würden
die ehks in unterschiedlichen neuronalen Populationen exprimiert,
umfassend einige der wichtigsten zentralen aufsteigenden cholinergischen
Nuclei, wurde erwartet, dass Liganden, die diese Rezeptoren binden,
eine Rolle bei der Förderung
von Wachstum oder vom Überleben
dieser Nervenzellen spielen. Da die Expression von Ehk-1 früh in der
Entwicklung beginnt, können
seine verwandten Liganden eine Rolle in der Embryogenese spielen.
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Obwohl
viele Schemata zur Identifikation von verwandten Liganden der vielen
identifizierten verwaisten Rezeptoren angedacht wurden, wurden sehr
wenige solche Liganden identifiziert und die Liganden, die bis jetzt
identifiziert wurden, scheinen keine andere Aktivität zu haben
als die Fähigkeit,
ihren verwandten Rezeptor zu binden. Die Internationale Veröffentlichung
Nummer WO/94/11020, veröffentlicht
am 26. Mai 1994 beschreibt zum Beispiel Liganden, die an den Eck-Rezeptor
binden. Im Besonderen wird der Ligand EBP (ebenfalls bekannt als
B61) beschrieben. Obwohl jedoch die Bindung von B61 an den Eck-Rezeptor
offenbart wird, wird keine biologische Aktivität beschrieben. Auf ähnliche
Weise wurde trotz der Beschreibung in PCT-Veröffentlichung Nummer WO 94/11384
(veröffentlicht
am 26. Mai 1994) eines Liganden, der den Elk-Rezeptor bindet, keine
biologische Aktivität
beobachtet, ungeachtet dessen, ob der Ligand membrangebunden oder
in Form eines Fc-Dimers des löslichen
Liganden präsentiert
wurde. Hinsichtlich des Elk-Rezeptors wurden jedoch chimäre EGFR-Elk-Rezeptoren
(bei denen die extrazelluläre
Domäne
des EGFR mit der cytoplasmatischen Elk-Domäne verbunden ist) verwendet,
um die funktionelle Integrität
(gemessen durch EGF stimulierte Autophosphorylierung) der enzymatischen
Domäne
dieses Rezeptors zu zeigen (Lhotak und Pawson, 1993, Mol. Cell.
Biol. 13:7071–7079).
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der Erfindung
können
lösliche
Formen der hierin beschriebenen Liganden verwendet werden, um bei
Ehk-1-, Ehk-2-, Ehk-3-, Eck- und Elk-Rezeptor exprimierenden Zellen
biologische Reaktionen zu fördern.
Im Besonderen wird hierin ein allgemeines Verfahren beschrieben,
das ein „Clustern" von Liganden bei ephverwandten
Rezeptoren hervorruft, welches so funktioniert, dass es ansonsten
inaktive lösliche
Liganden biologisch aktiv macht, oder welches die biologische Aktivität von Liganden
verstärkt,
welche ohne ein derartiges Clustern nur geringe Mengen an biologischer
Aktivität
hätten.
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In
einer Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der biologischen Aktivität der extrazellulären Domäne eines
Liganden der eph-Familie bereit, umfassend:
- a)
Expression der löslichen
Domäne
des Liganden mit einem Markierungsepitop;
- b) Exponieren der markierten löslichen Domäne mit Anti-Markierungs- Antikörpern zur
Bildung eines Clusters von Liganden der eph-Familie,
wobei
die biologische Aktivität
anhand der Phosphorylierung der Tyrosinkinasedomäne eines Rezeptors der eph-Familie
gemessen wird.
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Die
Erfindung stellt des Weiteren ein Präparat eines geclusterten, Epitop-markierten
löslichen
Liganden der eph-Familie, behandelt mit einem Anti-Epitop-Antikörper, welches
erhältlich
ist nach einem derartigen Verfahren, zur Verfügung, wobei der Ligand der
eph-Familie Efl-1 (B61) ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der biologischen Aktivität der löslichen
Domäne
eines Liganden der eph-Familie, ausgewählt aus Efl-1 (B61), zur Verfügung, umfassend:
- a) Expression der löslichen Domäne des Liganden mit der Fc-Domäne eines
IgG; und
- b) Zulassen der Bildung von Fc-Dimeren,
wobei die
biologische Aktivität
anhand der Phosphorylierung der Tyrosinkinasedomäne eines Rezeptors der eph-Familie
gemessen wird.
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Die
Erfindung stellt des Weiteren einen biologisch aktiven, geclusterten
löslichen
Liganden der eph-Familie, umfassend (lösliches Efl)n zur
Verfügung,
wobei das lösliche
Efl die extrazelluläre
Domäne
von Efl-1 (B61) ist und n 2 oder größer ist, wobei die biologische
Aktivität
anhand der Phosphorylierung der Tyrosinkinasedomäne eines Rezeptors der eph-Familie
gemessen wird.
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BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1.
Vektor pJFE14.
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2.
Sequenzvergleich von Liganden für
Ehk-1 und Elk-Rezeptoren. Ausgerichtete Sequenzen von B61 (SEQ ID
NR:1), Ehk-1-Ligand (EHK-1L) (SEQ ID NR:2) und Elk-Ligand (ELK-L)
(SEQ ID NR:3) werden gezeigt. Reste, die allen drei Sequenzen gemein
sind, sind umrandet, und Reste, die mindestens zweien gemein sind,
sind in der Consensus-Bahn aufgeführt; die fettgedruckten Punkte
zeigen konservierte Cysteine und die Sternchen bezeichnen Reste,
die die hauptsächlich
konservierten Regionen begrenzen. Kleingedruckte Buchstaben zeigen
die angenommenen aminoterminalen Signalsequenzen sowie die transmembrane
Domäne
von ELK-L und carboxy-terminale hydrophobe GPI-Erkennungsenden von
B61 und EHK1-L.
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3.
Nucleotidsequenz der codierenden Region von EHK-1 L (SEQ ID NR:4).
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4. Northern Blot-Analyse der Expression
von Efl-1 (B61), Efl-2 (EHK-1 L) und Efl-3 (ELK-L) bei Geweben von
adulten Ratten (A) und im sich entwickelnden Gehirn (B). Die gesamte
RNA (20 Mikrogramm pro Bahn) wurde von den angezeigten Geweben isoliert,
auf 1%igen Formaldehyd-Agarose-Gelen fraktioniert und auf Nylon-Membranen überführt. Die
Blots wurden auf Sonden, die mit 32P markiert
waren, und die von Restriktionsfragmenten, die sich innerhalb der
codierenden Regionen jeder cDNA befanden, hybridisiert.
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5.
Aktivierung von Rezeptoren der Eph-Familie durch membrangebundenen
oder geclusterten Liganden, wie durch Elk-Rezeptor-Tyrosin-Phosphorylierung
gemessen. 5A: Stimulierung unter Verwendung
von Kontroll-COS-Zellen, die mit Vektor allein (COS-Mock) transfiziert
sind oder COS-Zellen, die mit einem Expressionskonstrukt transfiziert
sind, das Efl-3 (ELK-L) codiert; 5B:
Stimulierung mit löslichem, myc-markiertem
Efl-3 (ELK-L), verwendet als nichtgeclusterter Ligand (zweite und
dritte Vertiefung) oder als Ligand, der durch Antikörper geclustert
ist (vierte und fünfte
Vertiefung). („+AB" bedeutet lösliche Liganden, geclustert
mit Antikörper).
