WO2005083077A1 - アミノ酸の製造法 - Google Patents

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WO2005083077A1
WO2005083077A1 PCT/JP2005/003694 JP2005003694W WO2005083077A1 WO 2005083077 A1 WO2005083077 A1 WO 2005083077A1 JP 2005003694 W JP2005003694 W JP 2005003694W WO 2005083077 A1 WO2005083077 A1 WO 2005083077A1
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energy
nadh dehydrogenase
microorganism
corynebacterium
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PCT/JP2005/003694
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Shin-Ichi Hashimoto
Kouichi Terazono
Akinori Yasuhara
Kazunobu Matsushita
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an amino acid.
  • amino acid productivity can be improved by amplifying DNA that encodes energy-producing NADH dehydrogenase in Escherichia coli or deleting DNA that encodes non-energy-producing NADH dehydrogenase. It has been reported (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-17363).
  • An object of the present invention is to provide an industrially advantageous method for producing an amino acid.
  • the present invention relates to the following (1) to (26).
  • a microorganism obtained by introducing DNA encoding an energy non-producing NADH dehydrogenase is cultured in a medium, amino acids are produced and accumulated in the culture, and the amino acids are collected from the culture.
  • a method for producing an amino acid is provided.
  • DNA encoding non-energy-producing NADH dehydrogenase is a genus of Corynebacterium, Escherichia, Pseudomonas, Azotobacter, or Salmonella.
  • DNA encoding non-energy-producing NADH dehydrogenase includes Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum), Corynebacterium, Corynebacterium diphtheriae, and Escherichia coli.
  • DNA encoding a non-energy-producing NADH dehydrogenase has a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 3, 5, 5, 7, 9, 11, 13 and 15. Or the DNA which hybridizes with DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence under stringent conditions.
  • Non-energy-producing NADH dehydrogenase DNA encoding the non-energy-producing NADH dehydrogenase of plasmid pCS-CGndh carried by Escherichia coli DH5a / pCS-CGndh (FERM BP-08633). Encodes a polypeptide that hybridizes under stringent conditions to DNA that encodes DNA or a DNA that has a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA, and that has a non-energy-producing NADH dehydrogenase activity
  • a non-energy-producing NADH dehydrogenase a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 16;
  • the polypeptide has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and is a non-energy producing polypeptide having NADH dehydrogenase activity.
  • the non-energy-producing NADH dehydrogenase is encoded by the DNA encoding the energy-non-producing NADH dehydrogenase of the plasmid pCS-CGi ⁇ dh carried by Escherichia coli DH5a / pCS-CGndh (FERM BP-08633).
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and having an energy non-producing NADH dehydrogenase activity. Characterized in that it is a peptide
  • the microorganism into which the DNA encoding the non-energy-producing NADH dehydrogenase is introduced is a genus of Escherichia or Corynebacterium.
  • Microorganisms that introduce DNA that encodes non-energy-producing NAM dehydrogenase include Corynebacterium dal mimicum (Corynebacterium, glutamicum), Corynebacterium cortebacterium (Corynebacterium fla glue), and Corynebacterium lactolacte.
  • the microorganism into which DNA encoding non-energy-producing NADH dehydrogenase is introduced is a microorganism belonging to Corynepterium daltamicum,
  • the amino acid is L-glutamic acid, L-glutamine, L-aspartic acid, L-asparagine, L-lysine, L-methionine, L-threonine, L-arginine, L-proline, L-citrulline, L-valine
  • An amino acid selected from the group consisting of L-leucine, L-iso mouth isin, L-serine, L-cystine, glycine, L-triphan, L-tyrosine, L-phenylalanine and L-histidine Any one of the above (1) to (13).
  • amino acid is an amino acid selected from the group consisting of L-glutamic acid, L-glutamine and L-lysine.
  • a microorganism belonging to Corynebacterium obtained by introducing DNA encoding non-energy-producing NADH dehydrogenase.
  • a microorganism belonging to Corynebacterium glutamicum obtained by introducing DNA encoding non-energy-producing NADH dehydrogenase.
  • DNA encoding non-energy-producing NADH dehydrogenase is selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, Escherichia, Pseudomonas, Azotobacter, Salmonella, and Lactobacillus. (16) or DNA which hybridizes under stringent-end conditions with DNA derived from a microorganism to be obtained, or DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA.
  • DNAs encoding non-energy-producing NADH dehydrogenase are corynebacterium daltamicum, corynebacterium diphtheria, escherichia coli, schizodomonas fluorescens, azotopobacter vinelandii, salmonella typhim Hybridizes with DNA derived from a microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to L. and Lactobacillus plantarum, or DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA under stringent conditions.
  • DNA encoding non-energy-producing NADH dehydrogenase has a base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, and 15
  • DNA encoding non-energy-producing NADH dehydrogenase is a non-energy-producing NADH dehydrogenase contained in plasmid pCS-CGndh carried by Escherichia coli' coli DH5a / pCS-CGnd FERM BP-08633).
  • a non-energy-producing NADH dehydrogenase a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 16; Or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and having an energy non-producing NADH dehydrogenase activity. 16) or (17) microorganisms.
  • Non-energy-producing NADH dehydrogenase is produced by DNA encoding energy-non-producing NADH dehydrogenase contained in plasmid pCS-CGndh carried by Escherichia coli DH5o; / pCS-CGndh (FERM BP-08633).
  • a polypeptide comprising an encoded polypeptide or an amino acid sequence in which at least one amino acid is deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and having an energy non-producing NADH dehydrogenase activity. Characterized by being a peptide
  • microorganism according to (16) or (17).
  • the non-energy-producing NADH dehydrogenase (hereinafter also referred to as NDH polypeptide) used in the present invention is one of the NADH dehydrogenase complexes that act as a proton pump in the electron transport system of aerobic bacteria.
  • a polypeptide having the activity of NADH dehydrogenase (hereinafter, abbreviated as "energy non-producing NADH dehydrogenase" activity) that constitutes a NADH dehydrogenase complex that can eliminate zero number of proton molecules per molecule Any polypeptide may be used.
  • NDH polypeptides examples include Corynebacterium
  • Genus (Corynebacterium), genus Escherichia, genus Pseudomonas, genus Azotobacter, Salmonella
  • NDH polypeptides derived from microorganisms belonging to the genus (Salmonella) or the genus Lactobacillus can be mentioned.
  • Corynebacterium includes Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glut ami cum), Corynebacterium diphtheria
  • microorganism belonging to the genus Escherichia examples include microorganisms belonging to the genus Escherichia coH.
  • microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include microorganisms belonging to Pseudomonas fluorescens.
  • microorganism belonging to the genus Azotobacter examples include microorganisms belonging to the genus Azotobacter vinelandii.
  • the microorganisms belonging to the genus Salmonella include Salmonella, Tiffimulus
  • Lactobacillus (Salmonella typhi murium). Microorganisms belonging to the genus Lactobacillus include Lactobacillus plantarum
  • NDH polypeptides derived from these microorganisms include, for example, polypeptides having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 6 derived from microorganisms belonging to the genus Corynepterium, SEQ ID NO: derived from microorganisms belonging to the genus Escherichia A polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 derived from a microorganism belonging to the genus Pseudomonas, a polypeptide having a amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 derived from a microorganism belonging to the genus Azotobacter A polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 derived from a microorganism belonging to the genus Salmonella; a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 derived from a microorganism belonging to the genus Lactobacill
  • NDH polypeptide A DNA encoding a non-energy-producing NADH dehydrogenase derived from Corynebacterium dartamicum, which is contained in the plasmid pCS-CGndh possessed by Escherichia coli DH5 // pCS-CGndh (FERM BP-08633).
  • the polypeptide encoded by ndh) (hereinafter abbreviated as NDH polypeptide A) can also be mentioned as the NDH polypeptide.
  • the NDH polypeptide used in the present invention has a non-energy-producing NADH dehydrogenase activity
  • the NDH polypeptide A or the known amino acid sequence of the known NDH polypeptide may have one amino acid sequence.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which the above amino acids have been deleted, substituted or added may be used.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added to the amino acid sequence of NDH polypeptide A or a known NDH polypeptide is obtained from Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition. tion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning Third Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter, Current Protocols in 'Molecular' biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research Natl. Acad. Sci. 'USA, 82, 488 (1985), etc., using NDH polypeptide A or a known NDH. It is obtained by introducing site-specific mutations into the DNA encoding the polypeptide. It is possible.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a known method such as the site-directed mutagenesis method described above.
  • the number is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • Deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence possessed by NDH polypeptide A or a known NDH polypeptide refers to a position in an arbitrary and / or one or more amino acid sequences in the same sequence. In the above, one or more amino acids are deleted, substituted or added, and the deletion, substitution or addition may occur simultaneously.
  • Amino acids to be substituted or added may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-asparaginic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoguchi isine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-norine, .L-cysteine and the like.
  • Group A leucine, isoleucine, norilleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, 0-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanan, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, orditin, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added to NDH polypeptide A or a known NDH polypeptide has an energy non-producing NADH dehydrogenase activity. It preferably has homology of at least 60% or more, usually at least 80%, particularly at least 95% with the polypeptide before deletion, substitution or addition.
  • wordlength 3.
  • non-energy-producing NADH dehydrogenase of NDH polypeptides includes, for example, non-energy-producing NADH dehydrogenase, ubiquinone-11 and NADH according to the description of FEMS Microbiology Letters, 204, 271 (2001). It can be measured by measuring the decrease in absorbance at 275 nm or 340 nm in the reaction mixture.
  • the DNA encoding the NDH polypeptide may be any DNA as long as it encodes a polypeptide having a non-energy-producing NADH dehydrogenase activity.
  • DNA encoding the NDH polypeptide examples include, for example, Corynebacterium harbored by the plasmid pCS-CGndh possessed by Escherichia coli 'DH5 «/ pCS-CGndh (FERM BP-08633), which encodes the NDH polypeptide A.
  • DNA encoding NADH dehydrogenase from Mudartamicum which encodes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, or 16, respectively.
  • Examples include DNAs encoding known NDH polypeptides such as DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, and 15.
  • the DNA encoding the NDH polypeptide used in the present invention may be a DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of NDH polypeptide A or a DNA encoding a known NDH polypeptide under stringent conditions. May be a DNA that hybridizes with E. coli and encodes a polypeptide having non-energy-producing NADH dehydrogenase activity.
  • DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of NDH polypeptide A or a DNA encoding a known NDH polypeptide and DNA that hybridizes under stringent conditions are, for example, NDH polypeptide A or Using a part or all of the DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the known NDH polypeptide-encoding DNA as a probe, colony hybridization method, plaque hybridization method, or It means DA obtained by using Southern blot hybridization method or the like.
  • hybridization was carried out at 65 in the presence of 0.7 to 1.0 mol / l sodium chloride using Filuichii immobilized with DNA derived from colonies or plaques. Wash the filter at 65 ° C with 0.1 to 2 times concentration of SSC solution (1% concentration of SSC solution is composed of 150 mmol / l sodium chloride and 15 MIO1 / 1 sodium citrate) Can be identified.
  • SSC solution 1% concentration of SSC solution is composed of 150 mmol / l sodium chloride and 15 MIO1 / 1 sodium citrate
  • DNA having a base sequence complementary to the base sequence of DNA encoding NDH polypeptide A or a known NDH polypeptide and DNA hybridizing under stringent end conditions include the BLAST and BLAST described above. When calculated using FASTA or the like, DNA having 75% or more homology with the nucleotide sequence of NDH polypeptide A or DNA encoding a known NDH polypeptide, preferably 80% or more homology DNA, more preferably DNA having 95% or more homology.
  • DNA encoding the NDH polypeptide can be prepared from a microorganism that is an aerobic bacterium and has a non-energy-producing NADH dehydrogenase in the electron transfer system according to the method described by Byon.
  • microorganisms having non-energy-producing NADH dehydrogenase in the electron transfer system include, for example, Corynebacterium daltamicum
  • the microorganism belonging to Salmonella typhimurium (Salm Microorganisms belonging to the genus Salmonel (Salmonel la), such as onel la typhimurium, and microorganisms belonging to the genus Lactobaci l lus, such as Lactobaci l lus pi ant arum. it can.
