JP4780783B2 - アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Description
例えば、エシェリヒア・コリのエネルギー産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを増幅させるか、またはエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを欠損させることでアミノ酸の生産性が向上することが報告されている(特開2002-17363号)。
電子伝達系における変異が微生物の生育に及ぼす影響について、Molenaarらはコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacteriumglutamicum)のNADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを破壊したが、生育等への影響はなかったことを報告している〔Journal of Bacteriology, 182, p.6884-6891(2000)〕。
従来の方法に加えてさらに物質の生産性を向上させる方法の開発が望まれている。
本発明は以下の(1)〜(26)に関する。
(1) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入して得られる微生物を培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物よりアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
(2) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エシェリヒア(Escherichia)属、シュードモナス属(Pseudomonas)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、サルモネラ(Salmonella)属およびラクトバチルス(Lactobacillus)属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のDNA、または該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであることを特徴とする、上記(1)の製造法。
(3) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacteriumglutamicum)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)、エシェリヒア・コリ(Escherichiacoli)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、アゾトバクター・ビネランディー(Azotobactervinelandii)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)およびラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillusplantarum)に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のDNA、または該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであることを特徴とする、上記(1)の製造法。
(4) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、配列番号3、5、7、9、11、13および15で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するDNA、または該塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである、上記(1)の製造法。
(5) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、エシェリヒア・コリDH5α/pCS-CGndh(FERM BP-08633)の保有するプラスミドpCS-CGndhの有するエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAまたは該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAである、上記(1)の製造法。
(6) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼが、配列番号4、6、8、10、12、14および16で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする上記(1)の製造法。
(7) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼが、エシェリヒア・コリDH5α/pCS-CGndh(FERM BP-08633)の保有するプラスミドpCS-CGndhの有するエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAにコードされるポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする上記(1)の製造法。
(8) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入する微生物が、エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、オーレオバクテリウム(Aureobacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、クラビバクター(Clavibacter)属、クルトバクテリウム(Curtobacterium)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ピメロバクター(Pimerobacter)属およびバチルス(Bacillus)属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記(1)〜(7)いずれか1つの製造法。
(9) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記(1)〜(7)いずれか1つの製造法。
(10) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入する微生物が、エシェリヒア・コリに属する微生物である、上記(1)〜(7)いずれか1つの製造法。
(11) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入する微生物が、コリネバクテリウム属に属する微生物である、上記(1)〜(7)いずれか1つの製造法。
(12) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacteriumglutamicum)、コリネバクテリウム・フラバム(Corynebacterium flavum)、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム(Corynebacteriumlactofermentum)およびコリネバクテリウム・エフィカシス(Corynebacterium efficasis)に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記(1)〜(7)いずれか1つの製造法。
(13) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である、上記(1)〜(7)いずれか1つの製造法。
(14) アミノ酸が、L−グルタミン酸、L−グルタミン、L−アスパラギン酸、L−アスパラギン、L−リジン、L−メチオニン、L−トレオニン、L−アルギニン、L−プロリン、L−シトルリン、L−バリン、L−ロイシン、L−イソロイシン、L−セリン、L−システイン、グリシン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−フェニルアラニンおよびL−ヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸である、上記(1)〜(13)いずれか1つの製造法。
(15) アミノ酸が、L−グルタミン酸、L−グルタミンおよびL−リジンからなる群より選ばれるアミノ酸である、上記(1)〜(13)いずれか1つの製造法。