Die Kontrolle (0 ng/ml) ist in der ersten Vertiefung gezeigt. 5C: Stimulierung mit löslichem, myc-markiertem Efl-1
(B61), welches als nicht-geclusterter Ligand (zweite Vertiefung)
oder als Ligand, welcher durch Antikörper geclustert ist (dritte
Vertiefung), verwendet wird. Die Kontrolle (0 ng/ml) wird in der
ersten Vertiefung gezeigt. Die oberen Abbildungen in den Figuren
A, B und C zeigen Immunpräzipitate,
die mit Antikörpern
gegen Phosphotyrosin immun-geblottet wurden. Die unteren Abbildungen
in den Figuren A, B und C zeigen Immunpräzipitate, die nachfolgend gestrippt
wurden und erneut mit Antikörpern,
die die Rezeptoren erkennen, in Reaktion gebracht wurden, um das
Gesamt-Rezeptor-Protein
sichtbar zu machen.
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6.
Induktion von Wachstumsreaktionen bei BAF-Zellen, welche durch Eck-Rezeptor-Chimäre vermittelt
wurden: A. Stimulationen fanden mit löslichem Efl-2 (EHK-1 L), hergestellt
in COS-Zellen mit oder ohne nachfolgendes Clustern statt. B. Stimulationen
fanden mit löslichem
Efl-1 (B61), welches in COS-Zellen mit oder ohne nachfolgendes Clustern
hergestellt wurden, statt.
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7.
Induktion von ELK-Rezeptor-Tyrosin-Phsophorylierung durch einen
geclusterten jedoch nicht dimeren Liganden. Bahn A: mock-COS-Überstände ohne
anti-menschliche Antikörper;
Bahn B: anti-menschliche Antikörper;
Bahn C: ELK-L- Fc
ohne quervernetzende Antikörper;
und Bahn D: quervernetzende Antikörper. Löslicher Fc-markierter ELK-Ligand
(ELK-L-Fc) wurde als COS-Zellüberstand
hergestellt und als nicht geclusterter, dimerer Ligand oder als
durch Antikörper
geclusterter Ligand verwendet. Die Ligandenkonzentrationen wurden
durch Quantifizierung der Menge an Fc-Epitop unter Verwendung eines
ELISA-Tests bestimmt. Das Liganden-Clustern wurde durch Zusetzen
von Anti-menschlichen Antikörpern
und Inkubieren über
eine Stunde vor Stimulierung der Zellen durchgeführt. Reporterzellen waren NIH
3T3-Fibroblasten, die mit ELK transfiziert waren. Die Zellen wurden
4–6 Stunden
in serumfreiem Medium ausgehungert und dann 40 Minuten stimuliert
mit: Im Anschluss an die Stimulierung wurden die Zellen solubilisiert
und mit Antikörpern,
die die Rezeptoren erkennen, immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate
wurden mit Antikörpern
gegen Phosphotyrosin immungeblottet.
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8.
Induktion von Wachstumsreaktionen in BAF-Zellen, die durch ECK-Rezeptorchimäre vermittelt werden.
Die Stimulierungen wurden mit löslichem
dreifachem myc-markiertem EHK1-Liganden (EHK1 L-m3) und dreifachem
mycmarkiertem B61 (B61-m3), welches in COS-Zellen mit oder ohne
nachfolgendes Clustern mit anti-myc- und anti-Maus-Antikörper hergestellt
wurden, durchgeführt.
Da die katalytische Domäne
des ECK-Rezeptors die Wachstumsreaktion bei BAF-Zellen nicht vermittelt, wurde stattdessen
eine Rezeptor-Chimäre
(in der die Ektodomäne
des ECK-Rezeptors mit der cytoplasmatischen Domäne des FGF-Rezeptors verbunden wurde) in die BAF-Zellen
eingeführt,
um die Reporterzellinie darzustellen.
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9.
Induktion von Wachstumsreaktionen im BAF-Zellen, vermittelt durch
ECK-Rezeptor-Chimäre. Die
Stimulierungen wurden mit löslichem
EHK-1-L-Fc und B61-Fc,
das in COS-Zellen mit oder ohne nachfolgendes Clustern mit anti-menschlichen
Antikörpern
hergestellt wurde, durchgeführt.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Verwendung von Testsystemen unter Verwendung der Ehk-1-, Ehk-2-,
Ehk-3-, Eck- und Elk-Rezeptoren führte zu der Entdeckung von
mit diesen Rezeptoren verwandten Liganden. Solche Liganden sind
für die
Förderung
des Wachstums und des Überlebens
von neuronalen, epithelialen oder anderen Rezeptor-tragenden Zellpopulationen in vitro von Nutzen.
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Die
Anmelder haben entdeckt, dass der zuvor identifizierte Ligand B61
(Holzmann et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:5830–5838) auch an Ehk-1 bindet
und dass sowohl B61 als auch die Ehk-1-Liganden ebenfalls den Ehk-2-
und den Ehk-3-Rezeptor wie auch den Eck-Rezeptor binden.
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Die
hierin beschriebenen Liganden werden Efl's (transmembrane Eph-Liganden
der Tyrosin-Kinase-Familie)
genannt. Die Aminosäuresequenzen
von B61 (Efl-1) und EHK-1 L (Efl-2) sowie auch die Sequenz des an
Elk bindenden Liganden Efl-3, der in WO 94/11020 (veröffentlicht
am 26. Mai 1994) beschrieben wurde, werden in 2 gezeigt.
Ein zusätzlicher
Ligand, der an Ehk-1, Ehk-2, und Ehk-3 bindet, sowie der Eck-Rezeptor
wurde als Efl-4 identifiziert. Plasmid pJFE14, welches den Liganden
Efl-4 codiert, wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags
am 21. Oktober 1994 als 75921 hinterlegt.
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Wenn
hierin verwendet umfassen Efl-1, Efl-2, Efl-3 und Efl-4 funktionell äquivalente
Moleküle,
in welchen Aminosäurereste
innerhalb der Sequenz substituiert werden, was eine stille Veränderung
zur Folge hat. Zum Beispiel können
ein oder mehrere Aminosäurereste
innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure von ähnlicher Polarität substituiert
werden, was als funktionelles Äquivalent
wirkt und eine stille Veränderung nach
sich zieht. Substitute für
eine Aminosäure
innerhalb der Sequenz können
aus anderen Angehörigen
der Klasse, zu der die Aminosäure
gehört,
ausgewählt
werden. Zum Beispiel umfassen die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin,
Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin.
Die polaren neutralen Aminosäuren
umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und
Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen
Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen
Asparaginsäure
und Glutaminsäure.
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Zellen,
welche Efl's expimieren,
können
dies natürlicherweise
tun oder können
gentechnisch verändert sein,
so dass sie diese Liganden durch Transfektion, Transduktion, Elektroporation,
Mikroinjektion, durch ein transgenes Tier etc. von Nucleinsäure, die
die hierin beschriebenen Efls in einem geeigneten Expressionsvektor,
wie supra beschrieben herstellen.
Vektoren, die die cDNA, die Efl-2 (EHK-1 L) codiert, enthalten,
wurden bei der American Type Collection unter den Bedingungen des
Budapester Vertrags am 4. April 1994 als pJFE14, enthaltend Ehk-1L2B4
und Ehk-1L3B1 hinterlegt und wurden mit den ATCC-Benennungen 75728
beziehungsweise 75729 belegt. (Die Liganden, die durch diese Vektoren
codiert werden sind identisch). Der pJFE14-Vektor, der die cDNA,
die Efl-3 (ELK-L) codiert, enthält,
wurde bei der American Type Culture Collection unter den Bedingungen
des Budapester Vertrags am 12. April 1994 als pJFE14, enthaltend
efl-3 hinterlegt und wurde mit der ATCC-Benennung 75734 belegt.
Der pJFE14-Vektor,
der die cDNA, die Efl-4 codiert, enthält, wurde bei der American
Type Culture Collection unter den Bedingungen des Budapester Vertrags
am 21. Oktober 1994 als pJFE14, codierend efl-4, hinterlegt und
wurde mit der ATCC-Benennung 75921 belegt.
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Zusätzlich zieht
die vorliegende Erfindung die Verwendung der hierin beschriebenen
Liganden in löslichen
Formen und in markierten Formen in Betracht.
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Jedes
Verfahren für
die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor, das der Fachmann
kennt, kann verwendet werden, um Expressionsvektoren, die Efl's codieren unter
Verwendung geeigneter Transkriptions/Translations-Kontrollsignale
und der Protein codierenden Sequenzen, herzustellen. Diese Verfahren
können
rekombinante DNA und synthetische Verfahren in vitro und
Rekombinationen in vivo (genetische Rekombination) umfassen.
Die Expression von Nucleinsäuresequenz,
die die Efl's oder
Peptidfragmente davon codieren, können durch eine zweite Nucleinsäuresequenz
reguliert werden, so dass das Protein oder Peptid in einem Wirt,
der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, exprimiert
wird. Die Expression der hierin beschriebenen Efl's kann zum Beispiel
durch jedes Promotor/Verstärkerelement,
das auf dem Fachgebiet bekannt ist, kontrolliert werden. Promotoren,
die zur Kontrolle der Expression der Liganden verwendet werden können, umfassen
die lange terminale Wiederholung, wie in Squinto et al., (1991,
Cell 65:1–20)
beschrieben, die frühe
SV40-Promotorregion (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304–310), den
CMV-Promotor, die 5'-terminate
M-MuLV-Wiederholung,
den Promotor, der in der langen 3'-terminalen Wiederholung von Rous-Sarcomvirus
enthalten ist (Yamamoto, et al., 1980; Cell 22:787–797), den
Herpes-Thymidin-Kinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A.78:144–1445),
die regulatorischen Sequenzen des Metallthionein-Gens (Brinster
et al., 1982, Nature 296;39–42);
prokaryotische Expressionsvektoren wie den ß-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff,
et al.,1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727–3731) oder
den tac-Promotor (DeBoer, et
al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21–25), siehe auch „Useful
proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74–94; Promotorelemente
von Hefe oder anderen Pilzen wie den Gal 4-Promotor, den ADH (Alkohol-Dehydrogenase)-Promotor,
den PGK (Phosphoglyzerin-Kinase)-Promotor, den basischen Phosphatase-Promotor
und die folgenden tierischen Transkriptions-Kontrollregionen, die
Gewebespezifität zeigen
und in transgenen Tieren verwendet wurden: die Genkontrollregion
von Elastase I, welche in acinösen
Bauchspeicheldrüsenzellen
aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38:639–646; Ornitz et al., 1986,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399–409; Mac Donald, 1987, Hepatology
7:425–515); Kontrollregion
des Insulingens, welche in Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse aktiv
ist (Hanahan, 1985, Nature 315:115–122), Kontrollregion des Immunglobulingens,
welche in Lymphzellen aktiv ist (Grosschedl et al.,1984, Cell 38:647–658; Adames
et al., 1985 Nature 318:533–538;
Alexander et al., 1987. Mol. Cell. Biol. 7:1436–1444); die Brusttumor-Viruskontrollregion
bei der Maus, die in Hoden, Brust-, Lymph- und Mast-Zellen aktiv
ist (Leder et al., 1986, Cell 45:485–495), die Albumin-Genkontrollregion,
die in Leber aktiv ist (Pinkert et al.,1987, Genes and Devel. 1:268–276), Alpha-Fetoprotein-Genkontrollregion,
die in Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol.
5:1639–11648;
Hammer et al., 1987, Science 235:53–58); Alpha 1-Antitrypsin-Genkontrollregion,
die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel.
1:161–171),
Beta-Globin-Genkontrollregion, die in Myeloidzellen aktiv ist (Mogram
et al., 1985, Nature 315:338–340;
Kollias et al., 1986, Cell 46:89–94); Genkontrollregion von
basischem Myelinprotein, welche in Oligodendrocytenzellen im Gehirn
aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48:703–712); Genkontrollregion der
leichten Kette 2 von Myosin, die im Skelettmuskel aktiv ist (Shani,
1985, Nature 314:283–286)
und Genkontrollregion des gonadotropen Freisetzungshormons, die
im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., Science 234: 1372–1378),
sind jedoch nicht darauf beschränkt.
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Demnach
können
Expressionsvektoren die in einem Bakterien- oder Eukaryonten-Wirt repliziert werden
können
und die Efl-codierende Nucleinsäure
umfassen, wie hierin beschrieben, für die Transfektion des Wirts
und dadurch zur direkten Expression solcher Nucleinsäure verwendet
werden, um die Efl-Proteine herzustellen, welche dann in biologisch
aktiver Form gewonnen werden können.
Wie hierin verwendet umfasst eine biologisch aktive Form eine Form,
die in der Lage ist an den entsprechenden Rezeptor zu binden, wie Ehk-1
oder Elk und die eine differenzierte Funktion verursacht und/oder
den Phänotyp
der Zelle, die den Rezeptor exprimiert, beeinflusst. Derartige biologisch
aktive Formen würden
zum Beispiel die Phosphorylierung der Tyrosin-Kinase-Domäne des Ehk-1
oder Elk-Rezeptors
oder die Stimulierung der Synthese von zellulärer DNA induzieren.
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Expressionsvektoren,
die die Geninsertionen enthalten, können durch drei allgemeine
Ansätze
identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Gegenwart
oder Abwesenheit von „Markierungs"-Genfunktionen und
(c) Expression von inserierten Sequenzen. Im ersten Ansatz kann
die Gegenwart eines fremden Gens, welches in einen Expressionsvektor
inseriert ist, durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden,
welche Sequenzen enthalten, die zu einem inserierten efl-Gen homolog
sind, nachgewiesen werden. Im zweiten Ansatz kann das rekombinante
Vektor/Wirt-System basierend auf der Gegenwart oder Abwesenheit
bestimmter „Markierungs"-Genfunktionen (z.B.
Thymidin-Kinaseaktivität, Resistenz
gegen Antibiotika, transformierter Phänotyp, Einschlusskörperbildung
bei Baculovirus, etc.), welche durch die Insertion von fremden Genen
in den Vektor verursacht werden, identifiziert werden. Zum Beispiel
können,
wenn das efl-Gen innerhalb der Marker-Gensequenz des Vektors inseriert
wird, Rekombinanten, die die Insertion enthalten, durch die Abwesenheit
der Genfunktion des Markers identifiziert werden. Im dritten Ansatz
können
rekombinante Expressionsvektoren durch Testen des fremden Genprodukts,
das durch die Rekombinante exprimiert wird, identifiziert werden.
Solche Tests können
zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionalen Eigenschaften
des efl-Genprodukts
basieren, zum Beispiel durch Binden des Liganden an den Ehk-1- oder
Elk-Rezeptor oder eines Abschnitts davon, der zum Beispiel mit einem
nachweisbaren Antikörper
oder einem Abschnitt davon oder durch Binden an Antikörper, die
gegen das Efl-Protein oder einen Abschnitt davon hergestellt wurden,
markiert werden kann.
-
Der
Efl-2 (EHK-1L)-Ligand scheint einige Homologie mit dem zuvor identifizierten
Liganden B61 (hierin als Efl-1 bezeichnet) zu haben. (Holzmann,
et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:5830–5838). Wie B61 endet Efl-22 in
einer C-terminalen hydrophoben Sequenz, die eine Erkennungssequenz
zu codieren scheint, die es erlaubt, durch GPI verbunden zu werden
und der deshalb eine intrazelluläre
Domäne
fehlt. In der Tat scheint eine Vorbehandlung von Efl-2 exprimierenden
Zellen mit Phospholipase C die Bindung des hk-1-Rezeptorkörpers zu reduzieren,
was bestätigt,
dass diese Proteine durch PI verbunden sind. Efl-3 wird nicht unter
Verwendung von Phospholipase C von der Zelloberfläche gespalten
und es scheint ein herkömmliches
transmembranes Protein mit einer cytoplasmatischen Domäne zu umfassen.
-
Die
hierin beschriebenen Liganden können
als membrangebundene Formen in tierischen Zellexpressionssystemen
hergestellt werden oder in löslicher
Form exprimiert werden. Löslichen
Formen der Liganden können
unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, exprimiert
werden. Eine üblicherweise
verwendete Strategie beteiligt die Verwendung von Oligonucleotid-Primern,
von welchen einer den N-Terminus des Proteins umspannt wobei der
andere die Region direkt stromaufwärts zu einem hydrophoben Segment
des Proteins umfasst, welche entweder die GPI-Bindungs-Erkennungsdomäne oder
eine transmembrane Domäne
des Proteins darstellt. Das Oligonucleotid, das die C-terminate
Region umspannt, wird so modifiziert, dass sie vor der hydrophoben
Domäne
ein Stop-Codon enthält.
Die beiden Oligonucleotide werden zur Verstärkung einer modifizierten Version
des Gens verwendet, das ein Protein codiert, welches sekretiert wird
und nicht membrangebunden ist. Alternativ kann in dem Vektor ein
geeigneter Restriktionsort verwendet werden, um eine veränderte Sequenz
zu inserieren, die die GBI-Bindungs-Erkennungsdomäne oder
die transmembrane Domäne
entfernt, wodurch ein Vektor entsteht, der in der Lage ist, eine
sekretierte Form des Proteins zu exprimieren. Das so hergestellte
lösliche
Protein würde
die Region des Proteins vom N-Terminus zu der Region, die der hydrophoben
GPI-Erkennungsdomäne
oder der transmembranen Domäne
vorangeht, umfassen.
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Die
Anmelder haben herausgefunden, dass, obwohl die löslichen
Liganden, die gemäß der Erfindung hergestellt
wurden, an die Rezeptoren in der eph-Unterfamilie binden, solche
löslichen
Liganden oft wenig oder keine biologische Aktivität haben.
Solche löslichen
Liganden werden gemäß der vorliegenden
Erfindung durch Liganden-„Clustern" aktiviert. „Clustern" wie hierin verwendet
bezieht sich auf jedes Verfahren, welches dem Fachmann bekannt ist,
zur Herstellung von Multimeren der löslichen Abschnitte von hierin
beschriebenen Liganden.
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In
einer Ausführungsform
ist ein „geclustertes" efl ein Dimer, das
gemäß der vorliegenden
Erfindung zum Beispiel unter Verwendung der Fc-Domäne von IgG
hergestellt wurde (Aruffo et al., 1991, Cell 67:35–44), was
zur Expression des löslichen
Liganden als Disulfid-gebundenes Homodimer führt. In einer anderen Ausführungsform
werden sekretierte Formen der Liganden mit Epitop-Markierungen an
ihren C-Termini konstruiert; anti-Markierungs-Antikörper werden
dann verwendet um die Liganden zu aggregieren.
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Alternativ
können
Multimere durch gentechnische Veränderung und Expression von
Molekülen
hergestellt werden, die aus dem löslichen oder extrazellulären Abschnitt
des Liganden bestehen, auf den die Fc-Domäne von hlgG folgt, gefolgt
von entweder dem oben beschriebenen c-jun- oder c-fos-Leucin-Zipper
[Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547–1553 (1992)]. Da diese Leucin-Zipper
vor allem Heterodimere bilden, können
sie dazu verwendet werden, die Bildung der Heterodimere voranzutreiben,
wenn gewünscht.
Was die beschriebenen chimären
Proteine, die Leucin-Zipper verwenden, betrifft, so können diese
ebenfalls mit Metallchelaten oder einem Epitop markiert werden.
Diese markierte Domäne
kann für
die schnelle Reinigung durch Metall-Chelat-Chromatographie und/oder
durch Antikörper
verwendet werden, um den Nachweis auf Western Blots, Immunpräzipitation,
oder die Erschöpfung/Blockierung
der Aktivität
in Biotests zu ermöglichen.
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Multimere
lösliche
Liganden können
durch die Expression als chimäre
Moleküle
unter Verwendung flexibler Verbindungsschleifen hergestellt werden.
Ein DNA-Konstrukt,
welches das chimäre
Protein codiert, wird so angelegt, dass es zwei oder mehrere lösliche oder
extrazelluläre
Domänen,
die durch eine flexible Schleife in ein Tandem („Kopf an Kopf") miteinander verbunden
werden, exprimiert. Diese Schleife kann gänzlich artifiziell (z.B. Polypeptid-Wiederholungen,
welche in einem bestimmten Intervall von Serin oder Threonin unterbrochen
werden) oder „geliehen" von natürlich vorkommenden
Proteinen (z.B. der Hinge-Region von hIG) sein. Es können Moleküle hergestellt
werden, in welchen die Länge
und Zusammensetzung der Schleife variiert ist, um die Selektion
von Molekülen
mit erwünschten
Eigenschaften zu gewährleisten.
Obwohl sie nicht durch Theorie gebunden sein möchten, glauben die Anmelder,
dass die Membran-Gebundenheit der Liganden das Liganden-Clustern
erleichtert, was wiederum die Rezeptor-Multimerisierung und – Aktivierung
fördert. Dementsprechend
wird die biologische Aktivität
des löslichen
Liganden gemäß der vorliegenden
Erfindung durch Nachahmung des membrangebundenen Liganden-Clusterns
in Lösung
erreicht. Somit umfasst ein biologisch aktiver, geclusterter, löslicher
Ligand der eph-Familie (lösliches
Efl)n, worin das lösliche efl die extrazelluläre Domäne eines
Liganden ist, der einen Rezeptor der eph-Familie bindet und n zwei
oder größer ist.
Wie hierin beschrieben sind Efl-1, Efl-2 und Efl-3 alle gemäß dem Verfahren der Erfindung
biologisch aktiv gemacht.
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In
jedem Fall wird der Fachmann erkennen, dass der Erfolg des Clusterns
eine Analyse der biologischen Aktivität unter Verwendung von Biotests,
wie den hierin beschriebenen erfordert. Zum Beispiel gibt es, wie
in 5 gezeigt, trotz der Tatsache, dass die Rezeptorphosphorylierung
deutlich durch die Stimulierung von Rezeptor exprimierenden Reporter-Zellen
mit COS-Zellen, welche Membranformen der Liganden B61, Efl-2 und
Efl-3 (5A, Bahnen 1 und 2) über-exprimieren,
induziert wird, bei der Verwendung von löslichen Formen dieser Liganden
keine erkennbare Phosphorylierung (5B,
Bahnen 2 und 3, und 5C, Bahn 2). Werden
jedoch sekretierte Formen der Liganden mit myc markiert und werden
Antikörper
verwendet, um die Liganden zu clustern, so induzieren die zuvor
inaktiven löslichen
Liganden stark eine Rezeptor-Tyrosin-Phosphorylierung in Reporter-Zellen, welche
Elk- und Ehk-1-Rezeptoren exprimieren (5B,
Bahnen 4 und 5, 5C, Bahn 3) sowie
eine Vermehrung in Reporter-Zellen, welche eine Eck-Rezeptor-Chimäre exprimieren (6A).
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Obwohl
in einigen Beispielen die Dimerisierung der Liganden ausreicht,
um biologische Aktivität
zu induzieren, zeigen die in 7 aufgeführten Daten,
wie die hierin beschriebenen Verfahren in bestimmten Fällen verwendet
werden, um die Hinlänglichkeit
eines bestimmten Cluster-Verfahrens zu bestimmen. Wie in 7 mit
dem Elk-Liganden gezeigt scheint die Dimerisierung des löslichen
Liganden unter Verwendung von Fc nicht auszureichen, um eine biologische
Antwort zu erzielen (7, Bahn C). Dennoch ergab ein
weiteres Clustern des Liganden gemäß der Erfindung unter Verwendung
von anti-Fc-Antikörpern
eine deutliche Zunahme der biologischen Aktivität (Bahn D).
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Im
Fall des Liganden B61 scheint mit dem löslichen Liganden ohne Clustern
ein geringer Wert an biologischer Aktivität erzielt zu werden; eine solche
niedrige biologische Aktivität
kann durch „Eigen-Clustern" auf geringem Niveau
verursacht werden. Dennoch zeigten die Anmelder, dass sogar im Fall
von efl's wie B61, die
einige biologische Aktivität
haben, die Aktivität
durch Clustern gemäß der vorliegenden
Erfindung verstärkt werden
kann.
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Zellen
können übergangsweise
oder vorzugsweise konstitutiv und permanent die Efl's in natürlicher Form
oder in löslicher
Form als markierte Efl's
oder geclusterte Efl's
wie hierin beschrieben exprimieren.
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Die
rekombinanten Faktoren können
durch jedes Verfahren, das die nachfolgende Bildung eines stabilen,
biologisch aktiven Proteins gewährleistet,
gereinigt werden. Als Beispiel und nicht als Beschränkung können die
Faktoren von Zellen entweder als lösliche Proteine oder als Einschlusskörper gewonnen
werden, von welchen sie quantitativ durch 8M Guanidin-Hydrochlorid
und Dialyse extrahiert werden können.
Um die Faktoren weiter zu reinigen können herkömmliche Ionenaustauschchromatographie,
hydrophobe Interaktions-chromatographie, Umkehrphasenchromatographie
oder Gelfiltration verwendet werden.
-
Der
mögliche
therapeutische Nutzen von verwandten Liganden von Ehk-1 wurde kürzlich vorgeschlagen.
Im adulten Gehirn zeigten zelluläre
Lokalisationen von ehk-1 an, dass das Gen vor allem in Neuronen exprimiert
wird und ihre höchste
Expressionsmenge in unterscheidbaren neuronalen Populationen erreichen, die einige
der wichtigsten zentralen aufsteigenden cholinergischen Nuclei (interpedunkulare
Region, Riechwulst und seitliche Mandeln) und monoaminergische Nuclei
(Locus coeruleus, Dorsalnaht und Substantia nigra) umfassen. Ehk-1-Sonden
heben stark den piriformen Cortex in der ventrolateralen Region
des Vorderhirns, das horizontale Glied des diagonalen Bands, das
rostrale Septum und Neuronen, welche mit dem Indusium griseum und
der Tenia tecta in Verbindung stehen im Hippocampus, in pyramidalen
Neuronen in CA3 und CA2 und etwas schwächer in CA1 im oberen Colliculus
und im retrosplenialen Cortex und in Neuronen des Locus coeruleus.
-
Im
Gehirn adulter Ratten kann beobachtet werden, dass Ehk-1 neuronenreiche
Anhäufungen,
welche mit den interpedunkularen Nuclei und der Substantia nigra,
den basolateralen und lateralen Mandeln und der Dorsalnaht in Verbindung
stehen stark hervorhebt. Ehk-1-Sonden konnten mit der granulären Schicht
des Cerebellums, mit Purkinje-Zellen im Cerebellum und mitralen
Zellen im Riechkolben hybridisieren.
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Bei
E13-Embryos kommen ehk-1-Transkripte bemerkenswert häufiger im
Kopf als im Körper
vor. Vom ersten Tag nach der Geburt an (P1) erreichen die Banden
ihren höchsten
Wert im Gehirn und gehen im adulten Gehirn leicht zurück. Ehk-1-Banden
gehen in zerebellaren Proben während
des Übergangs
von P1 zu Adulten zurück,
was nahe legt, dass die Hauptexpressionsstellen im adulten Gesamtgehirn
vor allem außerhalb
des Cerebellums liegen.
-
Längeres Aussetzen
zeigt, dass die neuralspezifischen Banden ebenfalls in RNAs von
Primärkulturen von
Astrocyten des Hipocampus nachweisbar sind. Dies ist unerwartet,
da RNA-Hybridisierungsstudien in situ anzeigen, dass das ehk-Gen
vor allem in Neuronen, nicht in Glia exprimiert wird. Untersuchungen
in verschiedenen etablierten Zelllinien zeigt an, dass ehk-1 vor
allem in Zellen neuronalen Ursprungs einschließlich verschiedener neuroepitheliomaler
und neuroblastomaler Linien exprimiert wird.
-
Der
Elk-Rezeptor wird ebenfalls primär
im Gehirn exprimiert. Entsprechend wird angenommen, dass der hierin
beschriebene Elk-bindende Ligand die Induktion einer differentiellen
Funktion unterstützen
wird und/oder den Phänotyp
wie das Wachstum und/oder das Überleben
von Nervenzellen bei der Expression dieses Rezeptors beeinflussen
wird.
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Northern-Blot-Analyse
(4) zeigte eingeschränkte und
reziproke Expressionsmuster für
Efl-2 (EHK-1L) und Efl-1 (B61) im Gegensatz zur breiten Verteilung
von Efl-3 (ELK-L). Wie Elk-1 wird Efl-2 fast ausschließlich im
Zentralnervensystem exprimiert mit der bemerkenswerten Ausnahme
von hoher Expression in der Haut, wo eine Ehk-1-Expression fast
nicht nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu wird Efl-1 (B61) primär in nicht-neuronalen
Geweben exprimiert (4A; längeres Aussetzen zeigt geringe
Mengen an B61 in den meisten Nervenstrukturen). Anders als der Elk-Rezeptor,
der nur im Gehirn und in den Hoden exprimiert wird, wird Efl-1 (ELK-L)
sowohl in neuronalen als auch nicht-neuronalen Geweben in großem Maße exprimiert.
Im Gehirn ist sowohl die Expression von Efl-1 als auch Efl-3, jedoch
nicht von Efl-2 früh
in der Entwicklung deutlich höher und
geht dann zurück
(4B). Was Efl-1 und Efl-3 betrifft, so werden die
Liganden für
andere für
das Nervensystem spezifische Rezeptor-Tyrosinkinasen (wie die Neurotrophin-Liganden
für die
Trk-Rezeptoren) ebenfalls in nicht-neuronalen Geweben exprimiert
(Maisonpierre et al. 1990, Science 247:1446–1451; Maisonpierre et al.
1990, Neuron 5:501–509),
offensichtlich weil sie als Zielabgeleitete Faktoren für axonale
Prozesse, die diese Gewebe innervieren, dienen (Thoenen, H. 1991;
Trends Neurosci. 14:165–170).
Die nicht-neuronale Expression von Efl-1 und Efl-3 erhöht die Möglichkeit,
dass sie als Liganden für
Mitglieder der Eph-Rezeptorfamilie dienen, wie Eck, welche durch
Nicht-Nervenzellen exprimiert werden.
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Die
hierin beschriebenen Efl's,
Peptidfragmente davon oder Derivate, einschließlich geclusterte Liganden
können
in einem geeigneten pharmakologischen Träger formuliert werden, um Arzneimittel
bereitzustellen. Die Efl-Proteine, Peptidfragmente oder Derivate
können
systemisch oder lokal verabreicht werden. Jede geeignete Art der
Verabreichung, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt auf
intravenöse,
intrathecale, intraarterielle, intranasale, orale, subcutane, intraperitoneale
Verabreichung oder lokale Injektion oder chirurgisches Implantat.
Langzeitwirkende Formulierungen werden ebenfalls bereitgestellt.
-
BEISPIEL 1: EXPRESSIONSCLONIERUNG
VON EHK-1-BINDENDEN LIGANDEN
-
COS-7-Zellen
wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle Medium (DMEM), welches 10%
fötales
Rinderserum (FBS), jeweils 1 % Penicillin und Streptomycin (P/S)
und 2 mM Glutamin in einer Atmosphäre von 5% CO2 enthielt,
gezüchtet.
Die menschliche Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y (erhalten von June
Biedler, Sloan-Kettering) wurde in Eagle minimalem Essentialmedium
(EMEM) mit 10% FBS, (P/S) und 2 mM Glutamin gezüchtet.
-
Menschliche
Efl-cDNA-Clone voller Länge
wurden durch Absuchen einer SHSY5Y-cDNA-Genbank in dem pJFE14-Vektor, der
in COS-Zellen exprimiert wird, erhalten. Menschliche Efl-4-cDNA-Clone
voller Länge wurden
durch Absuchen einer cDNA-Genbank
einer menschlichen 143B-Osteosarcom Zelllinie in dem pJFE14-Vektor,
der in COS-Zellen exprimiert wird, erhalten. Der pJFE14-Vektor ist,
wie in 1 gezeigt, eine modifizierte Version des Vektors
pSRα (Takebe,
et al. 1988, Mol. Cell. Biol. 8:466–472). Die Genbank wurde unter
Verwendung der zwei BSTX1-Restriktionsorte
im pJFE14-Vektor hergestellt.
-
COS-7-Zellen
wurden vorübergehend
entweder mit der pJFE14-Vektor-Genbank oder einem Kontrollvektor
durch das DEAE-Dextran-Transfektionsprotokoll transfiziert. Kurz,
COS-M5-Zellen wurden in einer Dichte von 1,0 × 106 Zellen
pro 100 mm Platte 24 Stunden vor der Transfektion ausgestrichen.
Für die
Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem DMEM, welches 400 μg/ml DEAE-Dextran,
1 μM Chloroquin
und 2 mM Glutamin und 1 μg
der geeigneten DNA enthielt, 3–4
Stunden bei 37°C
in einer Atmosphäre
von 5% CO2 gezüchtet. Das Transfektionsmedium
wurde belüftet
und durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 10% DMSO 2–3 Min lang
ersetzt. Nach diesem DMSO-„Schock" wurden die COS-7-Zellen
mit 10% FBS, jeweils 1 % Penicillin und Streptomycin und 2 mM Glutamin
für 48
Stunden in DMEM platziert.
-
Das
Absuchen wurde unter Verwendung eines Ehk-1-Rezeptorkörpers, der
aus der extrazellulären Domäne von Ehk-1
bestand, welche mit der konstanten Region von IgG1 verbunden war,
durch direkte Lokalisierung einer Oberflächenfärbung durchgeführt. Dieser
Rezeptorkörper
wurde wie folgt hergestellt: Der Fc-Abschnitt von menschlichem IgG1,
der an der Hinge-Region beginnt und bis zu dem Carboxylende des
Moleküls
reicht, wurde unter Verwendung von PCR mit Oligonucleotiden, die
der veröffentlichten
Sequenz von menschlichem IgG1 entsprechen, von plazentaler cDNA
cloniert. Geeignete Restriktionsorte wurden ebenfalls in die Oligonucleotide
eingeschlossen, um eine Clonierung des PCR-Fragments in einen Expressionsvektor zu
gewährleisten.
Expressionsvektoren, die Rezeptoren von voller Länge enthalten, wurden entweder
durch den Abbau durch Restriktionsenzyme oder durch PCR-Strategien
modifiziert, um die transmembranen und intrazellulären Domänen durch
Restriktionsorte zu ersetzen, die eine Clonierung des menschlichen
IgG1-Fragments in diese Orte gewährleisten;
dies wurde auf eine Weise durchgeführt, dass ein Fusionsprotein
mit der Ektodomäne
des Rezeptors als Aminoende und dem Fc-Abschnitt von menschlichem
IgG1 als Carboxylende erzeugt wurde. Ein Alternativverfahren zur
Herstellung von Rezeptorkörpern
wird in Goodwin, et al. 1993, Cell 73:447–456 beschrieben. Kurz, eine
Platte von 100 mm mit COS-Zellen
wurde mit 1 μg
SHSY5Y-Genbank-Plasmid-DNA transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion
wurden die Zellen dadurch sondiert, dass sie 30 Min mit Ehk-1IgG
(in Form von COS-Zellüberständen) inkubiert
wurden. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen, mit Methanol
fixiert und dann zusätzliche
30 Min mit PBS/10% Rinder-Kälberserum/anti-menschlichem
IgG-basischem Phosphatase-Konjugat
inkubiert. Nach drei Waschungen mit PBS wurden die Zellen 30–60 Min
in alk-phos-Substrat inkubiert. Die Platte wurde dann mikroskopisch
auf die Gegenwart von oberflächengefärbten Zellen
hin geprüft.
Für jede
gefärbte
Zelle wurde mit einer Plastikpipettenspitze ein kleiner, sie umgebender
Bereich von der Platte gekratzt und Plasmid-DNA wurde dann gewonnen
und verwendet, um Bakterienzellen zu elektroporieren. Plasmid-DNA,
die von Kulturen hergestellt wurde, welche aus diesen Elektroporationen
abgeleitet wurden, wurde verwendet, um COS-Zellen für eine zweite
Anreicherungsrunde zu transfizieren. Die zweite Runde wurde mit
Standard-Panning-Techniken
durchgeführt.
Nach der zweiten Anreicherungsrunde wurden einzelne Bakterienkolonien
herausgenommen und Plasmid-DNA, die aus diesen Kolonien hergestellt
wurde, wurde auf ihre Fähigkeit,
Ehk-1-Färbung
in COS-Zellen, welche mit ihnen transfiziert wurden, zu induzieren,
getestet.
-
Drei
Clone aus der SY5Y-Genbank wurden identifiziert, die eine Bindung
an den Ehk-1-Rezeptorkörper
zeigten. Der erste wurde als B61 identifiziert. Der zweite und dritte
Clon, welche identisch sind und hierin efl-2 genannt werden, scheinen
sich von B61 zu unterscheiden, jedoch mit ihm verwandt zu sein,
wie unter Verwendung von teilweiser Nucleotidsequenzierung bestimmt
wurde, welche nahe legt, dass diese Familienmitglieder von B61 sein
könnten.
Alle drei Liganden scheinen membrangebunden zu sein. Des Weiteren
ist Efl-2 wie B61 GPI-gebunden.
-
Die
Genbank, die von der menschlichen Osteosarcom-Zelllinie abgeleitet
ist ergab einen Clon, der Efl-4 codiert. Dieser Ligand bindet die
Ehk-1, Ehk-2 und Ehk-3 und Eck-Rezeptoren, jedoch nicht den Elk-Rezeptor.
-
BEISPIEL 2; CLONIERUNG
VON EFL'S
-
Homologieregionen
zwischen B61 und Efl-2 können
verwendet werden, um zusätzliche
Efl's, wie in der
Patentanmeldung der Vereinigten Staaten Reihe Nr. 08/144.992 beschrieben,
zu identifizieren. 2 zeigt zum Beispiel zwei solche
Sequenzhomologieregionen, die jeweils die Aminosäuresequenzen mit den Einzelbuchstaben
V(F/Y)WNSSN (SEQ ID NR:5) und NDY(V/L)DI(I/Y)CPHY (SEQ ID NR:6)
tragen, wobei die Buchstaben in Klammern Reste anzeigen, die sich
in menschlichem und Ratten-B61 im Vergleich zu dem abgeleiteten
Efl-2-Protein unterscheiden. Degenerierte Oligodesoxynucleotide,
die diesen beibehaltenen Proteinregionen entsprechen, können dann
konstruiert werden und verwendet werden, um PCR-Reaktionen unter
Verwendung von cDNAs, die aus verschiedenen Geweben, einschließlich embryonischem
und adultem Gehirn, hergestellt werden, auszulösen. Entstehende verstärkte DNA-Fragmente
können
dann durch Insertion in die Plasmide cloniert werden, DNA-Sequenzierung
unterzogen werden und diese Sequenzen können dann mit jenen der bekannten
Efl's verglichen
werden.
-
BEISPIEL 3: EXPRESSIONSCLONIERUNG
VON ELK-BINDENDEN LIGANDEN
-
COS-7-Zellen
wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle Medium (DMEM), welches 10%
fötales
Rinderserum (FBS), jeweils 1 % Penicillin und Streptomycin (P/S)
und 2 mM Glutamin in einer Atmosphäre von 5% CO2 enthielt,
gezüchtet.
Die menschliche Neuroepitheliomlinie CP-100 (erhalten von) wurde
in Eagle minimalem Essentialmedium (EMEM) mit 10% FBS, (P/S) und
2 mM Glutamin gezüchtet.
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Menschliche
Efl-cDNA-Clone voller Länge
wurden durch Absuchen einer CP100-cDNA-Genbank in dem pJFE14-Vektor, der
in COS-Zellen exprimiert wird, erhalten. Dieser Vektor ist, wie
in 1 gezeigt, eine modifizierte Version des Vektors
pSRα (Takebe,
et al. 1988, Mol. Cell. Biol. 8:466–472). Die Genbank wurde unter
Verwendung der zwei BSTX1-Restriktionsorte im pJFE14-Vektor hergestellt.
-
COS-7-Zellen
wurden vorübergehend
entweder mit der pJFE14-Vektor-Genbank oder einem Kontrollvektor
durch das DEAE-Dextran-Transfektionsprotokoll transfiziert. Kurz,
COS-M5-Zellen wurden in einer Dichte von 1,0 × 106 Zellen
pro 100 mm Platte 24 Stunden vor der Transfektion ausgestrichen.
Für die
Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem DMEM, welches 400 μg/ml DEAE-Dextran,
1 μM Chloroquin
und 2 mM Glutamin und 1 μg
der geeigneten DNA enthielt, 3–4
Stunden bei 37°C
in einer Atmosphäre
von 5% CO2 gezüchtet. Das Transfektionsmedium
wurde belüftet
und durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 10% DMSO 2–3 Min lang
ersetzt. Nach diesem DMSO-„Schock" wurden die COS-7-Zellen
mit 10% FBS, jeweils 1 % Penicillin und Streptomycin und 2 mM Glutamin
für 48
Stunden in DMEM platziert.
-
Das
Absuchen wurde unter Verwendung eines Elk-Rezeptorkörpers, der
aus der extrazellulären
Domäne
von Elk bestand, welche mit der konstanten Region von IgG1 verbunden
war, durch direkte Lokalisierung einer Oberflächenfärbung durchgeführt. Dieser
Rezeptorkörper
wurde wie folgt hergestellt: Der Fc-Abschnitt von menschlichem IgG1,
der an der Hinge-Region beginnt und bis zu dem Carboxylende des
Moleküls
reicht, wurde von plazentaler cDNA unter Verwendung von PCR mit
Oligonucleotiden, die der veröffentlichten
Sequenz von menschlichem IgG1 entsprechen, cloniert. Geeignete Restriktionsorte
wurden ebenfalls in die Oligonucleotide eingeschlossen, um eine
Clonierung des PCR-Fragments in einen Expressionsvektor zu gewährleisten.
Expressionsvektoren, die Rezeptoren von voller Länge enthielten, wurden entweder
durch den Abbau durch Restriktionsenzyme oder durch PCR-Strategien
modifiziert, um die transmembranen und intrazellulären Domänen durch
Restriktionsorte zu ersetzen, die eine Clonierung des menschlichen
IgG1-Fragments in diese Orte gewährleisten;
dies wurde auf eine Weise durchgeführt, dass ein Fusionsprotein
mit der Ektodomäne
des Rezeptors als Aminoende und der Fc-Abschnitt von menschlichem
IgG1 als Carboxylende erzeugt wurde. Ein Alternativverfahren zur
Herstellung von Rezeptorkörpern
wird in Goodwin, et al. 1993, Cell 73:447–456 beschrieben.
-
Kurz,
eine Platte von 100 mm mit COS-Zellen wurde mit 1 μg CHP100-Genbank-Plasmid-DNA transfiziert.
Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen dadurch sondiert,
dass sie 30 Min mit Elk-IgG (in Form von COS-Zellüberständen) inkubiert
wurden. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen, mit Methanol
fixiert und dann zusätzliche
30 Min mit PBS/10% Rinder-Kälberserum/antimenschlichem
IgG-basischem Phosphatase-Konjugat inkubiert. Nach drei Waschungen
mit PBS wurden die Zellen 30–60
Min in alk-phos-Substrat inkubiert. Die Platte wurde dann mikroskopisch
auf die Gegenwart von oberflächengefärbten Zellen
hin geprüft.
Für jede
gefärbte
Zelle wurde mit einer Plastikpipettenspitze ein kleiner, sie umgebender Bereich
von der Platte gekratzt und Plasmid-DNA wurde dann gewonnen und
verwendet, um Bakterienzellen zu elektroporieren. Plasmid-DNA, die von Kulturen
hergestellt wurde, welche aus diesen Elektroporationen abgeleitet
wurden, wurde verwendet, um COS-Zellen für eine zweite Anreicherungsrunde
zu transfizieren. Die zweite Runde wurde mit Standard-Panning-Techniken
durchgeführt.
Nach der zweiten Anreicherungsrunde wurden einzelne Bakterienkolonien
herausgenommen und Plasmid-DNA, die aus diesen Kolonien hergestellt wurde,
wurde auf ihre Fähigkeit,
Elk-Färbung
in COS-Zellen, welche mit ihnen transfiziert wurden, zu induzieren,
getestet.
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Ein
identifizierter Clon, der Bindung an den Elk-Rezeptorkörper zeigte,
wurde beim ATCC am 12. April 1994 hinterlegt und als 75734 bezeichnet.
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BEISPIEL 4: AKTIVIERUNG
VON LÖSLICHEN
EFL'S
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Tests
von membrangebundenen Efl's
wurden entweder durch Züchten
von COS-Zellen,
die mit Vektor allein (COS-Mock) oder von COS-Zellen, die mit Efl-3-Expressionsvektor
transfiziert wurden, durchgeführt,
wobei die Zellen von den Platten mit PBS und 1 mM EDTA gelöst, dann
pelletiert und in PBS resuspendiert wurden. Die Zellen wurden oben
auf Reporter-Zelllinien aufgelagert.
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Lösliches
Efl-3 (Elk-1) und Efl-1 (B61), jedes unter Verwendung des myc-Epitops
an ihren C-Enden markiert (Stahl, et al. Science 263, 92–95 (1994)],
wurden als COS-Zellüberstände hergestellt
und als ungeclusterte Liganden oder als durch Antikörper geclusterte
Liganden verwendet. Die Ligandenkonzentrationen wurden durch Quantifizieren
der Menge an myc-Epitop auf Slot-Blots abgeschätzt; das Liganden-Clustern wurde durch
Zusetzen von monoclonalen anti-myc-Antikörpern und polyclonalen anti-Maus-Antikörpern und
Inkubation bei 37°C
für eine
Stunde durchgeführt,
bevor die Zellen stimuliert wurden. Reporter-Zelllinien waren 3T3-Fibroblasten, die
mit Elk transfiziert waren (5A und 5B) oder C2C12-Zellen, die mit Ehk-1 transfiziert waren
(5C). Reporterzellen wurden auf 10cm-Platten
4–6 Stunden
in serumfreiem Medium ausgehungert und dann 15 Minuten wie oben
angemerkt stimuliert, dann solubilisiert und mit Antikörpern, die
die Rezeptoren erkennen, immunpräzipitiert.
Die Immunpräzipitate
wurden mit Antikörpern
gegen Phosphotyrosin immun-geblottet (5, obere
Abbildungen) und danach gestrippt und erneut mit Antikörpern belegt,
die die Rezeptoren erkennen, um das gesamte Rezeptorprotein sichtbar
zu machen (5, untere Abbildungen).
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Um
die Induktion der Wachstumsreaktionen in BAF-Zellen zu messen, welche
durch Rezeptor-Chimären
vermittelt wurden, wurden Stimulierungen mit löslichem EHK-1 L (Efl-2) und
B61 (Efl-1), welche in COS-Zellen mit oder ohne nachfolgendes Clustern
hergestellt wurden, durchgeführt.
Nach zwei Tagen Stimulierung wurde die Anzahl an lebensfähigen Zellen
durch Zusetzen der vitalen Färbung
MTT (3-{4,5-Dimethylthiazol-yl}-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) über 4 Stunden
festgestellt, gefolgt von Solubilisierung und Bestimmung der optischen
Dichte (O.D.) wie zuvor beschrieben [lp et al., 1993, Neuron 10:137–149) (8).
Die in 9 beschriebenen Daten resultieren aus MTT-Tests,
die wie vorstehend mit löslichem
Ehk-1L-Fc und B61-Fc, hergestellt in COS-Zellen mit und ohne nachfolgendes Clustern
mit anti-Fc-Antikörpern,
durchgeführt wurde.
Da die katalytische Domäne
des Eck-Rezeptors Wachstumsreaktionen in BAF-Zellen nicht vermittelt, wurde
stattdessen eine Rezeptorchimäre
(in der die Ektodomäne
des Eck-Rezeptors mit der cytoplasmatischen Domäne des FGF-Rezeptors fusioniert
wurde) in BAF-Zellen eingeführt,
um eine Reporter-Zelllinie herzustellen.
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Wie
in 5B, Bahnen 2 und 3 und in 5C, Bahn 2 gezeigt, wurde keine Liganden
induzierte Rezeptoraktivierung, wie durch die Rezeptorphosphorylierung
beurteilt, bei der Verwendung von löslichen Formen von Elk-1 (Efl-3)
oder B61 (Efl-1) beobachtet. Eine Rezeptorphosphorylierung wurde
jedoch deutlich durch die Stimulierung von Rezeptor exprimierenden
Reporter-Zellen mit COS-Zellen, die membrangebundene Formen dieser
Liganden überexprimieren,
induziert (z.B. 5A, Bahnen 1 und 2).
Um diese Diskrepanz zu erklären,
vermuteten wir, dass Membranbindung das Liganden-Clustern erleichtert,
welches wiederum die Rezeptormultimerisation und -Aktivierung fördert. Um
ein Liganden-Clustern in Lösung
nachzuahmen, wurden sekretierte Ligandenformen mit Epitopmarkierungen
an ihren C-Termini konstruiert; Antikörper gegen die Markierungen
wurden dann verwendet um die Liganden zu aggregieren. Diese Art
des Clusterns ermöglichte
es zuvor inaktiven löslichen
Liganden, die Rezeptortyrosin-Phosphorylierung in Reporter-Zellen,
die Elk- und Ehk-1-Rezeptoren exprimieren (5B,
Bahnen 1–5
und 5C, Bahnen 1–3) in hohem Maß zu induzieren. Auf ähnliche
Weise reicht die Dimerisierung des Liganden, wie gezeigt in 7 mit
Hinblick auf Efl-3 (ELK-L), nicht aus, um biologische Aktivität zu induzieren,
wohingegen Multimere eine signifikante Aktivität zeigten. Diese Ergebnisse
zeigen die Notwendigkeit, wie hierin beschrieben, die Effizienz
eines bestimmten Mechanismus des Clusterns insofern festzustellen,
als jeder einzelne Ligand betroffen ist.
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Eine
solche Effizienz des Clusterns kann durch Messen der Phosphorylierung
des Rezeptors bestimmt werden. Alternativ kann die Vermehrung in
Reporterzellen verwendet werden, die einen geeigneten Rezeptor oder
eine geeignete Rezeptorchimäre
exprimieren, wie die Eck-Rezeptorchimäre, die in Experimenten verwendet
wurde, deren Ergebnisse in 6 gezeigt
sind.
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Dosis-Reaktions-Studien
zeigten, dass Clustern eine mindestens 100-mal größere Potenz
und gesättigte
Reaktionen mit geringen Ligandenkonzentrationen (im Vergleich zu
jenen, welche mit Liganden gesehen wurden) im Vergleich zu anderen
Rezeptorfamilien sowohl im Phosphorylierungstest (getestet für den Elk-Liganden,
Daten nicht gezeigt) als auch im Vermehrungstest (getestet für Efl-1
und B61, 6) ergab [lp, et al. Neuron
10:137–149
(1993)]. Die geringe Wirkung von nichtgeclustertem B61 (6B) erinnert an die kürzliche Entdeckung, dass hohe
Konzentrationen an löslichem
B61 die Eck-Tyrosin-Phosphorylierung induzieren könnte [Bartley,
et al. Nature 368:558–560
(1994)]; in der letzteren Studie wurde die Sättigung nicht einmal bei 1–2 mg/ml
B61-Konzentrationen erreicht. Diese Wirkungen könnten einer schwachen Fähigkeit
des löslichen
Liganden selbst zugeschrieben werden zu dimerisieren oder zu aggregieren,
entweder spontan oder als Ergebnis einer Reinigung. Es wird angenommen,
dass lösliche
Liganden ihre Rezeptoren auf Grund ihrer Bivalenz oder Multivalenz
aktivieren [Schlessinger, J. & Ullrich,
A. Neuron 9:383–391
(1992)]; einige Liganden sind Monomere, die zwei unterschiedliche
Rezeptorbindungsstellen enthalten, wohingegen andere als kovalent
oder nicht-kovalent miteinander verbundene Dimere Bivalenz erreichen.
Unsere Ergebnisse definieren eine neue Klasse von Liganden, die
als lösliche
Liganden uneffektiv erscheinen, möglicherweise, weil sie monovalent sind,
obwohl sie in Lösung
durch Clustern künstlich
aktiviert werden können.
Diese Liganden scheinen für
die Aggregation und die Aktivierung ihrer Rezeptoren von ihrer Membranbindung
abzuhängen.
Durch die Begrenzung der Diffusion in zwei Richtungen könnte eine
Membranbindung die Wahrscheinlichkeit von Ligand-Ligand-Kollisionen leicht
erhöhen
und dadurch die Ligandendimerisierung oder ein extensiveres Liganden-Clustern
zwischen Liganden, die in Lösung
nur schwach interagieren, fördern.
Alternativ können
spezifische Mechanismen zur Bildung von Ligandencluster auf der
Zelloberfläche
existieren. Zusätzlich
würde erwartet,
dass Liganden-Rezeptor-Paare in den Kontaktregionen zwischen Zellen,
die Liganden tragen, und Zellen, die Rezeptoren tragen, erwartet.
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Irgendeine
oder alle dieser lateralen Aggregations-Wirkungen könnten zur
Rezeptor-Multimerisation und
-Aktivierung beitragen. Die Beobachtung, dass der EPH-verbundene, neuronal-exprimierte
NUK-Rezeptor sich vorübergehend
in Regionen mit Zell-Zell-Kontakt konzentriert [Henkemeyer, et al.
Oncogene 9:1001–1014 (1994)],
bestätigt
die Möglichkeit,
dass Interaktionen zwischen einem Liganden, der an eine Membran
gebunden ist, und einem Rezeptor, der an eine andere Membran gebunden
ist, die laterale Aggregation fördern
könnte.
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HINTERLEGUNG
VON MIKROORGANISMEN
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Die
folgenden Mikroorganismen wurden bei der American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 in Übereinstimmung
mit dem Budapester Vertrag hinterlegt.
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Die
vorliegende Erfindung ist auf die hierin beschriebenen Ausführungsformen
nicht beschränkt.