JP5860287B2 - L−アミノ酸の製造法 - Google Patents
L−アミノ酸の製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5860287B2 JP5860287B2 JP2011549040A JP2011549040A JP5860287B2 JP 5860287 B2 JP5860287 B2 JP 5860287B2 JP 2011549040 A JP2011549040 A JP 2011549040A JP 2011549040 A JP2011549040 A JP 2011549040A JP 5860287 B2 JP5860287 B2 JP 5860287B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- protein
- activity
- yeig
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 32
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 104
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 77
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 76
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 65
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 21
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 19
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 17
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 7
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 162
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 72
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 60
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 description 47
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 33
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 33
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 28
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 28
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 28
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 27
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 241000677647 Proba Species 0.000 description 12
- 101150062928 glnE gene Proteins 0.000 description 12
- 101150041871 gltB gene Proteins 0.000 description 12
- 101150039906 gltD gene Proteins 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 9
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 101150016728 yeiG gene Proteins 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 6
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 6
- ZPAVDMSDYRVQJR-BQBZGAKWSA-N (2s)-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-2-formamido-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC=O ZPAVDMSDYRVQJR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- -1 ethanol and propanol Chemical compound 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 2
- 102000005133 Glutamate 5-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108700023479 Glutamate 5-kinases Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910003797 SPO1 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910003798 SPO2 Inorganic materials 0.000 description 2
- 101100150136 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SPO1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100478210 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) spo2 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 101150019841 penP gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 2
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-3-Hydroxy-2-pyrolidinecarboxylic acid Natural products OC1CCNC1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOFPFYYTUIARDI-ZCFIWIBFSA-N (2r)-2-aminooctanedioic acid Chemical group OC(=O)[C@H](N)CCCCCC(O)=O YOFPFYYTUIARDI-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- JFOWDKWFHZIMTR-RUCXOUQFSA-N (2s)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2,5-diamino-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JFOWDKWFHZIMTR-RUCXOUQFSA-N 0.000 description 1