(16) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入して得られるコリネバクテリウムに属する微生物。
(17) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAを導入して得られるコリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物。
(18) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、シュードモナス属、アゾトバクター属、サルモネラ属およびラクトバチルス属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のDNA、または該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである、上記(16)または(17)の微生物。
(19) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ジフテリア、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・フルオレッセンス、アゾトバクター・ビネランディー、サルモネラ・ティフィムリウムおよびラクトバチルス・プランタラムに属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のDNA、または該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである、上記(16)または(17)の微生物。
(20) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、配列番号3、5、7、9、11、13および15で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するDNA、または該塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである、上記(16)または(17)の微生物。
(21) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAが、エシェリヒア・コリDH5α/pCS-CGndh(FERM BP-08633)の保有するプラスミドpCS-CGndhの有するエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAまたは該DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAである、上記(16)または(17)の微生物。
(22) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼが、配列番号4、6、8、10、12、14および16で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドである、上記(16)または(17)の微生物。
(23) エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼが、エシェリヒア・コリDH5α/pCS-CGndh(FERM BP-08633)の保有するプラスミドpCS-CGndhの有するエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAによりコードされるポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする上記(16)または(17)の微生物。
(24) コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC14752/pCS-CGndh、またはコリネバクテリウム・グルタミカム FERM BP-1069/pCS-CGndh。
(25) エシェリヒア・コリDH5α/pCS-CGndh(FERM BP-08633)。
(26) エシェリヒア・コリDH5α/pCS-CGndh(FERM BP-08633)の保有するプラスミドpCS-CGndh。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacteriumdiphtheriae)に属する微生物等をあげることができる。
シュードモナス属に属する微生物としては、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)に属する微生物等をあげることができる。
アゾトバクター属に属する微生物としては、アゾトバクター・ビネランディー(Azotobacter vinelandii)に属する微生物をあげることができる。
ラクトバチルス属に属する微生物としては、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)に属する微生物をあげることができる。
これらの微生物に由来するNDHポリペプチドとしては、例えば、コリネバクテリウム属に属する微生物に由来する配列番号4または6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、エシェリヒア属に属する微生物に由来する配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、シュードモナス属に属する微生物に由来する配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、アゾトバクター属に属する微生物に由来する配列番号12で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、サルモネラ属に属する微生物に由来する配列番号14で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ラクトバチルス属に属する微生物に由来する配列番号16で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド等の公知のNDHポリペプチドをあげることができる。
さらに、本発明に用いられるNDHポリペプチドは、エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼ活性を有していれば、NDHポリペプチドAまたは公知のNDHポリペプチドの有するアミノ酸配列に1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
NDHポリペプチドAまたは公知のNDHポリペプチドの有するアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加があることを意味し、欠失、置換若しくは付加が同時に生じてもよい。
天然型アミノ酸としては、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン、L−グルタミン酸、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−アルギニン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−システインなどがあげられる。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
また、NDHポリペプチドAまたは公知のNDHポリペプチドに1以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するためには、欠失、置換若しくは付加前のポリペプチドと、少なくとも60%以上、通常は80%以上、特に95%以上の相同性を有していることが好ましい。
BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(
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.)。
NDHポリペプチドをコードするDNAとしては、エネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAであれば、いずれのDNAであってもよい。
NDHポリペプチドAまたは公知のNDHポリペプチドをコードするDNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとは、例えば、NDHポリペプチドAまたは公知のNDHポリペプチドをコードするDNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAを意味する。
