JP2002017361A - リーリンタンパク質ｃｒ−５０エピトープ領域 - Google Patents
リーリンタンパク質ｃｒ−５０エピトープ領域Info
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 脊椎動物におけるリーリンタンパク質自体の
機能を更に研究し、リーリン遺伝子の異常並びにニュー
ロンの配置異常に起因する脳の障害に対して適切な診断
及び治療を提供することを可能とする。 【解決手段】 リーリンタンパク質のCR-50抗体認識部
位を含み、F-spondinドメイン及びリピート部位を含ま
ないリーリンタンパク質エピトープ領域ポリペプチド及
びこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
機能を更に研究し、リーリン遺伝子の異常並びにニュー
ロンの配置異常に起因する脳の障害に対して適切な診断
及び治療を提供することを可能とする。 【解決手段】 リーリンタンパク質のCR-50抗体認識部
位を含み、F-spondinドメイン及びリピート部位を含ま
ないリーリンタンパク質エピトープ領域ポリペプチド及
びこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リーリンタンパク
質のCR-50エピトープ領域ポリペプチド及びそれをコー
ドするポリヌクレオチドに関する。
質のCR-50エピトープ領域ポリペプチド及びそれをコー
ドするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】哺乳動物の中枢神経系（CNS）において
は、種々のクラスのニューロンがその発生部位から最終
的な場所に移動して、精巧な層構造に配置されることが
知られている（Rakic, P., (1995) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 92, 11323-11327; Pearlman, A. L.ら, (199
8) Curr. Opin. Neurobiol., 8, 45-54; Rice, D. S. &
Curran, T., (1999) Genes Dev., 13, 2758-2773）。新
皮質の発達は、プレプレート形成から開始する。プレプ
レートは、皮質表面近くに存在し、皮質求心性神経線維
及びCajal-Retzius及び将来のサブプレートニューロン
を含む最も早期に生成したニューロンの表面叢から構成
される。従って、プレプレートは皮質プレートニューロ
ンによって分割され、Cajal-Retziusニューロンが分化
する表面の辺縁層、及びサブプレートニューロンが分化
する深部のサブプレートになる（Allendoerfer, K. L.
& Shatz, C. J. (1994) Annu. Rev. Neurosci., 17, 18
5-218）。皮質プレートニューロンは脳室帯で発生し、
放射状のグリア線維に沿って中間帯及びサブプレートを
通過して移動し、皮質プレートに到達する。より早い時
期に発生したニューロンを通り越して、より遅い時期に
発生したニューロンが規則的に移動することにより、哺
乳類の皮質層にインサイド−アウトのニューロンの層形
成がなされる（Angevine, J. B. & Sidman, R. L. (196
1) Nature, 25, 766-768; Rakic, P. (1972) J. Comp.
Neurol., 145, 61-84）。
は、種々のクラスのニューロンがその発生部位から最終
的な場所に移動して、精巧な層構造に配置されることが
知られている（Rakic, P., (1995) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 92, 11323-11327; Pearlman, A. L.ら, (199
8) Curr. Opin. Neurobiol., 8, 45-54; Rice, D. S. &
Curran, T., (1999) Genes Dev., 13, 2758-2773）。新
皮質の発達は、プレプレート形成から開始する。プレプ
レートは、皮質表面近くに存在し、皮質求心性神経線維
及びCajal-Retzius及び将来のサブプレートニューロン
を含む最も早期に生成したニューロンの表面叢から構成
される。従って、プレプレートは皮質プレートニューロ
ンによって分割され、Cajal-Retziusニューロンが分化
する表面の辺縁層、及びサブプレートニューロンが分化
する深部のサブプレートになる（Allendoerfer, K. L.
& Shatz, C. J. (1994) Annu. Rev. Neurosci., 17, 18
5-218）。皮質プレートニューロンは脳室帯で発生し、
放射状のグリア線維に沿って中間帯及びサブプレートを
通過して移動し、皮質プレートに到達する。より早い時
期に発生したニューロンを通り越して、より遅い時期に
発生したニューロンが規則的に移動することにより、哺
乳類の皮質層にインサイド−アウトのニューロンの層形
成がなされる（Angevine, J. B. & Sidman, R. L. (196
1) Nature, 25, 766-768; Rakic, P. (1972) J. Comp.
Neurol., 145, 61-84）。
【０００３】マウスの常染色体劣性突然変異体であるこ
とが知られているリーラーは、ニューロンが正常に発生
するが配置が異常なものであり、その結果CNSに秩序立
った皮質層が形成されない（Falconer, D. S., (1951)
J. Genet., 50, 192-201; Rakic, P. & Caviness, V.
S. J., (1995) Neuron, 14, 1101-1104; Stanfield, B.
B. & Cowan, W. M. (1979) J. Comp. Neurol. 185, 42
3-459; Caviness, V.S.Jr. (1982) Dev. Brain Res.,
4, 293-302; Caviness, V. S. Jr. & Sidman, R. L.,
(1973) J. Comp. Neurol., 148, 141-151; deRouvroit,
C. L. & Goffinet, A. M. (1998) Adv. Anat. Embryo
l. Cell Biol., 150, 1-106）。例えばリーラーの新皮
質においては皮質プレートニューロンが正常マウスとは
逆の向きに配列している（「アウトサイド-イン」）。
本発明者等は先に、リーラーマウスを正常な胎児脳のホ
モジネートで免疫することによって、モノクローナル同
種抗体、CR-50を得た（Ogawa, M.ら, (1995) Neuron, 1
4, 899-912）。この抗体は、正常マウスの辺縁帯におけ
るCajal-Retziusニューロンと特異的に反応することが
示された。その後、CR-50抗体は、リーラー遺伝子（ree
lin、Reln）によってコードされるリーリンタンパク質
そのものを認識することが示された。リーリンは、3461
アミノ酸から構成される、相対分子量388Kの分泌型細胞
外マトリクスタンパク質である（D'Arcangelo, G.ら,
(1997) J. Neurosci. 17, 23-31; D'Arcangelo, G.ら,
(1995) Nature, 374, 719-723）（図１A）。リーリンの
Ｎ-末端は脊髄における交連軸索の接着及び伸長を調節
する細胞外マトリクスタンパク質であるＦ-spondinのＮ
-末端と25％の同一性を有する（Klar, A.ら, (1992) Ce
ll 69,95-110）。リーリンの最初の500アミノ酸に続い
て、それぞれ350-390アミノ酸からなり、中央に30アミ
ノ酸のEGF様モチーフを含む8個の「リーリンリピート」
がある（D'Arcangelo, G.ら, (1995) Nature, 374, 719
-723）。リーリンの高度に荷電したＣ-末端は、細胞外
空間への分泌に必須である（D'Arcangelo, G.ら,(1997)
J. Neurosci. 17, 23-31; deBerbeyck, V.ら, (1997)
Mol. Brain Res.,50, 85-90）。
とが知られているリーラーは、ニューロンが正常に発生
するが配置が異常なものであり、その結果CNSに秩序立
った皮質層が形成されない（Falconer, D. S., (1951)
J. Genet., 50, 192-201; Rakic, P. & Caviness, V.
S. J., (1995) Neuron, 14, 1101-1104; Stanfield, B.
B. & Cowan, W. M. (1979) J. Comp. Neurol. 185, 42
3-459; Caviness, V.S.Jr. (1982) Dev. Brain Res.,
4, 293-302; Caviness, V. S. Jr. & Sidman, R. L.,
(1973) J. Comp. Neurol., 148, 141-151; deRouvroit,
C. L. & Goffinet, A. M. (1998) Adv. Anat. Embryo
l. Cell Biol., 150, 1-106）。例えばリーラーの新皮
質においては皮質プレートニューロンが正常マウスとは
逆の向きに配列している（「アウトサイド-イン」）。
本発明者等は先に、リーラーマウスを正常な胎児脳のホ
モジネートで免疫することによって、モノクローナル同
種抗体、CR-50を得た（Ogawa, M.ら, (1995) Neuron, 1
4, 899-912）。この抗体は、正常マウスの辺縁帯におけ
るCajal-Retziusニューロンと特異的に反応することが
示された。その後、CR-50抗体は、リーラー遺伝子（ree
lin、Reln）によってコードされるリーリンタンパク質
そのものを認識することが示された。リーリンは、3461
アミノ酸から構成される、相対分子量388Kの分泌型細胞
外マトリクスタンパク質である（D'Arcangelo, G.ら,
(1997) J. Neurosci. 17, 23-31; D'Arcangelo, G.ら,
(1995) Nature, 374, 719-723）（図１A）。リーリンの
Ｎ-末端は脊髄における交連軸索の接着及び伸長を調節
する細胞外マトリクスタンパク質であるＦ-spondinのＮ
-末端と25％の同一性を有する（Klar, A.ら, (1992) Ce
ll 69,95-110）。リーリンの最初の500アミノ酸に続い
て、それぞれ350-390アミノ酸からなり、中央に30アミ
ノ酸のEGF様モチーフを含む8個の「リーリンリピート」
がある（D'Arcangelo, G.ら, (1995) Nature, 374, 719
-723）。リーリンの高度に荷電したＣ-末端は、細胞外
空間への分泌に必須である（D'Arcangelo, G.ら,(1997)
J. Neurosci. 17, 23-31; deBerbeyck, V.ら, (1997)
Mol. Brain Res.,50, 85-90）。
【０００４】細胞質においては、リーリンシグナルは細
胞質内アダプタータンパク質、Disabledホモログ１（Da
b1）によって受け取られる（Howell, B. W.ら, (1997)
EMBOJ. 16, 121-132; Howell, B. W.ら, (1997) Nature
389, 733-737; Howell, B.W.ら, (1999) Genes Dev. 1
3, 643-648; Sheldon, M.ら, (1997) Nature, 389,730-
733; Ware, M. L.ら, (1997) Neuron, 19, 239-249; Ri
ce, D. S.ら, (1998) Development, 125, 3719-372
9）。このタンパク質の欠損は、マウスにおいてリーラ
ー様表現型を引き起こす（Howell, B. W.ら, (1997) Na
ture 389, 733-737; Sweet, H. O.ら, (1996) Mamm. Ge
nome, 7, 798-802, J. Biol. Chem., 273,556-3560; Yo
neshima, H.ら, (1997) Neurosci. Res., 29, 217-22
3）。Dab1は、数種の細胞表面タンパク質の細胞質ドメ
インにおける非リン酸化NPxYモチーフに結合する（Paws
on, T. & Scott, J. D. (1997) Science, 278, 2075-20
80; Trommsdorff, M.ら, (1998) J. Biol. Chem., 273,
3556-3560; Homayouni, R.ら,(1999) J. Neurosci., 1
9, 7507-7515; Howell, B.ら, (1999) Mol. Cel. Bio
l., 19, 5179-5188）。リーリンはDab1のチロシンリン
酸化を誘導する（Howell,B. W.ら, (1999) Genes Dev.
13, 643-648）。超低密度リポタンパク質受容体（VLDL
R）遺伝子及びアポリポタンパク質Ｅ受容体２（ApoER
2）遺伝子を共に欠いたダブルノックアウトマウスの表
現型がリーラーマウスの表現型と区別できないことも示
された（Trommsdorff, M.ら, (1999) Cell, 97, 698-70
1）。近年、リーリンはVLDLR、ApoER2（D'Arcangelo,
G.ら, (1999) Neuron, 24, 471-479; Hiesberger, T.
ら, (1999) Neuron, 24, 481-489）、及びカドヘリン関
連ニューロン受容体（CNR）ファミリーメンバー（Senza
ki, K.ら, (1999) Cell 99, 635-647）に結合し、これ
はDab1のチロシンリン酸化につながることが報告され
た。これらの結果から、リーリンは、VLDLR、ApoER2、
及びCNRファミリータンパク質を介してDab1のチロシン
リン酸化を刺激することによって、ニューロンの移動及
び配置を調節することが示唆される。
胞質内アダプタータンパク質、Disabledホモログ１（Da
b1）によって受け取られる（Howell, B. W.ら, (1997)
EMBOJ. 16, 121-132; Howell, B. W.ら, (1997) Nature
389, 733-737; Howell, B.W.ら, (1999) Genes Dev. 1
3, 643-648; Sheldon, M.ら, (1997) Nature, 389,730-
733; Ware, M. L.ら, (1997) Neuron, 19, 239-249; Ri
ce, D. S.ら, (1998) Development, 125, 3719-372
9）。このタンパク質の欠損は、マウスにおいてリーラ
ー様表現型を引き起こす（Howell, B. W.ら, (1997) Na
ture 389, 733-737; Sweet, H. O.ら, (1996) Mamm. Ge
nome, 7, 798-802, J. Biol. Chem., 273,556-3560; Yo
neshima, H.ら, (1997) Neurosci. Res., 29, 217-22
3）。Dab1は、数種の細胞表面タンパク質の細胞質ドメ
インにおける非リン酸化NPxYモチーフに結合する（Paws
on, T. & Scott, J. D. (1997) Science, 278, 2075-20
80; Trommsdorff, M.ら, (1998) J. Biol. Chem., 273,
3556-3560; Homayouni, R.ら,(1999) J. Neurosci., 1
9, 7507-7515; Howell, B.ら, (1999) Mol. Cel. Bio
l., 19, 5179-5188）。リーリンはDab1のチロシンリン
酸化を誘導する（Howell,B. W.ら, (1999) Genes Dev.
13, 643-648）。超低密度リポタンパク質受容体（VLDL
R）遺伝子及びアポリポタンパク質Ｅ受容体２（ApoER
2）遺伝子を共に欠いたダブルノックアウトマウスの表
現型がリーラーマウスの表現型と区別できないことも示
された（Trommsdorff, M.ら, (1999) Cell, 97, 698-70
1）。近年、リーリンはVLDLR、ApoER2（D'Arcangelo,
G.ら, (1999) Neuron, 24, 471-479; Hiesberger, T.