- LHGVYNDAWRBWGL-UHFFFAOYSA-O (e)-(5-amino-5-carboxy-2-oxopentylidene)-iminoazanium Chemical compound OC(=O)C(N)CCC(=O)C=[N+]=N LHGVYNDAWRBWGL-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N (e)-1-[(2s)-2-amino-2-carboxyethoxy]-2-diazonioethenolate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CO\C([O-])=C\[N+]#N AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical group [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100365584 Escherichia coli (strain K12) frmB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108020000311 Glutamate Synthase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical group O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N O-methylserine Chemical compound COC[C@H](N)C(O)=O KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Chemical class 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Chemical class 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229950011321 azaserine Drugs 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N benzopyrrole Natural products C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 101150101449 frmB gene Proteins 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N isoglutamic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)CC(O)=O BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical class [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 108020002447 serine esterase Proteins 0.000 description 1
- 102000005428 serine esterase Human genes 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940083608 sodium hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-IMJSIDKUSA-N trans-3-hydroxy-L-proline Chemical compound O[C@H]1CC[NH2+][C@@H]1C([O-])=O BJBUEDPLEOHJGE-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
- C12Y301/02012—S-Formylglutathione hydrolase (3.1.2.12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Description
またグルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型細菌を用いるL-グルタミンの製造法としては、アデニリル化によりグルタミンシンテターゼの制御を行なうグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼの活性が低下したコリネ型細菌を用いる方法(非特許文献1、特許文献3)、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼによりアデニリル化を受けるグルタミンシンテターゼORF中の405番目のアミノ酸残基が置換されたコリネ型細菌を用いる方法(非特許文献1、特許文献4)およびPIIタンパク質の活性が低下したコリネ型細菌を用いる方法(非特許文献2、特許文献3)などが知られている。
エシェリヒア・コリにおいてyeiG遺伝子にコードされるYeiGはセリンエステラーゼモチーフを持ち、カルボキシルエステラーゼ活性を有することが報告されている(非特許文献3)。また、ホルミルグルタチオンに対して高い加水分解活性を有することから、グルタチオン依存型のホルムアルデヒド解毒経路で働くことが示唆されている。
YeiGを高発現した微生物を用いたL-グルタミンの製造法は知られておらず、YeiGがアミノ酸合成に関わっているか否か、またYeiGの高発現がアミノ酸合成に対しどのような影響を与えるかについては知られていない。
(1)以下の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質の活性が親株に比べて向上した微生物を培地に培養し、該培地中にL-アミノ酸を生成、蓄積せしめ、該培地中からL-アミノ酸を採取することを特徴とする、L-アミノ酸の製造法。
[1]配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、YeiG活性を有する蛋白質
[3]配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性があるアミノ酸配列からなり、かつYeiG活性を有する蛋白質
(2)微生物が以下の[1]〜[3]のいずれかに記載のDNAで形質転換された微生物、又は該DNAの発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が親株に比べて増加した微生物である、(1)記載のL‐アミノ酸の製造法。
[1]請求項1の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA
[2]配列番号1で表される塩基配列を有するDNA
[3]配列番号1で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNA
(3) 微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である(1)または(2)記載のL‐アミノ酸の製造法。
(4)L−アミノ酸が、L−グルタミンである、(1)〜(3)のいずれかに記載のL−アミノ酸の製造法。
(1)YeiG活性が親株に比べて向上した微生物
本明細書においてYeiG活性とは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質が有する活性をいい、本明細書においてYeiG活性を有する蛋白質とは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と、実質的に同等の活性を有する蛋白質をいう。
[1]配列番号2表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつYeiG活性を有する蛋白質、および
[3]配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性があるアミノ酸配列を有し、かつYeiG活性を有する蛋白質、をあげることができる。
配列番号2で表されるアミノ酸配列において1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、1個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−アルギニン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−システインなどがあげられる。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
また、YeiG活性を有する蛋白質としては、配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつYeiG活性を有する蛋白質をあげることができる。
[4]上記[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA、
[5]配列番号1で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列を有するDNA、または
[6]配列番号1で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNA、を用いて親株を形質転換して得られる微生物をあげることがでる。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号1で表される塩基配列中のコーディング領域の塩基配列からなるDNAと少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