  • the microorganism is cultured by a known method (for example, the method described in Mol. Microbiol., 20, 833 (1996)), and after cultivation, is cultured by a known method (for example, by using Current Protocols in Molecular Biology). Described above), the chromosomal DNA of the microorganism is isolated and purified.
  • the chromosomal DNA of the microorganism isolated and purified as type PCR PCR method (PCR Protocols, Academic Press (1990 )] Can be used to obtain the desired DNA.
  • the primer for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and designed based on the nucleotide sequence of ndh of a microorganism belonging to Corynebacterium dartamicum DNA that has
  • the target DNA can also be obtained by the following method.
  • any of a phage vector, a plasmid vector and the like can be used as long as they can replicate autonomously in the Escherichia coli K12 strain.
  • ZAP Express (Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)), Azap II (Stratagene), AgtlO, Agtll [DNA Cloning, A Practical Approach, 1, .49 (1985) )), ⁇ TriplEx (Clontech), AExCell (Amersham-Pharmacia Biotech), pBluescript II KS (-), pBluescript II SK (+) (Structure Gene, ucleic Acids Research,, 9494) (1989)], pUC18 [Gene, 33.103 (1985)], and the like.
  • the vector incorporating the DNA is introduced into a microorganism belonging to Escherichia coli.
  • Any microorganism belonging to Escherichia coli can be used as the microorganism belonging to Escherichia coli.
  • Escherichia coli Kl XL-Blue MRF [Stratagin, Strategies, 5, 81 (1992)]
  • Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)]
  • the target clone can be obtained from the obtained DNA library by the colony one-hybridization method, the plaque hybridization method, the southern hybridization method, or the like described in (1).
  • the DNA probe used for hybridization may be a DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of a known NDH polypeptide, or a portion thereof, or a known NDH polypeptide. Synthesized based on the base sequence of the DNA to encode And DNA fragments obtained by PCR using a DNA primer designed using a known base sequence, and the like.
  • the obtained DNA can be used as it is or after digestion with an appropriate restriction enzyme, etc., and integrated into a vector by an ordinary method, using a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, ABI377 DNA sequencer (Perkin Elma Inc.)
  • the DNA sequence is determined by the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) 3].
  • a primer is prepared based on the determined nucleotide sequence, and the isolated and purified chromosomal DNA is used as type III, and the target is obtained by PCR (PCR Protocols, Academic Press (1990)). You can get DNA.
  • the desired DNA can be prepared by chemical synthesis using a Perceptive 'Biosystems 8905 type DNA synthesizer or the like.
  • Examples of the DNA encoding the polypeptide used in the present invention obtained as described above include, for example, the energy of plasmid PC'S-CGndh carried by Escherichia anemone DH5a / pCS-CGndh (1nd8? -08633). DNA encoding non-producing NADH dehydrogenase can be mentioned.
  • the DNA is a DNA encoding NDH polypeptide A. .
  • a microorganism used in the method for producing an amino acid of the present invention can be prepared.
  • the DNA is introduced downstream of a promoter of an appropriate expression vector to prepare a recombinant DNA.
  • a method for introducing the recombinant DNA into a host microorganism can be mentioned.
  • the host microorganism is not particularly limited as long as it is an aerobic bacterium.
  • the electron transfer system of the microorganism may not particularly use an energy non-producing NADH dehydrogenase.
  • host microorganisms include the genus Escherichia, the genus Corynebacterium, the genus Brevibacterium, the genus Arthrobacter, the genus Aureobacterium, Cellulomonas (CeUulomonas), Clavibacter, Clutono, Curtobacterium, Microbacterium, Pimerobacter, Pierobacter la, Klebsiella, Klebsiella Genus, Serratia, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium
  • Genus (Agrobacte um), genus Anabaena, chromatium, genus Rhodobac, genus Rhodopseudomonas, genus Rhodospi ril llum, Streptomyces Microorganisms belonging to the genus (Streptomyces), Zymomonas, Zymomonas and the like.
  • Microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia col i XL 1 -Blue,
  • Escherichia col i XL2-Blue Escherichia col i thigh, Escherichia col i ⁇ 5 ⁇ , Escherichia col i MC1000, Escherichia col i KY3276, Escherichia col i W1485, Escherichia col i Thigh 09, Escherichia col i HB10K Escherichia col i No.
  • Microorganisms belonging to Escherichia coli such as Escherichia col i W3110, Escherichia col i NY49, Escherichia col i MP347, and Escherichia col i NM52, can be mentioned.
  • Corynebacterium examples include Corynebacterium such as Corynebacterium glutamiami cum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC13869.
  • Corynebacterium such as ammoniagenes ATCC21170 etc.
  • Microorganisms belonging to Corynebacterium acetoacidophi lum such as ammoniagenes.
  • Corvnebacterium acetoacidophi lum such as ATCC13870 can be mentioned.
  • microorganism belonging to the genus Brevibacterium examples include microorganisms belonging to Brevibacterium imariophi lum, Brevibacterium saccharolyt icunu Brevibacterium f lavum, Brevibacterium lactofermentum, and the like.
  • Microorganisms belonging to the genus Arthrobacter include Arthrobacter ci treus,
  • Examples include microorganisms belonging to Arthrobacter globi formis.
  • microorganisms belonging to the genus Oreobacterium include microorganisms belonging to Aureobacterium flavescens, Aureobacter rums erdae, Aureobacterium tes taceum, and the like.
  • Microorganisms belonging to the genus Cellus Monas include CeUulomonas f lavigena,
  • Microorganisms belonging to CeUulomonas carta can be mentioned.
  • the microorganism belonging to the genus Clavibacter is Clavibacter michiga solid,
  • Microorganisms belonging to Clavibacterrathayi can be mentioned.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Kurtobacterium include microorganisms belonging to Curtobacterium albidum, Curtobacterium citreum, Curtobacterium luteum, and the like.
  • Microorganisms belonging to the genus Microbacterium include Microbacteriji ammoniaphilum ⁇ Microbacterium lacticum, such as icrobacterium ammoni philum ATCC15354,
  • Microbacterium i microorganisms belonging to eriale can be mentioned.
  • Microorganisms belonging to Pimerobacter simplex can be mentioned as microorganisms belonging to the genus Pimeropax.
  • the microorganism belonging to the genus Enterobacter is Enterobacter agglomerans
  • ATCC1228 ⁇ D Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, Enterobacter amni genus ⁇ Enterobacter asburiae> Enterobacter cloacae Enterobacter dissolvens, Enterobacter gergoviae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter intermedius, Enterobacter nimipressuralis> Enterobacter sakazakii,
  • Microorganisms belonging to Enterobacter taylorae can be mentioned.
  • microorganisms belonging to the genus Klebsiella include microorganisms belonging to Klebsiella planticola.
  • microorganisms belonging to the genus Serratia include microorganisms belonging to Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia entomophila, Serratia grimes U, Serratia proteamacul o :, Serratia odorifera, Serratia plymuthica Serratia rubidaea and Serratia marcescens.
  • microorganisms belonging to the Erubinia genus for example, Erwinia uredovora, Erwinia carotovora, Erwinia ananas, Erwinia herbicola, Erwinia punctata 3 ⁇ 4 Erwinia terreus> Erwinia cacticida> Erwinia chrysanthemi, Erwinia mallotivora ⁇ Erwinia persici Keio, Erwinia psidii, Erwinia quercina> Erwinia rhaponticu Erwinia rubrifaciens, microorganisms belonging to Erwinia salicis, and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Bacillus include microorganisms belonging to Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus amylol iquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus iceniformis, and Bacillus pumilus.
  • Microorganisms belonging to the genus Pseudomonas putida include microorganisms belonging to Pseudomonas putida.
  • microorganism belonging to the genus Agrobacterium examples include microorganisms belonging to Agrobacterium radiobacter Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rubi and the like.
  • Examples of the microorganism belonging to the genus Anabaena include microorganisms belonging to Anabaena cylindrica, Anabaena doliolum, and Anabaena flosaquae.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Chromatium include Chromatium buderu
  • Chromatium tepidum Chromatium vinosu ⁇ Chromatium warmingiu Microorganisms belonging to Chromatium fluviatile and the like.
  • microorganism belonging to the genus Rhodobacta examples include microorganisms belonging to Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Rhodoseudomonas include microorganisms belonging to Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas marina and Rhodopseudomonas palustris.
  • Rhodospirillum examples include microorganisms belonging to Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum salexigens> Rhodospirillum salinarum, and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Streptomyces include, for example, Streptomyces ambofaciens ⁇ Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aur6us, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus,
  • Streptomyces lividans Microorganisms belonging to Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus and the like can be mentioned.
  • microorganisms belonging to the genus Zymomonas include microorganisms belonging to Zymomonas mobiHs.
  • a microorganism belonging to the genus, Escherichia or Bacillus is preferably used, a microorganism belonging to Corynebacterium or the genus Escherichia is more preferably used, and a microorganism belonging to the genus Corynebacterium is more preferably used.
  • any method can be used as long as the DNA can be introduced into the host microorganism.
  • a method using calcium ions CProc. Natl. Acad. Sci., USA , 69, 2110 (1972)] the protoplast method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-248394), the electrolysis method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], and the like.
  • those which can replicate autonomously in a host microorganism or can be integrated into a chromosome and which contain a promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide used in the present invention can be transcribed are used.
  • pBTrp2 pBTac pBTac2 (both from Boehringer Mannheim), pHelixl (Roche Diagnostics), PKK233-2 (Amersham-Pharmacia Biotech), PSE280 (Invitrogen), GEMEX -1 (Prome PQE-8 (manufactured by Qiagen), pET-3 (manufactured by Novagen), pKYPIO (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-110600), PKYP200 (Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)), pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989) 3, pGELl [Proc. Natl.
  • any promoter can be used as long as it functions in the host microorganism.
  • tr promoter P trp
  • lac promoter P lac
  • P R promoter Isseki one one such P SE promoter Isseki, Eshierihia' such microorganisms or phages belonging to coli derived promoter
  • spol promoter Isseki one SP_rei_2 flop port motor -
  • Promoter in which two series P lrp, tac promoter, lacT7 promoter mono- can be used artificially designed and modified promoter Chancellor as the let I promoter scratch.
  • the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium
  • a P54-6 port motor [ ⁇ 1 ⁇ Microbiol. Biotec nol., 53, 674-679 (2000)] can also be mentioned.
  • xylA Promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)] can also be mentioned.
  • Recombinant DNA is a recombinant DNA that is capable of autonomous replication in a host microorganism and is composed of the above promoter, a ribosome binding sequence, a DNA encoding the polypeptide used in the present invention, and a transcription termination sequence. Is preferred. A gene that controls the promotion may be included.
  • a transcription termination sequence is not always necessary, it is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below a structural gene.
  • Examples of such a recombinant DNA include a plasmid pCS-CGndh carried by Escherichia coli DH5a / pCS-CGndh (FERM BP-08633).
  • Examples of the microorganisms of the present invention obtained by the above-mentioned method include, for example, C. var. FERM BP-1069 / pCS-CGndh.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention introduced into the host microorganism may be present on the recombinant DNA in the microorganism or may be integrated on the chromosome.
  • a microorganism obtained by introducing a DNA encoding the polypeptide used in the present invention (hereinafter abbreviated as the microorganism of the present invention) is cultured in a medium, and amino acids are produced and accumulated in the culture. Amino acids can be produced by collecting the amino acids from the culture.
  • the amino acid is not particularly limited, and is an amino acid biosynthesized from 2-oxo dartalic acid such as L-glutamic acid and L-glutamine; an amino acid biosynthesized from oxa-mouth acetic acid such as L-aspartic acid and L-asparagine; L-lysine Amino acids biosynthesized from aspartic acid such as L-methionine and L-threonine; amino acids biosynthesized from L-glutamic acid such as L-arginine, L-arginine and L-citrulline; L-valine and L -Amino acids biosynthesized from pyruvate, such as leucine and L-isoleucine, and amino acids biosynthesized from 3_phosphodariseric acid, such as L-serine, L-cystine, and glycine, L-tributophane, L-tyrosine, and L-glycine Examples include amino acids
  • the medium used for the culture contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like, which can be assimilated by the microorganism of the present invention, so that the microorganism can grow and the production of the target amino acid can be efficiently performed.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by the microorganism of the present invention, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or hydrolyzed starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and the like. Alcohols such as methanol, ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or inorganic salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor. , Casein hydrolyzate, soybean meal hydrolyzate, various yeast cells, and digests thereof.
  • potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the cultivation is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culturing temperature is 15 ° (: preferably ⁇ 50 ° C., more preferably 20 ° C. to 45 ° C.
  • the culturing time is usually 5 hours to 7 days, more preferably 12 hours to 4 days.
  • Medium If necessary, maintain the pH at 3 to 9. Adjust the pH with an inorganic or organic acid, alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibacterial substance such as penicillin, ampicillin, or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer when culturing a microorganism into which DNA has been introduced using recombinant DNA using an inducible promoter, an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer when culturing a microorganism into which DNA has been introduced using a recombinant DNA using a lac promoter, isopropyl-1] 3-D-thiogalactopyranoside or the like can be used to prepare a recombinant DNA using a tr promoter.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Amino acids are collected from the culture solution after the completion of culture, using methods commonly used for isolating amino acids, such as a method using activated carbon, a method using an ion exchange resin, a crystallization method, and a precipitation method, alone or in combination. be able to.
  • Example 1 is shown below, but the present invention is not limited to the following examples.
  • Example 1 is shown below, but the present invention is not limited to the following examples.
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 was synthesized.
  • the DNA 0.5 mo 1 / L each
  • the chromosomal DNA 0.1 / ig
  • 2.5 units of HuDNA polymerase manufactured by Stratagene
  • 200 11101 / each PCR was performed in 40 L of a reaction solution containing L of dNTP (dATP, dGTP, dCTP and dTTP).
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed by an electroporation method (Nucleic acid Res., 16, 6127-6145 (1988)).
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed by an electroporation method (Nucleic acid Res., 16, 6127-6145 (1988)).
  • a plasmid was extracted from colonies grown on the agar medium by a conventional method, and the plasmid was extracted using restriction enzymes.
  • the plasmid was obtained by inserting a DNA fragment containing Corynebacterium dartamicum ndh into the pGEM R- T Easy vector, and this plasmid was named pT-CGndh.
  • Corynebacterium daltamicum LS-22 strain was transformed using the electrification method [Nucleic acid Res., 16, 6127-6145 (1988)].
  • the obtained transformant was spread on an LB agar medium containing 25 / g / mL kanamycin, and cultured at 30 ° C for one day. Plasmids were extracted from colonies grown on the agar medium by a conventional method, and their structures were analyzed using restriction enzymes. The plasmid was a plasmid in which a DNA fragment containing ndh was inserted into PCS299P. It was confirmed. This plasmid was named pCS-CGndh.
  • Escherichia coli DH5 / pCS-CGndh containing the plasmid PCS-CGndh was designated as FERM BP-08633 on February 19, 2004, by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center 1, Ibaraki, Japan Deposited at 1-1-1, Higashi 1-chome, Chuo No. 6 (Postal Code 305-8566), Higashi 1-chome, Tsukuba City, Prefecture.
  • MG medium 10 g / L glucose, 3 g / L potassium dihydrogen phosphate, 3 g / L dipotassium hydrogen phosphate, 2 g / L ammonium chloride, 2 g / L urea, 0.5 g / L sulfuric acid
  • MG medium 10 mg / L glucose, 3 g / L potassium dihydrogen phosphate, 3 g / L dipotassium hydrogen phosphate, 2 g / L ammonium chloride, 2 g / L urea, 0.5 g / L sulfuric acid
  • Magnesium7 hydrate 10 mg / L iron sulfate10 hydrate, lmg / L manganese sulfate7 hydrate, 30 mg / L biotin, lmg / L thiamine hydrochloride, 20 mg / L cysteine hydrochloride, 0.5 g / L casamino acid and lmL / L metal mix (990 mg / L iron
  • the culture supernatant was applied to column AQ-312 (YMC) at 40 (mobile phase: 2.94 g / L sodium citrate, 1.42 g / L sodium sulfate, 17 mL / L n -Propanol and pH 2.4 solution containing 3 g / L sodium lauryl sulfate), reaction solution (18.5 g / L phosphoric acid, llg / L NaOH, 0.6 g / L orthophthalaldehyde, 2 ml) / L mercaptoethanol and a solution containing 3 mL / L Brige-35) and subjected to fluorescence analysis at an excitation wavelength of 345 nm and an absorption wavelength of 455 nm.
  • YMC column AQ-312
  • Corynebacterium daltamicum LS-22 strain accumulated 1.5 g / L of glutamic acid in the culture solution, whereas Corynebacterium daltamicum LS-22 / pCS-CGndh strain 2. Glutamic acid of 3 g / L was accumulated.
  • Corynebacterium dartamicum ATCC14752 strain and Corynebacterium dartamicum ATCC14752 / pCS-CGndh strain were each added to a GS medium (70 g / L glucose, 10 g / L corn steep liquor, 10 g / L meat extract, 10 g / L yeast).
  • Extract 5 g / L ammonium sulfate, 0.5 g / L potassium dihydrogen phosphate, 1.5 g / L dipotassium hydrogen phosphate, 0.5 g / L magnesium sulfate7 hydrate, 10 mg / L iron sulfate1 0 hydrate, 10 mg / L manganese sulfate 'hemihydrate, 0.8 mg / L copper sulfate' 57K hydrate, 8.3 g / L urea, 5 ig / L biotin, and lmg / L thiamine hydrochloride Medium containing pH 7.2] was inoculated into a test tube containing 5 mL, and cultured with shaking at 30 for 24 hours.
  • the accumulated amount of glucumin in the ATCC14752 / pCS-CGndh strain was 33.3 g / L.
  • Corynebacterium dartamicum FERM BP-1069 strain and Corynebacterium glutamicum FERM BP-1069 / pCS_CGndh strain were each added to an LS medium (50 g / L sucrose, 30 g / L corn steep liquor, 20 g / L meat extract, 20 g / L casamino acid, 8 g / L ammonium sulfate, 2 g / L potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / L magnesium sulfate7 hydrate, 3 g / L urea, 20 g / L peptone, 10 mg / L iron sulfate 10 hydrate, 10mg / L zinc sulfate7 hydrate, 20mg / L nicotinic acid, 10mg / L calcium pantothenate,
  • 0.5 mL of this culture was added to LP medium [100 g / L molasses (as sugar), 45 g / L ammonium sulfate, 3 g / L urea, 0.5 g / L potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / L magnesium sulfate, A culture medium containing heptahydrate, 0.3 mg / L biotin and 30 g / L calcium carbonate and having a pH of 7.0] was added to a test tube containing 5 mL, and cultured at 30 rpm for 72 hours at 220 rpm with shaking. After completion of the culture, the concentration of lysine in the culture supernatant was quantified by HPLC.
  • the culture supernatant was applied to column 0DS-80TS (TOSOH) at 40 ° C (mobile phase: 2.94 g / L sodium citrate, 1.42 g / L sodium sulfate, 300 mL / L acetonitrile) , And 3 g / L sodium lauryl sulfate, pH 6.0 solution), reaction solution (18.5 g / L boric acid, llg / L sodium hydroxide, 0.6 g / L orthophthalaldehyde, 2 ml / L The solution was mixed with a solution containing mercaptoethanol and 3 mL / L Bri-35) and subjected to fluorescence analysis at an excitation wavelength of 345 nm and an absorption wavelength of 455 nm.
  • TOSOH TOSOH

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Abstract

本発明は、好気性細菌の電子伝達系においてプロトンポンプとして作用するNADHデヒドロゲナーゼ複合体のうち、電子１個あたり排出できるプロトン分子数がゼロであるNADHデヒドロゲナーゼ複合体を構成するNADHデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入して得られる微生物および該微生物を用いることを特徴とする工業的に有利なアミノ酸の製造法を提供する。

Description

アミノ酸の製造法
技術分野
本発明は、 アミノ酸の製造法に関する。 背景技術
近年、 微生物の電子伝達系に変異を施し、 アミノ酸 の物質の生産性を向上させ る試みが報告されている。
例えば、 ェシェリヒア ·コリのエネルギー産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一 ドする D N Aを増幅させるか、 またはエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼ をコードする D NAを欠損させることでアミノ酸の生産性が向上することが報告さ れている （特開 2002-17363号） 。
また、 バチルス ·サブチリス (Baci l lus subt i l is) において、 エネルギー生成 効率の高いチトクロム beォキシダ一ゼをコ一ドする D N Aを増幅することによつ てリボフラビンの生産性が向上することが報告されている （TO03/072785号） 。 電子伝達系における変異が微生物の生育に及ぼす影響について、 Molenaarらは コリネバクテリゥム 'グルタミカム (Corynebacterium glut ami cum) の NADHデヒ ド口ゲナーゼをコードする D NAを破壊したが、 生育等への影響はなかつたことを 報告している (Journal of Bacteriology, 182, p. 6884-6891 (2000) 〕 。
このように微生物の電子伝達系における変異が、 該微生物による物質の生産性に 影響を及ぼす可能性のあることが知られているが、 どのように影響するかを予測す ること,は難しい。 '
従来の方法に加えてさらに物質の生産性を向上させる方法の開発が望まれている。 発明の開示 ' 本発明の目的は、 工業的に有利なアミノ酸の製造法を提供することにある。
本発明は以下の （1 ) 〜 （2 6 ) に関する。
( 1 ) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする D N Aを導入し て得られる微生物を培地に培養し、 培養物中にアミノ酸を生成、 蓄積させ、 該培養 物よりアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
( 2 ) エネルギー非産生型 NADHデヒド口ゲナーゼをコ一ドする D NAが、 コリ ネバクテリゥム (Corynebacterium) 属、 ェシエリヒア (Escherichia) 属、 シユー ドモナス属 (Pseudomonas) 属、 ァゾトパクター (Azotobacter) 属、 サルモネラ
(Salmonel la) 属およびラクトバチルス (Lactobaci l lus) 属に属する微生物から なる群より選ばれる微生物由来の D NA、 または該 D NAの塩基配列と相補的な塩 基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aで あることを特徴とする、 上記 （1) の製造法。
(3) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする DN Aが、 コリ ネバクテリゥム ·ダルタミカム (Corynebacterium glut ami cum) 、 コリネバクテリ ,ゥム 'ジフテリア (Corynebacterium diphtheriae) 、 ェシエリヒア .コリ
(Escherichia colリ 、 シュ一ドモナス 'フルォレツセンス (Pseudomonas f luorescens 、 ァゾトパクター ·ビ不ランディ一 (Azotobacter vinelandii) 、 サルモネラ ·ティフィムリウム (Salmonella typhimurium) およびラクトバチル ス ·プランタラム (Lactobacillus pi ant arum) に属する微生物からなる群より選 ばれる微生物由来の DNA、 または該 DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有す る DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであることを特 徴とする、 上記 （1) の製造法。
(4) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする DNAが、 配列 番号 3、， 5、 7、 9、 11、 13および 15で表される塩基配列からなる群より選 ばれる塩基配列を有する DNA、 または該塩基配列と相補的な塩基配列を有する D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAである、 上記 (1) の製造法。
(5) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする DNAが、 ェシ エリヒア ·コリ DH5 a/pCS-CGndh(FERM BP-08633)の保有するプラスミド pCS- CGndh の有するエネルギー非産生型 NADHデヒド口ゲナ一ゼをコ一ドする DN Aまたは該 DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下 でハイプリダイズし、 かつエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ活性を有す るポリペプチドをコードする DNAである、 上記 （1) の製造法。
(6) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼが、 配列番号 4、 6、 8、 1 0、 12、 14および 16で表されるアミノ酸配列からなる群より'選ばれるァミノ 酸配列を有するポリペプチド、 または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列におい て、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か つエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチドであるこ とを特徴とする上記 （1) の製造法。
( 7 ) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼが、 ェシエリヒア .コリ DH5 a/pCS-CGndh(FERM BP-08633)の保有するプラスミド pCS- CGi^dhの有するエネルギ —非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする D N Aにコードされるポリべプチ ド、 または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつエネルギー非産生型 NADHデヒド口ゲナ一ゼ活性を有するポリぺプチドであることを特徴とする上記
(1) の製造法。 (8) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする DNAを導入す る微生物が、，ェシエリヒア (Escherichia) 属、 コリネバクテリゥム属
(Corynebacterium) 、 ブレビバクテリウム (Brevi bacterium) 属、 アースロバク 夕一 (Arthrobacter) 属、 オーレォバクテリゥム (Aureobacterium) 属、 セルロモ ナス (Cellulomonas) 属、 クラビバクタ一 (Clavibacter) 属、 クルトバクテリウ ム (Curtobacterium) 属、 ミクロバクテリゥム (Microbacterium) 属、 ピメロパク ター (Pimerobacter) 属およびバチルス (Bacillus) 属に属する微生物からなる群 より選ばれる微生物である、 上記 （1) 〜 （7) いずれか 1つの製造法。
( 9 ) エネルギー非産生型 NADHデヒド口ゲナーゼをコ一ドする DN Aを導入す る微生物が、 ェシエリヒア属に属する微生物である、 上記 （1) 〜 （7) いずれか 1つの製造法。
(1 0) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする DN Aを導入 する微生物が、 ェシエリヒア ·コリに属する微生物である、 上記 （1) 〜 （7) い ずれか 1つの製造法.。
(1 1) エネルギー非産生型 NAMデヒドロゲナーゼをコードする DN Aを導入 する微生物が、 コリネパクテリゥム属に属する微生物である、 上記 （1) 〜 （7) いずれか 1つの製造法。
(1 2) エネルギー非産生型 NAMデヒドロゲナーゼをコードする DNAを導入 する微生物が、 コリネバクテリウム ·ダル夕ミカム (Corynebacterium , glutamicum) 、 コリネパ'クテリウム ·フラノ ム (Corynebacterium fla糊) 、 コリ ネノ クテリゥム 'ラクトフアーメンタム (Corynebacterium lactofermentum) およ びコリネパクテリゥム .エフイカシス (Corynebacterium efficasis) に属する微 生物か なる群より選ばれる微生物である、 上記 （1) 〜 （7) いずれか 1つの製 造法。
( 1 3) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする DN Aを導入 する微生物が、 コリネパクテリゥム ·ダルタミカムに属する微生物である、 上記
(1) 〜 （7) いずれか 1つの製造法。
(14) アミノ酸が、 L—グルタミン酸、 L—グルタミン、 L—ァスパラギン酸、 L—ァスパラギン、 L一リジン、 L—メチォニン、 L—トレオニン、 L—アルギニ ン、 L—プロリン、 Lーシトルリン、 L—バリン、 L—ロイシン、 L—イソ口イシ ン、 L—セリン、 L一システィン、 グリシン、 L一卜リブ卜ファン、 Lーチロシン、 L一フエ二ルァラニンおよび L一ヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸であ る、 上記 （1) 〜 （1 3) いずれか 1つの製造法。
(1 5) アミノ酸が、 L—グルタミン酸、 L—グルタミンおよび L一リジンから なる群より選ばれるアミノ酸である、 上記 （1) 〜 （1 3) いずれか 1つの製造法。 (16) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする DNAを導入 して得られるコリネバクテリゥムに属する微生物。
(17) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする DN Aを導入 して得られるコリネバクテリゥム ·グルタミカムに属する微生物。
(18) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコ一ドする D N Aが、 コ リネバクテリウム属、 ェシエリヒア属、 シユードモナス属、 ァゾトバクタ一属、 サ ルモネラ属およびラクトバチルス属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物 由来の DNA、 または該 DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとス トリンジエンドな条件下でハイブリダィズする DNAである、 上記 （16) または
(17) の微生物。 '
(19) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする DN Aが、 コ リネバクテリゥム ·ダルタミカム、 コリネバクテリゥム ·ジフテリア、 ェシエリヒ ァ ·コリ、 シュ一ドモナス ·フルォレツセンス、 ァゾトパクター ·ビネランディ一、 サルモネラ ·ティフィムリウムおよびラクトバチルス ·プランタラムに属する微生 物からなる群より選ばれる微生物由来の DNA、 または該 DNAの塩基配列と相補 的な塩基配列を有する DN Aとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする D NAである、 上記 （16) または （17) の微生物。
(20) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする DN Aが、 配 列番号 3、 5、 7、 9、 11、 13および 15で表される塩基配列からなる群より 選ばれる塩基配列を有する DNA、 または該塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aである、 上記 （1 6) または （17) の微生物。
(21)' エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする DN Aが、 ェ シエリヒア 'コリ DH5a/pCS- CGnd FERM BP- 08633)の保有するプラスミド pCS- CGndhの有するエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする DN Aま たは該 DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジエンドな 条件下でハイプリダイズし、 かつエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ活性 を有するポリペプチドをコードする DNAである、 上記 （16) または （17) の 微生物。
(22) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼが、 配列番号 4、 6、 8、 10、 12、 14および 16で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミ ノ酸配列を有するポリぺプチド、 または該ポリぺプチドの有するアミノ酸配列にお いて、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼ活性を有するポリペプチドである、 上記 （16) または （17) の微生物。 (23) エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼが、 ェシエリヒア .コリ DH5o;/pCS-CGndh(FERM BP- 08633)の保有するプラスミド pCS- CGndhの有するェネル ギ一非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする DNAによりコードされるポリ ペプチド、 または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、 1以上のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつエネルギ一非産生 型 NADHデヒドロゲナ一ゼ活性を有するポリべプチドであることを特徴とする上記
(16) または （17) の微生物。
(24) コリネバクテリゥム ·ダルタミカム ATCC14752/pCS-CGndh, またはコリ ネバクテリゥム ·グルタミカム FERM BP_1069/pCS-CGndh。 .
(25) ェシェリヒア ·コリ DH5 a/pCS-CGndh (FERM BP- 08633) 。
(26) ェシェリヒア ·コリ DH5 α/pCS-CGndh (FERM BP- 08633) の保有するプ ラスミド PCS- CGndh。 発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられるエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ （以下、 NDH ポリペプチドともいう） は、 好気性細菌の電子伝達系においてプロトンポンプとし て作用する NADHデヒド口ゲナ一ゼ複合体のうち、 電子 1個あたり排出できるプロ トン分子数がゼロである NADHデヒドロゲナ一ゼ複合体を構成する NADHデヒドロゲ ナ一ゼの活性 （以下、 エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ"ゼ活性と略す） を 有するポリペプチドであれば、 いずれのポリペプチドであってもよい。
NDHポリペプチドとしては、 例えば、 コリネバクテリゥム
(Corynebacterium) 属、 ェシエリヒア (Escherichia) 属、 シュ一ドモナス属 (Pseudomonas) 属、 ァゾトパクター (Azotobacter) 属、 サルモネラ
(Salmonella) 属、 ラクトバチルス (Lactobacillus) 属に属する微生物等に由来 する公知の N D Hポリペプチドをあげることができる。
コリネパクテリゥム属に属する微生物としては、 コリネパクテリゥム ·ダルタミ カム (Corynebacterium glut ami cum) 、 コリネバクテリゥム .ジフテリア
(Corynebacterium diphtheriae) に属する微生物等をあげることができる。
ェシエリヒア (Escherichia) 属に属する微生物としては、 ェシエリヒア 'コリ (Escherichia coH) に属する微生物等をあげることができる。
シユードモナス属に属する微生物としては、 シユードモナス ·フルォレツセンス (Pseudomonas fluorescens) に属する微生物等をあげることができる。
ァゾトバクタ一属に属する微生物としては、 ァゾトバクタ一·ビネランディー (Azotobacter vinelandii) に属する微生物をあげることができる。
サルモネラ属に属する微生物としては、 サルモネラ，ティフィムリウム
(Salmonella typhi murium) に属する微生物をあげることができる。 ラクトバチルス属に属する微生物としては、 ラクトバチルス ·プランタラム
(Lactobaci l lus pi ant arum) に属する微生物をあげることができる。
これらの微生物に由来する NDHポリペプチドとしては、 例えば、 コリネパクテ リウム属に属する微生物に由来する配列番号 4または 6で表されるアミノ酸配列を 有するポリぺプチド、 ェシェリヒア属に属する微生物に由来する配列番号 8で表さ れるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 シユードモナス属に属する微生物に由来 する配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 ァゾトバクタ一 属に属する微生物に由来する配列番号 1 2で表されるアミノ酸配列を有するポリべ プチド、 サルモネラ属に属する微生物に由来する配列番号 1 4で表されるアミノ酸 配列を有するポリペプチド、 ラクトバチルス属に属する微生物に由来する配列番号 1 6で表されるァミノ酸配列を有するポリペプチド等の公知の N D Hポリペプチド をあげることができる。
また、 ェシエリヒア ·コリ DH5 «/pCS- CGndh (FERM BP-08633)の保有するプラス ミド pCS-CGndhが有する、 コリネバクテリゥム ·ダルタミカム由来のエネルギー非 産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする D NA (ndh) によりコードされるポリ ペプチド （以下、 NDHポリペプチド Aと略す） も ND Hポリペプチドとしてあげ ることができる。
さらに、 本発明に用いられる ND Hポリペプチドは、 エネルギー非産生型 NADH デヒドロゲナ一ゼ活性を有していれば、 ND Hポリペプチド Aまたは公知の NDH ポ 'リぺプチドの有するァミノ酸配列に 1以上のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加 されたァミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
ND Hポリペプチド Aまたは公知の ND Hポリペプチドの有するアミノ酸配列に 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプ' チドは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edi t ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (以下、 モレキュラー ·クローニング第 3版と略 す） 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons (1987-1997) (以下、 カレント ·プロトコールズ ·イン'モレキュラー 'バイオロジーと略す） 、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Nat l. Acad. Sci. 'USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を 用いて、 ND Hポリペプチド Aま は公知の NDHポリペプチ をコードする D N Aに部位特異的変異を導入することにより、 取得することができる。
欠失、 置換若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、 上記の部位 特異的変異法等の周知の方法により欠失、 置換もしくは付加できる程度の数であり、 1個から数十個、 好ましくは 1〜2 0個、 より好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ま しくは 1〜5個である。 N D Hポリぺプチド Aまたは公知の N D Hポリぺプチドの有するァミノ酸配列に おいて 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたとは、 同一配列中の任意 かつ 1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、 1または複数のアミノ酸の 欠失、 置換若しくは付加があることを意味し、 欠失、 置換若しくは付加が同時に生 じてもよい。
置換若しくは付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。
天然型アミノ酸としては、 Lーァラニン、 L—ァスパラギン、 L—ァスパラギン 酸、 L—グルタミン、 L—グルタミン酸、 グリシン、 L—ヒスチジン、 L—イソ口 イシン、 L—ロイシン、 L—リジン、 L—アルギニン、 L一メチォニン、 L一フエ 二ルァラニン、 L—プロリン、 Lーセリン、 Lースレオニン、 L—トリプトファン、 L—チロシン、 L—ノ リン、. L -システィンなどがあげられる。
以下に、 相互に置換可能なアミソ酸の例を示す。 同一群に含まれるアミノ酸は相 互に置換可能である。 ，
A群：ロイシン、 イソロイシン、 ノリレロイシン、 バリン、 ノルバリン、 ァラニン、 2 -アミノブタン酸、 メチォニン、 0-メチルセリン、 t -ブチルグリシン、 t-ブチル ァラニン、 シクロへキシルァラニン
B群：ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 イソァスパラギン酸、 イソグルタミン酸、 2-アミノアジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、 グルタミン
D群： リジン、 アルギニン、 オル二チン、 2，4-ジァミノブタン酸、 2, 3-ジァミノ プロピオン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、 スレオニン、 ホモセリン
' G群：フエ二ルァラニン、 チロシン
また、 N D Hポリぺプチド Aまたは公知の N D Hポリぺプチドに 1以上のアミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチドがエネルギ 一非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼ活性を有するためには、 欠失、 置換若しくは付 加前のポリペプチドと、 少なくとも 6 0 %以上、 通常は 8 0 %以上、 特に 9 5 %以 上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Kar l in and Al tsc ulによるアルゴリズム BLAST [Pro. Nat l . Acad. Sci. USA, 90> 5873 (1993) ]ゃ？八31八[)^ 0(13 Enzymol . , 183, 63 (1990) ]を用いて決定することができる。 このアルゴリズム BLASTに基づ いて、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol . Biol . , 215, 403 (1990) ] 。
BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、 パラメータは 例えば Score= 100、 wordlength= 12とする。 また、 BLASTに基づいて BLASTXによ つてアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメータは例えば score=50、
wordlength=3とする。 BLASTと' Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プ ログラムのデフォルトパラメーターを用いる ¾ これらの解析方法の具体的な手法は 公知である (ht tp://www. ncbi. nlin. nih. gov. ) 。
ND Hポリぺプチドのエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼの活性は、 た とえば FEMS Microbiology Let ters, 204, 271 (2001)の記載に準じて、 エネルギー 非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ、 ュビキノン一 1および NADHを含有する反応液に おける 275nmまたは 340nmでの吸光度の減少を測定することにより測定することが きる。
ND Hポリペプチドをコードする D N Aとしては、 エネルギー非産生型 NADHデ ヒドロゲナ一ゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする D NAであれば、 いずれの D NAであってもよい。
ND Hポリペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 ND Hポリペプチド Aをコードする、 ェシエリヒア 'コリ DH5 «/ pCS- CGndh (FERM BP- 08633)の保有 するプラスミド pCS- CGndhが有するコリネバクテリゥム ·ダルタミカム由来の NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする D NA、 配列番号 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4および 1 6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをそれぞれコードす る、 配列番号 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3および 1 5で表される塩基配列を有する D N A等の公知の NDHポリペプチドをコードする D N A等をあげることができる。 本発明に用いられる NDHポリペプチドをコードする D N Aは、 NDHポリぺプ チド Aまたは公知の ND Hポリペプチドをコードする D NAの塩基配列と相補的な 塩基配列を有する D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつェ ネルギ一非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする D NAであってもよい。
N D Hポリペプチド Aまたは公知の N D Hポリペプチドをコードする D N Aの塩 基配列と相補的な塩基配列を有する D NAとストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする D NAとは、 例えば、 NDHポリペプチド Aまたは公知の ND Hポリべ プチドをコードする D N Aの塩基配列と相補的な塩基配列を有する D N Aの一部、 または全部をプローブとして、 コロニー ·ハイブリダィゼーシヨン法、 プラーク ' ハイブリダィゼーション法あるいはサザンブロッ卜ハイブリダィゼーション法等を 用いることにより得られる D Aを意味する。
具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の D NAを固定化したフィル夕一を 用いて、 0. 7〜1. 0mol/lの塩化ナトリウム存在下、 65ででハイブリダィゼーシヨン を行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶液 （1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mmol/l 塩化ナトリウム、 15MIO1/1クェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65°C条件下で フィルターを洗浄することにより同定できる D NAをあげることができる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 モレキュラー ·クロ一ニング第 3版、 カレント 'プ 口トコ一ルズ ·イン 'モレキュラー ·バイオロジー、 DNA Cloning 1 : Core
Techniques, A Pract ical Approach, Second Edi t ion, Oxford Universi ty (1995) 等に記載されている方法に準じて行うことができる。
N D Hポリぺプチド Aまたは公知の N D Hポリぺプチドをコ一ドする D N Aの塩 基配列と相補的な塩基配列を有する D NAとストリンジエンドな条件下でハイプリ ダイズする D NAとしては、 上記 BLASTや FASTA等を用いて計算したときに、 ND Hポリペプチド Aまたは公知の N DHポリペプチドをコードする D N Aの塩基配列 と 75%以上の相同性を有する D NA、 好ましくは 80%以上の相同性を有する D NA、 さらに好ましくは 95%以上の相同性を有する D NAをあげることができる。
ND Hポリペプチドをコードする D NAは、 好気性細菌であって、 電子伝達系に エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼを有する微生物から卞記の方法に準じ て調製することができる。 電子伝達系にエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲチ一 ゼを有する微生物としては、 例えば、 コリネバクテリウム ·ダルタミカム
(Corynebacterium glut ami cum) 等のコリネノ、、クテリウム (Corynebacterium) 厲、 ブ1レビバクテリゥム (Brevibacterium) 属、 アースロバクタ一 (Arthrobacter) 属、 オーレォバクテリゥム (Aureobacterium) 属、 セルロモナス (Cel lulomonas) 属、 クラビバクタ一 (Clavibacter) 属、 クルトバクテリゥム (Curtobacterium) 属、 ミクロバクテリゥム (Microbacterium) 属、 ピメロパクター (Pimerobacter) 属に 属する微生物等のいわゆるコリネ型細菌、 ェシエリヒア ·'コリ (Escherichia col i) 等のェシエリヒア (Escher ichia) 属に属する微生物、 シュ一ドモナス ·フ リレオレツセンス (Pseudomonas f luorescens) 等のシユードモナス (Pseudomonas) 属に属する微生物、 ァゾトバクタ一 ·ビネランディー (Azotobacter vinelandi i) 等のァゾトパクター (Azotobacter) 属に属する微生物、 サルモネラ ·ティフィム リウム (Salmonel la typhimurium) 等のサルモネラ (Salmonel la) 属に属する微生 物、 ラクトバチルス ·プラン夕ラム (Lactobaci l lus pi ant arum) 等のラクトバチ ルス (Lactobaci l lus)属に属する微生物等をあげることができる。
上記微生物を公知の方法 〔例えば、 Mol. Microbiol. , 20, 833 (1996)に記載の 方法〕 により培養し、 培養後、 公知の方法 （例えば、 カレント ·プロトコールズ' イン ·モレキュラー ·バイオロジーに記載の方法） により、 該微生物の染色体 D N Aを単離精製する。
公知の NDHポリペプチドをコードする D N Aの塩基配列をもとに合成した D N Aをプライマーとして用い、 単離精製された上記微生物の染色体 D NAを铸型とし て P C R法 〔PCR Protocols, Academic Press (1990) ] を用いて目的とする D NA を取得することができる。 プライマ一としては、 例えば、 配列番号 3で表される塩基配列を有する、 コリネ バクテリゥム ·ダルタミカムに属する微生物の ndhの塩基配列をもとに設計した配 列番号 1および 2で表される塩基配列を有する D N Aをあげることができる。
また、 以下の方法によっても、 目的とする DNAを取得することができる。
単離精製した染色体 DNAを用いて、 モレキュラー'クローニング第 3版やカレ ント .プロトコ一ルス、 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second. Edit ion, Oxford University Press (1995)等に記載された方法に準じて DNAライブラリーを作製する。
DN Aライブラリ一を作製するためのクロ一ニングベクターとしては、 ェシエリ ヒア ·コリ K12株中で自立複製できるものであれば、 ファ一ジベクター、 プラスミ ドベクタ—等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express 〔ストラタジーン 社製、 Strategies, 5, 58 (1992)〕 、 Azap II (ストラタジ一ン社製） 、 AgtlO, Agtll [DNA Cloning, A Practical Approach, 1, .49 (1985)〕 、 λ TriplEx (ク ローンテック社製) 、 AExCell (アマシャム ·フアルマシア ·バイオテク社製) 、 pBluescript II KS (-)、 pBluescript II SK(+) 〔ストラ夕ジーン社製、 ucleic Acids Research, , 9494 (1989)〕 、 pUC18 [Gene, 33. 103 (1985)] 等をあげ ることができる。
DNAを組み込んだベクターをェシエリヒア ·コリに属する微生物に導入する。 ェシエリヒア ·コリに属する微生物としては、 ェシエリヒア 'コリに属する微生 物であればいずれでも用いることができる。 具体的には、 ェシエリヒア 'コリ XLl-Blue MRF' 〔ストラタジ一ン社製、 Strategies, 5, 81 (1992)] 、 ェシエリヒ ァ 'コリ C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] 、 ェシエリヒア 'コリ Y1088
[Science, 222, 778 (1983)3 、 ェシエリヒア 'コリ Y1090 , [Science, 222, 778 (1983)〕 、 ェシエリヒア 'コリ NM522 [J. Mol. Bioし， 166, 1 (1983)] 、 ェシ エリヒア 'コリ K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕 、 ェシエリヒア 'コリ 頂 109 [Gene, 38, 275 (1985)〕 、 ェシエリヒア 'コリ DH5a [J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)] 等をあげることができる。
モレキュラー ·クロ一ニング第 3版、 カレント 'プロトコ一ルズ ·イン 'モレキ ユラ一 ·ノ、、ィォロジ一、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等の実験書に記載されているコロニ 一-ハイプリダイゼーション法、 プラーク ·ハイブリダイゼーション法ぁるいはサ ザンハイプリダイゼーション法等により、 得られた DN Aライブラリ一から目的と するクローンを取得することができる。
ハイブリダィゼーションに用いる DNAプロ一ブとしては、 公知の NDHポリべ プチドをコ一ドする D N Aの塩基配列と.相補的な塩基配列を有する D N Aまたはそ の一部、 公知の N D Hポリペプチドをコードする D N Aの塩基配列をもとに合成し た D N Aなどの他、 公知の塩基配列を利用して設計した D N Aプライマーを用いて P C Rなどにより取得した D N A断片などをあげることができる。
例えば、 配列番号 3で表される塩基配列を有する、 コリネパクテリゥム ·ダル夕 ミカムに属する微生物の ndhの塩基配列をもとに設計した配列番号 1および 2で表 される塩基配列を有する D N Aを、 パーセプティブ ·バイオシステムズ社製 8905 型 D NA合成装置等を用いて化学合成し、 該合成 D NAをプライマーとして、 コリ ネバクテリゥム ·ダルタミカムに属する微生物から取得した D NA断片などを例示 することができる。
取得した D NAをそのまま、 あるいは適当な制限酵素などで切断後、 常法により ベクタ一に組み込み、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えば ABI377D NAシ ークェンサ一 （パーキン 'エルマ一社製） 等を用いたジデォキシ法 〔Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) 3 により、 該 D NAの塩基配列を決定する。 さらに、 決定された塩基配列に基づいたプライ.マーを調製し、 単離精製された染 色体 D NAを铸型として、 P C R法 〔PCR Protocols, Academic Press (1990)〕 に より、 目的とする D NAを取得することができる。
また、 決定された D N Aの塩基配列に基づいて、 パーセプティブ'バイオシステ ムズ社製 8905型 D N A合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする D N Aを調製することもできる。
上記のようにして取得される本発明に用いられるポリペプチドをコードする D N Aとして、 例えば、 ェシエリヒアノコリ DH5 a/pCS- CGndh ( 1¾ 8?-08633)の保有 するプラスミド PC'S- CGndhが有するエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼを コ一ドする D NAをあげることができる。 該 D NAは、 ND Hポリペプチド Aをコ ードする D NAである。 .