ら, (1999) Neuron, 24, 481-489）、及びカドヘリン関
連ニューロン受容体（CNR）ファミリーメンバー（Senza
ki, K.ら, (1999) Cell 99, 635-647）に結合し、これ
はDab1のチロシンリン酸化につながることが報告され
た。これらの結果から、リーリンは、VLDLR、ApoER2、
及びCNRファミリータンパク質を介してDab1のチロシン
リン酸化を刺激することによって、ニューロンの移動及
び配置を調節することが示唆される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記CR-50抗体は、リ
ーリンの機能をin vitro及びin vivoの双方で中和する
活性を有している（Ogawa, M.ら, (1995) Neuron, 14,
899-912；DelRio, J. Q.ら, (1997) Nature, 385, 70-7
4; Miyata, T.ら, (1997) J. Neurosci., 17, 3599-360
9; Nakajima, K.ら, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 94, 8196-8201）。最近、本発明者等はCR-50抗体の
認識するエピトープがＮ-末端近辺に位置していること
を報告した（D'Arcangelo, G.ら, (1997) J. Neurosci.
17, 23-31）。CR-50抗体はリーリンの機能を阻害する
ことから、このCR-50エピトープ領域は神経発達の過程
におけるリーリンシグナル伝達において重要な役割を果
たしていると考えられる。そこで、脊椎動物におけるリ
ーリンタンパク質自体の機能を更に研究し、リーリン遺
伝子の異常並びにニューロンの配置異常に起因する脳の
障害に対して適切な診断及び治療を提供することを可能
とするために、リーリンのCR-50エピトープ領域を特定
し、リーリンタンパク質におけるその機能を検討するこ
とが必要である。
ーリンの機能をin vitro及びin vivoの双方で中和する
活性を有している（Ogawa, M.ら, (1995) Neuron, 14,
899-912；DelRio, J. Q.ら, (1997) Nature, 385, 70-7
4; Miyata, T.ら, (1997) J. Neurosci., 17, 3599-360
9; Nakajima, K.ら, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 94, 8196-8201）。最近、本発明者等はCR-50抗体の
認識するエピトープがＮ-末端近辺に位置していること
を報告した（D'Arcangelo, G.ら, (1997) J. Neurosci.
17, 23-31）。CR-50抗体はリーリンの機能を阻害する
ことから、このCR-50エピトープ領域は神経発達の過程
におけるリーリンシグナル伝達において重要な役割を果
たしていると考えられる。そこで、脊椎動物におけるリ
ーリンタンパク質自体の機能を更に研究し、リーリン遺
伝子の異常並びにニューロンの配置異常に起因する脳の
障害に対して適切な診断及び治療を提供することを可能
とするために、リーリンのCR-50エピトープ領域を特定
し、リーリンタンパク質におけるその機能を検討するこ
とが必要である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、リーリン
タンパク質がin vitro及びin vivoの双方で互いに結合
して大きなタンパク質複合体を形成することを見出し
た。興味深いことに、この会合体形成は、リーリン機能
を中和することが知られている濃度のCR-50抗体によっ
て明らかに阻害された。
タンパク質がin vitro及びin vivoの双方で互いに結合
して大きなタンパク質複合体を形成することを見出し
た。興味深いことに、この会合体形成は、リーリン機能
を中和することが知られている濃度のCR-50抗体によっ
て明らかに阻害された。
【０００７】本発明者等は先に、F-spondinドメイン及
びCR-50認識部位を含み、リピート部位を含まないXenop
usにおけるトランケート型リーリンタンパク質を見出し
た（特願2000-109954号）が、上記知見に基づき更に検
討した結果、CR-50との結合、及び本発明によって初め
て見出されたこのリーリンタンパク質の複合体形成に最
も重要であるエピトープ領域ポリペプチドを単離し、そ
の有用性を初めて見出した。
びCR-50認識部位を含み、リピート部位を含まないXenop
usにおけるトランケート型リーリンタンパク質を見出し
た（特願2000-109954号）が、上記知見に基づき更に検
討した結果、CR-50との結合、及び本発明によって初め
て見出されたこのリーリンタンパク質の複合体形成に最
も重要であるエピトープ領域ポリペプチドを単離し、そ
の有用性を初めて見出した。
【０００８】すなわち本発明者等は、CR-50エピトープ
領域が、リーリンタンパク質のアミノ酸230-346に相当
することを見出した（配列番号２）。そしてこのエピト
ープ領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）
を発現ベクターに導入し、大腸菌で発現させて得られる
組み換えCR-50エピトープ領域を用いて検討したとこ
ろ、このエピトープ領域ポリペプチドが静電的相互作用
によって速やかに規則的なホモポリマーを形成すること
を見出し、このポリマーの形成が全長のリーリンタンパ
ク質の会合体形成及び機能と密接に関係することを見出
し、本発明に到った。
領域が、リーリンタンパク質のアミノ酸230-346に相当
することを見出した（配列番号２）。そしてこのエピト
ープ領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）
を発現ベクターに導入し、大腸菌で発現させて得られる
組み換えCR-50エピトープ領域を用いて検討したとこ
ろ、このエピトープ領域ポリペプチドが静電的相互作用
によって速やかに規則的なホモポリマーを形成すること
を見出し、このポリマーの形成が全長のリーリンタンパ
ク質の会合体形成及び機能と密接に関係することを見出
し、本発明に到った。
【０００９】すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１
１）を提供する。 （１） リーリンタンパク質のCR-50抗体認識部位を含
み、F-spondinドメイン及びリピート部位を含まないリ
ーリンタンパク質CR-50エピトープ領域ポリペプチド。
１）を提供する。 （１） リーリンタンパク質のCR-50抗体認識部位を含
み、F-spondinドメイン及びリピート部位を含まないリ
ーリンタンパク質CR-50エピトープ領域ポリペプチド。
【００１０】本明細書において、「リーリンタンパク
質」とは、リーラー突然変異マウスの原因遺伝子にコー
ドされるタンパク質で、シグナルペプチド、F-spondin
ドメイン、CR-50認識部位、リーリンリピートを含む細
胞外基質タンパク質をいう。「F-spondinドメイン」と
は、リーリンタンパク質のＮ末端側において、F-spondi
nとの間に相同性が認められる領域をいう。
質」とは、リーラー突然変異マウスの原因遺伝子にコー
ドされるタンパク質で、シグナルペプチド、F-spondin
ドメイン、CR-50認識部位、リーリンリピートを含む細
胞外基質タンパク質をいう。「F-spondinドメイン」と
は、リーリンタンパク質のＮ末端側において、F-spondi
nとの間に相同性が認められる領域をいう。
【００１１】「CR-50認識部位」とは、マウスのリーリ
ンタンパク質において、CR-50抗体の認識する部位、ま
たは他の生物のもつリーリンタンパク質においては、マ
ウスリーリンのCR-50認識部位と相同な領域をいう。な
お、CR-50抗体は、Neuron 14, 899-912(1995)に記載の
方法により作製することができる。「リピート部位」と
は、リーリンタンパク質において、中心にEGF様モチー
フをもつ互いに相同性のあるアミノ酸配列の単位が連続
して繰り返される領域をいう。
ンタンパク質において、CR-50抗体の認識する部位、ま
たは他の生物のもつリーリンタンパク質においては、マ
ウスリーリンのCR-50認識部位と相同な領域をいう。な
お、CR-50抗体は、Neuron 14, 899-912(1995)に記載の
方法により作製することができる。「リピート部位」と
は、リーリンタンパク質において、中心にEGF様モチー
フをもつ互いに相同性のあるアミノ酸配列の単位が連続
して繰り返される領域をいう。
【００１２】（２） マウスに由来する上記（１）に記
載のリーリンタンパク質CR-50エピトープ領域ポリペプ
チド。 （３） 以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかであるポ
リペプチド。 （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプ
チド （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１個若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつCR-50抗体と結合し得るポ
リペプチド （４） 上記（１）から（３）のいずれかに記載のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
載のリーリンタンパク質CR-50エピトープ領域ポリペプ
チド。 （３） 以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかであるポ
リペプチド。 （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプ
チド （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１個若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつCR-50抗体と結合し得るポ
リペプチド （４） 上記（１）から（３）のいずれかに記載のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１３】（５） 以下の（ａ）から（ｃ）のいずれ
かであるポリヌクレオチド。 （ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリ
ヌクレオチド （ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列において、１
個または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加
されたヌクレオチド配列からなり、かつCR-50抗体と結
合し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの配列と
縮重関係にあるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオ
チド 上記（３）または（５）における「数個」とは、例えば
部位特異的突然変異誘導法等によって誘導し得る変異の
数をいい、突然変異前の機能を損なわない範囲の数を意
味する。また、「縮重関係」とは、ヌクレオチド配列は
相違しているが、コドンの縮重のために互いに同じアミ
ノ酸またはアミノ酸配列をコードする２以上のポリヌク
レオチド間の関係を意味する。
かであるポリヌクレオチド。 （ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリ
ヌクレオチド （ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列において、１
個または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加
されたヌクレオチド配列からなり、かつCR-50抗体と結
合し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの配列と
縮重関係にあるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオ
チド 上記（３）または（５）における「数個」とは、例えば
部位特異的突然変異誘導法等によって誘導し得る変異の
数をいい、突然変異前の機能を損なわない範囲の数を意
味する。また、「縮重関係」とは、ヌクレオチド配列は
相違しているが、コドンの縮重のために互いに同じアミ
ノ酸またはアミノ酸配列をコードする２以上のポリヌク
レオチド間の関係を意味する。
【００１４】（６） 上記（４）若しくは（５）に記載
のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。 上記ポリヌクレオチドを含有し得るベクターとしては、
当分野において使用可能なことが知られ、上記ポリヌク
レオチドがコードするポリペプチドの発現に好適なもの
であれば特に限定されるものではないが、例えばpET-29
a（Novagen）、pcDNA3（Invitrogen）等が挙げられる。
のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。 上記ポリヌクレオチドを含有し得るベクターとしては、
当分野において使用可能なことが知られ、上記ポリヌク
レオチドがコードするポリペプチドの発現に好適なもの
であれば特に限定されるものではないが、例えばpET-29
a（Novagen）、pcDNA3（Invitrogen）等が挙げられる。
【００１５】また、当分野において公知のように、発現
ベクター中に上記ポリヌクレオチドの発現を制御し得る
プロモーター、エンハンサー等の調節配列を適宜含ませ
ることができる。更に、発現させるポリペプチドは本発
明に係るポリペプチドのみであっても良いが、目的に応
じ、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GS
T）等の他のタンパク質、またはヒスチジンタグ等のタ
グ等との融合タンパク質として発現させても良い。
ベクター中に上記ポリヌクレオチドの発現を制御し得る
プロモーター、エンハンサー等の調節配列を適宜含ませ
ることができる。更に、発現させるポリペプチドは本発
明に係るポリペプチドのみであっても良いが、目的に応
じ、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GS
T）等の他のタンパク質、またはヒスチジンタグ等のタ
グ等との融合タンパク質として発現させても良い。
【００１６】（７） 上記（６）に記載の発現ベクター
でトランスフェクトされた宿主細胞。宿主細胞として
は、上記ポリペプチドを発現できるものであればいずれ
でも良く、当分野において使用可能なことが知られてい
る動物細胞、植物細胞、細菌等が挙げられるが、特に大
腸菌、293T細胞、COS細胞等を使用するのが好適であ
る。
でトランスフェクトされた宿主細胞。宿主細胞として
は、上記ポリペプチドを発現できるものであればいずれ
でも良く、当分野において使用可能なことが知られてい
る動物細胞、植物細胞、細菌等が挙げられるが、特に大
腸菌、293T細胞、COS細胞等を使用するのが好適であ
る。
【００１７】（８） 上記（７）に記載の宿主細胞を培
養することを含む、上記（１）から（３）のいずれかに
記載のポリペプチドの製造方法。 （９） 上記（１）から（３）のいずれかに記載のポリ
ペプチド、または上記（４）若しくは（５）に記載のポ
リヌクレオチドを添加することを含む、リーリンタンパ
ク質の会合体形成を促進する方法。
養することを含む、上記（１）から（３）のいずれかに
記載のポリペプチドの製造方法。 （９） 上記（１）から（３）のいずれかに記載のポリ
ペプチド、または上記（４）若しくは（５）に記載のポ
リヌクレオチドを添加することを含む、リーリンタンパ
ク質の会合体形成を促進する方法。
【００１８】（１０） 上記（１）から（３）のいずれ
かに記載のポリペプチド、または上記（４）若しくは
（５）に記載のポリヌクレオチドを含む、リーリンタン
パク質の会合体形成を促進する組成物。 （１１） 上記（１）から（３）のいずれかに記載のポ
リペプチド、または上記（４）若しくは（５）に記載の
ポリヌクレオチドを含む、神経細胞の配置異常による疾
患の診断及び／または治療のための医薬組成物。
かに記載のポリペプチド、または上記（４）若しくは
（５）に記載のポリヌクレオチドを含む、リーリンタン
パク質の会合体形成を促進する組成物。 （１１） 上記（１）から（３）のいずれかに記載のポ
リペプチド、または上記（４）若しくは（５）に記載の
ポリヌクレオチドを含む、神経細胞の配置異常による疾
患の診断及び／または治療のための医薬組成物。
【００１９】
【発明の実施の形態】胎児脳の生細胞を抗リーリン抗体
で染色した場合、新皮質のCajal-Retziusニューロン等
のリーリン分泌細胞の細胞表面が斑点状のパターンで標
識される（Ogawa, M.ら, (1995) Neuron, 14, 899-912;
deBerbeyck, V.ら, (1997) Mol. Brain Res., 50, 85-
90; Miyata, T.ら, (1997) J. Neurosci., 17, 3599-36
09; Nakajima, K.ら, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 94, 8196-8201）ことから、リーリンタンパク質が
集まってリーリン分泌細胞の細胞膜表面に結合している
ことが示唆される。リーリンタンパク質がin vivoで実
際に集まっているか否かを決定するために、非変性及び
変性ゲル電気泳動後のウエスタンブロット分析を行っ
た。胎児の大脳ホモジネート（胎児期18日；E18）を変
性条件下で分離した場合、抗リーリン抗体による免疫ブ
ロットから、ヘテロ接合体リーラー（Reln rl/＋；rl/
＋）で400kDaのバンドのみが明らかになった（図１
B）。これは明らかにリーリンタンパク質のモノマーに
対応している。対照的に、大脳（E18）及び小脳（生後5
日；P5）ホモジネートを非変性ネイティブゲル上で分離
した場合、ヘテロ接合体（rl/＋）のモノマーバンドに
加え、400kDaからウェルまで広がった広範囲のバンドが
検出された（図１C）。
で染色した場合、新皮質のCajal-Retziusニューロン等
のリーリン分泌細胞の細胞表面が斑点状のパターンで標
識される（Ogawa, M.ら, (1995) Neuron, 14, 899-912;
deBerbeyck, V.ら, (1997) Mol. Brain Res., 50, 85-
90; Miyata, T.ら, (1997) J. Neurosci., 17, 3599-36
09; Nakajima, K.ら, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 94, 8196-8201）ことから、リーリンタンパク質が
集まってリーリン分泌細胞の細胞膜表面に結合している
ことが示唆される。リーリンタンパク質がin vivoで実
際に集まっているか否かを決定するために、非変性及び
変性ゲル電気泳動後のウエスタンブロット分析を行っ
た。胎児の大脳ホモジネート（胎児期18日；E18）を変
性条件下で分離した場合、抗リーリン抗体による免疫ブ
ロットから、ヘテロ接合体リーラー（Reln rl/＋；rl/
＋）で400kDaのバンドのみが明らかになった（図１
B）。これは明らかにリーリンタンパク質のモノマーに
対応している。対照的に、大脳（E18）及び小脳（生後5
日；P5）ホモジネートを非変性ネイティブゲル上で分離
した場合、ヘテロ接合体（rl/＋）のモノマーバンドに
加え、400kDaからウェルまで広がった広範囲のバンドが
検出された（図１C）。
【００２０】次いで培養した小脳顆粒細胞から分泌され
たリーリンの状態を調べた。リーラーホモ接合体（rl/r
l）及びヘテロ接合体の初代小脳培養の上清を非変性ネ
イティブゲル電気泳動上で分離し、抗リーリン抗体で検
出した。この実験においても、ヘテロ接合体マウスのサ
ンプルのみが分子量400kDa以上の広範囲のバンドを示し
た（図１D）。これらの結果から、分泌されたリーリン
は、in vitro及びin vivo双方で大きなタンパク質複合
体の状態にあることが示唆された。
たリーリンの状態を調べた。リーラーホモ接合体（rl/r
l）及びヘテロ接合体の初代小脳培養の上清を非変性ネ
イティブゲル電気泳動上で分離し、抗リーリン抗体で検
出した。この実験においても、ヘテロ接合体マウスのサ
ンプルのみが分子量400kDa以上の広範囲のバンドを示し
た（図１D）。これらの結果から、分泌されたリーリン
は、in vitro及びin vivo双方で大きなタンパク質複合
体の状態にあることが示唆された。
【００２１】次いで、リーリンタンパク質分子が互いに
相互作用を実際に示すか否かを細胞接着アッセイにより
検討した。分泌されたリーリンの一部はリーリン産生脳
細胞そのものの表面に結合している（Ogawa, M.ら, (19
95) Neuron, 14, 899-912; deBerbeyck, V.ら, (1997)
Mol. Brain Res., 50, 85-90; Miyata, T.ら, (1997)J.
Neurosci., 17, 3599-3609; Nakajima, K.ら, (1997)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8196-8201）ことか
ら、分泌されたリーリンが293T細胞に同様に結合するか
否かを調べるために、リーリントランスフェクト293T生
細胞をCR-50抗体で染色した（図２A）。生きた293T細胞
の細胞表面は、生きた脳細胞の表面と同様な斑点状のパ
ターンで染色されたが、固定された細胞は細胞質が拡散
して染色された（図２B）。これらの結果から、分泌さ
れたリーリン分子の一部がトランスフェクトされた293T
細胞の表面に結合していることが示される。
相互作用を実際に示すか否かを細胞接着アッセイにより
検討した。分泌されたリーリンの一部はリーリン産生脳
細胞そのものの表面に結合している（Ogawa, M.ら, (19
95) Neuron, 14, 899-912; deBerbeyck, V.ら, (1997)
Mol. Brain Res., 50, 85-90; Miyata, T.ら, (1997)J.
Neurosci., 17, 3599-3609; Nakajima, K.ら, (1997)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8196-8201）ことか
ら、分泌されたリーリンが293T細胞に同様に結合するか
否かを調べるために、リーリントランスフェクト293T生
細胞をCR-50抗体で染色した（図２A）。生きた293T細胞
の細胞表面は、生きた脳細胞の表面と同様な斑点状のパ
ターンで染色されたが、固定された細胞は細胞質が拡散
して染色された（図２B）。これらの結果から、分泌さ
れたリーリン分子の一部がトランスフェクトされた293T
細胞の表面に結合していることが示される。
【００２２】リーリントランスフェクト293T細胞をリー
リン被覆皿上に接種した場合、リーリンを含有しない上
清で被覆した対照の皿（図２D,G）よりずっと多くの細
胞が結合した（図２C）。骨格のベクターのみをトラン
スフェクトした対照細胞はリーリン被覆または対照の皿
に結合しなかった（図２E-G）。従って、リーリン分子
が互いに相互作用することが示唆された。実際、リーリ
ンの断片を有する発現cDNAライブラリーを、これと相互
作用する分子を探すためにスクリーニングすると、リー
リンcDNAの集団そのものが第２及び第３のスクリーニン
グによって顕著に富化された（データは示さない）。こ
れらのことから、リーリンタンパク質が互いに結合して
大きなタンパク質複合体を形成することが明らかになっ
た。
リン被覆皿上に接種した場合、リーリンを含有しない上
清で被覆した対照の皿（図２D,G）よりずっと多くの細
胞が結合した（図２C）。骨格のベクターのみをトラン
スフェクトした対照細胞はリーリン被覆または対照の皿
に結合しなかった（図２E-G）。従って、リーリン分子
が互いに相互作用することが示唆された。実際、リーリ
ンの断片を有する発現cDNAライブラリーを、これと相互
作用する分子を探すためにスクリーニングすると、リー
リンcDNAの集団そのものが第２及び第３のスクリーニン
グによって顕著に富化された（データは示さない）。こ
れらのことから、リーリンタンパク質が互いに結合して
大きなタンパク質複合体を形成することが明らかになっ
た。
【００２３】次いで、このリーリン分子間の相互作用と
リーリンタンパク質の機能との関係を更に検討するため
に、CR-50抗体がリーリン分子の会合体形成に及ぼす効
果を検討した（図３）。その結果、CR-50抗体の添加に
よってリーリン分子の会合体形成が阻害され、この会合
体形成がリーリンタンパク質の機能と結びついたもので
あり、しかもエピトープ領域によるものであることが明
らかになった。このことを更に確認するために、本発明
者等はCR-50抗体の認識部位であるエピトープ領域のみ
を発現させた。
リーリンタンパク質の機能との関係を更に検討するため
に、CR-50抗体がリーリン分子の会合体形成に及ぼす効
果を検討した（図３）。その結果、CR-50抗体の添加に
よってリーリン分子の会合体形成が阻害され、この会合
体形成がリーリンタンパク質の機能と結びついたもので
あり、しかもエピトープ領域によるものであることが明
らかになった。このことを更に確認するために、本発明
者等はCR-50抗体の認識部位であるエピトープ領域のみ
を発現させた。
【００２４】リーリンタンパク質のエピトープ領域の特
定は、以下のようにして行った。まず、リーリン分子の
遺伝子配列の一部分を部分的にコードする遺伝子配列を
組み込んだ遺伝子発現系を系統的に多数作製し、in vit
ro転写／翻訳実験（プロメガのプロトコールに従う）に
より、各々の遺伝子がコードするタンパク質を産生させ
た。この各々のタンパク質について、CR-50抗体によ
り、免疫沈降するか否かをウエスタンブロット法で解析
し、CR-50抗体が認識するエピトープ領域を決定した。
定は、以下のようにして行った。まず、リーリン分子の
遺伝子配列の一部分を部分的にコードする遺伝子配列を
組み込んだ遺伝子発現系を系統的に多数作製し、in vit
ro転写／翻訳実験（プロメガのプロトコールに従う）に
より、各々の遺伝子がコードするタンパク質を産生させ
た。この各々のタンパク質について、CR-50抗体によ
り、免疫沈降するか否かをウエスタンブロット法で解析
し、CR-50抗体が認識するエピトープ領域を決定した。
【００２５】この結果、リーリンタンパク質のCR-50エ
ピトープ領域はアミノ酸230-346（配列番号２）である
ことが明らかになった。リーリンタンパク質の会合体が
CR-50エピトープ領域そのものによって仲介されている
のか否かを決定するために、ペトリ皿を精製した組み換
えCR-50エピトープ断片で被覆し、全長リーリンでトラ
ンスフェクトした293T細胞を用いて細胞接着アッセイを
実施した。リーリン提示細胞をCR-50エピトープ被覆皿
上に接種した場合、対照の皿と比較して用量依存的にず
っと多くの細胞が結合した（図４）。これらの結果か
ら、リーリンタンパク質が精製CR-50エピトープ断片に
結合することが示され、リーリン分子の相互作用がCR-5
0エピトープ領域そのものによって仲介されていること
が示唆された。
ピトープ領域はアミノ酸230-346（配列番号２）である
ことが明らかになった。リーリンタンパク質の会合体が
CR-50エピトープ領域そのものによって仲介されている
のか否かを決定するために、ペトリ皿を精製した組み換
えCR-50エピトープ断片で被覆し、全長リーリンでトラ
ンスフェクトした293T細胞を用いて細胞接着アッセイを
実施した。リーリン提示細胞をCR-50エピトープ被覆皿
上に接種した場合、対照の皿と比較して用量依存的にず
っと多くの細胞が結合した（図４）。これらの結果か
ら、リーリンタンパク質が精製CR-50エピトープ断片に
結合することが示され、リーリン分子の相互作用がCR-5
0エピトープ領域そのものによって仲介されていること
が示唆された。
【００２６】上記の知見から、例えばサンプルにおける
リーリンタンパク質の会合体形成の有無及び／または程
度を検出することによって、そのサンプルにおけるリー
リンタンパク質の異常を検出することが可能であること
が明らかである。検出方法としては、特に限定するもの
ではないが、例えばサンプルからリーリンタンパク質ま
たはこれをコードする遺伝子を抽出し、必要に応じて精
製、増幅等の操作を行った後、電気泳動、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、細胞接着アッセイ、電子顕微鏡観察か
らなる群から選択される１または複数の使用を含む方法
が挙げられる。
リーリンタンパク質の会合体形成の有無及び／または程
度を検出することによって、そのサンプルにおけるリー
リンタンパク質の異常を検出することが可能であること
が明らかである。検出方法としては、特に限定するもの
ではないが、例えばサンプルからリーリンタンパク質ま
たはこれをコードする遺伝子を抽出し、必要に応じて精
製、増幅等の操作を行った後、電気泳動、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、細胞接着アッセイ、電子顕微鏡観察か
らなる群から選択される１または複数の使用を含む方法
が挙げられる。
【００２７】また、CR-50エピトープ領域を被覆したプ
レートを調製し、サンプルにおけるリーリンタンパク質
を含むエピトープ結合性物質をスクリーニングするため
に使用することができる。CR-50エピトープ領域の代わ
りにCR-50抗体を被覆したプレートを使用した場合に
は、エピトープ領域を含むリーリンタンパク質をより特
異的にスクリーニングすることができる。これらのスク
リーニング方法においては、当業者であれば容易に認識
されるように、蛍光色素を結合させた２次抗体の使用等
によって結合の有無を検出することができる。
レートを調製し、サンプルにおけるリーリンタンパク質
を含むエピトープ結合性物質をスクリーニングするため
に使用することができる。CR-50エピトープ領域の代わ
りにCR-50抗体を被覆したプレートを使用した場合に
は、エピトープ領域を含むリーリンタンパク質をより特
異的にスクリーニングすることができる。これらのスク
リーニング方法においては、当業者であれば容易に認識
されるように、蛍光色素を結合させた２次抗体の使用等
によって結合の有無を検出することができる。
【００２８】更に、CR-50抗体を被覆したプレートを含
む、サンプル中のリーリンタンパク質またはそのエピト
ープ領域を含む断片の有無または量を検出するためのキ
ットを提供することができる。また、本発明のポリペプ
チドまたはこれをコードするポリヌクレオチドを添加す
ることによって、生体におけるリーリンタンパク質の会
合体形成を促進することが可能である。この場合、本発
明のポリペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオ
チドは単独で添加しても良いが、リーリンタンパク質の
会合体形成を促進する組成物として添加することも可能
である。組成物に含めることができる他の成分について
は特に限定されるものではなく、当分野で通常使用され
るものであり、本発明の目的を達成可能なものであれば
いずれでも良い。
む、サンプル中のリーリンタンパク質またはそのエピト
ープ領域を含む断片の有無または量を検出するためのキ
ットを提供することができる。また、本発明のポリペプ
チドまたはこれをコードするポリヌクレオチドを添加す
ることによって、生体におけるリーリンタンパク質の会
合体形成を促進することが可能である。この場合、本発
明のポリペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオ
チドは単独で添加しても良いが、リーリンタンパク質の
会合体形成を促進する組成物として添加することも可能
である。組成物に含めることができる他の成分について
は特に限定されるものではなく、当分野で通常使用され
るものであり、本発明の目的を達成可能なものであれば
いずれでも良い。
【００２９】生体においては、リーリンタンパク質が正
常に機能するために会合体を形成していることが必要で
あることが見出されたが、リーリンタンパク質の機能解
明のためにその会合体形成を阻害する方法も提供され
る。リーリンタンパク質の会合体形成を阻害する組成物
としては、例えばリーリンタンパク質のCR-50エピトー
プ領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを含むもの等が挙げられ
る。
常に機能するために会合体を形成していることが必要で
あることが見出されたが、リーリンタンパク質の機能解
明のためにその会合体形成を阻害する方法も提供され
る。リーリンタンパク質の会合体形成を阻害する組成物
としては、例えばリーリンタンパク質のCR-50エピトー
プ領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを含むもの等が挙げられ
る。
【００３０】また、本発明により、本発明のポリペプチ
ド、またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む、
神経細胞の配置異常による疾患の治療のための医薬組成
物を提供することができる。例えば、本発明のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに組
み込み、これを患者の組織に由来する神経芽細胞、神経
幹細胞等に導入し、この細胞を患者の脳に移植すること
により、神経細胞の配置異常による疾患、例えば滑脳
症、多小脳回症、異所性灰白質等の疾患の治療を行うこ
とができる。医薬組成物は、本発明のポリペプチド、ま
たはこれをコードするポリヌクレオチドの他、医薬組成
物に通常用いられる製薬上許容し得る担体、賦形剤、緩
衝剤等を含むことができる。
ド、またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む、
神経細胞の配置異常による疾患の治療のための医薬組成
物を提供することができる。例えば、本発明のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに組
み込み、これを患者の組織に由来する神経芽細胞、神経
幹細胞等に導入し、この細胞を患者の脳に移植すること
により、神経細胞の配置異常による疾患、例えば滑脳
症、多小脳回症、異所性灰白質等の疾患の治療を行うこ
とができる。医薬組成物は、本発明のポリペプチド、ま
たはこれをコードするポリヌクレオチドの他、医薬組成
物に通常用いられる製薬上許容し得る担体、賦形剤、緩
衝剤等を含むことができる。
【００３１】
【実施例】以下本発明を実施例を挙げて説明するが、本
発明は以下の実施例に限定されるものではない。動物 ヘテロ接合体B6C3Fe-a/a-rlの成体（Jackson Laborator
y, Bar Harbor, ME）由来のリーラーマウスを使用し
た。ホモ接合体及びヘテロ接合体のマウスは、ホモ接合
体の雄とヘテロ接合体の雌の交配によって得た。膣栓が
検出された日、及び出生日をそれぞれE0及びP0とした。
発明は以下の実施例に限定されるものではない。動物 ヘテロ接合体B6C3Fe-a/a-rlの成体（Jackson Laborator
y, Bar Harbor, ME）由来のリーラーマウスを使用し
た。ホモ接合体及びヘテロ接合体のマウスは、ホモ接合
体の雄とヘテロ接合体の雌の交配によって得た。膣栓が
検出された日、及び出生日をそれぞれE0及びP0とした。
【００３２】小脳初代培養 リーラーマウス（P5）の小脳から単一細胞懸濁液を調製
した。10％FCSを添加した基本イーグル培地中の細胞懸
濁液を、５×１０５細胞／ｃｍ２のポリ-L-リシン被覆
プラスティック皿上にまいた。皿にまいてから18時間後
に培養を無血清培地に移し、４日間インキュベートし、
培養上清を回収した。会合体形成に対する効果を調べる
場合、無血清培地には最初からCR-50抗体を添加した。
した。10％FCSを添加した基本イーグル培地中の細胞懸
濁液を、５×１０５細胞／ｃｍ２のポリ-L-リシン被覆
プラスティック皿上にまいた。皿にまいてから18時間後
に培養を無血清培地に移し、４日間インキュベートし、
培養上清を回収した。会合体形成に対する効果を調べる
場合、無血清培地には最初からCR-50抗体を添加した。
【００３３】電気泳動及びウエスタンブロット分析 リーリンのSDS-PAGE及びネイティブゲル電気泳動を実施
した。電気泳動の後、タンパク質をフィルター（Millip
ore）上に移した。ブロッキング後、フィルターを一次
抗体（G10：抗リーリンモノクローナル抗体；J. Neuros
cience Methods, 82, 17-24, 1998）溶液と共に室温で
３時間インキュベートした。インキュベーションの後、
フィルターを洗浄してペルオキシダーゼ結合抗マウス二
次抗体（Jackson ImmunoResearch）溶液と共にインキュ
ベートした。１時間のインキュベーションの後、フィル
ターを洗浄し、化学発光検出システム（Boehringer-Man
nheim）によってシグナルを可視化した。ホモジネート
タンパク質100μgまたは小脳培養上清20μgを使用し
た。
した。電気泳動の後、タンパク質をフィルター（Millip
ore）上に移した。ブロッキング後、フィルターを一次
抗体（G10：抗リーリンモノクローナル抗体；J. Neuros
cience Methods, 82, 17-24, 1998）溶液と共に室温で
３時間インキュベートした。インキュベーションの後、
フィルターを洗浄してペルオキシダーゼ結合抗マウス二
次抗体（Jackson ImmunoResearch）溶液と共にインキュ
ベートした。１時間のインキュベーションの後、フィル
ターを洗浄し、化学発光検出システム（Boehringer-Man
nheim）によってシグナルを可視化した。ホモジネート
タンパク質100μgまたは小脳培養上清20μgを使用し
た。
【００３４】免疫組織染色 293T細胞を全長マウスリーリン発現構築物（pCrl；D'Ar
cangeloら、J. Neuroscience, January 1, 17(1):23-3
1, 1997, (T.Curranから頂く)）でトランスフェクトし
た。トランスフェクションの２日後、細胞を４％PFAで
固定し、0.05％TritonX-100で処理し、10％ウマ血清で
ブロックした。免疫染色は５mg/mlのストックから1:200
希釈した精製CR-50抗体で実施した。二次抗体は1:100希
釈のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗
マウスIgGを用いた。生細胞表面染色の場合、CR-50を1:
200希釈で培養細胞の培地に直接添加し、37℃で30分間
インキュベートした。次いで細胞を固定し、ブロック
し、二次抗体と共にインキュベートした。
cangeloら、J. Neuroscience, January 1, 17(1):23-3
1, 1997, (T.Curranから頂く)）でトランスフェクトし
た。トランスフェクションの２日後、細胞を４％PFAで
固定し、0.05％TritonX-100で処理し、10％ウマ血清で
ブロックした。免疫染色は５mg/mlのストックから1:200
希釈した精製CR-50抗体で実施した。二次抗体は1:100希
釈のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗
マウスIgGを用いた。生細胞表面染色の場合、CR-50を1:
200希釈で培養細胞の培地に直接添加し、37℃で30分間
インキュベートした。次いで細胞を固定し、ブロック
し、二次抗体と共にインキュベートした。
【００３５】［実施例１］リーリンCR-50エピトープ領域の決定 PCR法により、リーリンタンパク質の全アミノ酸配列の
うち、次の各部分に相当するポリヌクレオチドを作製し
た。1-1800（プライマー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列
番号３)及びAGGAACAACAGGAACACAG（配列番号４））、1-
460（プライマー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列番号３)
及びCCTCTCTCCATCTTTGAGGAAC(配列番号５)）、1-346
（プライマー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列番号３)及び
CAGGGCCCAGCAGGCCTCATAC(配列番号６)）、1-230（プラ
イマー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列番号３)及びCTCTCC
CATCTCACAGTTGCTG(配列番号７)）、1-190（プライマ
ー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列番号３)及びGTAAGCAGTG
GCCTCTGTGGG（配列番号８））、190-346（プライマー：
TACTCGCACCTTGCTGAAATAC（配列番号９）及びCAGGGCCCAG
CAGGCCTCATAC(配列番号６)）、及び230-346（プライマ
ー：GAGCAGTGTGGCACCATCATG（配列番号１０）及びCAGGG
CCCAGCAGGCCTCATAC(配列番号６)）。これらをpcDNA3ベ
クター（Invitrogen;サイトメガロウイルス(CMV)プロモ
ーター、T7プロモーターを有する）にライゲースを用い
て組み込み、遺伝子発現系を構築した。次にそれらがコ
ードするDNAを精製し、そのうち２μｇをT7 RNA ポリメ
ラーゼと反応させてRNAを合成し、このRNAから、reticu
locyte lysate transcription/translationsystem（Tn
T、Promega）により各タンパク質を合成した。この各タ
ンパク質について、以下の方法により免疫沈降実験を行
った。まず各タンパク質溶液50μlをRIPAバッファー（5
0ｍＭ Tris、pH8.0、150ｍＭ NaCl、１％ Nonidet P4
0、0.5％Na デオキシコレート、0.1％ SDS）によって１
ｍｌに希釈した。この際、プロテアーゼ阻害剤のロイペ
プチン（20μg/ml）、アプロチニン（0.1mg/ml）、フェ
ニルメチルスルフォニルフルオライド（２ｍＭ）を加え
ておく。この各タンパク質溶液にCR-50抗体を含む腹水5
0μlを加え、４℃、一昼夜、インキュベートした。その
後、Immobilized G-proteinアガロースビーズ（Immunop
ure plus、Pierce）を加え、４℃で30分間インキュベー
トし、生成した免疫沈降物は遠心して回収し、RIPAバッ
ファーで３回洗浄した。これを20μl SDS-sample バッ
ファーで再懸濁させ、電気泳動した。CR-50エピトープ
を含むタンパク質は免疫沈降することから、この一連の
結果からCR-50エピトープ部位（230-346、配列番号２）
を決定した。
うち、次の各部分に相当するポリヌクレオチドを作製し
た。1-1800（プライマー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列
番号３)及びAGGAACAACAGGAACACAG（配列番号４））、1-
460（プライマー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列番号３)
及びCCTCTCTCCATCTTTGAGGAAC(配列番号５)）、1-346
（プライマー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列番号３)及び
CAGGGCCCAGCAGGCCTCATAC(配列番号６)）、1-230（プラ
イマー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列番号３)及びCTCTCC
CATCTCACAGTTGCTG(配列番号７)）、1-190（プライマ
ー：ATGGAGCGCGGCTGCTGGGC(配列番号３)及びGTAAGCAGTG
GCCTCTGTGGG（配列番号８））、190-346（プライマー：
TACTCGCACCTTGCTGAAATAC（配列番号９）及びCAGGGCCCAG
CAGGCCTCATAC(配列番号６)）、及び230-346（プライマ
ー：GAGCAGTGTGGCACCATCATG（配列番号１０）及びCAGGG
CCCAGCAGGCCTCATAC(配列番号６)）。これらをpcDNA3ベ
クター（Invitrogen;サイトメガロウイルス(CMV)プロモ
ーター、T7プロモーターを有する）にライゲースを用い
て組み込み、遺伝子発現系を構築した。次にそれらがコ
ードするDNAを精製し、そのうち２μｇをT7 RNA ポリメ
ラーゼと反応させてRNAを合成し、このRNAから、reticu
locyte lysate transcription/translationsystem（Tn
T、Promega）により各タンパク質を合成した。この各タ
ンパク質について、以下の方法により免疫沈降実験を行
った。まず各タンパク質溶液50μlをRIPAバッファー（5
0ｍＭ Tris、pH8.0、150ｍＭ NaCl、１％ Nonidet P4
0、0.5％Na デオキシコレート、0.1％ SDS）によって１
ｍｌに希釈した。この際、プロテアーゼ阻害剤のロイペ
プチン（20μg/ml）、アプロチニン（0.1mg/ml）、フェ
ニルメチルスルフォニルフルオライド（２ｍＭ）を加え
ておく。この各タンパク質溶液にCR-50抗体を含む腹水5
0μlを加え、４℃、一昼夜、インキュベートした。その
後、Immobilized G-proteinアガロースビーズ（Immunop
ure plus、Pierce）を加え、４℃で30分間インキュベー
トし、生成した免疫沈降物は遠心して回収し、RIPAバッ
ファーで３回洗浄した。これを20μl SDS-sample バッ
ファーで再懸濁させ、電気泳動した。CR-50エピトープ
を含むタンパク質は免疫沈降することから、この一連の
結果からCR-50エピトープ部位（230-346、配列番号２）
を決定した。
【００３６】［実施例２］リーリンエピトープタンパク質の発現及び精製 CR-50抗体に対するリーリンエピトープ断片（残基230-3
46、配列番号２）をHis-Tag融合タンパク質として大腸
菌で発現させた。リーリンのCR-50エピトープ領域をコ
ードするポリヌクレオチド（配列番号１）のPCR増幅
（プライマーGAGCAGTGTGGCACCATC(配列番号１１)及びCA
GGGCCCAGCAGGCCTCATAC(配列番号６)）によってこれをpE
T-29a（Novagen）中にクローニングした。CR-50エピト
ープ領域をコードするこのインサートをT4 DNAリガーゼ
によってＣ末端His-Tag配列（Novagen）を含むpET-29a
ベクター中にライゲートし、BL21/pLysS大腸菌細胞（No
vagen）に形質転換した。インサートの配列はDNA配列決
定（ABI PRISM Model 3700）によって確認した。IPTGに
よって組み換えリーリンエピトープポリペプチドの発現
を誘導し、His結合樹脂アフィニティーカラムを用いたp
ETシステムプロトコールに基づく手順で大腸菌抽出物か
らCR-50エピトープタンパク質を精製した。具体的には
大腸菌を集菌し、５ｍＭイミダゾール、20ｍＭ Tris-HC
l（pH8.0）、0.5Ｍ NaCl及び0.2ｍＭ PMSFを含有するバ
ッファーに再度懸濁し、超音波処理した。遠心分離後、
上清をHis結合樹脂アフィニティーカラム（Novagen）上
にのせた。
46、配列番号２）をHis-Tag融合タンパク質として大腸
菌で発現させた。リーリンのCR-50エピトープ領域をコ
ードするポリヌクレオチド（配列番号１）のPCR増幅
（プライマーGAGCAGTGTGGCACCATC(配列番号１１)及びCA
GGGCCCAGCAGGCCTCATAC(配列番号６)）によってこれをpE
T-29a（Novagen）中にクローニングした。CR-50エピト
ープ領域をコードするこのインサートをT4 DNAリガーゼ
によってＣ末端His-Tag配列（Novagen）を含むpET-29a
ベクター中にライゲートし、BL21/pLysS大腸菌細胞（No
vagen）に形質転換した。インサートの配列はDNA配列決
定（ABI PRISM Model 3700）によって確認した。IPTGに
よって組み換えリーリンエピトープポリペプチドの発現
を誘導し、His結合樹脂アフィニティーカラムを用いたp
ETシステムプロトコールに基づく手順で大腸菌抽出物か
らCR-50エピトープタンパク質を精製した。具体的には
大腸菌を集菌し、５ｍＭイミダゾール、20ｍＭ Tris-HC
l（pH8.0）、0.5Ｍ NaCl及び0.2ｍＭ PMSFを含有するバ
ッファーに再度懸濁し、超音波処理した。遠心分離後、
上清をHis結合樹脂アフィニティーカラム（Novagen）上
にのせた。
【００３７】［実施例３］細胞接着アッセイ リーリンの会合体形成がその生理的機能に関連している
か否かを調べるために、リーリン分子間の相互作用に対
する機能阻止抗リーリン抗体、CR-50（Ogawa,M.ら, (19
95) Neuron, 14, 899-912; DelRio, J. Q.ら, (1997) N
ature, 385, 70-74; Miyata, T.ら, (1997) J. Neurosc
i., 17, 3599-3609）の効果を調べた。
か否かを調べるために、リーリン分子間の相互作用に対
する機能阻止抗リーリン抗体、CR-50（Ogawa,M.ら, (19
95) Neuron, 14, 899-912; DelRio, J. Q.ら, (1997) N
ature, 385, 70-74; Miyata, T.ら, (1997) J. Neurosc
i., 17, 3599-3609）の効果を調べた。
【００３８】全長リーリンオープンリーディングフレー
ムを含むpCrlでトランスフェクトした293T細胞、及びベ
クターpcDNA3（Invitrogen）単独でトランスフェクトし
た同細胞を、DMEM＋10％ウシ胎児血清（FCS）中で５日
間培養し、上清を回収した。前者の上清は全長リーリン
分子を含み、後者はリーリンを含まない。ニトロセルロ
ース／メタノール処理後、一晩のインキュベーションに
よって各上清でペトリ皿を被覆した。CR-50エピトープ
被覆皿の調製は、大腸菌によって産生されたCR-50エピ
トープタンパク質と共に一晩インキュベーションしてペ
トリ皿を被覆した。次いで、pCrlまたはpcDNA3でトラン
スフェクトした293T細胞を48時間培養し、回収した後
に、リーリンで予め被覆した皿、またはpcDNA3トランス
フェクト293T細胞の培養上清で予め被覆した対照皿上に
それぞれまいた。２時間のインキュベーションの後、浮
遊細胞がなくなるまで各プレートをパンニングバッファ
ー（10％v/vFCSを含有するPBS）で7-10回洗浄した。細
胞接着に対するCR-50抗体の効果を調べる場合は、イン
キュベーション開始時からこれらを培地に添加した。次
いで先に被覆した皿上に残存した細胞をコンピューター
制御カメラに連結した顕微鏡によって観察した。この実
験は５回繰り返し、また、各皿については５つの顕微鏡
の視野について計数した。
ムを含むpCrlでトランスフェクトした293T細胞、及びベ
クターpcDNA3（Invitrogen）単独でトランスフェクトし
た同細胞を、DMEM＋10％ウシ胎児血清（FCS）中で５日
間培養し、上清を回収した。前者の上清は全長リーリン
分子を含み、後者はリーリンを含まない。ニトロセルロ
ース／メタノール処理後、一晩のインキュベーションに
よって各上清でペトリ皿を被覆した。CR-50エピトープ
被覆皿の調製は、大腸菌によって産生されたCR-50エピ
トープタンパク質と共に一晩インキュベーションしてペ
トリ皿を被覆した。次いで、pCrlまたはpcDNA3でトラン
スフェクトした293T細胞を48時間培養し、回収した後
に、リーリンで予め被覆した皿、またはpcDNA3トランス
フェクト293T細胞の培養上清で予め被覆した対照皿上に
それぞれまいた。２時間のインキュベーションの後、浮
遊細胞がなくなるまで各プレートをパンニングバッファ
ー（10％v/vFCSを含有するPBS）で7-10回洗浄した。細
胞接着に対するCR-50抗体の効果を調べる場合は、イン
キュベーション開始時からこれらを培地に添加した。次
いで先に被覆した皿上に残存した細胞をコンピューター
制御カメラに連結した顕微鏡によって観察した。この実
験は５回繰り返し、また、各皿については５つの顕微鏡
の視野について計数した。
【００３９】細胞接着アッセイにおいて、CR-50抗体を
培地に添加した場合、用量依存的に接着が阻害された
（図3A-E）。CR-50抗体20、50または200μg/mlにおい
て、結合した細胞数は、それぞれ対照の56％、44％及び
32％に減少した（図３A）。細胞接着アッセイが非特異
的バックグラウンド結合の約20％を示すことを考慮する
と（図２D-G）、20、50及び200μg/mlのCR-50抗体は、
それぞれおよそ1/3、1/4及び1/10まで特異的結合を阻害
できる。細胞接着アッセイは、技術的に困難なため、一
般に高いバックグラウンド値を有することから、培地中
に分泌されるリーリンの会合体形成に対するCR-50抗体
の効果を更に検討した。この抗体と共に小脳顆粒細胞を
培養し、その上清をウエスタンブロットによって分析し
た。興味深いことに、CR-50抗体20μg/mlにおいても、
ブロードな高分子量バンドは全く検出されなかった（図
３F）。培地に免疫していないマウスの免疫グロブリンG
（IgG）を添加した場合には、リーリン複合体は正常に
形成された。従ってCR-50抗体は、20μg/mlにおいても
明らかにリーリン分子同士の結合を阻害する。CR-50抗
体はほぼこの濃度からリーリンに対する機能阻止効果を
示すため（Ogawa, M.ら,(1995) Neuron, 14, 899-91
2;）、分子間相互作用に対する阻害効果はリーリン機能
阻止活性と良く相関する。これらの結果から、CR-50エ
ピトープ領域がリーリンタンパク質の会合体形成におい
て重要な領域であり、リーリン複合体の形成が生理的機
能において重要な役割を有していると考えられる。
培地に添加した場合、用量依存的に接着が阻害された
（図3A-E）。CR-50抗体20、50または200μg/mlにおい
て、結合した細胞数は、それぞれ対照の56％、44％及び
32％に減少した（図３A）。細胞接着アッセイが非特異
的バックグラウンド結合の約20％を示すことを考慮する
と（図２D-G）、20、50及び200μg/mlのCR-50抗体は、
それぞれおよそ1/3、1/4及び1/10まで特異的結合を阻害
できる。細胞接着アッセイは、技術的に困難なため、一
般に高いバックグラウンド値を有することから、培地中
に分泌されるリーリンの会合体形成に対するCR-50抗体
の効果を更に検討した。この抗体と共に小脳顆粒細胞を
培養し、その上清をウエスタンブロットによって分析し
た。興味深いことに、CR-50抗体20μg/mlにおいても、
ブロードな高分子量バンドは全く検出されなかった（図
３F）。培地に免疫していないマウスの免疫グロブリンG
（IgG）を添加した場合には、リーリン複合体は正常に
形成された。従ってCR-50抗体は、20μg/mlにおいても
明らかにリーリン分子同士の結合を阻害する。CR-50抗
体はほぼこの濃度からリーリンに対する機能阻止効果を
示すため（Ogawa, M.ら,(1995) Neuron, 14, 899-91
2;）、分子間相互作用に対する阻害効果はリーリン機能
阻止活性と良く相関する。これらの結果から、CR-50エ
ピトープ領域がリーリンタンパク質の会合体形成におい
て重要な領域であり、リーリン複合体の形成が生理的機
能において重要な役割を有していると考えられる。
【００４０】［実施例４］ゲル濾過クロマトグラフィー CR-50エピトープの構造的及び物理的特徴を調べるため
に、分析用ゲル濾過クロマトグラフィーによってCR-50
エピトープ断片を分析し、エピトープが集まってホモポ
リマーを形成できるか否かを調べた（図５）。
に、分析用ゲル濾過クロマトグラフィーによってCR-50
エピトープ断片を分析し、エピトープが集まってホモポ
リマーを形成できるか否かを調べた（図５）。
【００４１】クロマトグラフィーは、FPLCゲル濾過クロ
マトグラフィーシステム（Pharmacia）を使用した。こ
のシステムはコンピューターFPLC指令プログラム（Phar
macia）によって制御されている。サンプルを、20ｍＭ
リン酸ナトリウム、pH7.4、0.15Ｍ NaCl、５ｍＭ DTTを
含有するバッファーで予め平衡化したSuperdex-200ゲル
濾過カラム（分離範囲：10-600kDa、Pharmacia）上にの
せ、流速0.5ｍｌ／分で溶出させた。ロードしたサンプ
ル濃度は40μＭに調製した。
マトグラフィーシステム（Pharmacia）を使用した。こ
のシステムはコンピューターFPLC指令プログラム（Phar
macia）によって制御されている。サンプルを、20ｍＭ
リン酸ナトリウム、pH7.4、0.15Ｍ NaCl、５ｍＭ DTTを
含有するバッファーで予め平衡化したSuperdex-200ゲル
濾過カラム（分離範囲：10-600kDa、Pharmacia）上にの
せ、流速0.5ｍｌ／分で溶出させた。ロードしたサンプ
ル濃度は40μＭに調製した。
【００４２】生理的条件下（0.15Ｍ NaCl、pH7.4）で、
CR-50エピトープ断片の溶出プロファイルはこのカラム
の空隙容量（Ｖ０）にポリマーのピークを示すのみであ
った（図５Ａ）。このことから、全ての断片が600kDaよ
り大きい分子量の巨大な複合体に会合していることが示
唆される。CR-50エピトープモノマーの分子量は約15kDa
であり、従ってこのポリマーは40個以上のCR-50エピト
ープ分子から構成されている。このポリマーは10ｍＭの
ジチオスレイトール（DTT）の存在下においても検出さ
れた。
CR-50エピトープ断片の溶出プロファイルはこのカラム
の空隙容量（Ｖ０）にポリマーのピークを示すのみであ
った（図５Ａ）。このことから、全ての断片が600kDaよ
り大きい分子量の巨大な複合体に会合していることが示
唆される。CR-50エピトープモノマーの分子量は約15kDa
であり、従ってこのポリマーは40個以上のCR-50エピト
ープ分子から構成されている。このポリマーは10ｍＭの
ジチオスレイトール（DTT）の存在下においても検出さ
れた。
【００４３】［実施例５］電子顕微鏡測定 電子顕微鏡を用い、CR-50エピトープポリマーの構造を
調べた。CR-50エピトープポリマーの全体像は、ロータ
リーシャドウイング法及びネガティブ染色法（Katayam
a, E., (1989) J. Biochem., 106, 751-70）を用いて観
察した。CR-50エピトープタンパク質の溶液をカーボン
被覆銅グリッド上にアプライした。ロータリーシャドウ
イング法では、次にグリッドをプラチナでロータリーシ
ャドウした。ネガティブ染色法の場合、グリッドを１％
酢酸ウラニルでネガティブ染色し、洗浄及び風乾した。
これらのサンプルを、加速電圧80ｋVで操作するJEOL 20
00EX透過型電子顕微鏡（日本電子）で調べた。電子顕微
鏡測定のためのサンプル濃度は0.2μＭに調製した。
調べた。CR-50エピトープポリマーの全体像は、ロータ
リーシャドウイング法及びネガティブ染色法（Katayam
a, E., (1989) J. Biochem., 106, 751-70）を用いて観
察した。CR-50エピトープタンパク質の溶液をカーボン
被覆銅グリッド上にアプライした。ロータリーシャドウ
イング法では、次にグリッドをプラチナでロータリーシ
ャドウした。ネガティブ染色法の場合、グリッドを１％
酢酸ウラニルでネガティブ染色し、洗浄及び風乾した。
これらのサンプルを、加速電圧80ｋVで操作するJEOL 20
00EX透過型電子顕微鏡（日本電子）で調べた。電子顕微
鏡測定のためのサンプル濃度は0.2μＭに調製した。
【００４４】電子顕微鏡写真から、10ｍＭのDTT存在に
も関わらず、長さ100-400ｎｍの多数の数珠状ポリマー
構造が明らかになった（図６D-F）。図６Dに示すポリマ
ーは、より微細なポリマーがねじれた構造を有している
ように見える。実際には、直線状の構造を有するいくら
か（全体の３％未満）のより微細なポリマーも観察され
た（図６E）。
も関わらず、長さ100-400ｎｍの多数の数珠状ポリマー
構造が明らかになった（図６D-F）。図６Dに示すポリマ
ーは、より微細なポリマーがねじれた構造を有している
ように見える。実際には、直線状の構造を有するいくら
か（全体の３％未満）のより微細なポリマーも観察され
た（図６E）。
【００４５】［実施例６］コンゴー赤測定 CR-50エピトープ溶液は、不溶性沈殿がなく、透明であ
り、大腸菌によって産生した組み換えタンパク質を使用
した場合に見られることのある不規則な凝集は観測され
ない。上記のポリマーが不規則な凝集物と異なることを
更に確かめるために、サンプルを顕微鏡バンドシフトア
ッセイによってコンゴー赤結合について試験した（Klun
k, W. E.ら, (1989) J. Histochem. Cytochem., 37, 12
73-1279;Klunk, W. E.ら, (1989) J. Histochem. Cytoc
hem., 37, 1293-1297; Klunk, W. E.ら, (1999) Anal.
Biochem., 266, 66-76）。コンゴー赤は、規則的な平行
的配置にあるβ-シート構造を有するアミロイド様原線
維に結合することが知られており、これはコンゴー赤の
吸収スペクトルにおける赤色シフトによって検出するこ
とができる（Klunk, W. E.ら, (1999) Anal. Biochem.,
266, 66-76）。コンゴー赤分析は先に報告されている
ように（Klunk, W. E.ら, (1989) J. Histochem. Cytoc
hem., 37, 1273-1279; Klunk, W. E.ら, (1989) J. His
tochem. Cytochem., 37, 1293-1297; Klunk, W. E.ら,
(1999) Anal. Biochem., 266, 66-76）実施した。20ｍ
Ｍリン酸ナトリウム及び0.15Ｍ NaClを含有する10μＭ
コンゴー赤バッファー（pH7.4）500μlにタンパク質を
添加した。反応サンプルは完全に混合し、Jusco660分光
光度計によって吸収スペクトルを記録する前に少なくと
も30分間室温でインキュベートした。
り、大腸菌によって産生した組み換えタンパク質を使用
した場合に見られることのある不規則な凝集は観測され
ない。上記のポリマーが不規則な凝集物と異なることを
更に確かめるために、サンプルを顕微鏡バンドシフトア
ッセイによってコンゴー赤結合について試験した（Klun
k, W. E.ら, (1989) J. Histochem. Cytochem., 37, 12
73-1279;Klunk, W. E.ら, (1989) J. Histochem. Cytoc
hem., 37, 1293-1297; Klunk, W. E.ら, (1999) Anal.