2.本発明で用いられる微生物の調製
(1)YeiG活性が親株に比べて向上した微生物の調製
YeiG活性が親株に比べて向上した微生物のうち、比活性が親株のYeiG活性を有する蛋白質より高い微生物は、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAをin vitroにおける変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより該DNAに変異を導入した後、該変異DNAを親株の染色体DNA上に存在する変異導入前のYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAと公知の方法[Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2000, 6640 (2000)]を用いて置換することにより該変異DNAを発現する改変体を作成し、上記した方法により親株と改変体のYeiG活性、すなわちホルミルグルタチオン加水分解活性を比較することにより取得することができる。
そのようなプロモーターとしては、E. coliで機能するtrpプロモーター(P trp )、lacプロモーター(P lac )、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを2つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターもあげることができる。
(a)YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAの取得
YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAは、例えば上記1(1)のYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いた、微生物、好ましくはE. coliの染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、微生物、好ましくはE. coliの染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
宿主細胞としては、Escherichia属に属する微生物などをあげることができる。Escherichia属に属する微生物としては、例えば、E. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coliDH1、E. coli MC1000、E. coli ATCC 12435、E. coliW1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coliNo.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coliMP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coliME8415等をあげることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
上記のようにして取得されるDNAとして、例えば、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA、および配列番号1で表される塩基配列を有するDNAをあげることができる。
(b)YeiG活性を有する蛋白質を発現するプラスミドベクターで形質転換された微生物の取得
上記(a)の方法で得られるYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAをもとにして、必要に応じて、YeiG活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、YeiG活性を有する蛋白質の活性が宿主細胞、すなわち親株より向上した形質転換体を得ることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
(c)YeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAが染色体DNAに組み込まれた微生物の取得
上記(a)の方法で得られるYeiG活性を有する蛋白質をコードするDNAを染色体DNAの任意の位置に組み込むことにより、YeiG活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物を取得することもできる。
上記の方法に従って調製される親株よりもYeiG活性が向上した微生物の具体例としてはYeiG活性を有する蛋白質を発現するプラスミドベクターであるpTyeiGを有する大腸菌JP/pTyeiGをあげることができる。
3.本発明のL-アミノ酸の製造法
本発明の微生物の培養は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える天然培地または合成培地培を用いて培養することができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
培地中に生成、蓄積したL−アミノ酸の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下の方法でyeiG遺伝子発現プラスミドを造成した。
エシェリヒア・コリ JM101株をLB培地[10g/l バクトトリプトン(ディフコ社製)、5g/l イーストエキス(ディフコ社製)、5g/l 塩化ナトリウム]に植菌し30℃で一晩培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体DNAを単離精製した。
PCRは、鋳型として0.1μgの染色体DNA、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5 unitsのPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ製)、5μLのPyrobestDNAポリメラーゼ用×10緩衝液(タカラバイオ製)、各200μmol/LのdNTP(dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP)を含む反応液50μLを調製し、96℃で15秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
該DNA断片およびtrpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30[エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]をそれぞれHindIII、SacIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した後、ジーンクリーンIIキット(GENECLEAN II kit、BIO 101 社製)を用いて、制限酵素消化DNA断片をそれぞれ回収した。
得られた連結体DNAを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株(タカラバイオ製)を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、trpプロモーター下流にyeiG遺伝子が連結された発現ベクターであるpTyeiGが取得されていることを確認した。
L-グルタミン、L-グルタミン酸生産能を持つエシェリヒア・コリを作製するため、L-プロリン合成経路上のγ-グルタミン酸キナーゼをコードするproBとγ-グルタミルリン酸レダクターゼをコードするproAを欠損した株、グルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼをコードするglnEを欠損した株、グルタミン酸シンテースをコードするgltB、gltDを欠損した株を作製した。
(1)proBA遺伝子欠損エシェリヒア・コリJM101の作製
(a)遺伝子欠損用マーカー遺伝子の構築
相同組換えを用いたエシェリヒア・コリの遺伝子欠損および遺伝子置換のためのマーカー遺伝子として用いるcat遺伝子およびsacB遺伝子を以下の方法で単離した。
配列番号9および10で表わされる塩基配列からなる合成DNA、並びに配列番号12および14で表わされる塩基配列からなる合成DNAをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリJM101株のゲノムDNAを鋳型として1回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification kit(キアゲン社製)を用いて精製した増幅産物を等モルの比率で混合したものを鋳型として2回目のPCRを行い、増幅産物を取得し、再びQiaquick PCR purification kit(キアゲン社製)を用いて精製した。精製したDNA断片をアガロース電気泳動に供してproBA遺伝子が欠失したproBA周辺領域を含む約2kbのDNA断片が増幅されたことを確認した。