NDHポリペプチドAまたは公知のNDHポリペプチドをコードするDNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、上記BLASTやFASTA等を用いて計算したときに、NDHポリペプチドAまたは公知のNDHポリペプチドをコードするDNAの塩基配列と75%以上の相同性を有するDNA、好ましくは80%以上の相同性を有するDNA、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
公知のNDHポリペプチドをコードするDNAの塩基配列をもとに合成したDNAをプライマーとして用い、単離精製された上記微生物の染色体DNAを鋳型としてPCR法〔PCR Protocols, Academic Press (1990)〕を用いて目的とするDNAを取得することができる。
また、以下の方法によっても、目的とするDNAを取得することができる。
単離精製した染色体DNAを用いて、モレキュラー・クローニング第3版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法に準じてDNAライブラリーを作製する。
エシェリヒア・コリに属する微生物としては、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、エシェリヒア・コリXL1-Blue MRF' 〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、エシェリヒア・コリ C600 〔Genetics、39, 440 (1954)〕、エシェリヒア・コリ Y1088 〔Science, 222, 778 (1983)〕、エシェリヒア・コリ Y1090 〔Science, 222, 778 (1983)〕、エシェリヒア・コリ NM522 〔J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)〕、エシェリヒア・コリ K802 〔J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕、エシェリヒア・コリ JM109 〔Gene, 38, 275 (1985)〕 、エシェリヒア・コリ DH5α〔J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)〕等をあげることができる。
さらに、決定された塩基配列に基づいたプライマーを調製し、単離精製された染色体DNAを鋳型として、PCR法〔PCR Protocols, Academic Press (1990)〕により、目的とするDNAを取得することができる。
上記のようにして取得される本発明に用いられるポリペプチドをコードするDNAとして、例えば、エシェリヒア・コリDH5α/pCS-CGndh(FERM BP-08633)の保有するプラスミドpCS-CGndhが有するエネルギー非産生型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNAをあげることができる。該DNAは、NDHポリペプチドAをコードするDNAである。
本発明に用いられるポリペプチドコードするDNAを宿主微生物に導入する方法としては、該DNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAを宿主微生物に導入する方法をあげることができる。
宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、オーレオバクテリウム(Aureobacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、クラビバクター(Clavibacter)属、クルトバクテリウム(Curtobacterium)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ピメロバクター(Pimerobacter)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アナベナ(Anabaena)属、クロマチウム(Chromatium)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、ロドスピリウム(Rhodospirillum)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、ザイモモナス(Zymomonas)属等に属する微生物があげられる。
アースロバクター属に属する微生物としては、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globiformisに属する微生物等をあげることができる。
セルロモナス属に属する微生物としては、Cellulomonas flavigena、Cellulomonas cartaに属する微生物等をあげることができる。
クルトバクテリウム属に属する微生物としては、Curtobacterium albidum、Curtobacter iumcitreum、Curtobacteriumluteumに属する微生物等をあげることができる。
ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等のMicrobacterium ammoniaphilum、Microbacteriumlacticum、Microbacterium imperialeに属する微生物等をあげることができる。
エンテロバクター属に属する微生物としては、Enterobacter agglomerans ATCC1228等のEnterobacter agglomerans、Enterobacteraerogenes、Enterobacter amnigenus、Enterobacter asburiae、Enterobactercloacae、Enterobacter dissolvens、Enterobacter gergoviae、Enterobacterhormaechei、Enterobacter intermedius、Enterobacter nimipressuralis、Enterobactersakazakii、Enterobacter tayloraeに属する微生物等をあげることができる。
セラチア属に属する微生物としては、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratiaentomophila、Serratia grimesii、Serratia proteamaculans、Serratiaodorifera、Serratia plymuthica、Serratia rubidaea、Serratiamarcescensに属する微生物等をあげることができる。
シュードモナス属に属する微生物としては、Pseudomonas putidaに属する微生物等をあげることができる。
アナベナ属に属する微生物としては、例えば、Anabaena cylindrica、Anabaena doliolum、Anabaena flosaquaeに属する微生物等をあげることができる。
ロドバクター属に属する微生物としては、例えば、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroidesに属する微生物等をあげることができる。
ロドスピリウム属に属する微生物としては、例えば、Rhodospirillum rubrum、Rhodospirillum salexigens、Rhodospirillumsalinarumに属する微生物等をあげることができる。
上記宿主微生物のうち、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アースロバクター属、オーレオバクテリウム属、セルロモナス属、クラビバクター属、クルトバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ピメロバクター属、エシェリヒア属、またはバチルス属に属する微生物が好ましく用いられ、コリネバクテリウムまたはエシェリヒア属に属する微生物がより好ましく用いられ、コリネバクテリウム属に属する微生物がさらに好ましく用いられる。