得られた本発明に用いられるポリペプチドをコードする D N Aを宿主微生物に導 入することにより、 本発明のアミノ酸の製造法に用いられる微生物を作製すること ができる。
本発明に用いられるポリペプチドコードする D N Aを宿主微生物に導入する方法 としては、 該 D N Aを適当な発現べクタ一のプロモ一ターの下流に揷入して組換え 体 D N Aを作製し、 該組換え体 D NAを宿主微生物に導入する方法をあげることが できる。
宿主微生物は、 好気性細菌であれば特に限定されない。 また、 該微生物の電子伝 達系は、 特にエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼを用いるものでなくても よい。
宿主微生物としては、 例えば、 ェシエリヒア (Escherichia) 属、 コリネバクテ リウム (Corynebacterium) 属、 ブレビバクテリウム (Brevibacterium) 属、 ァー スロバクタ一 （Arthrobacter) 属、 オーレォバクテリゥム （Aureobacterium) 属、 セルロモナス (CeUulomonas) 属、 クラビバクタ一 (Clavibacter) 属、 クルトノ、 クテリゥム (Curtobacterium) 属、 ミクロパクテリゥム (Microbacterium) 属、 ピ メロパクター (Pimerobacter) 属、 ェンテロバクタ一 (Enterobacter) 属、 クレブ シエラ (Klebs iel la) 属、 セラチア（Serrat ia)属、 エルビニァ（Erwinia)属、 バチ ルス (Baci l lus)属、 シュ一ドモナス（Pseudomonas)属、 ァグロパクテリゥム
(Agrobacte um)属、 アナべナ (Anabaena)属、 クロマチウム（Chromat ium)属、 ロド パク夕一 (Rhodobacter)属、 口ドシユードモナス（Rhodopseudomonas)属、 ロドスピ リウム（Rhodospi ri l lum)属、 ストレプトマイセス (Streptomyces) 属、 ザィモモナ , ス (Zymomonas)属等に属する微生物があげられる。
ェシエリヒア属に属する微生物としては、 Escherichia col i XL 1 -Blue,
Escherichia col i XL2 - Blue、 Escherichia col i 腿、 Escherichia col i Μ5 α、 Escherichia col i MC1000, Escherichia col i KY3276, Escherichia col i W1485, Escherichia col i 腿 09、 Escherichia col i HB10K Escherichia col i No. 49、 Escherichia col i W3110、 Escherichia col i NY49、 Escherichia col i MP347 、 Escherichia col i NM52 等のェシェリヒア .コリに属する微生物を'あげることが できる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、 Corynebacter ium glut ami cum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC13869等の Corynebacterium
glut ami cunu Corynebacterium a腿 oniagenes 'ATCC6872、 Corynebacterium
ammoniagenes ATCC21170等の Corynebacterium ammoniagenes. Corvnebacterium acetoacidophi lum ATCC13870等の Corynebacterium acetoacidophi lumに属する微 生物等をあげることができる。
ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、 Brevibacterium imariophi lum, Brevibacterium saccharolyt icunu Brevibacterium f lavum、 Brevibacter ium lactofermentumに属する微生物等をあげることができる。
アースロバクター属に属する微生物としては、 Arthrobacter ci treus,
Arthrobacter globi formisに属する微生物等をあげることができる。
ォ一レオバクテリウム属に属する微生物としては、 Aureobacterium f lavescens, Aureobacter rums erdae, Aureobacterium tes taceumに属する微生物等をあげる ことができる。
セル口モナス属に属する微生物としては、 CeUulomonas f lavigena,
CeUulomonas cartaに属する微生物等をあげることができる。
クラビバクター属に属する微生物とレては、 Clavibacter michiga固 is、
Clavibacterrathayiに属する微生物等をあげることができる。 クルトバクテリウム属に属する微生物としては、 Curtobacterium albidum, Curtobacter iumcitreum, Curtobacterium luteumに属する微生物等をあげること ができる。
ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、 icrobacterium ammoni philum ATCC15354等の Microbacteriji ammoniaphilum^ Microbacterium lacticum,
Microbacterium i即 erialeに属する微生物等をあげることができる。
ピメロパク夕一属に属する微生物としては、 Pimerobacter simplexに属する微 生物等をあげることができる。
ェンテロバクタ一属に属する微生物としては、 Enterobacter agglomerans
ATCC1228 ^(D Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes、 Enterobacter amni genus ^ Enterobacter asburiae> Enterobacter cloacae Enterobacter dissolvens、 Enterobacter gergoviae、 Enterobacter hormaechei'、 Enterobacter intermedius、 Enterobacter nimipressuralis> Enterobacter sakazakii,
Enterobacter tayloraeに属する微生物等をあげることができる。
クレブシエラ属に属する微生物としては、 Klebsiella planticolaに属する微生 物等をあげることができる。
セラチア属に属する微生物としては、 Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens、 Serratia entomophila、 Serratia grimes U、 Serratia proteamacul應:、 Serratia odorifera, Serratia plymuthica Serratia rubidaea. Serratia marcescensに属する微生物等をあげることができる。
エルビニァ属に属する微生物としては、 例えば、 Erwinia uredovora, Erwinia carotovora、 Erwinia ananas、 Erwinia herbicola, Erwinia punctata¾ Erwinia terreus> Erwinia cacticida> Erwinia chrysanthemi、 Erwinia mallotivora^ Erwinia persici應、 Erwinia psidii、 Erwinia quercina> Erwinia rhaponticu Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis に属する微生物等をあげることができる。 バチルス属に属する微生物としては、 Bacillus subtilis、 Bacillus megaterium, Bacillus amylol iquefaciens、 Bacillus coagulans, Bacillus 1 ic eniformis, Bacillus pumilusに属する微生物等をあげることができる。
シユードモナス属に属する微生物としては、 Pseudomonas putidaに属する微生 物等をあげることができる。
ァグロパクテリゥム属に属する微生物としては、 例えば、 Agrobacterium radiobacter Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rubiに属する微生物等 をあげることができる。
アナべナ属に属する微生物としては、 例えば、 Anabaena cylindrica, Anabaena doliolum, Anabaena f losaquaeに属する微生物等をあげることができる。 クロマチウム属に属する微生物としては、 例えば、 Chromatium buderu
Chromatium tepidum, Chromatium vinosu ^ Chromatium warmingiu Chromatium fluviatileに属する微生物等をあげることができる。
ロドバクタ一属に属する微生物としては、 例えば、 Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroidesに属する微生物等をあげることができる。
ロドシユードモナス属に属する微生物としては、 例えば、 Rhodopseudomonas blastica、 Rhodopseudomonas marina. Rhodopseudomonas palustrisに属する微生 物等をあげることができる。
ロドスピリゥム属に属する微生物としては、 例えば、 Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum salexigens> Rhodospirillum salinarumに属する微生物等をあけ、 ることができる。
ストレブトマイセス属に属する微生物としては、 例えば、 Streptomyces ambofaciens^ Streptomyces aureofaciens 、 Streptomyces aur6us、 Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus、
Streptomyces lividans Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis、 Streptomyces vinaceusに属する微生物等をあげるこ とができる。
ザィモモナス属に属する微生物としては、 例えば、 Zymomonas mobiHsに属する 微生物等をあげることができる。
上記宿主微生物のうち、 コリネパクテリゥム属、 ブレビバクテリウム属、 アース ロバクタ一属、 ォ一レオバクテリウム属、 セル口モナス属、 クラビバクター属、 ク ルトバクテリウム属、 ミクロバクテリウム属、 ピメロパクター属、 ェシエリヒア属、 またはバチルス属に属する微生物が好ましく用いられ、 コリネバクテリゥムまたは ェシエリヒア属に属する微生物がより好ましく用いられ、 コリネバクテリウム属に 属する微生物がさらに好ましく用いられる。
宿主微生物への組換え体 D N Aの導入方法としては、 上記宿主微生物へ D N Aを 導入できる方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを 用いる方法 CProc. Natl. Acad. Sci.， USA, 69, 2110 (1972)〕 、 プロトプラスト 法 （特開昭 63- 248394) 、 エレクトロボレ一シヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕 等をあげることができる。
発現ベクターとしては、 宿主微生物において自立複製可能ないしは染色体中への 組込が可能で、 本発明に用いられるポリペプチドをコードする DNAを転写できる 位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
例えば、 pBTrp2、 pBTac pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイム社製） 、 pHelixl (ロシュ ·ダイァグノステイクス社製) 、 PKK233-2 (アマシャム ·フアル マシア ·バイオテク社製) 、 PSE280 (インビトロジェン社製） 、 GEMEX-1 (プロメ ガ社製） 、 PQE- 8 (キアゲン社製） 、 pET- 3 (ノバジェン社製） 、 pKYPIO (特開昭 58-110600) 、 PKYP200 [Agric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)〕 、 pLSAl [Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)3、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4.306 (1985) 3 、 pBluescriptll SK (十）、 Bluescript II KS (-) (ストラタジーン社製) 、 pTrS30 〔ェシエリヒア ·コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製〕 、 pTrS32
〔ェシェリヒア 'コリ JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408)より調製〕 、 pPAC31
(W098/12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)3、 pSTV28(宝酒造社製)、 UC118
(宝酒造社製) 、 PAl (特開昭 63- 233798) 、 pCG116、 pCGl (特開平 6- 277082)、 PCS299P (W0 00/63388)等があげられる。 '
プロモーターとしては、 宿主微生物中で機能するものであればいかなるものでも よい。 例えば、 tr プロモーター (Ptrp) 、 lacプロモーター (Plac) 、' PLプロモ —夕一、 PRプロモ一夕一、 PSEプロモ一夕一等の、 ェシエリヒア 'コリに属する 微生物やファージ等に由来するプロモーター、 SPOlプロモ一夕一、 SP〇2プ 口モータ—、 p e nPプロモーター等をあげることができる。 また Plrpを 2つ直列 させたプロモーター、 tacプロモーター、 lacT7プロモータ一、 let Iプロモータ 一のように人為的に設計改変されたプロモータ一等も用いることができる。
また、 宿主微生物がコリネバクテリウム属に属する微生物である場合、 P54- 6プ 口モーター [Αρρ1· Microbiol. Biotec nol., 53, 674-679 (2000)] もあげられる。 バチルス属に属する微生物である場合、 xylAプロモー夕一 〔Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)〕 もあげられる。
組換え体 DNAは宿主微生物中で自立複製可能であると同時に、 上記プロモータ 一、 リボソーム結合配列、 本発明に用いられるポリペプチドをコードする DNA、 転写終結配列より構成された組換え体 DNAであることが好ましい。 プロモー夕一 を制御する遺伝子が含まれていでもよい。
リボソーム結合配列であるシャイン—ダルガノ （Shine-Dalgarno) 配列と開始コ ドンとの間は、 適当な距離 （例えば 6〜18塩基） を有していることが好ましい。 転写終結配列は必ずしも必要ではないが、 構造遺伝子の直下に転写終結配列を配 置することが好ましい。
このような組換え体 DNAとしては、 例えばェシエリヒア■コリ DH5a/ pCS- CGndh (FERM BP- 08633)の保有するプラスミド pCS-CGndhをあげることができる。 上記方法によって得られる本発明の微生物としては、 例えば実施例に示されるコ リネバクテリゥム ·ダルタミカム LS-22/pCS-CGndh, コリネパクテリゥム ·ダル夕 ミカム ATCC14752/PCS- CGndh、 コリネパクテリゥム ·グルタミカム FERM BP - 1069/pCS-CGndhをあげることができる。 宿主微生物に導入された本発明【こ用いられるポリペプチドをコードする D N Aは、 微生物中で組換え体 D NA上に存在していてもよいし、 染色体上に組み込まれてい てもよい。
該 D N Aを染色体上に組み込む方法としては、 例えば、 Escherichia col i and Salmonel la typ imurium, 1996年、 2325頁、 2339頁、 アメリカン ·ソサエティ 一 ·フォ一 ·マイクロバイオロジー等に記載のファー やトランスポゾンを用いる 方法をあげることができる。
本発明に用いられるポリぺプチドをコ一ドする D N Aを導入して得られる微生物 (以下、 本発明の微生物と略す） を培地に培養し、 培養物中にアミノ酸を生成、 蓄 積させ、 該培養物からアミノ酸を採取することにより、 アミノ酸を製造することが できる。
アミノ酸に特に限定はなく、 L—グルタミン酸、 L一グルタミン等の 2—ォキソ ダルタル酸から生合成されるアミノ酸、 Lーァスパラギン酸、 L—ァスパラギン等 のォキサ口酢酸から生合成されるアミノ酸、 L一リジン、 L—メチォニン、 L—ト レオニン等のァスパラギン酸から生合成されるアミノ酸、 L一アルギニン、 L—プ 口リン、 Lーシトルリン等の L一グルタミン酸から生合成されるアミノ酸、 L—バ リン、 L—ロイシン、 L—イソロイシン等のピルビン酸から生合成されるアミノ酸、 Lーセリン、 L一システィン、 グリシン等の 3 _ホスホダリセリン酸から生合成さ、 れるアミノ酸、 L一トリブトファン、 Lーチロシン、 L一フエ二ルァラニン等のコ リスミ酸から生合成されるアミノ酸、 L—ヒスチジン等があげられる。
培養に用いる培地として.は、 本発明の微生物が資化することのできる炭素源、 窒 素源、 無機塩類等を含有し、 該微生物が生育でき、 かつ目的とするアミノ酸の生産 が効率的に行なえる培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。 炭素源としては、 本発明の微生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクトース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加 分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 メタノール、 ェタノ一ル、 プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アン モニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その 他の含窒素化合物、 ならびにペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスティープ リカー、 カゼイン加水分解物、 大豆粕加水分解物、 各種醱酵菌体、 およびその消化 物等を用いることができる。
' 無機塩としては、 リン酸二水素カリウム、 リン酸水素二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。 培養は、 通常、 振とう培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行なう。 培養温度は 15° (：〜 50°Cがよく、 より好ましくは 20°C〜45°Cである。 培養時間は通 常 5時間〜 7日間、 より好ましくは 12時間〜 4日間である。 培養中必要に応じて PHを 3〜9に保持する。 pHの調整は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア等を用いて行なう。
また培養中必要に応じて、 ペニシリンやアンピシリン、 テトラサイクリン等の抗 生物質を培地に添加してもよい。
プロモ一夕一として誘導性のプロモーターを用いた組換え体 D NAを用いて D N Aを導入した微生物を培養するときには、 必要に応じてインデューサ一を培地に添 加してもよい。 例えば、 l acプロモーターを用いた組換え体 D NAを用いて D NA を導入した微生物を培養するときにはィソプロピル一 ]3— D—チォガラクトピラノ シド等を、 t r プロモーターを用いた組換え体 D NAを用いて D NAを導入した微 生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
培養終了後の培養液から、 活性炭を用いる方法、 イオン交換樹脂を用いる方法、 結晶化法、 沈殿法等の、 通常アミノ酸の単離に用いられる方法を単独でまたは組み 合わせて、 アミノ酸を採取することができる。
以下に実施例を示すが、 本発明は下記実施例に限定されるものではない。 実施例 1
( 1 ) コリネバクテリゥム ·グルタミカム LS，22株を LB培地 〔10g/Lバクトト リプトン （ディフコ社製） 、 5g/Lイーストエキストラクト （ディフコ社製） およ び 5g/L塩化ナトリウムを含む培地〕 に植菌し、 30°Cで一晩培養した。 培養後、 Ei kmannsらの方法 〔Mi crobi ol .， 140, 1817 (1994)〕 に準じて、 該微生物の染色体 D NAを単離精製した。
' 配列番号 3で表されるコリネバクテリウム ·ダルタミカム ATCC13032の ndhの塩 基配列に基いて配列番号 1および 2で表される塩基配列を有する D NAを合成した。 該 D N A (各 0. 5 mo 1/L)をプライマーとし、 上記染色体 D N A (0. 1 /i g)を铸型 として、 HuDNAポリメラーゼ （ストラタジーン社製） 2. 5単位ぉょび各200 11101/ Lの dNTP (dATP、 dGTP、 dCTPおよび dTTP) を含む反応液 40 L中で PCRを行なつ た。
反応終了後、 得られた反応液のうち 4 Lをァガロースゲル電気泳動に供し、 公 知のコリネバクテリゥム ·ダルタミカムの ndhに相当する 1. 9kbの断片が増幅して いることを確認した後； 残りの反応液と等量の TE 〔10腿 o l/L トリス-塩酸 (pH8. 0)、 1腿 o l/Lエチレンジァミン四酢酸を含有する溶液〕 飽和フエノール/クロロフオル ム （lvo l/lvo l) 溶液を混合した。 該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍量 の冷エタノールを加えて混合し、 - 80°Cで 30分間放置した。 該溶液を遠心分離して DNAを得、 該 DNAを 20 Lの TEに溶解した。
該 DNA溶解液 5/ Lと pGEMR- T Easy vector . (プロメガ社製） 0.06 zgを pGEMR - T Easy vector systemのライゲーシヨンキット （プロメガ社製） を用いて 16°Cで 16時間反応させ、 ndhを含む DNA断片と pGEMR-T Easy vectorを連結した。
連結反応後の反応液を用いてェシェリヒア ·コリ DH5 α株を、 エレクトロボレ一 シヨン法 (Nucleic acid Res., 16, 6127-6145 (1988)〕 によって形質転換レた。 得られた形質転換体を、 100 g/mL のアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布し、 30°Cで一晩培養した。 該寒天培地上に生育したコロニーより常法により従ってブラ スミドを抽出し、 制限酵素を用いてその構造を解析することにより、 pGEMR-T Easy vectorにコリネバクテリゥム ·ダルタミカムの ndhを含む DNA断片が揷入され たプラスミドであることを確認した。 このプラスミドを pT- CGndhと命名した。
プラスミド pT-CGndh 1 gを制限酵素 Kpnlおよび Sailで切断し、 得られた DN A断片を含む溶液をァガロースゲル電気泳動に供し、 約 2kbの DNA断片を分離し た。 ，
コリネ型細菌用の発現べクタ一である pCS299P(TO 00/63388)0.2 i を制限酵素 Kpnlおよび Sailで切断後、 得られた DNA断片を含む溶液をァガロースゲル電気 泳動に供し、 約 5.4kbの DNA断片を分離した。
上記で得られた ndhを含む約 2kbの DNA断片と pCS299Pの切断断片 （約
5.4kb) をライゲ一シヨンキット (宝酒造社製） を用いて、 6°Cで 16時間反応させ て連結した。
連結反応後の反応液を用いてコリネバクテリゥム ·ダルタミカム LS-22株を、 ェ レクトロボレ一シヨン法 [Nucleic acid Res., 16, 6127-6145 (1988)] を用いて 形質転換した。
得られた形質転換体を 25/ g/mLのカナマイシンを含む LB寒天培地に塗布し、 30°Cで一日間培養した。 該寒天培地上に生育したコロニーより、 常法によりプラス ミドを抽出し、 制限酵素を用いてその構造を解析して、 該プラスミドが、 PCS299P に ndhを含む DNA断片が挿入されたプラスミドであることを確認した。 このブラ スミドを pCS- CGndhと命名した。
プラスミド PCS- CGndhを含有するェシェリヒア 'コリ DH5 /pCS- CGndhは、 FERM BP - 08633として、 平成 16年 2月 19日付けで、 独立行政法人産業技術総合研究 所 特許生物寄託センタ一、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) に寄託されている。
(2) コリネパクテリゥム ·ダルタミカム LS-22株およびコリネパクテリゥム · ダルタミカム LS- 22株に pCS- CGndhを導入したコリネパクテリゥム ·ダルタミカム LS-22/pCS-CGndh株をそれぞれ、 試験管中の LB培地 5mLに植菌し、 30°Cでー晚振 とう培養した。
培養液 lmLを l OOmLの MG培地 〔10g/L グルコース、 3g/L リン酸二水素カリウム、 3g/L リン酸水素二カリウム、 2g/L塩化アンモニゥム、 2g/L尿素、 0. 5g/L硫酸マ グネシゥム · 7水和物、 10mg/L硫酸鉄 · 1 0水和物、 lmg/L硫酸マンガン · 7水 和物、 30mg/L ピオチン、 lmg/Lチアミン塩酸塩、 20mg/L システィン塩酸塩、 0. 5g /L カザミノ酸、 および lmL/L メタルミックス （990mg/L硫酸鉄 · 7水和物、 880m g/L硫酸亜鉛 · 7水和物、 393mg/L硫酸銅 · 5水和物、 72mg/L塩化マンガン · 4 水和物、 88mg/L 四ホウ酸ナトリウム ' 1 0水和物および 37mg/Lパラモリブデン 酸アンモニゥム · 4水和物を含有する溶液）を含有する培地〕 の入った 500mL容三 角フラスコに添加し、 30°Cで 80時間、 220ΠΜΙで振とう培養した。 培養後、 培養上 清のグルタミン酸濃度を HPLCにて定量した。
HPLC分析は、 培養上清を 40 でカラム AQ- 312 (YMC社製）に供し （移動相： 2. 94 g/L クェン酸ナトリウム、 1. 42g/L硫酸ナ卜リウ厶、 17mL/L n-プロパノールおよ び 3g/L ラウリル硫酸ナトリウムを含有する pH 2. 4の溶液） 、 反応液 (18. 5g/L ホ ゥ酸、 l lg/L NaOH、 0. 6g/Lオルトフタルアルデヒド、 2ml/L メルカプトエタノー ルおよび 3mL/L Br ige- 35を含有する溶液）と混合し、 励起波長 345nm、 吸収波長 45 5nmの蛍光分析に供して行つた。
その結果、 コリネバクテリゥム ·ダルタミカム LS- 22株が培養液中に 1. 5g/Lの グルタミン酸を蓄積していたのに対し、 コリネバクテリウム 'ダルタミカム LS-22 /pCS-CGndh株は 2. 3g/Lのグルタミン酸を蓄積していた。
実施例 2
実施例 1と同様に、 エレクト口ポレーシヨン法を用いてコリネバクテリゥム ·グ ルタミカム ATCC14752株に pCS- CGndhを導入し、 コリネバクテリゥム ·グルタミ カム ATCC14752/pCS-CGndh株を得た。
コリネパクテリゥム ·ダルタミカム ATCC14752株およびコリネバクテリゥム · ダルタミカム ATCC14752/pCS- CGndh株を、 それぞれ GS培地 [70g/L グルコース、 10g/L コーンスティープリカ一、 10g/L 肉エキス、 10g/L酵母エキス、 5g/L硫酸 アンモニゥム、 0. 5g/L リン酸二水素カリウム、 1. 5g/L リン酸水素二カリウム、 0. 5g/L硫酸マグネシウム · 7水和物、 10mg/L硫酸鉄 · 1 0水和物、 10mg/L硫酸 マンガン' 7水和物、 0. 8mg/L硫酸銅' 5 7K和物、 8. 3g/L 尿素、 5 i g/L ピオチン、 および lmg/Lチアミン塩酸塩を含有し、 pH 7. 2の培地〕 5mLの入った試験管に植 菌し、 30 で 24時間振とう培養した。
この培養液 2. 5mLを 25mLの GP培地 〔116g/L グルコース、 4g/L フラク 1 ス、 50g/L塩化アンモニゥム、 10mg/L ニコチン酸、 0. 7g/L リン酸二水素カリウム、 0. 7g/L リン酸水素二カリウム、 0. 5g/L硫酸マグネシウム · 7水和物、 20mg/L硫 酸鉄. 1 0水和物、 20mg/L 硫酸マンガン ' 7水和物、 0. 8mg/L硫酸銅 ' 5水和物、 5g/L尿素、 0. 5 /i g/L ピオチン、 lmg/Lチアミン塩酸塩および 50g/L炭酸カルシ ゥムを含有し、 PH 7. 2の培地〕 の入った三角フラスコに添加し、 30°Cで 72時間、 22(kpmで振とう培養した。
培養後、 培養上清中のグルタミンの蓄積量を実施例 1に記載した HPLC条件で定 量した。
その結果、 コリネバクテリゥム ·ダルタミカム ATCC14752株のグルタミンの蓄積 量は 32. 2g/Lであるのに対し、 コリネバクテリゥム ·ダルタミカム
ATCC14752/pCS-CGndh株のグル夕ミンの蓄積量は 33. 3g/Lであった。
実施例 3
実施例 1と同様に、 エレクトロボレ一シヨン法を用いてコリネパクテリゥム ·グ ル夕ミカム FERM BP-1069株に pCS- CGndhを導入し、 コリネバクテリゥム ·グル夕 ミカム FERM BP- 1069/pCS- CGndh株を得た。
コリネバクテリゥム ·ダルタミカム FERM BP- 1069株およびコリネバクテリウ ム ·グルタミカム FERM BP-1069/pCS_CGndh株を、 それぞれ、 LS培地 〔50g/L シュ クロース、 30g/L コーンスティープリカ一、 20g/L 肉エキス、 20g/Lカザミノ酸、 8g/L硫酸アンモニゥム、 2g/L リン酸二水素カリウム、 0. 5g/L硫酸マグネシゥ ム · 7水和物、 3g/L尿素、 20g/Lペプトン、 10mg/L硫酸鉄 · 1 0水和物、 10mg/L 硫酸亜鉛 · 7水和物、 20mg/Lニコチン酸、 10mg/Lパントテン酸カルシウム、
0. Img/L ピオチン、 lmg/L チアミン塩酸塩および 10g/L 炭酸カルシウムを含有し、 pH 7. 2の培地〕 5mLの入った試験管に植菌し、 30°Cで 24時間振とう培養した。