10mmol/LのL-アラビノースと50μg/mlのアンピシリンの存在下で培養して得られたエシェリヒア・コリ JM101/pKD46に、電気パルス法により上記で取得したcat-sacB断片の挿入されたproBA遺伝子周辺領域を含むDNA断片を導入した。
上記のようにしてproBA遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリJP株と命名した。
配列番号15および16で表わされる塩基配列からなる合成DNA、並びに配列番号18および20で表わされる塩基配列からなる合成DNAをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリJM101株のゲノムDNAを鋳型として1回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification kit(キアゲン社製)を用いて精製した増幅産物を等モルの比率で混合したものを鋳型として2回目のPCRを行い、増幅産物を取得し、再びQiaquick PCR purification kit(キアゲン社製)を用いて精製した。精製したDNA断片をアガロース電気泳動に供してglnE遺伝子が欠失したglnE周辺領域を含む約2kbのDNA断片が増幅されたことを確認した。
上記のようにしてglnE遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリJPE株と命名した。
配列番号21および22で表わされる塩基配列からなる合成DNA、並びに配列番号24および26で表わされる塩基配列からなる合成DNAをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリJM101株のゲノムDNAを鋳型として1回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification kit(キアゲン社製)を用いて精製した増幅産物を等モルの比率で混合したものを鋳型として2回目のPCRを行い、増幅産物を取得し、再びQiaquick PCR purification kit(キアゲン社製)を用いて精製した。精製したDNA断片をアガロース電気泳動に供してgltB、gltD遺伝子が欠失したgltB、gltD周辺領域を含む約2kbのDNA断片が増幅されたことを確認した。
得られた形質転換体を、25μg/mlのクロラムフェニコールおよび50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地(LB+クロラムフェニコール+アンピシリン)に塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。相同組換えが生じた株はクロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示すので、選択したコロニーを10%シュクロース、25μg/mlのクロラムフェニコールおよび50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地(LB+シュクロース+クロラムフェニコール+アンピシリン)およびLB+クロラムフェニコール+アンピシリンにレプリカし、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した株を選択した。
上記のようにしてgltB、gltD遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリJPBD株と命名した。
実施例2で得られたJP株、JPE株およびJPBD株に実施例1で得られたpTyeiGおよびpTrs30を形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれJP/pTyeiG、JP/pTrs30、JPE/pTyeiG、JPE/pTrs30、JPBD/pTyeiG、JPBD/pTrs30と命名した。
上記で得られた形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含む8mlのLB培地が入った太型試験管に接種し、30℃で17時間培養した。該培養液を100μg/mlのアンピシリンを含む培地[16g/L リン酸水素二カリウム、14g/L リン酸二水素カリウム、5g/L 硫酸アンモニウム、1g/L クエン酸(無水)、5g/L カザミノ酸(ディフコ社製)、10g/L グルコース、10mg/L ビタミンB1、25mg/L 硫酸マグネシウム・7水和物、50mg/L 硫酸鉄・7水和物、100mg/L L-プロリン、pH7.2に10mol/Lの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンB1、硫酸マグネシウム・7水和物、硫酸鉄・7水和物は別個に加圧滅菌後添加した]が8ml入っている試験管に1%接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。該培養上清中の培養生成物の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により定量した。結果を表1に示す。グリセロール培地、キシロース培地、アラビノース培地ではグルコースの代わりにこれらを炭素源として用いた。これらの培地を用いた場合の培養生成物の蓄積量を表2〜表4に示す。
配列番号4−人口配列の説明:合成DNA
配列番号5−人口配列の説明:合成DNA
配列番号6−人口配列の説明:合成DNA
配列番号7−人口配列の説明:合成DNA
配列番号8−人口配列の説明:合成DNA
配列番号9−人口配列の説明:合成DNA
配列番号10−人口配列の説明:合成DNA
配列番号11−人口配列の説明:合成DNA
配列番号12−人口配列の説明:合成DNA
配列番号13−人口配列の説明:合成DNA
配列番号14−人口配列の説明:合成DNA
配列番号15−人口配列の説明:合成DNA
配列番号16−人口配列の説明:合成DNA
配列番号17−人口配列の説明:合成DNA
配列番号18−人口配列の説明:合成DNA
配列番号19−人口配列の説明:合成DNA
配列番号20−人口配列の説明:合成DNA
配列番号21−人口配列の説明:合成DNA
配列番号22−人口配列の説明:合成DNA
配列番号23−人口配列の説明:合成DNA
配列番号24−人口配列の説明:合成DNA
配列番号25−人口配列の説明:合成DNA
配列番号26−人口配列の説明:合成DNA
Claims (2)
- 以下の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質の活性がL−グルタミン又はL−グルタミン酸を生産する親株に比べて向上したエシェリヒア属に属する微生物を培地に培養し、該培地中にL−グルタミンを生成、蓄積せしめ、該培地中からL−グルタミンを採取することを特徴とする、L−グルタミンの製造法。
[1]配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつYeiG活性を有する蛋白質
[3]配列番号2で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性があるアミノ酸配列からなり、かつYeiG活性を有する蛋白質 - 微生物が以下の[1]〜[2]のいずれかに記載のDNAで形質転換された微生物、又は該DNAの発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が親株に比べて増加した微生物である、請求項1記載のL−グルタミンの製造法。
[1]請求項1の[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA
[2]配列番号1で表される塩基配列を有するDNA
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011549040A JP5860287B2 (ja) | 2010-01-08 | 2011-01-07 | L−アミノ酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010002704 | 2010-01-08 | ||
JP2010002704 | 2010-01-08 | ||
JP2011549040A JP5860287B2 (ja) | 2010-01-08 | 2011-01-07 | L−アミノ酸の製造法 |