例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもベーリンガーマンハイム社製)、pHelix1(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)、pKK233-2(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)、pSE280(インビトロジェン社製)、pGEMEX-1(プロメガ社製)、pQE-8(キアゲン社製)、pET-3(ノバジェン社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)(ストラタジーン社製)、pTrS30 〔エシェリヒア・コリJM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製〕、pTrS32 〔エシェリヒア・コリJM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製〕、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pPA1(特開昭63-233798)、pCG116、pCG1(特開平6-277082)、pCS299P(WO 00/63388)等があげられる。
組換え体DNAは宿主微生物中で自立複製可能であると同時に、上記プロモーター、リボソーム結合配列、本発明に用いられるポリペプチドをコードするDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体DNAとしては、例えばエシェリヒア・コリDH5α/ pCS-CGndh(FERM BP-08633)の保有するプラスミドpCS-CGndhをあげることができる。
宿主微生物に導入された本発明に用いられるポリペプチドをコードするDNAは、微生物中で組換え体DNA上に存在していてもよいし、染色体上に組み込まれていてもよい。
本発明に用いられるポリペプチドをコードするDNAを導入して得られる微生物(以下、本発明の微生物と略す)を培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物からアミノ酸を採取することにより、アミノ酸を製造することができる。
炭素源としては、本発明の微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
培養は、通常、振とう培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行なう。培養温度は15℃〜50℃がよく、より好ましくは20℃〜45℃である。培養時間は通常5時間〜7日間、より好ましくは12時間〜4日間である。培養中必要に応じてpHを3〜9に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行なう。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換え体DNAを用いてDNAを導入した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換え体DNAを用いてDNAを導入した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換え体DNAを用いてDNAを導入した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例1
(1) コリネバクテリウム・グルタミカム LS-22株をLB培地〔10g/L バクトトリプトン(ディフコ社製)、5g/L イーストエキストラクト(ディフコ社製)および5g/L 塩化ナトリウムを含む培地〕に植菌し、30℃で一晩培養した。培養後、Eikmannsらの方法〔Microbiol., 140, 1817 (1994)〕に準じて、該微生物の染色体DNAを単離精製した。
該DNA(各0.5μmol/L)をプライマーとし、上記染色体DNA(0.1μg)を鋳型として、PfuDNAポリメラーゼ(ストラタジーン社製)2.5単位および各200μmol/LのdNTP(dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP)を含む反応液40μL中でPCRを行なった。
連結反応後の反応液を用いてエシェリヒア・コリDH5α株を、エレクトロポレーション法〔Nucleic acid Res., 16, 6127-6145 (1988)〕によって形質転換した。
コリネ型細菌用の発現ベクターであるpCS299P(WO 00/63388)0.2μgを制限酵素KpnIおよびSalIで切断後、得られたDNA断片を含む溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約5.4kbのDNA断片を分離した。
連結反応後の反応液を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムLS-22株を、エレクトロポレーション法〔Nucleic acid Res., 16, 6127-6145 (1988)〕を用いて形質転換した。
プラスミドpCS-CGndhを含有するエシェリヒア・コリDH5α/pCS-CGndhは、FERM BP-08633として、平成16年2月19日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305-8566)に寄託されている。
(2) コリネバクテリウム・グルタミカムLS-22株およびコリネバクテリウム・グルタミカムLS-22株にpCS-CGndhを導入したコリネバクテリウム・グルタミカムLS-22/pCS-CGndh株をそれぞれ、試験管中のLB培地5mLに植菌し、30℃で一晩振とう培養した。
実施例2
実施例1と同様に、エレクトロポレーション法を用いてコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC14752株にpCS-CGndhを導入し、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC14752/pCS-CGndh株を得た。
その結果、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14752株のグルタミンの蓄積量は32.2g/Lであるのに対し、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14752/pCS-CGndh株のグルタミンの蓄積量は33.3g/Lであった。
実施例3
実施例1と同様に、エレクトロポレーション法を用いてコリネバクテリウム・グルタミカム FERM BP-1069株にpCS-CGndhを導入し、コリネバクテリウム・グルタミカム FERM BP-1069/pCS-CGndh株を得た。
配列番号2−人工配列の説明:合成DNA
Claims (3)
- 以下の[1]〜[3]のいずれかに記載のDNAでコリネバクテリウム属に属する微生物を形質転換して得られる微生物を培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物よりアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
[1]配列番号3または5で表される塩基配列からなるDNA
[2]配列番号3または5で表される塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつエネルギー非生産型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNA
[3]上記[1]または[2]のDNAを含有する組換え体DNA - コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・フラバム(Corynebacterium flavum)、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム(Corynebacterium lactofermentum)およびコリネバクテリウム・エフィカシス(Corynebacterium efficasis)に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、請求の範囲第1項に記載の製造法。
- 以下の[1]〜[3]のいずれかに記載のDNAでコリネバクテリウム・グルタミカムATCC14752またはコリネバクテリウム・グルタミカムFERM BP−1069を形質転換して得られる微生物。
[1]配列番号3または5で表される塩基配列からなるDNA
[2]配列番号3または5で表される塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつエネルギー非生産型NADHデヒドロゲナーゼをコードするDNA
[3]上記[1]または[2]のDNAを含有する組換え体DNA
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