この培養液 0. 5mLを LP培地 〔100g/L 糖蜜 （糖分として）、 45g/L硫酸アンモニ ウム、 3g/L尿素、 0. 5g/L リン酸二水素カリウム、 0. 5g/L硫酸マグネシウム， 7 水和物、 0. 3mg/L ピオチンおよび 30g/L炭酸カルシウムを含有し、 pH7. 0の培地〕 5mLの入った試験管に添加し、 30でで 72時間、 220rpmで振とう培養した。 培養終 了後、 培養上清のリジン濃度を HPLCにて定量した。
HPLC分析は、 培養上清を、 40°Cでカラム 0DS- 80TS (TOSOH社製）に供し （移動 相： 2. 94g/L クェン酸ナトリウム、 1. 42g/L硫酸ナトリウム、 300mL/L ァセトニト リル、 および 3g/L ラウリル硫酸ナトリウムを含有する pH 6. 0の溶液） 、 反応液 (18. 5g/Lホウ酸、 l lg/L水酸化ナトリウム、 0. 6g/Lオルトフタルアルデヒド、 2ml/L メルカプトエタノールおよび 3mL/L Br ige- 35を含有する溶液）と混合し、 励 起波長 345nm、 吸収波長 455nmの蛍光分析に供して行った。
その結果、 コリネバクテリゥム ·ダルタミカム FERM BP- 1069株のリジンの蓄積 量は 24. 8g/Lであったのに対し、 コリネパクテリゥム ·ダルタミカム PERM BP - 1069/pCS-CGndh株のリジンの蓄積量は 28. 6g/Lであった。 産業上の利用可能性
本発明により、 工業的に有利なアミノ酸の製造法を提供する 配列表フリーテキスト 配列番号 1一人工配列の説明： '合成 D N A
配列番号 2—人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲
1 . ェ,ネルギ一非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコ一ドする DN Aを導入して 得られる微生物を培地に培養し、 培養物中にアミノ酸を生成、 蓄積させ、 該培養物 よりアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
2 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする D NAが、 コリネ バクテリゥム (Corynebacterium) 属、 ェシエリヒア (Escherichia)'属、 シユード モチス属 (Pseudomonas) 属、 ァゾトパクター (Azotobacter) 属、 サルモネラ
(Salmonel la) 属およびラクトバチルス (Lactobaci l lus) 属に属する微生物から なる群より選ばれる微生物由来の D NA、 または該 DNAの塩基配列と相補的な塩 基配列を有する D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aで あることを特徴とする、 請求の範囲第 1項記載の製造法。 ，
3 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする D N Aが、 コリネ バクテリウム ·ダルタミカム (Corynebacterium glutamicum) 、 コリネバクテリウ ム .ジフテリ.ァ (Corynebacterium diphtheriae 、 ェシエリヒア .コリ
(Escherichia c li) 、 シユードモナス ·フレオレツセンス (Pseudomonas f luorescens) 、 アツ卜ノ クタ一'ビネランアイ一 (Azotobacter vinelandi u 、 サルモネラ ·ティフィムリウム (Salmonel la typhi murium) およびラクトバチル ス ·プラン夕ラム (Lactobaci l lus pi ant arum) に属する微生物からなる群より選 ばれる微生物由来の D NA、 'または該 D NAの塩基配列と相補的な塩基配列を有す る D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aであることを特 徵とする、 請求の範囲第 1項記載の製造法。
4. エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする D NAが、 配列番 号 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3および 1 5で表される塩基配列からなる群より選ば れる塩基配列を有する D N A、 または該塩基配列と相補的な塩基配列を有する D N Aとストリンジエンドな条件下でハイブリダィズする D NAである、 請求の範囲第
1項記載の製造法。
5 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする D NAが、 ェシェ リヒア ·コリ DH5 a/pCS-CGndh (FERM BP- 08633)の保有するプラスミド CS-CGndhの 有するエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする D NAまたは該 D NAの塩基配列と相補的な塩基配列を有する D NAとストリンジェントな条件下で ハイプリダイズし、 かつエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ活性を有する ポリペプチドをコードする D NAである、 請求の範囲第 1項記載の製造法。
6 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼが、 配列番号 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4および 1 6で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配 列を有するポリペプチド、 .または該ポリべプチドの有するアミノ酸配列において、
1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつェ ネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチドであることを 特徴とする、 請求の範囲第 1項記載の製造法。 .
7 . エネルギー非産生型 NADHデヒド口ゲナ一ゼが、 ェシエリヒア .コリ DH5 α /pCS-CGndh (FERM BP-08633)の保有するプラスミド pCS- CGndhの有するエネルギー 非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする D NAにコードされるポリペプチド、 または該ポリぺプチドの有するアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつエネルギー非産生型 NADHデ ヒドロゲナ一ゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする、 請求の範囲第 1項記載の製造法。
,8 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコ一ドする D NAを導入する 微生物が、 ェシエリヒア (Escherichia) 属、 コリネバクテリゥム属
(Corynebacterium) 、 ブレビバクテリウム (Brevibac terium) 属、 アースロバク ター (Arthrobacter) 属、 オーレォバクテリゥム (Aureobacterium) 属、 セルロモ ナス (CeHulomonas) 属、 クラビバクタ一 (Clavibacter) 属、 クルトバクテリウ ム (Curtobacterium) 属、 ミクロパクテリゥム (Microbacterium) 属、 ピメロバク 夕一 (Pimerobacter) 属およびバチルス (Baci l lus) 属に属する微生物からなる群 より選ばれる微生物であ 、 請求の範囲第 1〜 7項いずれか 1項に記載の製造法。 9 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする D NAを導入する 微生物が、 ェシエリヒア属に属する微生物である、 請求の範囲第 1〜 7項いずれか 1項に記載の製造法。
1 0 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする D NAを導入す る微生物が、 ェシエリヒア ·コリに属する微生物である、 請求の範囲第 1〜7項い ずれか 1項に記載の製造法。
1 1 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする D NAを導入す る微生物が、 コリネパクテリゥム属に属する微生物である、 請求の範囲第 1〜 7項 いずれか 1項に記載の製造法。
1 2 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする D NAを導入す る微生物が、 コリネパクテリゥム ·ダルタミカム (Corynebacterium glut ami cum) 、 コリネパクテリゥム 'フラバム (Corynebacterium f lavum) 、 コリネバクテリウ ム 'ラクトフアーメンタム (Corynebacterium lactofermentum) およびコリネバク テリゥム ·エフイカシス (Corynebacterium ef f icas is) に属する微生物からなる 群より選ばれる微生物である、 請求の範囲第 1〜 7項いずれか 1項に記載の製造法。
1 3 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする D NAを導入す る微生物が、 コリネバクテリウム ·ダルタミカムに属する微生物である、 請求の範 囲第 1〜 7項いずれか 1項に記載の製造法。
1 4. アミノ酸が、 L—グルタミン酸、 L一グルタミン、 L—ァスパラギン酸、 Lーァスパラギン、 L—リジン、 L一メチォニン、 L—トレオニン、 L—アルギニ ン、 L—プロリン、 L—シトルリン、 L—バリン、 L—ロイシン、 L—イソ口イシ ン、 L—セリン、 L—システィン、 グリシン、 L—トリブトファン、 L—チロシン、 L—フエ二ルァラニンおよび L一ヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸であ る、 請求の範囲第 1〜 1 3項いずれか 1項に記載の製造法。
1 5 . アミノ酸が、 L—グルタミン酸、 L一グルタミンおよび L一リジンからな る群より選ばれるアミノ酸である、 請求の範囲第 1〜1 3項いずれか 1項に記載の 製造法。
1 6 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする D N Aを導入し て得られるコリネパクテリゥム属に属する微生物。
1 7 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする D N Aを導入し て得られるコリネバクテリゥム ·ダルタミカムに属する微生物。
1 8 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコードする D NAが、 コリ ネバクテリウム属、 ェシエリヒア属、 シユードモナス属、 ァゾトバク夕ー属、 サル モネラ属およびラクトバチルス属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由 来の D NA、 または該 D NAの塩基配列と相補的な塩基配列を有する D NAとスト リンジェントな条件下でハイブリダィズする D NAである、 請求の範囲 1 6または 1 7記載の微生物。
1 9 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコードする D N Aが、 コリ ネバクテリゥム ·ダルタミカム、 コリネパクテリゥム ·ジフテリア、 ェシエリヒ ァ ·コリ、 シユードモナス ·フルォレツセンス、 ァゾトパクター ·ビネランディ一、 サルモネラ ·ティフィムリウムおよびラクトバチルス ·プランタラムに属する微生 物からなる群より選ばれる微生物由来の D NA、 または該 D NAの塩基配列と相補 的な塩基配列を有する D NAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする D N Aである、 請求の範囲第 1 6または 1 7項記載の微生物。
2 0 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする D NAが、 配列 番号 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3および 1 5で表される塩基配列からなる群より選 ばれる塩基配列を有する D N A、 または該塩基配列と相補的な塩基配列を有する D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aである、 請求の範囲 第 1 6または 1 7項記載の微生物。
2 1 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼをコ一ドする D NAが、 ェシ エリヒア ·コリ DH5 «/pCS- CGndh (FERM BP- 08633)の保有するプラスミド pCS - CGndhの有するエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼをコ一ドする D NAま たは該 D NAの塩基配列と相補的な塩基配列を有する D NAとストリンジェントな 条件下でハイプリダイズし、 かつエネルギー非産生型 NADHデヒド口ゲナ一ゼ活性 を有するポリペプチドをコードする D NAである、 請求の範囲第 1 6または 1 7項 記載の微生物。
2 2 . エネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナ一ゼが、 配列番号 4、 6、 8、
1 0、 1 2、 1 4および 1 6で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるァミノ 酸配列を有するポリべプチド、 または該ポリべプチドの有するアミノ酸配列におい て、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か つエネルギ一非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチドである、 請求の範囲第 1 6または 1 7項記載の微生物。
2 3 . エネルギ一非産生型 NADHデヒドロゲナーゼが、 ェシエリヒア ·コリ DH5 a/pCS-CGndh (FERM BP- 08633)の保有するプラスミド pCS_CGndhの有するエネルギ —萍産生型 NAMデヒド口ゲナーゼをコ一ドする D N Aによりコードされるポリぺ プチド、 または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつエネルギー非産生型 NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリぺプチドであることを特徴とする請求の 範囲第 1 6または 1 1項記載の微生物。
2 4 . コリネバクテリゥム ·グルタミカム ATCC14752/pCS_CGndh、 またはコリネ パクテリゥム ·グルタミカム FERM ΒΡ-1069/pCS-CGndho
2 5 . ェシェリヒア 'コリ DH5 α/pCS-CGndh (FERM BP-08633) 。
2 6 . ェシェリヒア ·コリ DH5 α/pCS-CGndh (FERM BP-08633) の保有するプラ スミド pCS_CGndh0
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