Biochem., 266, 66-76）。コンゴー赤は、規則的な平行
的配置にあるβ-シート構造を有するアミロイド様原線
維に結合することが知られており、これはコンゴー赤の
吸収スペクトルにおける赤色シフトによって検出するこ
とができる（Klunk, W. E.ら, (1999) Anal. Biochem.,
266, 66-76）。コンゴー赤分析は先に報告されている
ように（Klunk, W. E.ら, (1989) J. Histochem. Cytoc
hem., 37, 1273-1279; Klunk, W. E.ら, (1989) J. His
tochem. Cytochem., 37, 1293-1297; Klunk, W. E.ら,
(1999) Anal. Biochem., 266, 66-76）実施した。20ｍ
Ｍリン酸ナトリウム及び0.15Ｍ NaClを含有する10μＭ
コンゴー赤バッファー（pH7.4）500μlにタンパク質を
添加した。反応サンプルは完全に混合し、Jusco660分光
光度計によって吸収スペクトルを記録する前に少なくと
も30分間室温でインキュベートした。
【００４６】コンゴー赤溶液にCR-50エピトープポリマ
ーを添加すると、λmaxは486ｎｍ（対照：図６A(b)に示
す）から505ｎｍ（図６A(a)）となり、赤色シフトが誘
導されたが、不規則な凝集物ではこのシフトは生じな
い。ポリマー含有溶液と色素のみの溶液とでスペクトル
が最も異なる点は528ｎｍであり（図６B）、アミロイド
原線維の場合（541ｎｍ；Klunk, W. E.ら, (1999) Ana
l. Biochem., 266, 66-76）よりも短波長側であった。
従って、CR-50エピトープ断片は規則的な構造を有する
数珠状可溶性ポリマーを形成するが、これはアミロイド
原線維の構造と異なっていた。
ーを添加すると、λmaxは486ｎｍ（対照：図６A(b)に示
す）から505ｎｍ（図６A(a)）となり、赤色シフトが誘
導されたが、不規則な凝集物ではこのシフトは生じな
い。ポリマー含有溶液と色素のみの溶液とでスペクトル
が最も異なる点は528ｎｍであり（図６B）、アミロイド
原線維の場合（541ｎｍ；Klunk, W. E.ら, (1999) Ana
l. Biochem., 266, 66-76）よりも短波長側であった。
従って、CR-50エピトープ断片は規則的な構造を有する
数珠状可溶性ポリマーを形成するが、これはアミロイド
原線維の構造と異なっていた。
【００４７】［実施例７］円偏光二色性（CD）顕微鏡測定 CR-50エピトープ断片の二次構造を分析するために、円
偏光二色性（CD）分光測定を実施した。CDスペクトル
は、温度を20℃に制御するためのコンピューター制御さ
れた水浴を備えたJasco分光偏光計、モデルJ-725で測定
した。結果は平均残基楕円率［θ］として表した。CDス
ペクトルはタンパク質濃度５μＭで測定した。分光偏光
計は窒素ガスで満たし、195ｎｍから250ｎｍまで走査し
た。各スペクトルを得るために10回の測定蓄積から平均
化した。二次構造含量はellipticity値から評価した（G
reenfield, N. J. & Fasman, G. D., (1969) Biochemis
try,8, 4108-4116; Chen, Y. -H.ら, (1972) Biochemis
try, 11, 4120-4131; Brahms, S. & Brahms, J., (198
0) J. Mol. Biol., 138, 149-178; Greenfield, N. J.
(1996) Anal. Biochem. 235, 1-10）。
偏光二色性（CD）分光測定を実施した。CDスペクトル
は、温度を20℃に制御するためのコンピューター制御さ
れた水浴を備えたJasco分光偏光計、モデルJ-725で測定
した。結果は平均残基楕円率［θ］として表した。CDス
ペクトルはタンパク質濃度５μＭで測定した。分光偏光
計は窒素ガスで満たし、195ｎｍから250ｎｍまで走査し
た。各スペクトルを得るために10回の測定蓄積から平均
化した。二次構造含量はellipticity値から評価した（G
reenfield, N. J. & Fasman, G. D., (1969) Biochemis
try,8, 4108-4116; Chen, Y. -H.ら, (1972) Biochemis
try, 11, 4120-4131; Brahms, S. & Brahms, J., (198
0) J. Mol. Biol., 138, 149-178; Greenfield, N. J.
(1996) Anal. Biochem. 235, 1-10）。
【００４８】生理的条件下（0.15Ｍ NaCl、pH7.4）で、
CR-50エピトープ断片のCDスペクトルは、207ｎｍに最小
を有するブロードな負の曲線を示した（図６Cにおける
0.15Ｍ）。この結果から、CR-50エピトープ断片におけ
るα-へリックス及びβ-シートの相対比率は、それぞれ
約20％及び40％であると算定された（Greenfield, N.J.
& Fasman, G. D., (1969) Biochemistry, 8, 4108-411
6; Chen, Y. -H.ら,(1972) Biochemistry, 11, 4120-41
31; Brahms, S. & Brahms, J., (1980) J. Mol. Biol.,
138, 149-178）。
CR-50エピトープ断片のCDスペクトルは、207ｎｍに最小
を有するブロードな負の曲線を示した（図６Cにおける
0.15Ｍ）。この結果から、CR-50エピトープ断片におけ
るα-へリックス及びβ-シートの相対比率は、それぞれ
約20％及び40％であると算定された（Greenfield, N.J.
& Fasman, G. D., (1969) Biochemistry, 8, 4108-411
6; Chen, Y. -H.ら,(1972) Biochemistry, 11, 4120-41
31; Brahms, S. & Brahms, J., (1980) J. Mol. Biol.,
138, 149-178）。
【００４９】［実施例８］ポリマー形成に対するイオン強度の影響 ポリマー形成のメカニズムを調べるために、ポリマー形
成に対するイオン強度の影響を検討した。塩（NaCl）濃
度を上昇させるにつれて、ポリマーは次第にモノマーに
解離し、このポリマーが静電的相互作用によって形成さ
れていることが示された（図５A-D）。最終的に、1.0Ｍ
のNaClにおいて、全ての断片がモノマーとして存在した
（図５D）。ポリマーからモノマーへのこの転移は、塩
濃度に依存して可逆的であった。CDスペクトル分析か
ら、塩濃度が上昇した場合には負の極小値が長波長側に
シフトし、楕円率が減少することが示された（図６
C）。これらの結果は、β-シート含量が増加し、α-ヘ
リックス含量が減少することを意味する。1.0ＭのNaCl
において、ポリマーが完全にモノマーに解離した場合
（図５D）、負の極小は218ｎｍになり、ほとんど全ての
規則的構造がβ-シートであることが示される（図６
Ｃ）。これらの結果から、α-ヘリックス領域が主とし
てポリマー形成に寄与していることが示唆される。
成に対するイオン強度の影響を検討した。塩（NaCl）濃
度を上昇させるにつれて、ポリマーは次第にモノマーに
解離し、このポリマーが静電的相互作用によって形成さ
れていることが示された（図５A-D）。最終的に、1.0Ｍ
のNaClにおいて、全ての断片がモノマーとして存在した
（図５D）。ポリマーからモノマーへのこの転移は、塩
濃度に依存して可逆的であった。CDスペクトル分析か
ら、塩濃度が上昇した場合には負の極小値が長波長側に
シフトし、楕円率が減少することが示された（図６
C）。これらの結果は、β-シート含量が増加し、α-ヘ
リックス含量が減少することを意味する。1.0ＭのNaCl
において、ポリマーが完全にモノマーに解離した場合
（図５D）、負の極小は218ｎｍになり、ほとんど全ての
規則的構造がβ-シートであることが示される（図６
Ｃ）。これらの結果から、α-ヘリックス領域が主とし
てポリマー形成に寄与していることが示唆される。
【００５０】
【発明の効果】本明細書に記載したデータから、in vit
ro及びin vivoにおいて、リーリン分子が互いに集まっ
て巨大なタンパク質複合体を形成していることが示され
る。本研究（図２A）及び先に報告したように（Ogawa,
M.ら, (1995) Neuron, 14, 899-912; deBerbeyck, V.
ら, (1997) Mol. Brain Res., 50, 85-90; Miyata, T.
ら,(1997) J. Neurosci., 17, 3599-3609; Nakajima,
K.ら, (1997) Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 94, 8196-8
201）、分泌されたリーリンのいくつかは、未知のメカ
ニズムによってリーリン産生細胞の表面に結合してい
る。生細胞上のリーリンタンパク質を抗体で免疫染色す
ると、細胞膜上に多くの斑点として標識され、これはリ
ーリン会合体のマトリクスを反映している可能性があ
る。更に、培養細胞から分泌されたリーリンタンパク質
が培地中において複合体を形成していることも示され
た。従って、リーリンは細胞表面に結合しているか、細
胞外に分泌されているかに関わらず、会合していると考
えられる。リーリン受容体発現細胞が移動してリーリン
と相互作用する場合、リーリン複合体は「多価リガン
ド」として機能し、受容体の多量体化を誘導し、タンパ
ク質キナーゼによる細胞内Dab1タンパク質のリン酸化を
引き起こすかもしれない。この受容体の多量化は、胎児
の脳を抗CNRタンパク質及びCR-50抗体で二重染色した場
合、リーリンと共に位置する「斑点」として観察されて
いる可能性がある（Senzaki, K.ら, (1999) Cell,99, 6
35-647）。
ro及びin vivoにおいて、リーリン分子が互いに集まっ
て巨大なタンパク質複合体を形成していることが示され
る。本研究（図２A）及び先に報告したように（Ogawa,
M.ら, (1995) Neuron, 14, 899-912; deBerbeyck, V.
ら, (1997) Mol. Brain Res., 50, 85-90; Miyata, T.
ら,(1997) J. Neurosci., 17, 3599-3609; Nakajima,
K.ら, (1997) Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 94, 8196-8
201）、分泌されたリーリンのいくつかは、未知のメカ
ニズムによってリーリン産生細胞の表面に結合してい
る。生細胞上のリーリンタンパク質を抗体で免疫染色す
ると、細胞膜上に多くの斑点として標識され、これはリ
ーリン会合体のマトリクスを反映している可能性があ
る。更に、培養細胞から分泌されたリーリンタンパク質
が培地中において複合体を形成していることも示され
た。従って、リーリンは細胞表面に結合しているか、細
胞外に分泌されているかに関わらず、会合していると考
えられる。リーリン受容体発現細胞が移動してリーリン
と相互作用する場合、リーリン複合体は「多価リガン
ド」として機能し、受容体の多量体化を誘導し、タンパ
ク質キナーゼによる細胞内Dab1タンパク質のリン酸化を
引き起こすかもしれない。この受容体の多量化は、胎児
の脳を抗CNRタンパク質及びCR-50抗体で二重染色した場
合、リーリンと共に位置する「斑点」として観察されて
いる可能性がある（Senzaki, K.ら, (1999) Cell,99, 6
35-647）。
【００５１】リーリンタンパク質の会合体形成は、リー
リンのＮ末端近くに位置するCR-50エピトープ領域を介
して静電的相互作用によって起こると考えられる。CR-5
0抗体は固定及びエタノール処理等の種々の処理に対し
て非常に感受性が高いことから三次元構造を認識してい
ると考えられる。このエピトープ領域はリーリン機能に
必須であり、CR-50抗体は皮質の再凝集培養実験におけ
る層構造形成（Ogawa,M.ら, (1995) Neuron, 14, 899-9
12）、小脳移植片培養におけるプルキンエ細胞の配列
（Miyata, T.ら, (1997) J. Neurosci., 17, 3599-360
9）、及びin vitroでの内側嗅領−海馬経路における軸
索分岐パターン（DelRio, J. Q.ら, (1997)Nature, 38
5, 70-74）を阻害し、in vivoで海馬の発達を阻止する
（Nakajima, K.ら, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 94, 8196-8201）。
リンのＮ末端近くに位置するCR-50エピトープ領域を介
して静電的相互作用によって起こると考えられる。CR-5
0抗体は固定及びエタノール処理等の種々の処理に対し
て非常に感受性が高いことから三次元構造を認識してい
ると考えられる。このエピトープ領域はリーリン機能に
必須であり、CR-50抗体は皮質の再凝集培養実験におけ
る層構造形成（Ogawa,M.ら, (1995) Neuron, 14, 899-9
12）、小脳移植片培養におけるプルキンエ細胞の配列
（Miyata, T.ら, (1997) J. Neurosci., 17, 3599-360
9）、及びin vitroでの内側嗅領−海馬経路における軸
索分岐パターン（DelRio, J. Q.ら, (1997)Nature, 38
5, 70-74）を阻害し、in vivoで海馬の発達を阻止する
（Nakajima, K.ら, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 94, 8196-8201）。
【００５２】本明細書に記載の結果から、分泌されたリ
ーリンの会合体形成は、CR-50抗体によって、20μg/ml
においても阻害されることが示される。リーリン機能は
ほぼこの濃度からCR-50抗体によって阻害されるため、
その機能が阻止されたときにリーリンの会合体形成も阻
害されると考えられる。近年、リポタンパク質受容体
（VLDLR及びApoER2）及びCNRファミリーメンバーが全長
リーリンに結合することが報告された（D'Arcangeloら,
(1999) Neuron 24, 471-479; Hiesberger, T.ら, (199
9) Neuron, 24, 481-489; Senzaki, K.ら, (1999) Cel
l, 99, 635-647）。しかしながら、VLDLR及びApoER2
は、CR-50エピトープ領域を含むリーリンの組み換えＮ
末端部には結合せず、CNRタンパク質は、CR-50エピトー
プ領域の下流にある第１のリーリンリピートのサブリピ
ートＢに結合する（Senzaki, K.ら, (1999) Cell, 99,
635-647）。これらの結果から、これら３種全ての結合
部位は、リーリン上のCR-50エピトープ領域の外側に位
置することが示される。しかしながら、更なる分析か
ら、CR-50抗体が、VLDLR発現293T細胞（D'Arcangeloら,
(1999) Neuron 24, 471-479）及びCNR1タンパク質の細
胞外ドメイン（Senzaki, K.ら, (1999) Cell, 99, 635-
647）へのリーリンの結合を阻害することが明らかにな
った。これらの結果の解釈は、Ｎ末端へのCR-50結合に
よって、リーリン上の結合部位に構造変化または立体障
害が誘導され、受容体−リーリン相互作用が間接的に阻
害される可能性である。あるいはまた、またはその上、
リガンド（リーリン）そのものの巨大な複合体形成を妨
害することによって、CR-50抗体が受容体に結合したリ
ーリンタンパク質の数を減少させる可能性もある。リー
リンの会合体形成はCR-50抗体によって阻害されるた
め、各受容体はリーリンの巨大な複合体よりもモノマー
に結合している可能性があり、受容体−リガンド相互作
用の直接阻害と区別することは困難である。興味深いこ
とに、小脳顆粒細胞から分泌されるリーリンの会合は20
μg/mlの抗体によってさえ阻害された（図３F）。対照
的に、リポタンパク質受容体発現細胞へのリーリンの結
合は、115及び300μg/mlのCR-50抗体によってそれぞれ3
6％及び16％まで減少した（D'Arcangeloら, (1999) Neu
ron 24, 471-479）。本明細書に記載した全長リーリン
を用いた細胞接着アッセイは、この抗体による実質的に
同程度の阻害を示した（図３E：50及び200μg/mlのCR-5
0抗体で44％及び32％まで減少）。培養細胞を用いた細
胞接着アッセイでは一般にバックグラウンドが高いこと
を考慮すると（図２D-G、４B、C）、これらのデータか
ら、CR-50抗体が、リーリンタンパク質そのものの会合
体形成を阻害することによって、（少なくとも一部は）
リーリン機能を中和している可能性が示唆される。従っ
て、受容体に対するリーリンモノマーの結合がニューロ
ン移動を制御する適切なシグナル伝達を開始することが
できるか否かを明らかにすることが重要である。
ーリンの会合体形成は、CR-50抗体によって、20μg/ml
においても阻害されることが示される。リーリン機能は
ほぼこの濃度からCR-50抗体によって阻害されるため、
その機能が阻止されたときにリーリンの会合体形成も阻
害されると考えられる。近年、リポタンパク質受容体
（VLDLR及びApoER2）及びCNRファミリーメンバーが全長
リーリンに結合することが報告された（D'Arcangeloら,
(1999) Neuron 24, 471-479; Hiesberger, T.ら, (199
9) Neuron, 24, 481-489; Senzaki, K.ら, (1999) Cel
l, 99, 635-647）。しかしながら、VLDLR及びApoER2
は、CR-50エピトープ領域を含むリーリンの組み換えＮ
末端部には結合せず、CNRタンパク質は、CR-50エピトー
プ領域の下流にある第１のリーリンリピートのサブリピ
ートＢに結合する（Senzaki, K.ら, (1999) Cell, 99,
635-647）。これらの結果から、これら３種全ての結合
部位は、リーリン上のCR-50エピトープ領域の外側に位
置することが示される。しかしながら、更なる分析か
ら、CR-50抗体が、VLDLR発現293T細胞（D'Arcangeloら,
(1999) Neuron 24, 471-479）及びCNR1タンパク質の細
胞外ドメイン（Senzaki, K.ら, (1999) Cell, 99, 635-
647）へのリーリンの結合を阻害することが明らかにな
った。これらの結果の解釈は、Ｎ末端へのCR-50結合に
よって、リーリン上の結合部位に構造変化または立体障
害が誘導され、受容体−リーリン相互作用が間接的に阻
害される可能性である。あるいはまた、またはその上、
リガンド（リーリン）そのものの巨大な複合体形成を妨
害することによって、CR-50抗体が受容体に結合したリ
ーリンタンパク質の数を減少させる可能性もある。リー
リンの会合体形成はCR-50抗体によって阻害されるた
め、各受容体はリーリンの巨大な複合体よりもモノマー
に結合している可能性があり、受容体−リガンド相互作
用の直接阻害と区別することは困難である。興味深いこ
とに、小脳顆粒細胞から分泌されるリーリンの会合は20
μg/mlの抗体によってさえ阻害された（図３F）。対照
的に、リポタンパク質受容体発現細胞へのリーリンの結
合は、115及び300μg/mlのCR-50抗体によってそれぞれ3
6％及び16％まで減少した（D'Arcangeloら, (1999) Neu
ron 24, 471-479）。本明細書に記載した全長リーリン
を用いた細胞接着アッセイは、この抗体による実質的に
同程度の阻害を示した（図３E：50及び200μg/mlのCR-5
0抗体で44％及び32％まで減少）。培養細胞を用いた細
胞接着アッセイでは一般にバックグラウンドが高いこと
を考慮すると（図２D-G、４B、C）、これらのデータか
ら、CR-50抗体が、リーリンタンパク質そのものの会合
体形成を阻害することによって、（少なくとも一部は）
リーリン機能を中和している可能性が示唆される。従っ
て、受容体に対するリーリンモノマーの結合がニューロ
ン移動を制御する適切なシグナル伝達を開始することが
できるか否かを明らかにすることが重要である。
【００５３】精製したCR-50エピトープ断片は速やかに
会合して規則的な反復構造を有する可溶性のホモポリマ
ーを形成する。このポリマーはα−ヘリックス＋β−シ
ート構造を有し、この内α−ヘリックス領域が主として
ポリマー形成に寄与している。Chou ＆ Fasman法（Cho
u, P. Y. & Fasman, G. D. (1978) Adv. Enzymol., 47,
45-148）による二次構造予測から、エピトープがＣ末
端に長いα−ヘリックスドメインを有し、中央部に短い
α−ヘリックスドメインを有することが示唆された。実
際、これらの部位は多くの（約30％）荷電したアミノ酸
を含み、これがポリマー形成に関係していると考えられ
る。これら２つのドメインはヒンジとして機能してモノ
マーを会合させ、数珠状のひも様構造のポリマーを形成
する可能性がある。ｐＨ変化による実験から、CR-50エ
ピトープ断片が生理的条件下においてのみ元のα−ヘリ
ックス＋β−シート構造をとることが示された（データ
は示さない）。本発明者等はまた、CR-50エピトープ断
片間の静電的相互作用がCR-50エピトープの表面電荷密
度に依存することを見出した。
会合して規則的な反復構造を有する可溶性のホモポリマ
ーを形成する。このポリマーはα−ヘリックス＋β−シ
ート構造を有し、この内α−ヘリックス領域が主として
ポリマー形成に寄与している。Chou ＆ Fasman法（Cho
u, P. Y. & Fasman, G. D. (1978) Adv. Enzymol., 47,
45-148）による二次構造予測から、エピトープがＣ末
端に長いα−ヘリックスドメインを有し、中央部に短い
α−ヘリックスドメインを有することが示唆された。実
際、これらの部位は多くの（約30％）荷電したアミノ酸
を含み、これがポリマー形成に関係していると考えられ
る。これら２つのドメインはヒンジとして機能してモノ
マーを会合させ、数珠状のひも様構造のポリマーを形成
する可能性がある。ｐＨ変化による実験から、CR-50エ
ピトープ断片が生理的条件下においてのみ元のα−ヘリ
ックス＋β−シート構造をとることが示された（データ
は示さない）。本発明者等はまた、CR-50エピトープ断
片間の静電的相互作用がCR-50エピトープの表面電荷密
度に依存することを見出した。
【００５４】ゲル濾過分析における興味深い知見は、生
理的条件下においては巨大なポリマーのピークのみがあ
り、モノマーのピークがないことであった（図５A）。
しかしながら、全長リーリンのウエスタンブロットか
ら、モノマーからネイティブなゲルの上端まで広がるブ
ロードなバンドが示され（図１B-D）、構成モノマー数
の異なる種々のポリマーがあることが示される。CR-50
エピトープ領域そのものは速やかに会合し、次いでそれ
が全長ポリマー形成の駆動力となることが示唆される。
全長分子の場合、立体障害または他の何らかのメカニズ
ムによって、種々の重合段階に留められるのであろう。
理的条件下においては巨大なポリマーのピークのみがあ
り、モノマーのピークがないことであった（図５A）。
しかしながら、全長リーリンのウエスタンブロットか
ら、モノマーからネイティブなゲルの上端まで広がるブ
ロードなバンドが示され（図１B-D）、構成モノマー数
の異なる種々のポリマーがあることが示される。CR-50
エピトープ領域そのものは速やかに会合し、次いでそれ
が全長ポリマー形成の駆動力となることが示唆される。
全長分子の場合、立体障害または他の何らかのメカニズ
ムによって、種々の重合段階に留められるのであろう。
【００５５】本発明によって、脊椎動物の発達中の脳に
おけるリーリンタンパク質の会合体形成が、この相互作
用を明らかに阻害する機能阻害抗体、CR-50に対するエ
ピトープ領域によって仲介されることが初めて明らかに
なった。生体において、リーリンが大きな複合体として
機能し、神経発達過程におけるニューロンの移動を制御
していることが示唆されるが、この複合体形成の状態を
本発明のポリペプチドを用いて検討することが可能であ
る。
おけるリーリンタンパク質の会合体形成が、この相互作
用を明らかに阻害する機能阻害抗体、CR-50に対するエ
ピトープ領域によって仲介されることが初めて明らかに
なった。生体において、リーリンが大きな複合体として
機能し、神経発達過程におけるニューロンの移動を制御
していることが示唆されるが、この複合体形成の状態を
本発明のポリペプチドを用いて検討することが可能であ
る。
【００５６】更に、本発明は、上記のような生体内にお
けるリーリンタンパク質の機能の解明と共に、本発明の
ポリペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチド
を用いて、リーリンタンパク質の会合を促進し、リーリ
ン遺伝子の異常並びにニューロンの配置異常に起因する
脳の障害及び疾患、例えば滑脳症、多小脳回症、異所性
灰白質等の疾患の適切な診断及び治療に利用することが
できる。本発明のポリペプチドは、F-spondinドメイン
及びリピート部位を含まないので、分子が小さく、必要
とする複合体形成の目的のためにのみ使用することがで
き、添加効果が大きいことが特徴であり、特に以下のよ
うな利点を有する。
けるリーリンタンパク質の機能の解明と共に、本発明の
ポリペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチド
を用いて、リーリンタンパク質の会合を促進し、リーリ
ン遺伝子の異常並びにニューロンの配置異常に起因する
脳の障害及び疾患、例えば滑脳症、多小脳回症、異所性
灰白質等の疾患の適切な診断及び治療に利用することが
できる。本発明のポリペプチドは、F-spondinドメイン
及びリピート部位を含まないので、分子が小さく、必要
とする複合体形成の目的のためにのみ使用することがで
き、添加効果が大きいことが特徴であり、特に以下のよ
うな利点を有する。
【００５７】まず、疾患の治療の目的のため、患者であ
る個体に投与する場合、その投与方法に関わらず、本来
その個体に欠損している物質を体外から人工的に投与す
るので、その個体に外来物質が導入されることになる。
この外来物質の投与は、目的とする主作用のみならず、
副作用をも引き起こすことが考えられる。治療に有効
な、必要不可欠の最小限のポリペプチドとしてエピトー
プ領域を特定できたことにより、エピトープ領域のみの
ポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドという形で投
与する場合、本来治療に不必要な部分を含まないので、
外来物質誘導性の副作用を最小限に抑制することができ
る。また、治療に必要な最小限の領域であるエピトープ
領域だけに限定すれば、それをコードするポリヌクレオ
チド及びポリペプチドそのものを作製するコストを最小
限に抑えることができる。
る個体に投与する場合、その投与方法に関わらず、本来
その個体に欠損している物質を体外から人工的に投与す
るので、その個体に外来物質が導入されることになる。
この外来物質の投与は、目的とする主作用のみならず、
副作用をも引き起こすことが考えられる。治療に有効
な、必要不可欠の最小限のポリペプチドとしてエピトー
プ領域を特定できたことにより、エピトープ領域のみの
ポリヌクレオチド、あるいはポリペプチドという形で投
与する場合、本来治療に不必要な部分を含まないので、
外来物質誘導性の副作用を最小限に抑制することができ
る。また、治療に必要な最小限の領域であるエピトープ
領域だけに限定すれば、それをコードするポリヌクレオ
チド及びポリペプチドそのものを作製するコストを最小
限に抑えることができる。
【００５８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Reelin protein CR-50 epitope region <130> RJH12-008N <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gag cag tgt ggc acc atc atg cat ggc aat gct gtc acc ttc tgt gag 48 Glu Gln Cys Gly Thr Ile Met His Gly Asn Ala Val Thr Phe Cys Glu 1 5 10 15 ccg tac ggc cct cga gag ctg acc acc aca tgc ctg aac aca aca aca 96 Pro Tyr Gly Pro Arg Glu Leu Thr Thr Thr Cys Leu Asn Thr Thr Thr 20 25 30 gca tct gtc ctc cag ttt tcc att ggg tca gga tca tgt cga ttt agt 144 Ala Ser Val Leu Gln Phe Ser Ile Gly Ser Gly Ser Cys Arg Phe Ser 35 40 45 tac tct gac ccc agc atc act gtg tca tac gcc aag aac aat acc gct 192 Tyr Ser Asp Pro Ser Ile Thr Val Ser Tyr Ala Lys Asn Asn Thr Ala 50 55 60 gat tgg att cag ctg gag aaa att aga gcc cct tcc aat gtg agc aca 240 Asp Trp Ile Gln Leu Glu Lys Ile Arg Ala Pro Ser Asn Val Ser Thr 65 70 75 80 gtc atc cac atc ctg tac ctc ccc gag gaa gcc aaa ggg gag agc gtg 288 Val Ile His Ile Leu Tyr Leu Pro Glu Glu Ala Lys Gly Glu Ser Val 85 90 95 cag ttc cag tgg aaa cag gac agc ctg cga gtg ggt gag gtg tat gag 336 Gln Phe Gln Trp Lys Gln Asp Ser Leu Arg Val Gly Glu Val Tyr Glu 100 105 110 gcc tgc tgg gcc ctg 351 Ala Cys Trp Ala Leu 115 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Gln Cys Gly Thr Ile Met His Gly Asn Ala Val Thr Phe Cys Glu 1 5 10 15 Pro Tyr Gly Pro Arg Glu Leu Thr Thr Thr Cys Leu Asn Thr Thr Thr 20 25 30 Ala Ser Val Leu Gln Phe Ser Ile Gly Ser Gly Ser Cys Arg Phe Ser 35 40 45 Tyr Ser Asp Pro Ser Ile Thr Val Ser Tyr Ala Lys Asn Asn Thr Ala 50 55 60 Asp Trp Ile Gln Leu Glu Lys Ile Arg Ala Pro Ser Asn Val Ser Thr 65 70 75 80 Val Ile His Ile Leu Tyr Leu Pro Glu Glu Ala Lys Gly Glu Ser Val 85 90 95 Gln Phe Gln Trp Lys Gln Asp Ser Leu Arg Val Gly Glu Val Tyr Glu 100 105 110 Ala Cys Trp Ala Leu 115 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer for PCR <400> 3 atggagcgcg gctgctgggc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer for PCR <400> 4 aggaacaaca ggaacacag 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer for PCR <400> 5 cctctctcca tctttgagga ac 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer for PCR <400> 6 cagggcccag caggcctcat ac 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer for PCR <400> 7 ctctcccatc tcacagttgc tg 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer for PCR <400> 8 gtaagcagtg gcctctgtgg g 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer for PCR <400> 9 tactcgcacc ttgctgaaat ac 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer for PCR <400> 10 gagcagtgtg gcaccatcat g 21 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer for PCR <400> 11 gagcagtgtg gcaccatc 18
【００５９】
配列番号３：PCRのための合成プライマー 配列番号４：PCRのための合成プライマー 配列番号５：PCRのための合成プライマー 配列番号６：PCRのための合成プライマー 配列番号７：PCRのための合成プライマー 配列番号８：PCRのための合成プライマー 配列番号９：PCRのための合成プライマー 配列番号１０：PCRのための合成プライマー 配列番号１１：PCRのための合成プライマー
【図１】天然のリーリン分子が共に会合していることを
示す。 （Ａ）リーリンの一次構造の模式図を示す。CR-50抗体
はリーリンリピートの上流を認識する。 （Ｂ-Ｄ）抗リーリン抗体による免疫ブロットを示す。
（Ｂ）リーラーヘテロ接合体（rl/＋）及びホモ接合体
（rl/rl）大脳（E18）のホモジネートでSDS-PAGEを実施
した。（Ｃ）リーラーヘテロ接合体及びホモ接合体の大
脳（E18）及び小脳（P5）のホモジネートをネイティブP
AGEによって分離した。（Ｄ）リーラーへテロ接合体及
びホモ接合体（P5）の小脳初代培養の上清をネイティブ
PAGEゲル上にのせた。
示す。 （Ａ）リーリンの一次構造の模式図を示す。CR-50抗体
はリーリンリピートの上流を認識する。 （Ｂ-Ｄ）抗リーリン抗体による免疫ブロットを示す。
（Ｂ）リーラーヘテロ接合体（rl/＋）及びホモ接合体
（rl/rl）大脳（E18）のホモジネートでSDS-PAGEを実施
した。（Ｃ）リーラーヘテロ接合体及びホモ接合体の大
脳（E18）及び小脳（P5）のホモジネートをネイティブP
AGEによって分離した。（Ｄ）リーラーへテロ接合体及
びホモ接合体（P5）の小脳初代培養の上清をネイティブ
PAGEゲル上にのせた。
【図２】細胞接着アッセイから、リーリン分子が互いに
結合することが示される。（Ａ、Ｂ）リーリンをトラン
スフェクトした293T細胞のCR-50抗体による免疫染色を
示す。CR-50を生細胞に添加した場合、細胞表面上に斑
点状の染色が観察され（Ａ）、一方固定及び膜を透過性
にした後にCR-50を添加した場合、細胞質が全体的に染
色された（Ｂ）。（Ｃ−Ｆ）細胞接着アッセイを示す。
（Ｃ）リーリン被覆皿上のリーリン提示細胞。（Ｄ）対
照被覆皿上のリーリン提示細胞。（Ｅ）リーリン被覆皿
上の対照細胞。（Ｆ）対照被覆皿上の対照細胞。（Ｇ）
（Ｆ）を100とスコアして標準化させた細胞数を示すヒ
ストグラムを示す。数値は５回の独立した実験の平均値
±標準偏差（S.D.）である。
結合することが示される。（Ａ、Ｂ）リーリンをトラン
スフェクトした293T細胞のCR-50抗体による免疫染色を
示す。CR-50を生細胞に添加した場合、細胞表面上に斑
点状の染色が観察され（Ａ）、一方固定及び膜を透過性
にした後にCR-50を添加した場合、細胞質が全体的に染
色された（Ｂ）。（Ｃ−Ｆ）細胞接着アッセイを示す。
（Ｃ）リーリン被覆皿上のリーリン提示細胞。（Ｄ）対
照被覆皿上のリーリン提示細胞。（Ｅ）リーリン被覆皿
上の対照細胞。（Ｆ）対照被覆皿上の対照細胞。（Ｇ）
（Ｆ）を100とスコアして標準化させた細胞数を示すヒ
ストグラムを示す。数値は５回の独立した実験の平均値
±標準偏差（S.D.）である。
【図３】CR-50抗体によるリーリン分子間の相互作用の
阻害を示す。 （Ａ-Ｅ）CR-50抗体による細胞接着の阻害を示す。
（Ａ）リーリン被覆皿上のリーリン提示細胞。（Ｂ-
Ｄ）20、50及び200μg/mlのCR-50抗体と共にそれぞれイ
ンキュベーションした後のリーリン被覆皿上のリーリン
提示細胞。（Ｅ）（Ａ）に標準化した（Ａ-Ｄ）それぞ
れの細胞数を示すヒストグラム。数値は５回の独立した
実験の平均値±標準偏差（S.D.）である。（Ｆ）CR-50
抗体によるリーリン会合の阻害を示す。リーラーヘテロ
接合体小脳（P5）細胞をマウスIgGなし（−）、非免疫
化マウスIgG、またはCR-50抗体の存在下培養した。これ
らの培養の上清をネイティブPAGEで分離し、抗リーリン
で検出した。
阻害を示す。 （Ａ-Ｅ）CR-50抗体による細胞接着の阻害を示す。
（Ａ）リーリン被覆皿上のリーリン提示細胞。（Ｂ-
Ｄ）20、50及び200μg/mlのCR-50抗体と共にそれぞれイ
ンキュベーションした後のリーリン被覆皿上のリーリン
提示細胞。（Ｅ）（Ａ）に標準化した（Ａ-Ｄ）それぞ
れの細胞数を示すヒストグラム。数値は５回の独立した
実験の平均値±標準偏差（S.D.）である。（Ｆ）CR-50
抗体によるリーリン会合の阻害を示す。リーラーヘテロ
接合体小脳（P5）細胞をマウスIgGなし（−）、非免疫
化マウスIgG、またはCR-50抗体の存在下培養した。これ
らの培養の上清をネイティブPAGEで分離し、抗リーリン
で検出した。
【図４】リーリンは細胞接着アッセイにおいてCR-50エ
ピトープ領域に結合する。（Ａ）CR-50エピトープ被覆
皿（200μg/ml）上のリーリン提示細胞。（Ｂ）対照被
覆皿上のリーリン提示細胞。（Ｃ）対照に標準化したCR
-50エピトープ被覆皿（200または50μg/ml）上の接着ア
ッセイにおける細胞数を示すヒストグラム。
ピトープ領域に結合する。（Ａ）CR-50エピトープ被覆
皿（200μg/ml）上のリーリン提示細胞。（Ｂ）対照被
覆皿上のリーリン提示細胞。（Ｃ）対照に標準化したCR
-50エピトープ被覆皿（200または50μg/ml）上の接着ア
ッセイにおける細胞数を示すヒストグラム。
【図５】CR-50エピトープ断片のホモポリマー形成を示
す。（Ａ）CR-50エピトープ断片が0.15Ｍ NaClにおいて
600kDa以上の分子量を有するホモポリマーを形成するこ
とを示すゲル濾過クロマトグラフィーの溶出プロファイ
ル。（Ｂ）−（Ｄ）ポリマーが高イオン強度において解
離することを示す（Ｂ：0.5Ｍ NaCl；Ｃ：0.75ＭNaCl；
Ｄ：1.0Ｍ NaCl）。ポリマーのピークは溶出時間7.7分
にあり、モノマーのピークは15.2分にある。Ｖ0はカラ
ムの空隙容量を示す。
す。（Ａ）CR-50エピトープ断片が0.15Ｍ NaClにおいて
600kDa以上の分子量を有するホモポリマーを形成するこ
とを示すゲル濾過クロマトグラフィーの溶出プロファイ
ル。（Ｂ）−（Ｄ）ポリマーが高イオン強度において解
離することを示す（Ｂ：0.5Ｍ NaCl；Ｃ：0.75ＭNaCl；
Ｄ：1.0Ｍ NaCl）。ポリマーのピークは溶出時間7.7分
にあり、モノマーのピークは15.2分にある。Ｖ0はカラ
ムの空隙容量を示す。
【図６】CR-50エピトープポリマーの構造解析を示す図
である。（Ａ）（ａ）コンゴー赤及びCR-50エピトープ
ポリマー、及び（ｂ）コンゴー赤単独での吸収スペクト
ルを観察した。CR-50エピトープポリマーを添加した場
合にλmaxの赤色シフトが生じる。（Ｂ）CR-50エピトー
プポリマーを含有する色素溶液及び色素のみの溶液間の
スペクトルの差異を検出した。（Ｃ）種々のNaCl濃度に
おけるCR-50エピトープ断片のCDスペクトルを観察し
た。（Ｄ-Ｆ）ロータリーシャドウイング法（Ｄ、Ｅ）
及びネガティブ染色法（Ｆ）によるCR-50エピトープポ
リマーの電子顕微鏡写真（棒＝100nm）。
である。（Ａ）（ａ）コンゴー赤及びCR-50エピトープ
ポリマー、及び（ｂ）コンゴー赤単独での吸収スペクト
ルを観察した。CR-50エピトープポリマーを添加した場
合にλmaxの赤色シフトが生じる。（Ｂ）CR-50エピトー
プポリマーを含有する色素溶液及び色素のみの溶液間の
スペクトルの差異を検出した。（Ｃ）種々のNaCl濃度に
おけるCR-50エピトープ断片のCDスペクトルを観察し
た。（Ｄ-Ｆ）ロータリーシャドウイング法（Ｄ、Ｅ）
及びネガティブ染色法（Ｆ）によるCR-50エピトープポ
リマーの電子顕微鏡写真（棒＝100nm）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB07 FB12 GC15 4B024 AA01 AA11 CA04 CA07 CA12 DA03 DA06 DA20 EA04 GA11 GA30 HA03 4B064 AG01 CA02 CA10 CA19 CC01 CC24 CE02 CE03 CE12 DA01 DA13 4B065 AA26X AA91Y AA93X AB01 AC14 AC16 BA02 BD50 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA23 CA53 DC50 NA14 ZA012 4C086 AA01 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 EA20 EA50 FA74 GA01 GA15 GA26
Claims (11)
- 【請求項１】 リーリンタンパク質のCR-50抗体認識部
位を含み、F-spondinドメイン及びリピート部位を含ま
ないリーリンタンパク質CR-50エピトープ領域ポリペプ
チド。 - 【請求項２】 マウスに由来する請求項１に記載のリー
リンタンパク質CR-50エピトープ領域ポリペプチド。 - 【請求項３】 以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかで
あるポリペプチド。 （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプ
チド （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１個若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつCR-50抗体と結合し得るポ
リペプチド - 【請求項４】 請求項１から３のいずれか１項に記載の
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかであ
るポリヌクレオチド。 （ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリ
ヌクレオチド （ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列において、１
個または数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加
されたヌクレオチド配列からなり、かつCR-50抗体と結
合し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの配列と
縮重関係にあるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオ
チド - 【請求項６】 請求項４または５に記載のポリヌクレオ
チドを含有する発現ベクター。 - 【請求項７】 請求項６に記載の発現ベクターでトラン
スフェクトされた宿主細胞。 - 【請求項８】 請求項７に記載の宿主細胞を培養するこ
とを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリ
ペプチドの製造方法。 - 【請求項９】 請求項１から３のいずれか１項に記載の
ポリペプチド、または請求項４若しくは５に記載のポリ
ヌクレオチドを添加することを含む、リーリンタンパク
質の会合体形成を促進する方法。 - 【請求項１０】 請求項１から３のいずれか１項に記載
のポリペプチド、または請求項４若しくは５に記載のポ
リヌクレオチドを含む、リーリンタンパク質の会合体形
成を促進する組成物。 - 【請求項１１】 請求項１から３のいずれか１項に記載
のポリペプチド、または請求項４若しくは５に記載のポ
リヌクレオチドを含む、神経細胞の配置異常による疾患
の診断及び／または治療のための医薬組成物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000202801A JP2002017361A (ja) | 2000-07-04 | 2000-07-04 | リーリンタンパク質ｃｒ−５０エピトープ領域 |
| US09/897,438 US20020137095A1 (en) | 2000-07-04 | 2001-07-03 | Reelin protein CR-50 epitope region |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000202801A JP2002017361A (ja) | 2000-07-04 | 2000-07-04 | リーリンタンパク質ｃｒ−５０エピトープ領域 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002017361A true JP2002017361A (ja) | 2002-01-22 |
Family
ID=18700273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000202801A Pending JP2002017361A (ja) | 2000-07-04 | 2000-07-04 | リーリンタンパク質ｃｒ−５０エピトープ領域 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP2002017361A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005083077A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | アミノ酸の製造法 |
| JP2010536357A (ja) * | 2007-08-20 | 2010-12-02 | ユニヴァルシテ リブレ デ ブリュッセル | 多能性幹細胞からのニューロン細胞の生成 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030165485A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-09-04 | Goran Bertilsson | Functional role and potential therapeutic use of Reelin, Gas6 and Protein S in relation to adult neural stem or progenitor cells |
| US20080070237A1 (en) * | 2003-08-11 | 2008-03-20 | Brunskill Eric W | Npas3 Mutant Mice and Uses for Screening and Testing Therapies for Schizophrenia and Related Neurological Disorders |
| CN102639700A (zh) | 2009-09-30 | 2012-08-15 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 通过调节自噬增强基因产物调节自噬的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
-
2000
- 2000-07-04 JP JP2000202801A patent/JP2002017361A/ja active Pending
-
2001
- 2001-07-03 US US09/897,438 patent/US20020137095A1/en not_active Abandoned
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005083077A1 (ja) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | アミノ酸の製造法 |
| JP2010536357A (ja) * | 2007-08-20 | 2010-12-02 | ユニヴァルシテ リブレ デ ブリュッセル | 多能性幹細胞からのニューロン細胞の生成 |
| US8633025B2 (en) | 2007-08-20 | 2014-01-21 | Universite Libre De Bruxelles | Generation of neuronal cells from embryonic stem cells |
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|---|---|
| US20020137095A1 (en) | 2002-09-26 |
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