PCT/JP2011/050208 WO2011083860A1 (ja) | 2010-01-08 | 2011-01-07 | L-アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2011083860A1 JPWO2011083860A1 (ja) | 2013-05-16 |
JP5860287B2 true JP5860287B2 (ja) | 2016-02-16 |
Family
ID=44305595
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011549040A Active JP5860287B2 (ja) | 2010-01-08 | 2011-01-07 | L−アミノ酸の製造法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8859241B2 (ja) |
EP (1) | EP2522737B1 (ja) |
JP (1) | JP5860287B2 (ja) |
WO (1) | WO2011083860A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012239452A (ja) * | 2011-05-24 | 2012-12-10 | Ajinomoto Co Inc | 澱粉高蓄積微細藻類及びそれを用いたグルコースの製造法、並びに目的物質の製造法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01312996A (ja) * | 1988-06-14 | 1989-12-18 | Asahi Denka Kogyo Kk | L−フェニルアラニンの製造方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS55148094A (en) | 1979-05-07 | 1980-11-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Preparation of l-glutamine by fermentation |
JPH03232497A (ja) | 1990-02-08 | 1991-10-16 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 発酵法によるl―グルタミンの製造方法 |
JP4560998B2 (ja) | 2001-02-05 | 2010-10-13 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−グルタミンの製造法及びl−グルタミン生産菌 |
RU2230114C2 (ru) | 2001-11-30 | 2004-06-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот |
EP1978094B1 (en) * | 2005-12-27 | 2012-03-14 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Method for production of l-glutamine |
-
2011
- 2011-01-07 US US13/520,954 patent/US8859241B2/en active Active
- 2011-01-07 JP JP2011549040A patent/JP5860287B2/ja active Active
- 2011-01-07 WO PCT/JP2011/050208 patent/WO2011083860A1/ja active Application Filing
- 2011-01-07 EP EP11731858.4A patent/EP2522737B1/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01312996A (ja) * | 1988-06-14 | 1989-12-18 | Asahi Denka Kogyo Kk | L−フェニルアラニンの製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN7011000348; Gonzalez C.F.: 'Molecular basis of formaldehyde detoxification. Characterization of two S-formylglutathione hydrolas' J. Biol. Chem. vol.281, 2006, p.14514-14522 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20120329106A1 (en) | 2012-12-27 |
EP2522737A1 (en) | 2012-11-14 |
JPWO2011083860A1 (ja) | 2013-05-16 |
WO2011083860A1 (ja) | 2011-07-14 |
EP2522737A4 (en) | 2015-12-09 |
US8859241B2 (en) | 2014-10-14 |
EP2522737B1 (en) | 2020-03-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8647839B2 (en) | Method for production of glutathione or gamma-glutamylcysteine | |
JP4881739B2 (ja) | L−アルギニン、l−オルニチンまたはl−シトルリンの製造法 | |
JP5662167B2 (ja) | L−アミノ酸の製造法 | |
US11155845B2 (en) | Method for producing theanine | |
JP6934774B2 (ja) | イミダゾールジペプチド合成活性を有するタンパク質及びイミダゾールジペプチドの製造方法 | |
JP5319521B2 (ja) | ジペプチドの製造法 | |
ES2382207T3 (es) | Procedimiento para la producción de L-glutamina | |
JP5860287B2 (ja) | L−アミノ酸の製造法 | |
KR20050108387A (ko) | L-세린 대사에 관여하는 단백질을 암호화하는 코리네형박테리아의 뉴클레오티드 서열 및 미생물에 의한 l-세린의제조 방법 | |
JP6086678B2 (ja) | ホモアミノ酸の製造法 | |
JP2012183048A (ja) | 4−ヒドロキシ安息香酸関連物質の製造法 | |
JP5424604B2 (ja) | グルコサミンの製造法 | |
JP2011239707A (ja) | ペプチドの製造法 | |
JP2013106588A (ja) | L−アスパラギンの製造法 | |
WO2021261564A1 (ja) | ジペプチドの製造法 | |
JP2010200682A (ja) | メナキノンの製造法 | |
JP2021019518A (ja) | ビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造法 | |
JP2014073118A (ja) | ジメチロールカルボン酸誘導体の製造法 | |
JPWO2005083077A1 (ja) | アミノ酸の製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131210 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150217 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150417 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150929 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151102 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151201 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151218 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5860287 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |