JPH09511401A - 生物学上活性なｅｐｈ族リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｅｐｈ族リセプタを結合する新規なリガンドが同定され、生物学上活性型にて可溶性リガンドを作成する方法が記載される。これら新規な蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンは、ニューロンおよび他のリセプタを含有する細胞集団を支持するのに有用である組換蛋白質の産生を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学上活性なＥＰＨ族リガンド この出願は１９９４年９月１日付け出願の「Ｅｐｈ族リガンドの生物学的活性 を増大させる方法」と題する米国特許出願第０８／２９９，５６７号の部分継続 出願であり、米国特許出願第０８／２９９，５６７号は１９９４年４月１２日付 け出願の「Ｅｐｈ族リガンド」と題する米国特許出願第０８／２２９，４０２号 の部分継続出願であり、米国特許出願第０８／２２９，４０２号は１９９４年４ 月４日付け出願の「Ｅｈｋ−１結合性リガンド」と題する米国特許出願第０８／ ２２２，０７５号の部分継続出願であり、米国特許出願第０８／２２２，０７５ 号は１９９３年１０月２８日付け出願の「ニューロトリフィン活性のための分析 システム」と題する米国特許出願第０８／１４４，９９２号の部分継続出願であ り、米国特許出願第０８／１４４，９９２号は１９９１年７月２６日付け出願の 「ニューロトロフィン活性のための分析システム」と題する米国特許出願第０７ ／７３６，５５９号の部分継続出願であり、米国特許出願第０７／７３６，５５ ９号は１９９１年７月１０日付け出願の「ニューロトロフィン活性のための分析 システム」と題 する米国特許出願第０７／６９０，１９９号の部分継続出願である。 技術分野 本発明は、リセプタ様蛋白質チロシンキナーゼ、たとえばＥｈｋ（Ｅｈｋ−１ 、Ｅｈｋ−２およびＥｈｋ−３を含む）、ＥｃｋおよびＥｌｋのＥｐｈサブ族に 属する蛋白質を結合する新規なリガンド、並びに生物学上活性である可溶性型の これらリガンドを作成する方法を提供する。 発明の背景 細胞を結合することによりたとえば細胞成長、生存もしくは分化のような表現 型反応を誘発するポリペプチドリガンドの能力は、しばしば経膜チロシンキナー ゼを介して媒介される。各リセプタ チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の細胞外部分 は一般に、蛋白質にリガンド認識特性を付与するので、分子の最も特有な部分で ある。細胞外ドメインに対するリガンドの結合は細胞内チロシンキナーゼ触媒ド メインを介しシグナル導入をもたらし、生物学的シグナルを細胞内の標的蛋白質 に伝達する。この細胞質触媒ドメインにおける配列モチーフの特定列は、潜在的 キナーゼ基質へのアクセスを決定する［モハマジ等（１９９０）、 モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１１巻、第５０６８〜５０７８頁；ファ ントル等（１９９２）、セル、第６９巻、第４１３頁］。 ＲＴＫは、リガンド結合の後に二量化または他の関連するコンホメーション変 化を受けると思われ［Ｊ．シュレッシンガー（１９８８）、トレンド・バイオケ ミカル・サイエンス、第１３巻、第４４３〜４４７頁；ウルリッチおよびシュレ ッシンガー（１９９０）、セル、第６１巻、第２０３〜２１２頁；シュレッシン ガーおよびウルリッチ（１９９２）、ニューロン、第９巻、第３８３〜３９１頁 ］；各二量化性細胞質ドメイン間の分子相互作用はキナーゼ機能の活性化をもた らす。たとえば成長因子血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）のような場合はリガ ンドが２種のリセプタ分子を結合するダイマーである［ハルト等（１９８８）、 サイエンス、第２４０巻、第１５２９〜１５３１頁；ヘルジン（１９８９）、ジ ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６４巻、第８９０５〜８９１２ 頁］のに対し、たとえばＥＧＦの場合はリガンドがモノマーである［ウェーバー 等（１９８４）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５９巻、第 １４６３１〜１４６３６頁］。 高等生物における特定チロシンキナーゼ リセプタの組織分布はリセプタの生 物学的機能に関する適切なデータを与える。たとえば繊維芽細胞成長因子（ＦＧ Ｆ）のような或る種の成長因子および分化因子に関するチロシンキナーゼ リセ プタは広く発現され、したがって組織の成長および維持において或る種の一般的 な役割を演ずると思われる。リセプタのＴｒｋ ＲＴＫ族の各構成員［グラスお よびヤンコプーロス（１９９３）、トレンズ・イン・セルラ・バイオロジー、第 ３巻、第２６２〜２６８頁］はより一般的に神経系の細胞に限定され、さらにＮ ＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４／５よりなる神経成長因子族（ノイロ トロフィンとして知られる）はこれらリセプタを結合して脳および周辺部におけ る多様なニューロン群の分化を促進する［Ｒ．Ｍ．リンドセー（１９９３）、ニ ューロトロフィン因子、Ｓ．Ｅ．ラフリンおよびＪ．Ｈ．ファロン編、第２５７ 〜２８４頁（サンジエゴ、ＣＡ；アカデミックプレス社）］。組織におけるこの 種の１種のＴｒｋ族リセプタの局在は、このリセプタの潜在的な生物学的役割お よびこのリセプタを結合するリガンド（ここではコグネートと称する）に対する 洞察を可能にする。たとえば成体マウスにおいてｔｒｋＢは脳 組織で優先的に発現することも判明したが、著量のｔｒｋＢ ｍＲＮＡが肺、筋 肉および卵巣にも観察された。さらにｔｒｋＢ転写物は、妊娠中期および後期の 胎児にも検出された。１４日令および１８日令のマウス胎児の現場（ｉｎ ｓｉ ｔｕ）ハイブリッド化分析は、ｔｒｋＢ転写物が中枢および末梢神経系、たとえ ば脳、脊髄、脊髄神経節、脳神経節、交感神経系の脊椎傍トランクおよび各種の 神経支配経路に局在することを示し、これはｔｒｋＢ遺伝子産生物が神経発生お よび早期神経発育に関与するリセプタであると共に成体神経系にて役割を演ずる ことを示唆する。 ＲＴＫが発現される細胞環境は、リセプタに対するリガンドの結合に際し示さ れる生物学的反応に影響を及ぼし得る。たとえばＴｒｋリセプタを発現するニュ ーロン細胞がそのリセプタを結合するニューロトロフィンに暴露されると、ニュ ーロンの生存および分化が生ずる。同じリセプタが繊維芽細胞により発現される と、ニューロトロフィンに対する暴露は繊維芽細胞の増殖をもたらす［グラス等 （１９９１）、セル、第６６巻、第４０５〜４１３頁］。すなわち、細胞外ドメ インはリガンド特異性に関する決定因子を与えると思われ、シグナル導入が開始 されると細胞環境はこのシグナル導入の表現型成果を決定する。 多くのＲＴＫ族が、その細胞内ドメインにおける配列相同性に基づいて同定さ れている。ＮＧＦにより利用されるリセプタおよびシグナル導入経路はｔｒｋプ ロトオンコジーンの産生物を含む［カプラン等（１９９１）、ネイチャー、第３ ５０巻、第１５６〜１６０頁；クライン等（１９９１）、セル、第６５巻、第１ ８９〜１９７頁］。クライン等［（１９８９）、ＥＭＢＯジャーナル、第８巻、 第３７０１〜３７０９頁］は、ヒトｔｒｋプロトオンコジーンに高度に関連する と判明したチロシン蛋白質キナーゼ族のリセプタの第２構成員をコードするｔｒ ｋＢ の分離を報告している。ＴｒｋＢはＢＤＮＦ、ＮＴ−４および小程度ではあ るがＮＴ−３に結合して機能的反応を媒介する［スキント等（１９９１）、セル 、第６５巻、第８８５〜９０３頁；イプ等（１９９２）、プロシーディング・ナ ショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８９巻、第３０６０〜３０６４ 頁；クライン等（１９９２）、ニューロン、第８巻、第９４７〜９５６頁］。ア ミノ酸レベルにて、ｔｒｋおよびｔｒｋＢの産生物はｔｒｋに存在する１１個の システインのうち９個を含め細胞外領域に５７％の相同性を共有するこ とが判明した。この相同性はその各チロシンキナーゼ触媒ドメイン内では８８％ まで増大することが判明した。現在、Ｔｒｋ遺伝子族はｔｒｋＣローカスを含む よう拡大されており、ＮＴ−３がｔｒｋＣのための好適リガンドであると同定さ れている［ランバレ等（１９９１）、セル、第６６巻、第９６７〜９７９頁；バ レンズエラ等（１９９３）、ニューロン、第１０巻、第９６３〜９７４頁］。 Ｅｐｈ関連の経膜チロシンキナーゼは既知の最大リセプタ様チロシンキナーゼ 族を含み、多くの構成員が発育中および成体の神経系における特異的発現を示す 。Ｅｈｋ（ｅｐｈ相同性キナーゼ）−１および−２と称するＥｐｈ ＲＴＫ族の ２種の新規な構成員が、脳にて発現された遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）に基づくスクリーニングにより同定された［メイソンピエール等（１９９３ ）、オンコジーン、第８巻、第３２７７〜３３８８頁］。これら遺伝子は専ら神 経系にて発現されると思われ、Ｅｈｋ−１発現が神経発育の早期に開始する。最 近、この群の関連リセプタにおける新たなもの（Ｅｈｋ−３）がクローン化され た［バレンズエラ等、出版中］。 ｅｌｋ遺伝子はｅｐｈサブ族にも属するリセプタ様蛋白質− チロシンキナーゼをコードすると共に、殆ど専ら脳にて発現される（精巣では低 レベル）［レトウィン等（１９８８）；オンコジーン、第３巻、第６２１〜６７ ８頁；ロータック等（１９９１）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１１ 巻、第２４９６〜２５０２頁］。発現プロフィルに基づき、Ｅｌｋリセプタおよ びその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンドは神経系における細胞と細胞との相互作 用にて役割を演ずると予想される。 ＥｈｋおよびＥｌｋリセプタとは異なり、近縁のＥｃｋリセプタはより多面発 現的に機能すると思われ、神経組織、表皮組織および骨格組織にて同定されてお り、さらにマウス胎児におけるパターン形成の原腸形成部位、頭蓋顔面部位およ び肢芽部位に含まれると思われる［ガンユ等（１９９４）、オンコジーン、第９ 巻、第１６１３〜１６２４頁］。 多数のリセプタ チロシンキナーゼの同定はその同族リガンドの同定をずっと 上回る。最良でも、この種のリセプタが発現される組織の決定は標的組織におけ る細胞の成長、増殖および再生の調整に関する洞察を可能にする。ＲＴＫは発育 に際し多くの重要な機能を媒介すると思われるので、その同族リガンド は必ず発育に重要な役割を演ずる。 １９９３年１０月２８日付け出願の米国特許同時係属出願第０８／１４４，９ ９２号（参考のため、その全体をここに引用する）には多数のオーファン チロ シンキナーゼ リセプタ様分子、たとえばｔｒｋリセプタおよびインシュリン リセプタ族に相同性である５種のこれら分子、並びにそれぞれＣＳＦ１Ｒ／ＰＤ ＧＦＲ／ｋｉｔ；ｒｅｔ；ｅｃｋ−α（現在ではＥｈｋ−２として知られる）； およびｅｃｋ−β（Ｅｈｋ−１）に対し相同性である他の４種の分子が記載され ている。この米国特許出願には、Ｅｈｋ−１およびＥｈｋ−２を発現する細胞系 統を用いてその同族リガンドを同定すべく分析する方法が記載されている。ｅｈ ｋは主上昇中央コリン発生核の幾つかを含め異なるニューロン集団にて発現され ると思われるので、これらリセプタを結合するリガンドはこれらニューロン細胞 の成長もしくは生存の促進に役割を演ずると予想された。Ｅｈｋ−１の発現は発 育の早期に開始するので、この同族リガンドは胚胎発育に役割を演ずる。 既に同定されている多くのオーファン リセプタにつき同族リガンドを同定す るため多くの方式も考案されているが、この 種のリガンドの極めて僅かしか同定されておらず、現在まで同定されているリガ ンドはその同族リセプタを結合する能力以外には活性を持たないと思われる。た とえば１９９４年５月２６日付け公開の国際特許公開ＷＯ／９４／１１０２０号 はＥｃｋリセプタに結合するリガンドを記載している。特にリガンドＥＢＰ（Ｂ ６１としても知られる）が記載されている。しかしながらＥｃｋリセプタに対す るＢ６１の結合は開示されているが、その生物学的活性については記載されてい ない。同様に、Ｅｌｋリセプタを結合するリガンドに関するＰＣＴ特許公開ＷＯ ９４／１１３８４号（１９９４年５月２６日付け公開）での説明にも拘らず生 物学的活性は観察されなかった。これはリガンドが膜結合として或いは可溶性リ ガンドのＦｃダイマーの形態のいずれで存在するかには無関係である。しかしな がらＥｌｋリセプタに関し、キメラＥＧＦＲ−Ｅｌｋリセプタ（Ｅｌｋ細胞質ド メインに融合したＥＧＦＲの細胞外ドメインを有する）がこのリセプタの酵素ド メインの機能的一体性（ＥＧＦ−刺激の自己燐酸化により測定）を示すべく使用 されている［ロータックおよびポーソン（１９９３）、モレキュラ・セルラ・バ イオロジー、第１３巻、第７０７１〜７０７９ 頁］。 発明の要点 本発明は、細胞におけるＥｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｅｈｋ−３、Ｅｃｋおよび Ｅｌｋの各リセプタに結合する新規なポリペプチド リガンドを提供する。より 重要なことに、本発明は分化機能を促進すると共にリセプタ含有細胞の表現型（ たとえば成長および／または増殖）に影響を及ぼすのに有用である生物学上活性 な可溶性型のこれらリガンドを作成する手段を提供する。さらに本発明は、この 種のポリペプチド リガンドをコードする核酸、並びにこの種の蛋白質を産生す るための原核性および真核性の両発現系をも提供する。さらに本発明はこれらリ ガンドに対する抗体をも提供する。 本発明によれば、ここで説明する可溶性型のリガンドを用いてＥｈｋ−１、Ｅ ｈｋ−２、Ｅｈｋ−３、ＥｃｋおよびＥｌｋリセプタ発現性細胞における生物学 的反応を促進することができる。特にｅｐｈ関連リセプタに関するリガンドの「 クラスター化」を生ぜしめる一般的方法につき開示し、これは不活性な可溶性リ ガンドを生物学上活性にするよう機能し、或いはこの種のクラスター化が存在し なければ極く低レベルの生物学上活 性しか持たないようなリガンドの生物学上活性を増大させる。 さらに、ここに開示するリガンドは診断用途をも有する。本発明の特定具体例 においては、その機能もしくは発現における異常性の検出方法を神経障害または 他の障害の診断に用いることができる。他の具体例においては、各リガンドとそ の同族リセプタとの間の相互作用を操作して神経障害または他の障害を処置する ことができる。 図面の説明 第１図：ベクターｐＪＦＥ１４。 第２図：Ｅｈｋ−１およびＥｌｋリセプタに関するリガンドの配列比較。Ｂ６ １（配列番号１）、Ｅｈｋ−１リガンド（ＥＨＫ−１Ｌ）（配列番号２）および Ｅｌｋリガンド（ＥＬＫ−Ｌ）（配列番号３）の整列配列を示す。これら３種全 ての配列により共有される部分を枠で囲い、少なくとも２種により共有される部 分をコンセンサス レーンで示し、太点線は保存システインを示し、星印は主た る保持領域を境界する各部分を区切る。下側文字は推定アミノ末端シグナル配列 を示すと共に、ＥＬＫ−Ｌの経膜ドメイン並びにＢ６１およびＥＨＫ１−Ｌのカ ルボキシ末端疎水性ＧＰＩ−認識テールをも示す。 第３図：ＥＨＫ−１Ｌコード領域のヌクレオチド配列（配列番号４）。 第４図：成体ラット組織（Ａ）および発育中の脳（Ｂ）におけるＥｆｌ−１（ Ｂ６１）、Ｅｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）およびＥｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）発現の ノーザンブロット分析。全ＲＮＡ（１レーン当り２０μｇ）を指定組織から分離 し、１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにて分画し、ナイロン膜に移した。 各ブロットを³²Ｐ−標識プローブ（このプローブは各ｃＤＮＡのコード領域に対 し内部の制限断片から得られる）にハイブリダイズさせた。 第５図：膜結合もしくはクラスター化したリガンドによるＥｐｈ族リセプタの 活性化（Ｅｌｋリセプタチロシン燐酸化により測定）。第５Ａ図：ベクター単独 でトランスフェクトした比較ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−Ｍｏｃｋ）またはＥｆｌ−３ （ＥＬＫ−Ｌ）をコードする発現構成物でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を用 いる刺激。第５Ｂ図：非クラスター化リガンド（第２ウェルおよび第３ウェル） または抗体（第４ウェルおよび第５ウェル）によりクラスター化させたリガンド として使用した可溶性ｍｙｃ−標識Ｅｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）での刺 激。（「＋Ａｂ」は抗体でクラスター化した可溶性リガンドを示す）。比較（０ ｎｇ／ｍＬ）を第１ウェルで示す。第５Ｃ図：非クラスター化リガンド（第２ウ ェル）または抗体によりクラスター化したリガンド（第３ウェル）として使用し た可溶性ｍｙｃ−標識Ｅｆｌ−１（Ｂ６１）での刺激。比較（０ｎｇ／ｍＬ）を 第１ウェルで示す。第Ａ、ＢおよびＣ図における上側パネルはホスホチロシンに 対する抗体で免疫ブロットした免疫沈殿物を示す。第Ａ、ＢおよびＣ図における 下側パネルは、その後にストリップすると共にリセプタを認識する抗体により再 プロービングして全リセプタ蛋白質を可視化させた免疫沈殿物を示す。 第６図：Ｅｃｋリセプタキメラにより媒介されるＢＡＦ細胞における成長反応 の誘発。Ａ．刺激をＣＯＳ細胞で産生された可溶性Ｅｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ） により、その後のクラスター化と共に或いはクラスター化なしに行った。Ｂ．刺 激をＣＯＳ細胞で産生された可溶性Ｅｆｌ−１（Ｂ６１）により、その後のクラ スター化と共に或いはクラスター化なしに行った。 第７図：クラスター化されたがダイマーでないリガンドによるＥＬＫリセプタ チロシン燐酸化の誘発。レーンＡ：抗−ヒ ト抗体なしのｍｏｃｋ ＣＯＳ上澄。レーンＢ：抗−ヒト抗体。レーンＣ：架橋 性抗体なしのＥＬＫ−Ｌ−Ｆｃ。レーンＤ：架橋性抗体。可溶性Ｆｃ−標識ＥＬ Ｋリガンド（ＥＬＫ−Ｌ−Ｆｃ）をＣＯＳ細胞上澄として産生させると共に、非 クラスター化ダイマー リガンドまたは抗体によりクラスター化されたリガンド として使用した。リガンド濃度は、ｅｌｉｓａ分析を用いてＦｃエピトープの量 を定量化することにより推定した。リガンドのクラスター化は、抗−ヒト抗体を 添加すると共に室温にて細胞刺激前に１時間インキュベートすることにより行っ た。レポータ細胞は、ＥＬＫでトランスフェクトされたＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細 胞とした。細胞を血清フリーの培地にて４〜６時間にわたり飢餓させ、次いで４ ０分間にわたり次のように刺激した：刺激に続き細胞を可溶化させると共に、リ セプタを認識する抗体で免疫沈澱させた。免疫沈殿物をホスホチロシンに対する 抗体で免疫ブロットした。 第８図：ＥＣＫリセプタ キメラにより媒介されるＢＡＦ細胞における成長反 応の誘発。各刺激を可溶性のトリプルｍｙｃ−標識ＥＨＫ１リガンド（ＥＨＫ１ Ｌ−ｍ３）およびＣＯＣ細胞で産生されたトリプルｍｙｃ−標識Ｂ６１（Ｂ６１ −ｍ３） により、その後の抗−ｍｙｃおよび抗−マウス抗体でのクラスター化と共に或い はそれなしに行った。ＥＣＫリセプタの触媒ドメインはＢＡＦ細胞における成長 反応を媒介しないので、リセプタ キメラ（ここでＥＣＫリセプタのエクトドメ インをＦＧＦリセプタの細胞質ドメインに融合される）をＢＡＦ細胞に導入して レポータ細胞系統を作成した。 第９図：ＥＣＫリセプタ キメラにより媒介されるＢＡＦ細胞における成長反 応の誘発。各刺激は、ＣＯＳ細胞で産生された可溶性のＥＨＫ１−Ｌ−Ｆｃおよ びＢ６１−Ｆｃにより、その後の抗−ヒト抗体でのクラスター化と共に或いはそ れなしに行った。 発明の詳細な説明 Ｅｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｅｈｋ−３、ＥｃｋおよびＥｌｋを用いる分析シス テムの利用は、ここに説明するようにこれらレポータに対する同族リガンドの発 見をもたらした。この種のリガンドはインビトロにおけるニューロン、表皮また は他のリセプタ含有細胞の各集団の成長および生存を促進するのに有用である。 一層詳細に以下説明するように、本出願人は発現クローン化 によりＥｈｋ−１およびＥｌｋリセプタを結合する１種もしくはそれ以上の新規 なリガンドを見出した。さらに本出願人は従来同定されているリガンドＢ６１［ ホルツマン等（１９９０）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１０巻、第 ５８３０〜５８３８頁］もＥｈｋ−１に結合すること並びにＢ６１とＥｈｋ−１ との両リガンドもＥｈｋ−２を結合することを突き止め、さらにＥｈｋ−３リセ プタおよびＥｃｋリセプタを新たに見出した。 ここに説明する新規なリガンドをＥｆｌ（Ｅｐｈ経膜チロシンキナーゼ族リガ ンド）と命名する。１９９４年４月１２日付け出願の同時係属米国特許出願第０ ８／２２９，４０２号および１９９４年４月４日付け出願の米国特許出願第０８ ／２２５，０７５号に最初に記載された新規なＥｈｋ−１結合性リガンドＥｆｌ −１およびＥｆｌ−２は同一であって、ここではＥｆｌ−２と再命名する。Ｅｈ ｋ−１、Ｅｈｋ−２およびＥｈｋ−３、並びにＥｃｋリセプタを結合する他のリ ガンドはＥｆｌ−４と同定されており、Ｂ６１はＥｆｌ−１と今回命名された。 Ｂ６１（Ｅｆｌ−１）およびＥＨＫ−１Ｌ（Ｅｆｌ−２）のアミノ酸配列、並び にＥｌｋ結合性リガンドＥｆｌ−３ の配列［これは同時係属出願第０８／２２９，４０２号に記載され、ＰＣＴ／Ｕ Ｓ ９３／１０８７９号（１９９４年５月２６日付けでＷＯ ９４／１１０２０ 号として公開）で公開］を第２図に示す。この新規なリガンドＥｆｌ−４をコー ドするプラスミドｐＪＦＥ１４をブダペスト条約の規定に基づき１９９４年１０ 月２１日付けで第７５９２１号として寄託した。 ここで用いる場合Ｅｆｌ−１、Ｅｆｌ−２、Ｅｆｌ−３およびＥｆｌ−４は、 アミノ酸残基が暗黙変化（silent change）をもたらす配列内の残基につき置換 された機能上均等な分子を包含する。たとえば配列内の１個もしくはそれ以上の アミノ酸残基を機能的均等物として作用する同様な極性を持った他のアミノ酸で 置換して、暗黙変化をもたらすことができる。配列内のアミノ酸の置換は、この アミノ酸が属するクラスの他の構成員から選択することができる。たとえば非極 性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン 、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを包含する。極性の中性 アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギ ンおよびグルタミンを包含する。陽帯電（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジ ンおよびヒ スチジンを包含する。陰帯電（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミ ン酸を包含する。さらに本発明の範囲には、同一もしくは同様な生物学的活性を 示す蛋白質またはその断片もしくは誘導体および翻訳時または翻訳後にたとえば グリコシル化、蛋白質分解、抗体分子もしくは他の細胞リガンドに対する結合な どにより様々に改変される誘導体も包含される。 Ｅｆｌを発現する細胞は自然にそうすることもでき、或いは遺伝子操作して上 記のようにこれらリガンドを産生させることもでき、これにはトランスジェニッ ク動物などを介しここに説明したＥｆｌをコードする核酸の適する発現ベクター へのトランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーション、マ イクロインジェクションを行う。ＥＦｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）をコードするｃＤ ＮＡを含有したベクターをブダペスト条約の規定に基づき１９９４年４月４日付 けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＥｈｋ−１Ｌ２Ｂ４およ びＥｈｋ−１Ｌ３Ｂ１を含むｐＪＦＥ１４として寄託し、それぞれＡＴＣＣ番号 第７５７２８号および７５７２９号が付与された（これらベクターによりコード されたリガンドは同一である）。Ｅｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）をコードするｃＤＮ Ａを含有 したｐＪＦＥ１４ベクターをブダペスト条約の規定に基づき１９９４年４月１２ 日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにｅｆ１−３を含むｐ ＪＦＥ１４として寄託し、ＡＴＣＣ番号第７５７３４号が付与された。Ｅｆｌ− ４をコードするｃＤＮＡを含むｐＪＦＥ１４ベクターをブダペスト条約の規定に 基づき１９９４年１０月２１日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ションにＥｆｌ−４をコードするｐＪＦＥ１４として寄託し、ＡＴＣＣ番号第７ ５９２１号が付与された。 本発明は、上記の寄託プラスミドに含まれるＤＮＡ配列、並びにたとえばサム ブルック等、モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、第２版、 第１巻、第１０１〜１０４頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー ・プレス（１９８９）に規定されたような適度な厳密性（stringency）の条件下 でＥｆ１配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を包含する。し たがって、本発明により考えられる核酸は前記寄託物に含まれる配列、この種の 配列にハイブリダイズすると共にＥｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｅｈｋ−３、Ｅｃｋ もしくはＥｌｋリセプタを結合する核酸の配列、並びに遺伝子 コードの結果として上記配列の変質種であるがＥｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｅｈｋ −３、ＥｃｋもしくはＥｌｋリセプタを結合するリガンドをコードするような核 酸配列を包含する。 さらに本発明は可溶性型、切断型および標識型における、ここに説明したリガ ンドの使用をも包含する。 ベクター中へのＤＮＡ断片の挿入につき当業者に知られた任意の方法を用いて Ｅｆｌをコードする発現ベクターを作成することができ、これには適する転写／ 翻訳制御シグナルおよび蛋白質コード配列を使用する。これら方法はインビトロ 組換ＤＮＡおよび合成技術、並びにインビボ組換（遺伝子組換）を包含する。Ｅ ｆｌをコードする核酸配列またはそのペプチド断片の発現は、蛋白質もしくはペ プチドが組換ＤＮＡ分子で形質転換された宿主にて発現されるよう、第２の核酸 配列により調整することができる。たとえば、ここに説明したＥｆｌの発現は当 業界で知られた任意のプロモータ／エンハンサー要素により制御することができ る。リガンドの発現を制御すべく使用しうるプロモータは限定はしないがスキン ト等により記載された長末端リピート［（１９９１）セル、第６５巻、第１〜２ ０頁］；ＳＶ４０早期プロモータ領域［ベル、イストおよびチャンボン （１９８１）、ネイチャー、第２９０巻、第３０４〜３１０頁］、ＣＭＶプロモ ータ、Ｍ−ＭｕＬＶ５′末端リピート、ラウス肉腫ウィルスの３′長末端リピー トに含まれるプロモータ［ヤマモト等（１９８０）、セル、第２２巻、第７８７ 〜７９７頁］、ヘルペス チミジンキナーゼ プロモータ［ワグナー等（１９８ １）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７ ８巻、第１４４〜１４４５頁］、メタロチオエイン遺伝子の制御配列［ブリンス ター等（１９８２）、ネイチャー、第２９６巻、第３９〜４２頁］；原核性発現 ベクター、たとえばβ−ラクタマーゼ プロモータ［ビラ−カマロフ等（１９７ ８）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７ ５巻、第３７２７〜３７３１頁］もしくはｔａｃプロモータ［デボアー等（１９ ８３）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第 ８０巻、第２１〜２５頁、さらに「組換細菌からの有用な蛋白質質」、サイエン チフィック・アメリカン（１９８０）、第２４２巻、第７４〜９４頁参照］；酵 母もしくは他の真菌類からのプロモータ要素、たとえばＧａｌ ４プロモータ、 ＡＤＨ（アルコール デヒドロゲナー ゼ）プロモータ、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモータ、アルカリ 性ホスファターゼ プロモータ、並びに組織特異性を示すと共にトランスジェニ ック動物で用いられている以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞にて活性であ るエラスターゼＩ遺伝子制御領域［スイフト等（１９８４）、セル、第３８巻、 第６３９〜６４６頁；オルニッツ等（１９８６）、コールド・スプリング・ハー バー・シンポジウム・クオンタチブ・バイオロジー、第５０巻、第３９９〜４０ ９頁；マクドナルド（１９８７）、ヘパトロジー、第７、第４２５〜５１５頁］ ；膵臓β細胞にて活性であるインシュリン遺伝子制御領域［ハナハン（１９８５ ）、ネイチャー、第３１５巻、第１１５〜１２２頁］、リンパ様細胞にて活性で ある免疫グロブリン遺伝子制御領域［グロスシェドル等（１９８４）、セル、第 ３８巻、第６４７〜６５８頁；アダムス等（１９８５）、ネイチャー、第３１８ 巻、第５３３〜５３８頁；アレキサンダー等（１９８７）、モレキュラ・セルラ ・バイオロジー、第７巻、第１４３６〜１４４４頁］、睾丸細胞、胸細胞、リン パ様細胞およびマスト細胞にて活性であるマウス哺乳類腫瘍ウィルス制御領域［ レダー等（１９８６）、セル、第４５巻、第４８５〜 ４９５頁］、肝臓にて活性であるアルブミン遺伝子制御領域［ピンカート等（１ ９８７）、ジーン・アンド・ディベロップメント、第１巻、第２６８〜２７６頁 ］；肝臓にて活性であるα−フェト蛋白質遺伝子制御領域［クルムラウフ等（１ ９８５）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第５巻、第１６３９〜１６４８ 頁；ハンマー等（１９８７）、サイエンス、第２３５巻、第５３〜５８頁］；肝 臓にて活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域［ケルセイ等（１９８ ７）、ジーン・アンド・ディベロップメント、第１巻、第１６１〜１７１頁］； 骨髄性細胞にて活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域［モグラム等（１９８５ ）、ネイチャー、第３１５巻、第３３８〜３４０頁；コリアス等（１９８６）、 セル、第４６巻、第８９〜９４頁］；脳における乏突起膠細胞にて活性であるミ エリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域［リードヘッド等（１９８７）、セル、第４ ８巻、第７０３〜７１２頁］；骨格筋にて活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制 御領域［シャニ（１９８５）、ネイチャー、第３１４巻、第２８３〜２８６頁］ 、並びに視床下部にて活性であるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域［ メーソン等（１９８６）、サイエンス、第２３４巻、第 １３７２〜１３７８頁］を包含する。 したがって本発明によれば、ここに説明したＥｆｌ−コード性核酸を含む細菌 もしくは真核性宿主にて複製しうる発現ベクターを用いて宿主をトランスフェク トすることによりこの種の核酸の発現を指令してＥｆｌ蛋白質を産生させ、次い でこれを微生物学上活性な形態で回収することができる。ここで使用する生物学 上活性な形態は、適切なリセプタ（たとえばＥｈｋ−１もしくはＥｌｋ）に結合 すると共に異なった機能を生ぜしめ或いはリセプタを発現する細胞の表現型に影 響を及ぼしうる形態を包含する。この種の生物学上活性な形態は、たとえばＥｈ ｋ−１もしくはＥｌｋリセプタのチロシンキナーゼ ドメインのホスホリル化ま たは細胞ＤＮＡ合成の刺激を包含する。 遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは３種の一般的手法により同定すること ができる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化、（ｂ）「マーカー」遺伝子機 能の存在もしくは不存在、および（ｃ）挿入された配列の発現。第１の手法にお いて、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたｅｆｌ遺伝子 に対し相同性である配列を含んだプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド 化によって検出することができ る。第２の手法において、組換ベクター／宿主系は、ベクターにおける外来遺伝 子の挿入により生じた或る種の「マーカー」遺伝子機能（たとえばチミジンキナ ーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウィルスにおける 咬合体形成など）の存在もしくは不存在に基づいて同定および選択することがで きる。たとえばｅｆｌ遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されれば 、挿入物を含有する組換体はマーカー遺伝子機能の不存在により同定することが できる。第３の手法において、組換発現ベクターは組換体により発現された外来 遺伝子産生物を分析して同定することができる。この種の分析はたとえばｅｆｌ 遺伝子産生物の物理的もしくは機能的性質に基づくことができ、たとえば検出可 能な抗体もしくはその１部で標識しうるＥｈｋ−１もしくはＥｌｋリセプタまた はその部分に対するリガンドの結合またはＥｆｌ蛋白質もしくはその１部に対し 産生された抗体への結合によって行うことができる。 Ｅｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）リガンドは、従来同定されたリガンドＢ６１（こ こではＥｆｌ−１と称する）に対し或る程度の相同性を有すると思われる［ホル ツマン等（１９９０）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１０巻、第５８ ３０〜 ５８３８頁］。Ｂ６１と同様に、Ｅｆｌ−２は認識配列をコードしてＧＰ１結合 することにより細胞内ドメインを欠如しうると思われるＣ−末端疎水性配列で終 端する。事実、ホスホリパーゼＣでのＥｆｌ−２発現性細胞の予備処理はＥｈｋ −１リセプタ体結合を減少させると思われ、したがってこれら蛋白質がＰＩ結合 されることを確認する。Ｅｆｌ−３はホスホリパーゼＣにより細胞表面から切断 されず、細胞質ドメインを有する通常の経膜蛋白質を含むと思われる。 ここに説明したリガンドは動物細胞発現系で膜結合型として産生させることが でき、或いは可溶性型で発現させることができる。可溶性型のリガンドは、当業 界で知られた方法を用いて発現させることができる。一般的に使用される手法は 、一方が蛋白質のＮ−末端にまたがり、他方が蛋白質の疎水性セグメントに対し 直ぐ上流の領域にまたがるオリゴヌクレオチド プライマーの使用を含み、これ はＧＰＩ−結合認識ドメインまたは蛋白質の経膜ドメインのいずれかを示す。Ｃ −末端領域にまたがるオリゴヌクレオチドは、疎水性ドメインの前に停止コドン を含むよう改変される。２種のオリゴヌクレオチドを用いて、膜結合でなく分泌 される蛋白質をコードする遺伝子の改変型を 増幅させる。或いはベクターにおける便利な制限部位を用いてＧＰＩ−結合認識 ドメインもしくは経膜ドメインを除去する改変配列を挿入することができ、かく して分泌型の蛋白質を発現しうるベクターをもたらすことができる。このように 産生された可溶性蛋白質はＮ−末端から疎水性ＧＰＩ認識ドメインもしくは経膜 ドメインに先立つ領域までの蛋白質の領域を含む。 本出願人は、本発明により産生された可溶性リガンドがｅｐｈサブ族における リセプタに結合するが、この種の可溶性リガンドはしばしば殆どもしくは全く生 物学上活性を示さないことを突き止めた。この種の可溶性リガンドは本発明によ ればリガンド「クラスター化」によって活性化される。ここで用いる「クラスタ ー化」は、ここに説明したリガンドにおける可溶性部分のマルチマーを形成する ため当業者に知られた任意の方法を意味する。 １具体例において、「クラスター化」されたｅｆｌはたとえばＩｇＧのＦｃド メインを用いて本発明により作成されたダイマーであり［アルホ等（１９９１） 、セル、第６７巻、第３５〜４４頁］、ジスルフィド結合ホモダイマーとしての 可溶性リガンドの発現をもたらす。他の具体例において、分泌型のリガ ンドはそのＣ−末端にエピトープ標識を持って構成され、次いで抗−標識抗体を 用いてリガンドを凝集させる。 さらに本発明は、マルチマーとして存在し或いはマルチーを形成する他の「処 理（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」リガンド分子をも包含する。たとえば細胞外ドメ インのダイマーを、ロイシン ジッパーを用いて処理することができる。ヒト転 写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシン ジッパー ドメインは１：１の 化学量論量で安定なヘテロダイマーを形成することが示されている［ブッシュお よびサソーネ−コルシ、トレンズ・ジェネチックス、第６巻、第３６〜４０頁（ １９９０）；ゲンツ等、サイエンス、第２４３巻、第１６９５〜１６９９頁（１ ９８９）］。ｊｕｎ−ｊｕｎホモダイマーが生成することも示されているが、こ れらはｊｕｎ−ｆｏｓヘテロダイマーよりも約１０００倍低い安定性である。ｆ ｏｓ−ｆｏｓホモダイマーは検出されていない。ｃ−ｊｕｎもしくはｃ−ｆｏｓ のロシン ジッパー ドメインは、上記リガンドの可溶性もしくは細胞外ドメイ ンのＣ−末端にてキメラ遺伝子の遺伝子処理により枠内融合される。これら融合 は直接とすることができ、或いはたとえばヒトＩｇＧのヒンジ領域のような柔軟 性リンカード メインまたは小アミノ酸（たとえばグリシン、セリン、スレオニンもしくはアラ ニン）よりなるポリプチド リンカーを種々の長さおよび組合せで用いることも できる。さらに、キメラ蛋白質をＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈ ｉｓ（Ｈｉｓ６）により標識して金属キレートクロマトグラフィーにより急速精 製したり或いは抗体を入手しうるエピトープにより標識してウエスタンブロット 、免疫沈澱またはバイオアッセイにおける活性欠失／阻止での検出を可能にする こともできる。 或いはマルチマーは、リガンドの可溶性もしくは細胞外部分に続きｈｌｇＧの Ｆｃドメイン、次いで上記したｃ−ｊｕｎもしくはｃ−ｆｏｓ ロイシン ジッ パーよりなる分子を遺伝子処理すると共に発現させて作成することもできる［コ ステルニー等、ジャーナル・イミュノロジー、第１４８巻、第１５４７〜１５５ ３頁（１９９２）］。これらロイシン ジッパーは主としてヘテロダイマーを形 成するので、これらを用いて所望に応じヘテロダイマーの形成を促すことができ る。ロイシン ジッパーを用いて説明したキメラ蛋白質に関し、これらは金属キ レートもしくはエピトープで標識することもできる。この標識されたドメインを 金属−キレート クロマトグラフィーにより 及び／或いは抗体により急速精製してウエスタンブロット、免疫沈澱またはバイ オアッセイにおける活性欠失／阻止で検出しうるよう使用することができる。 本発明の他の具体例において、マルチマー可溶性 リガンドは柔軟性リンカー ループを用いキメラ分子としての発現により作成される。キメラ蛋白質をコード するＤＮＡ構成物は、柔軟性ループにより互いに直列（「ヘッド対ヘッド」）で 融合した２個もしくはそれ以上の可溶性もしくは細胞外ドメインを発現するよう 設計される。このループは全体として人工的（たとえば所定間隔にてセリンもし くはスレオニンにより中断されるポリグリシンリピート）とすることができ、或 いは天然蛋白質（たとえばｈｌｇＧのヒンジ領域）から「借用」することもでき る。ループの長さおよび組成を変化させるよう分子を処理して、所望の特性を有 する分子の選択を可能にすることもできる。特定の理論に拘束されるものでない が、本出願人はリガンドの膜付着がリガンドのクラスター化を容易化させてリセ プタのマルチマー化および活性化を促進するものと信ずる。すなわち本発明によ れば、可溶性リガンドの生物学的活性は溶液にて膜関連リガンド クラスター化 を模倣して得られる。すなわち、生 物学的に活性なクラスター化された可溶性ｅｐｈ族リガンドは（可溶性Ｅｆｌ）_n を含み、ここで可溶性ｅｆｌはｅｐｈ族リセプタを結合するリガンドの細胞外 ドメインであり、ｎは２もしくはそれ以上である。ここに説明したＥｆｌ−１、 Ｅｆｌ−２およびＥｆｌ−３は全て本発明の方法により生物学上活性にされる。 それぞれの場合、当業者はクラスター化の成功がたとえばここに説明したような 生検を用いる生物学的活性の分析を必要とすることを了解するであろう。たとえ ば第５図に示したように、レポータ細胞を発現するリセプタを膜型のリガンドＢ ６１、Ｅｆｌ−２およびＥｆｌ−３を過剰発現するＣＯＳ細胞で刺激することに よりリセプタ燐酸化が顕著に誘発されるという事実にも拘らず（第５Ａ図、レー ン１および２）、可溶性型のこれらリガンドを用いて観察しうる燐酸化は得られ ない（第５Ｂ図、レーン２および３、並びに第５Ｃ図、レーン２）。しかしなが ら、分泌型のリガンドをｍｙｃ標識すると共に抗体を使用して各リガンドをクラ スター化させれば、従来不活性の可溶性リガンドはＥｌｋおよびＥｈｋ−１リセ プタを発現するレポータ細胞におけるリセプタ チロシン燐酸化を強く誘発する （第５Ｂ図、レーン４および５、第５Ｃ図、レーン３）と共 にＥｃｋリセプタキメラを発現するレポータ細胞における増殖をも誘発する（第 ６Ａ図）。 幾つかの場合は生物学的活性を誘発させるのにリガンドの二量化にて充分であ るが、第７図に示したデータは或る場合ここで説明した方法をどのように用いて 特定クラスター化技術の能力を判定するかを示す。Ｅｌｋリガンドにつき第７図 に示したように、Ｆｃを用いる可溶性リガンドの二量化は生物学的反応を達成す るのに不充分であると思われる（第７図、レーンＣ）。しかしながら、抗−Ｆｃ 抗体を用いて本発明によりリガンドをさらにクラスター化させれば、生物学的活 性の相当な増加が生じた（レーンＤ）。 リガンドＢ６１の場合、クラスター化なしに得られた可溶性リガンドにつき低 レベルの生物学的活性が得られると思われる。この種の低レベルの生物学的活性 は低レベルの「自己クラスター化」によって生じ得る。しかしながら本出願人は 或る程度の生物学的活性を有するたとえばＢ６１のようなｅｆｌの場合にも活性 を本発明にしたがうクラスター化により増大させうることを示した。 本発明の細胞は、Ｅｆｌを天然型で或いはここに説明したよ うに標識Ｅｆｌもしくはクラスター化Ｅｆｌとしての可溶性型で一時的または好 ましくは構成的かつ永久的に発現することができる。 組換因子は、その後に安定かつ生物学上活性な蛋白質を形成させうる任意の技 術により精製することができる。たとえば限定はしないが、これら因子は可溶性 蛋白質として或いは封入体として細胞から回収することができ、そこから８Ｍグ アニジウム塩酸塩および透析によって定量的に抽出することができる。因子をさ らに精製するには慣用のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマ トグラフィー、逆相クロマトグラフィーもしくはゲル濾過を用いることができる 。 本発明の他の具体例においては組換ｅｆｌを用いて相同組換により内生遺伝子 を失活または「ノックアウト」することができ、これによりｅｆｌ蛋白質欠失細 胞、組織または動物を形成することができる。たとえば限定はしないが、組換ｅ ｆｌを処理して挿入突然変異体（たとえばｎｅｏ遺伝子）を含ませることができ 、これは天然ｅｆｌ遺伝子を失活させる。この種の構成物は、適するプロモータ の制御下で、たとえば胚幹細胞のような細胞中へ、たとえばトランスフェクショ ン、トランスダク ション、インジェクションなどの技術により導入することができる。この構成物 を含有する細胞を次いでＧ４１８耐性により選択することができる。次いで、無 傷（intact）ｅｆｌを欠如した細胞をたとえばサウザンブロッチングもしくはノ ーザンブロッチングまたは発現の検定により同定することができる。無傷ｅｆｌ を欠如した細胞を次いで早期胚細胞に融合させて、この種のリガンドを欠失した トランスジェニック動物を発生させることができる。この種の動物と内生ｅｆｌ を発現する動物との比較は、発育および維持におけるリガンドの役割を説明する のに役立つ。この種の動物を用いて、特定ニューロン集団などをインビボ過程で 一般にリガンドに依存して規定することができる。 さらに本発明は、たとえば診断用途にてリガンドを検出するのに有用である上 記Ｅｆｌに対する抗体をも提供する。ここに説明したリガンドに対する抗体は、 本発明によるクラスター化を達成するにも有用である。内生リガンドが存在する 場合、抗体自身は存在するリガンドを活性化させることにより治療剤として作用 しうる。 これらＥｆｌに指向させるモノクローナル抗体を作成するに は、細胞系統の連続培養により抗体分子を産生させる任意の技術を用いることが できる。たとえば最初にコーラーおよびミルスタインにより開発されたハイブリ ドーマ技術［（１９７５）、ネイチャー、第２５６巻、第４９５〜４９７頁］、 並びにトリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術［コツボール等（１９ ８３）、イミュノロジー・ツデイ、第４巻、第７２頁］およびヒト モノクロー ナル抗体を産生させるためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［コール等（１９８５ ）、「モノクローナル抗体および癌療法」、アランＲ．リス・インコーポレーシ ョン、第７７〜９６頁］などが本発明の範囲内である。 診断用途もしくは治療用途のためのモノクローナル抗体はヒト モノクローナ ル抗体もしくはキメラ ヒト−マウス（もしくは他の動物）モノクローナル抗体 とすることができる。ヒトモノクローナル抗体は当業界で知られた任意多くの技 術により作成することができる［たとえばテング等（１９８３）、プロシーディ ング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８０巻、第７３０８〜 ７３１２頁；コツボール等（１９８３）、イミュノロジー・ツデイ、第４巻、第 ７２〜７９頁；オルソン等（１９８２）、メソッズ・エンチモロジー、 第９２巻、第３〜１６頁］。キメラ抗体分子は、マウス抗原結合性ドメインをヒ トコンスタント領域と共に含有して作成することができる［モリソン等（１９８ ４）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８ １巻、第６８５１頁；タケダ等（１９８５）、ネイチャー、第３１４巻、第４５ ２頁］。 当業界で知られた各種の方法を、ここに説明したＥｆｌのエピトープに対する ポリクローナル抗体を産生させるべく使用することができる。抗体の産生には、 各種の宿主動物をＥｆｌまたはその断片もしくは誘導体の注射により免疫化する ことができ、宿主動物は限定はしないがウサギ、マウス、ラットなどを包含する 。各種のアジュバントを用いて宿主動物に応じ免疫学的反応を増大させることが でき、限定はしないがフロインド（完全もしくは不完全）、ミネラルゲル（たと えば水酸化アルミニウム）、表面活性物質、たとえばリソレシチン、プルロニッ ク・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホール イン ペット ヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びに潜在的に有用なヒト アジ ュバント、たとえばＢＣＧ（バシル・カルメッテ−ゲラン）およびコリネバクテ リウム・ パルブム を包含する。 選択されたＥｆｌエピトープに対する抗体の分子クローンは公知技術により作 成することができる。組換ＤＮＡ法［たとえばマニアチス等（１９８２）、モレ キュラ・クローニング、ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハ ーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク参照］ を用いて、モノクローナル抗体分子もしくはその抗原結合領域をコードする核酸 配列を作成することができる。 抗体分子は公知技術、たとえば免疫吸収もしくは免疫親和性クロマトグラフィ ー、たとえばＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラ フ法またはその組合せなどにより精製することができる。 本発明は、抗体分子およびこの種の抗体分子の断片を提供する。分子のイジオ タイプを含有する抗体断片は公知技術により発生させることができる。たとえば 、この種の断片は限定はしないが次のものを包含する：抗体分子のペプシン切断 により産生させうるＦ（ａｂ′）₂断片；Ｆ（ａｂ′）₂断片のジスルフィド架橋 を還元して発生させうるＦａｂ′断片；および抗体分子をパパインと還元剤とで 処理して発生させうるＦａｂ断片。 さらに本発明は神経障害に罹患した患者の処置方法をも提供し、この方法は患 者を有効量の１種もしくはそれ以上のＥｆｌ、そのペプチド断片またはＥｈｋ− １もしくはＥｌｋリセプタに結合しうる誘導体で処置することからなっている。 Ｅｈｋ−１に対する同族リガンドの有力な治療用途が米国特許出願第０８／１ ４４，９９２号に示唆されている。成体脳において、ｅｈｋ−１の細胞局在は遺 伝子が主としてニューロンで発現されると共に明確なニューロン集団にてその最 高発現レベルに達することを示し、これら神経集団は主上昇中央コリン発生性核 （脚間領域、嗅結節および側部扁桃）、並びにモノアミン作用性核（銹斑、背部 縫線および黒質）を包含する。Ｅｈｋ−１プローブは前脳の腹側外側領域におけ る梨状皮質、対角バンドの水平脚、吻側角膜および灰白鞘と脳縦条とに関連する ニューロン、海馬体、ＣＡ３およびＣＡ２における錐体ニューロン（ＣＡ１にて 若干弱い）、上側丘体、並びに脳縦条のレトロスプレニアル皮質およびニューロ ンを著しく強調した。 成体ラット脳にて、Ｅｈｋ−１は脚間核および黒質、底部および側部扁桃およ び背部縫線に関連したニューロンリッチ密度を著しく強調することが見られる。 Ｅｈｋ−１プローブは小脳 の顆粒層、小脳のパーキニエ細胞および嗅覚バルブにおける僧帽細胞に顕著にハ イブリダイズすることができた。 Ｅ１３胚において、ｅｈｋ−１転写物は身体におけるよりも頭にてずっと豊富 である。生後１日（Ｐ１）まで各バンドは脳にてその最高レベルに達し、成体脳 にて若干低下する。Ｅｈｋ−１バンドはＰ１から成体への移行期に際し小脳試料 にて低下し、これは成体の全脳における主たる発現部位が主として小脳の外側に 位置することを示唆する。 より長い暴露は、ｅｈｋ−１神経特異性バンドが海馬体星状細胞の一次培養物 からのＲＮＡでも検出しうることを示す。これは、ｅｈｋ遺伝子がグリアでなく 主としてニューロンで発現することを現場でのＲＮＡハイブリッド試験が示すた め予想外である。種々の確認された細胞系統における検査が示したところでは、 ｅｈｋ−１は種々の神経上皮腫および神経芽細胞腫系統を包含するニューロン由 来細胞にて主として発現される。 さらにＥｌｋリセプタも主として脳で発現される。したがって、ここに説明し たＥｌｋ結合性リガンドは異なる機能の誘発を支援し及び／或いはたとえば神経 細胞の成長および／または生存のような表現型に影響を与えて、このリセプタを 発現する ものと思われる。 ノーザンブロット分析（第４図）は、Ｅｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）の幅広い分布 と異なり、Ｅｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）およびＥｆｌ−１（Ｂ６１）につき制限 かつ逆（reciprocal）パターンの発現を示した。Ｅｈｋ−１と同様にＥｆｌ−２ も殆ど専ら中枢神経系で発現され、ただしＥｈｋ−１発現が殆ど検出しえない皮 膚にて高度に発現することが顕著な例外である。これに対し、Ｅｆｌ−１（Ｂ６ １）は主として非ニューロン組織で発現される（第４Ａ図；より長い暴露は大抵 の神経構造体にて低レベルのＢ６１を示す）。脳および精巣においてのみ発現さ れるＥｌｋリセプタとは異なり、Ｅｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）はニューロン組織お よび非ニューロン組織の両者にて広く発現される。脳においてＥｆｌ−１および Ｅｆｌ−３の両者（Ｅｆｌ−２は含まず）の発現は発育早期にて実質的に高く、 次いで低下する（第４Ｂ図）。Ｅｆｌ−１およびＥｆｌ−３の場合と同様に、他 の神経系特異性リセプタチロシンキナーゼのリガンド（たとえばＴｒｋリセプタ のニューロトロフィン リガンド）も非ニューロン組織にて発現され［メソンピ エール等（１９９０）、サイエンス、第２４７巻、第１４４６〜１４５１頁；メ ソンピエール等（１９９０）、ニューロン、第５巻、第５０１〜５０９頁］、こ れは明かにリガンドがこれら組織を神経刺激する軸索過程のための標的由来因子 として作用するからである［Ｈ．ソエネン（１９９１）、トレンズ・ニューロサ イエンス、第１４巻、第１６５〜１７０頁］。Ｅｆｌ−１およびＥｆｌ−３の非 ニューロン的発現も、これらが非神経細胞により発現されるＥｐｈリセプタ族の 構成員（たとえばＥｃｋ）のリガンドとして作用する可能性を高める。 さらに本発明は、ここに説明したＥｆｌ、そのペプチド断片または誘導体を適 する薬理キャリヤ中に含む医薬組成物をも提供する。 Ｅｆｌ蛋白質、ペプチド断片もしくは誘導体は全身的または局部的に投与する ことができる。当業界で知られた任意適する投与方式、たとえば限定はしないが 静脈内、胸部内、動脈内、鼻腔内、経口的、皮下、腹腔内の投与または局部注射 もしくは外科移植を用いることができる。遅延放出処方も可能である。 神経変質病／神経外傷に関する理解が一層明瞭になるので、内生Ｅｆｌの作用 を減少させるのが有利であることも明かとなる。したがって神経系外傷の分野に おいて、限定はしないが Ｅｈｋ−１もしくはＥｌｋリセプタと相互作用するための細胞結合リガンドと競 合しうるような可溶性型のＥｆｌを包含するＥｆｌ拮抗剤を与えることが望まし い。或いは可溶性型のＥｈｋ、ＥｃｋもしくはＥｌｋリセプタ（たとえば後記実 施例１に記載するように産生される「リセプタ体」として発現）は、リガンドを 結合して失活させることにより拮抗剤として作用しうる。この種の拮抗剤を全身 的でなく外傷部位に局部的に投与することが望ましい。Ｅｆｌ拮抗剤を与える移 植体の使用も望ましい。 代案として、或る種の症状はＥｆｌ反応性の増大から利点を受ける。したがっ て、この種の症状を有する患者においてはＥｆｌの個数もしくは結合親和性を増 大させることが有利である。これはＥｆｌ、Ｅｆｌ発現性細胞またはＥｈｋ−１ もしくはＥｌｋリセプタのいずれかを用いる遺伝子療法によって達成することが できる。適する細胞におけるこの種の組換蛋白質の選択的発現は、組織特異性も しくは誘発性プロモータにより或いは組換遺伝子を有する複製欠失ウィルスでの 局部注射により制御されるコード遺伝子を用いて達成することができる。実施例１：ＥＨＫ−１結合性リガンドの発現クローン化 ＣＯＳ−７細胞を、１０％の胎児牛血清（ＦＢＳ）とそれぞれ１％のペニシリ ンおよびストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）と２ｍＭのグルタミンとを含有するデュ ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて５％ＣＯ₂の雰囲気下に培養した。 ヒト神経芽細胞腫の細胞系統、すなわちＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ジュン・ビードラー、 ソロラン−ケッタリングから入手）を、１０％ＦＢＳと（Ｐ／Ｓ）と２ｍＭのグ ルタミンとを含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）にて培養した。 ＣＯＳ細胞で発現されたｐＪＦＥ１４ベクターにてＳＨＳＹ５Ｙ ｃＤＮＡラ イブラリーをスクリーニングすることにより、全長ヒトＥｆｌ ｃＤＮＡクロー ンを得た。ＣＯＳ細胞で発現されたｐＪＦＥ１４ベクターにてヒト骨髄肉腫１４ ３Ｂ細胞系統ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、全長ヒト Ｅｆｌ−４ ｃＤＮＡクローンを得た。第１図に示したようにｐＪＦＥ１４ベク ターはｐＳＲ_αの改変型である［タケベ等（１９８８）、モレキュラ・セルラ・ バイオロジー、第８巻、第４６６〜４７２頁］。ｐＪＦＥ１４ベクターにおける ２つのＢＳＴＸ１制限部位を用いてライブラリーを作成 した。 ＣＯＳ−７細胞に、ＤＥＡＥ−デキストラン トランスフェクション法により ｐＪＦＥ１４ライブラリーまたは比較ベクターのいずれかを一時的にトランスフ ェクトさせた。要約すれば、ＣＯＳ−Ｍ５細胞をトランスフェクションの２４時 間前に１００ｍｍプレート１枚当り１．０×１０⁶細胞の密度で塗沫した。トラ ンスフェクションのため、細胞を４００μｇ／ｍＬのＤＥＡＥ−デキストランと １μＭのクロロキンと２ｍＭのグルタミンと１μｇの適するＤＮＡとを含有する 血清フリーのＤＭＥＭにて３７℃で３〜４時間にわたり５％ＣＯ₂の雰囲気下に 培養した。トランスフェクション培地を吸引すると共に、１０％ＤＭＳＯを含む 燐酸塩緩衝塩水で２〜３分間かけて置換した。このＤＭＳＯ「ショック」の後、 ＣＯＳ−７細胞を１０％のＦＢＳとそれぞれ１％のペニシリンおよびストレプト マイシンと２ｍＭのグルタミンとを含むＤＭＥＭに４８時間入れた。 スクリーニングをＥｈｋ−１リセプタ体を用いる表面染色の直接的検出によっ て行い、このリセプタ体はＩｇＧ１コンスタント領域に融合したＥｈｋ−１の細 胞外ドメインで構成された。このリセプタ体は次のように作成した：ヒンジ領域 から開始す ると共に分子のカルボキシ末端まで延びるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を、ヒトＩｇ Ｇ１の公開配列に対応するオリゴヌクレオチドでのＰＣＲにより胎盤ｃＤＮＡか らクローン化させた。便利な制限部位をもオリゴヌクレオチドに一体化させて、 ＰＣＲ断片を発現ベクター中にクローン化させることができた。全長リセプタを 有する発現ベクターを制限酵素切断により或いはＰＣＲ手法により改変させて、 経膜および細胞内ドメインを制限部位（これら部位はヒトＩｇＧ１断片のこれら の部位へのクローン化を可能にする）で置換した。これは、リセプタ エクトド メインをそのアミノ末端として有すると共にヒトＩｇＧ１のＦｃ部分をそのカル ボキシ末端として有する融合蛋白質を発生させるよう行った。リセプタ体を作成 する代案方法についてはグッドウィン等（１９９３）、セル、第７３巻、第４４ ７〜４５６頁に記載されている。 要約すれば、ＣＯＳ細胞の１００ｍｍ皿に１μｇのＳＨＳＹ５Ｙライブラリー プラスミドＤＮＡをトランスフェクトさせた。トランスフェクションの２日後、 細胞をＥｈｋ−１ ＩｇＧと共に３０分間インキュベートして検定した（ＣＯＳ 細胞上澄の形態で）。次いで各細胞をＰＢＳで２回洗浄し、メタノールで 固定し、次いでＰＢＳ／１０％子牛血清／抗−ヒトＩｇＧ−アルカリホスファタ ーゼ結合体と共にさらに１０分間にわたりインキュベートした。ＰＢＳで３回洗 浄した後、細胞をａｌｋ−ｐｈｏｓ基質にて３０〜６０分間にわたりインキュベ ートした。次いで皿を表面染色細胞の存在につき顕微鏡検査した。各染色細胞に つき、これを包囲する小区域をプラスチック ピペット先端により皿から掻取り 、次いでプラスミドＤＮＡを再生させて細菌細胞をエレクトロポレートすべく使 用した。これらエレクトロポレーションから得られた培養物より作成されたプラ スミドＤＮＡを用いて第２回の集積につきＣＯＳ細胞をトランストした。第２回 目は標準的なパソニング技術を用いて行った。第２回目の集積（ｅｎｒｉｃｍｅ ｎｔ）の後、単一の細菌集落を釣り上げ、これら集落から作成されたプラスミド ＤＮＡをこれらによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞におけるＥｈｋ−１染 色を誘発する能力につき試験した。 ＳＹ５Ｙライブラリーからの３種のクローンを同定し、これらはＥｈｋ−１リ セプタ体への結合を示した。第１のものはＢ６１と同定された。同一であって、 ここではＥｆｌ−２と命名した第２および第３のクローンは相違すると思われる が、部分 ヌクレオチド配列決定により判定してＢ６１に関連すると思われ、これらがＢ６ １族の構成員であることを示唆する。これら３種全てのリガンドは膜結合してい ると思われる。さらにＢ６１と同様に、Ｅｆｌ−２はＧＰＩ−結合している。 ヒト骨髄肉腫細胞系統由来のライブラリーは、Ｅｆｌ−４をコードするクロー ンをもたらした。このリガンドはＥｈｋ−１、Ｅｈｋ−２およびＥｈｋ−３、並 びにＥｃｋの各リセプタを結合するがＥｌｋリセプタを結合しない。実施例２：新規なＥＦＬのクローン化 Ｂ６１とＥｆｌ−２との間の相同性の領域を用いて、米国特許出願第０８／１ ４４，９９２号に記載されたように他のＥｆｌを同定することができる。たとえ ば第２図は、これら２種の配列相同性の領域を示し、これらはそれぞれ単一文字 のアミノ酸配列、すなわちＶ（Ｆ／Ｙ）ＷＮＳＳＮ（配列番号５）およびＮＤＹ （Ｖ／Ｌ）ＤＩ（Ｉ／Ｙ）ＣＰＨＹ（配列番号６）を有し、ここで括弧内の文字 は推定Ｅｆｌ−２蛋白質と比較してヒトおよびラットのＢ６１で相違する残基を 示す。次いで、これら保存蛋白質領域に対応する変質オリゴデオキシヌクレオチ ドを、胚芽および成体脳を含め各種の組織から作成された ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を開始させるべく設計し使用することができる。次 いで、得られた増幅ＤＮＡ断片をプラスミド中への挿入によりクローン化させ、 ＤＮＡ配列決定にかけることができ、次いでこれら配列を公知Ｅｆｌの配列と比 較することができる。実施例３：ＥＬＫ結合性リガンドの発現クローン化 ＣＯＳ−７細胞を、１０％の胎児牛血清（ＦＢＳ）とそれぞれ１％のペニシリ ンおよびストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）と２ｍＭのグルタミンとを含有するデュ ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて５％ＣＯ₂の雰囲気下に培養した。 ヒト神経上皮腫系統ＣＨＰ１００（入手）を１０％ＦＢＳと（Ｐ／Ｓ）と２ｍＭ のグルタミンとを含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）にて培養した。 ＣＯＳ細胞で発現されたｐＪＦＥ１４ベクターにてＣＨＰ１００ ｃＤＮＡラ イブラリーをスクリーニングすることにより、全長ヒトＥｆｌ ｃＤＮＡクロー ンを得た。このベクターは第１図に示したようにベクターｐＳＲ_α［タケベ等（ １９８８）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第８巻、第４６６〜４７２頁 ］の改変型である。このライブラリーは、 ｐＪＦＥ１４ベクターにおける２つのＢＳＴＸＩ制限部位を用いて作成した。 ＣＯＳ−７細胞にｐＪＦＥ１４ライブラリーまたは比較ベクターのいずれかを ＤＥＡＥ−デキストラン トランスフェクション法により一時的にトランスフェ クトさせた。要約すれば、ＣＯＳ−Ｍ５細胞をトランスフェクションの２４時間 前に１００ｍｍプレート１枚当り１．０×１０⁶細胞の密度で塗沫した。トラン スフェクションのため、細胞を４００μｇ／ｍＬのＤＥＡＥ−デキストランと１ μＭのクロロキンと２ｍＭのグルタミンと１μｇの適するＤＮＡとを含有する血 清フリーのＤＭＥＭにて３７℃で３〜４時間にわたり５％ＣＯ₂の雰囲気下に培 養した。トランスフェクション培地を吸引し、１０％ＤＭＳＯを含む燐酸塩緩衝 塩水で２〜３分間かけて置換した。このＤＭＳＯ「ショック」の後、ＣＯＳ−７ 細胞を１０％のＦＢＳと１％のそれぞれペニシリンおよびストレプトマイシンと ２ｍＭグルタミンとを含むＤＭＥＭに４８時間入れた。 Ｅｈｋ−１リセプタ体を用いる表面染色の直接的検出によりスクリーニングを 行い、前記リセプタ体はＩｇＧ１コンスタント領域に融合したＥｌｋの細胞外ド メインで構成した。このリ セプタ体を次のように作成した：ヒンジ領域から開始すると共に分子のカルボキ シ末端まで延びるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を、ヒトＩｇＧ１の公開配列に対応す るオリゴヌクレオチドでのＰＣＲを用いて胎盤ｃＤＮＡからクローン化させた。 さらに、便利な制限部位をオリゴヌクレオチドに一体化させてＰＣＲ断片を発現 ベクター中にクローン化させることもできる。全長リセプタを有する発現ベクタ ーを制限酵素切断により或いはＰＣＲ手法により改変させて経膜ドメインおよび 細胞内ドメインを、ヒトＩｇＧ１断片をこれら部位にクローン化させうる制限部 位で置換した。これは、リセプタ エクトドメインをそのアミノ末端として有す ると共にヒトＩｇＧ１のＦｃ部分をそのカルボキシ末端として有する融合蛋白質 を発生させるよう行った。リセプタ体を作成する代案方法についてはグッドウィ ン等（１９９３）、セル、第７３巻、第４４７〜４５６頁に記載されている。 要約すれば、ＣＯＳ細胞の１００ｍｍ皿に１μｇのＣＨＰ１００ライブラリー プラスミドＤＮＡをトランスフェクトさせた。トランスフェクションの２日後、 細胞をＥｌｋ−ＩｇＧと共に３０分間インキュベートして検定した（ＣＯＳ細胞 上澄の形態で）。 次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄し、メタノールで固定し、次いでＰＢＳ／１０％ 子牛血清／抗−ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体と共にさらに３０分 間にわたりインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をａｌｋ−ｐｈ ｏｓ基質にて３０〜６０分間にわたりインキュベートした。次いで皿を表面染色 細胞の存在につき顕微鏡検査した。各染色細胞につき、これを包囲する小区域を プラスチック ピペット先端により皿から掻取り、次いでプラスミドＤＮＡを再 生すると共に細菌細胞をエレクトロポレートすべく使用した。これらエレクトロ ポレーションから得られた培養物より作成したプラスミドＤＮＡを用いて第２回 目の集積につきＣＯＳ細胞をトランスフェクトした。第２回目は標準的なパンニ ング技術を用いて行った。第２回目の集積の後、単一の細菌集落を釣り上げ、こ れら集落から作成されたプラスミドＤＮＡをこれらによりトランスフェクトされ たＣＯＳ細胞におけるＥｌｋ染色を誘発させる能力につき試験した。 Ｅｌｋリセプタ体に対する結合を示すと同定されたクローンを１９９４年４月 １２日付けでＡＴＣＣに寄託し、第７５７３４号と指定された。実施例４：可溶性ＥＦＬの活性化 ベクター単独（ＣＯＳ−Ｍｏｃｋ）でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞また はＥｆｌ−３発現ベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞のいずれかを増 殖させ、これら細胞を皿からＰＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡにより脱着させ、ペレッ ト化させ、次いでＰＢＳに再懸濁させることにより、膜結合したＥｆｌの分析を 行った。細胞をレポータ細胞系統の頂部に積層した。 それぞれＣ−末端にｍｙｃエピトープを用いて標識した可溶性Ｅｆｌ−３およ びＢ６１［スタール等、サイエンス、第２６３巻、第９２〜９５頁（１９９４） ］をＣＯＳ細胞上澄として産生させると共に、非クラスター化リガンドとして或 いは抗体によりクラスター化させたリガンドとして使用した。スロットブロット におけるｍｙｃエピトープの量を定量することによりリガンド濃度を推定した。 リガンドクラスター化は、抗−ｍｙｃ モノクローナル抗体と抗−マウス ポリ クローナル抗体とを添加すると共に細胞を刺激する前に３７℃にて１時間にわた りインキュベートすることにより行った。レポータ細胞系統はＥｌｋでトランス フェクトされた３Ｔ３繊維芽細胞（第５Ａ図および第５Ｂ図）またはＥｈｋ−１ でトランスフェクト されたＣ２Ｃ１２細胞（第５Ｃ図）とした。１０ｃｍ皿におけるレポータ細胞を 血清フリー培地にて４〜６時間にわたり飢餓させ、次いで上記したように１５分 間にわたり刺激し、次いで可溶化させると共にリセプタを認識する抗体で免疫沈 澱させた。免疫沈殿物をホスホチロシンに対する抗体で免疫ブロットし（第５図 、上側パネル）、次いで剥離させると共にリセプタを認識する抗体で再プローブ して全リセプタ蛋白質を可視化させた（第５図、下側パネル）。 Ｅｃｋリセプタ キメラにより媒介されたＢＡＦ細胞における成長反応の誘発 を測定するため、各刺激をＣＯＳ細胞で産生された可溶性Ｅｆｌ−１およびＢ６ １により、その後のクラスター化と共に或いはクラスター化なしに行った。２日 間の刺激の後、生体染料ＭＴＴ（３−｛４，５−ジメチルチアゾール−２−イル ｝−２，５−ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド）を４時間かけて添加し、 次いで従来記載されているように可溶化させると共に光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測 定することにより生存細胞の個数を評価した［イプ等（１９９３）、ニューロン 、第１０巻、第１３７〜１４９頁］（第８図）。第９図に示したデータは、ＣＯ Ｓ細胞で産生されてその後に抗Ｆｃ抗体でクラ スター化させた或いはクラスター化させなかった可溶性Ｅｈｋ−１Ｌ−Ｆｃおよ びＢ６１−Ｆｃを用いて行ったＭＴＴ分析からの結果である。Ｅｃｋリセプタの 触媒ドメインはＢＡＦ細胞における成長反応を媒介しないので、リセプタ キメ ラ（ここでは、ＥｃｋリセプタのエクトドメインをＦＧＦリセプタの細胞質ドメ インに融合させた）をＢＡＦ細胞に導入してレポータ細胞系統を作成した。 第５Ｂ図、レーン２および３、並びに第５Ｃ図、レーン２に示したように、リ セプタ燐酸化により判定してリガンド誘発のリセプタ活性化は可溶性型のＥｆｌ −３もしくはＢ６１を用いて観察されなかった。しかしながらリセプタ燐酸化は 、リセプタ発現レポータ細胞を膜結合型の前記リガンドを過剰発現するＣＯＳ細 胞で刺激することにより顕著に誘発された（たとえば第５Ａ図、レーン１および ２）。この相違点を説明するため、膜付着がリガンドのクラスター化を促進し、 次いでリセプタのマルチマー化および活性化を促進すると推定した。溶液におけ るリガンドのクラスター化を模倣するため、分泌型のリガンドをＣ−末端に添加 されたエピトープ標識を用いて作成した：次いで標識に対する抗体を用いてリガ ンドを凝集させた。この種 のクラスター化は、従来不活性の可溶性リガンドによりＥｌｋおよびＥｈｋ−１ レポータを発現するレポータ細胞にてリセプタ チロシン燐酸化を強度に誘発す ることができる（第５Ｂ図、レーン１〜５および第５Ｃ図、レーン１〜３）。同 様に、第７図に示すようにＥｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）に関しリガンドの二量化で は生物学的活性を誘発するのに不充分であるのに対し、マルチマーは顕著な活性 を有した。これらの結果は、ここに説明したように特定の各リガンドに関する限 りクラスター化の特定メカニズムの効果を評価する必要性を示す。 この種のクラスター化の効果は、リセプタの燐酸化を測定して判定することが できる。或いは、適するリセプタもしくはリセプタ キメラ（たとえばＥｃｋリ セプタキメラ）を発現するレポータ細胞での増殖を実験で用い、その結果を第６ 図に示す。 投与量−反応の各試験は、クラスター化が少なくとも１００倍大の能力をもた らすと共に低濃度のリガンド（他のリセプタ族に関するリガンドで見られる反応 ［イプ等、ニューロン、第１０巻、第１３７〜１４９頁］と比較）で飽和反応を もたらすことを燐酸化分析（Ｅｌｋリガンドにつき試験、データ示さず）および 増殖分析（Ｅｆｌ−１およびＢ６１につき試験、第６図） の両者にて示す。非クラスター化Ｂ６１の小さい効果（第６Ｂ図）は、高濃度の 可溶性Ｂ６１がＥｃｋチロシン燐酸化を誘発させうるという最近の知見［バート レー等、ネイチャー、第３６８巻、第５５８〜５６０頁（１９９４）］を思い出 させる。この試験では、１〜２ｍｇ／ｍＬ濃度のＢ６１においても飽和は達成さ れなかった。これらの効果は、可溶性リガンド自身が自然に或いは精製の結果と して二量化もしくは凝集する弱い能力に起因するのであろう。可溶性リガンドは 、二価もしくは多価であるためリセプタを活性化させると思われる［Ｊ．シュレ シンガーおよびＡ．ウルリッチ、ニューロン、第９巻、第３８３〜３９１頁（１ ９９２）］。或る種のリガンドは２個の異なるリセプタ結合性部位を有するモノ マーであるのに対し、他のリガンドは共有結合もしくは非共有結合したダイマー として二価性を達成する。本発明の結果は、恐らく一価であるため可溶性リガン ドとして無効であると思われるがクラスター化により溶液で人工的に活性化しう る新規な種類のリガンドを規定する。これらリガンドは、リセプタを凝集すると 共に活性化する膜付着に依存すると思われる。拡散を二次元に制限することによ り、膜付着は簡単にリガンド−リガンド衝突の傾向を増大 させることによりリガンド二量化或いは一層激しいリガンドのクラスター化、特 に溶液にて極く弱くしか相互作用しないリガンドのクラスター化を促進する。あ るいは、細胞表面リガンドのクラスターを形成させるには特異的メカニズムが存 在する。さらに、リガンド−リセプタ対はリガンド支持細胞とリセプタ支持細胞 との接触区域に蓄積すると思われる。 これら側方凝集作用は全てリセプタのマルチマー化および活性化に寄与しうる 。ＥＰＨ関連のニューロン発現されたＮＵＫリセプタが細胞と細胞との接触区域 に一時的に集中するという観察［ヘンケマイヤー等、オンコジーン、第９巻、第 １００１〜１０１４頁（１９９４）］は、１つの膜に結合したリガンドと他の膜 に結合したリセプタとの間の相互作用が側方凝集を促進するという可能性を裏付 ける。微生物の寄託 以下の微生物を、ブダペスト条約の規定に基づきアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリー ランド州２０８５２に寄託した。 受託番号 ｅｆｌ−２を有するｐＪＦＥ１４ ７５７２８ ｅｆｌ−３を有するｐＪＦＥ１４ ７５７３４ ｅｆｌ−４を有するｐＪＦＥ１４ ７５９２１ 以上、本発明を例示の目的で詳細に説明したが、本発明の範囲はこれら特定実 施例のみに限定されず、多くの改変をなしうることが当業者には了解されよう。 本明細書には各種の引例を引用したが、その開示を参考のためここに引用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／２９９，５６７ (32)優先日 1994年９月１日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／３２７，４２３ (32)優先日 1994年10月21日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ゲール，ニコラス アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10804、 ニユー・ロツチエル、エルク・アベニユ ー・140 (72)発明者 オールドリツチ，トーマス・エイチ アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10562、 オシニング、ブルツク・クラブ・ドライ ブ・２−３ (72)発明者 メイソンピエール，ピーター・シー アメリカ合衆国、ニユ・ヨーク・10520、 クロトン、エルモア・アベニユ・15 (72)発明者 ゴールドファーブ，ミツシエル アメリカ合衆国、ニユ・ジヤージー・ 07661、リバー・エツジ、タフト・ロー ド・327 (72)発明者 ヤンコポロス，ジヨージ・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10598、 ヨークタウン・ハイツ、バプテイスト・チ ヤーチ・ロード・1519

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ） ｅｐｈ族リガンドの可溶性ドメインをエピトープ標識と共に発現 させ； （ｂ） 前記標識された可溶性ドメインを抗−標識抗体に暴露させる ことを特徴とするｅｐｈ族リガンドの細胞外ドメインの生物学的活性を増大させ る方法。 ２． 前記標識化がリガンドのＣ−末端に位置する請求の範囲第１項に記載の方 法。 ３． 前記エピトープ標識がｃ−ｍｙｃである請求の範囲第２項に記載の方法。 ４． （ａ） ｅｐｈ族リガンドの可溶性ドメインをＩｇＧのＦｃドメインと共 に発現させ； （ｂ） Ｆｃダイマーを形成させる ことを特徴とするｅｐｈ族リガンドの可溶性ドメインの生物学的活性を増大させ る方法。 ５． エピトープ標識された可溶性ｅｆｌの抗−エピトープ抗体処理された調製 物。 ６． 前記エピトープ標識がリガンドのＣ−末端に位置する請求の範囲第５項に 記載の調製物。 ７． 前記エピトープがｍｙｃである請求の範囲第６項に記載の調製物。 ８． （可溶性Ｅｆｌ）_nを含み、可溶性ｅｆｌがｅｐｈ族リセプタを結合する リガンドの細胞外ドメインであり、ｎが２もしくはそれ以上であることを特徴と する生物学的に活性なクラスター化された可溶性ｅｐｈ族リガンド。 ９． 可溶性ＥｆｌがＥｆｌ−１、Ｅｆｌ−２、Ｅｆｌ−３およびＥｆｌ−４の 細胞外ドメインよりなる群から選択された細胞外ドメインである請求の範囲第８ 項に記載のクラスター化されたリガンド。 １０． 核酸の配列が： （ａ） プラスミドｐＪＦＥ１４（１９９４年１０月２１日付けでアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて第７５９２１号と指定された） に含まれるｅｆｌ−４ＤＮＡ配列のコード領域を含むＤＮＡ配列； （ｂ） 適当に厳密な条件下で前記（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズすると共に 、Ｅｈｋ−１リセプタを結合するＥｆｌ−４ 蛋白質をコードするＤＮＡ配列；及び （ｃ） 遺伝子コードの結果として前記（ａ）もしくは（ｂ）のＤＮＡ配列まで 変質すると共に、Ｅｈｋ−１リセプタを結合するＥｆｌ−４蛋白質をコードする ＤＮＡ配列 よりなる群から選択されることを特徴とするｅｆｌ−４を含む分離精製された核 酸分子。