JP5424604B2 - グルコサミンの製造法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
エシェリヒア・コリのyhbJ遺伝子については、yhbJ遺伝子の欠損株においてグルコサミン‐6‐リン酸合成酵素をコードするglmS遺伝子の発現量が向上していることが知られている(非特許文献1および2)。
しかし、yhbJ遺伝子を欠損した微生物、または上記のグルコサミン‐6‐リン酸の脱リン酸活性を有する蛋白質の活性が向上した微生物によるグルコサミンの製造法は知られていない。
[1]グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質の活性が野生株に比べて向上しており、かつ、配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質の活性が野生株に比べて低下または喪失している微生物を培地に培養し、培養液中にグルコサミンを生成、蓄積せしめ、該培養液中からグルコサミンを採取することを特徴とする、グルコサミンの製造法。
[2]グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質が、以下の(1)〜(3)より選ばれるいずれかの蛋白質:
(1)配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質
(3)配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質
であり、かつ、配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質が、以下の(4)または(5)の蛋白質:
(4)配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(5)配列番号18で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
である、[1]記載のグルコサミンの製造法。
[3]グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質が、以下の(1)または(2)のDNAにコードされる蛋白質である、[1]または[2]記載の製造法。
(1)配列番号1、3、5、7、9、11、13または15で表される塩基配列を有するDNA
(2)配列番号1、3、5、7、9、11、13または15で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNA
[4]配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質が、以下の(1)または(2)のDNAにコードされる蛋白質である、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の製造法。
(1)配列番号17で表される塩基配列を有するDNA
(2)配列番号17で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコサミン‐6‐リン酸を脱リン酸化する活性を有する蛋白質をコードするDNA
(1)グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性が野生株より向上した微生物
グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質の活性が野生株に比べ向上している微生物とは、(a)親株の染色体DNA上にあるグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i)野生株より該蛋白質の比活性が向上した微生物、およびii)野生株よりグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物、ならびに(b)親株をグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換して得られる微生物、である。
配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質のホモログ蛋白質とは、BLASTPなど公知の相同性検索プログラムを用いて検索したときに、上記のアミノ酸配列と相同性が高い、具体的には80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質をいう。
[1]配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質、および
[3]配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上の相同性を有し、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質、
をあげることができる。
配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列において1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、1個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−アルギニン、L−グルタミン、L−グルタミン酸、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−システインなどがあげられる。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
また、グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質としては、配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をあげることができる。
[4]上記[1]〜[3]のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA、
[5]配列番号1、3、5、7、9、11、13または15で表される塩基配列を有するDNA、または
[6]配列番号1、3、5、7、9、11、13または15で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNA、
を用いて親株を形質転換して得られる微生物をあげることがでる。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号1、3、5、7、9、11、13または15で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
(2)配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質の活性が野生株より低下、または喪失した微生物
本発明で用いられる微生物は、上記(1)の微生物であってさらに、配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質の活性が野生株より低下、または喪失した微生物である。
配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質のホモログ蛋白質とは、BLASTPなど公知の相同性検索プログラムを用いて検索したときに、上記のアミノ酸配列と相同性が高い、具体的には配列番号18で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、などをあげることができる。
配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては以下のDNA、
[7]配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA
[8] 配列番号18で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードするDNA
[9]上記[7]または[8]のいずれかの蛋白質をコードするDNA、
[10]配列番号17で表される塩基配列を有するDNA、および
[11]配列番号17で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードするDNA、
などをあげることができる。
転写調節領域としては、染色体DNA上におけるコーディング領域の5’末端より上流側100塩基、好ましくは50塩基からなるDNAをあげることができ、プロモーター領域としては、-10および-35領域に相当する領域をあげることができる。
塩基の付加としては、コーディング領域の5’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、50塩基以上、好ましくは100塩基以上、より好ましくは200塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上、特に好ましくは1kb以上のDNA断片を付加することをあげることができ、特に好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号17で表される塩基配列と少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
2.本発明で用いられる微生物の調製
(1)グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質の活性が野生株より高い微生物の調製
グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質の活性が野生株より高い微生物のうち、比活性が野生株のグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質より高い微生物は、グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAをin vitroにおける変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより該DNAに変異を導入した後、該変異DNAを親株の染色体DNA上に存在する変異導入前のグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAと公知の方法[Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 97, 6640 (2000)]を用いて置換することにより該変異DNAを発現する改変体を取得することができ、該取得した改変体が目的の微生物であることは、グルコース等の糖源を添加した培地で培養し、培養液中に蓄積するグルコサミンを定量することにより、確認することができる。
そのようなプロモーターとしては、E. coliで機能するtrpプロモーター(P trp )、lacプロモーター(P lac )、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを2つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターもあげることができる。
(a)グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAの取得
グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAは、例えば上記1(1)のグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAの塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネア属またはモルガネラ属に属する微生物、より好ましくはE. coliの染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネア属またはモルガネラ属に属する微生物、より好ましくはE. coliの染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
宿主細胞としては、例えば、Escherichia属に属する微生物などをあげることができる。Escherichia属に属する微生物としては、例えば、E. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coli DH1、E. coli MC1000、E. coli ATCC 12435、E. coli W1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coli No.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coli MP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coli ME8415等をあげることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
上記のようにして取得されるDNAとして、例えば、配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA、および配列番号1、3、5、7、9、11、13または15で表される塩基配列を有するDNAをあげることができる。
(b)グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質を発現するプラスミドベクターで形質転換された微生物の取得
上記(a)の方法で得られるグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAをもとにして、必要に応じて、グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質の活性が野生株より向上した形質転換体を得ることができる。
原核生物を宿主細胞として用いる場合は、グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
該組換え体DNAの宿主細胞としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネア属、モルガネラ属などに属する微生物、具体的には、E. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coliDH1、E. coli MC1000、E. coli ATCC 12435、E. coliW1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coliNo.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coliMP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coliME8415、E.coliATCC9637等をあげることができる。より好ましい宿主としてはE. coliをあげることができる。
(c)グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAが染色体DNAに組み込まれた微生物の取得
上記(a)の方法で得られるグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNAを染色体DNAの任意の位置に組み込むことにより、グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物を取得することもできる。
(2)配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質の活性が野生株より低下、または喪失した微生物の取得
(a)配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の取得
配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、例えば上記1(2)の配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に従い、上記2(1)(a)と同様の方法により取得することができる。
(b)配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物の取得
配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質の活性が親株より低下、または喪失した微生物は、UV照射、変異剤などで微生物を異処理した後、配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質の活性が親株より低下または喪失した菌株を選択する方法、または微生物の染色体DNA上の配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法などにより取得することができる。
微生物の染色体DNAの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、上記2(2)(a)で取得できる配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を用いて、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を作製し、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドDNAと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、E. coliで頻用される相同組換えを利用した方法としてはラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)]をあげることができる。
3.本発明のグルコサミンの製造法
上記1の方法で調製することができる微生物を培地に培養し、培養物中にグルコサミンを生成、蓄積させ、該培養物からグルコサミンを採取することにより、グルコサミンを製造することができる。
炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えばグルコース、糖蜜、フラクトース、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類などをあげることができる。
無機塩としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。
さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質(例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸)を添加することができる。
培養物中に蓄積したグルコサミンは、通常の精製方法によって採取することができる。例えばグルコサミンは、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、濃縮、結晶分別等の公知の方法を併用することによって採取することができる。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用いて、ybiV遺伝子、ybjI遺伝子、ycjU遺伝子、yidA遺伝子、yigL遺伝子、yniC遺伝子、yqaB遺伝子およびcof遺伝子の各塩基配列に基づき、該遺伝子を増幅するためのプライマーDNAを合成した。各遺伝子を増幅するために用いたプライマーDNAの塩基配列は表1のとおりである。
PCRは0.1μgの染色体DNA、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5units のPfu DNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×10緩衝液、200μmol/L の各deoxyNTPを含む40μLの反応液を用い、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で1分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。
次にtrpプロモーターを含む発現ベクターpTrs30〔大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製可能〕をClaIおよびBamHI、並びにHindIIIおよびBamHIで切断後、上記と同様の方法により約4.5kbのDNA断片をそれぞれ精製した。
得られた各連結DNAを用いてE. coli NM522株を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
E. coliの染色体DNA上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)]に従って作製した。
(1)yhbJ遺伝子欠損用DNA断片のクローニング
E. coli K12株の染色体DNA上に存在する配列番号17で表される塩基配列を有するyhbJ遺伝子を欠損させることを目的に、実施例1と同様、DNA合成機を用いて、エシェリヒア・コリK12株の染色体DNA上におけるyhbJ遺伝子の上流および下流に位置する400〜500bpからなる塩基配列と相同な配列を有するDNA断片を増幅するためのプライマーDNA、および酵母由来Flp recombinaseが認識する塩基配列を有するDNAを合成した。
次に、上記合成DNAをプライマーセットとして用い、E. coli ATCC9637株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、用いる鋳型とプライマーDNAが異なる点以外は、実施例1と同様の条件で行った。
次に上記の上流DNA断片、下流DNA断片、およびHindIIIで切断したpKD3を鋳型に、配列番号46および49で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いたクロスオーバーPCR法 [J. Bacteriol., 179, 6228-6237 (1997)]により、中心部にpKD3のクロラムフェニコール耐性遺伝子部分が挿入し、3つのDNA断片が連結したDNA断片(yhbJ遺伝子欠損用DNA断片)を取得した。
(2)yhbJ遺伝子が欠損したE. coliの作製
E. coli ATCC9637株をpKD46で形質転換した後、アンピシリン耐性を指標にして形質転換体を選択し、該形質転換体をE. coli ATCC9637/pKD46と命名した。
上記で取得したE. coli ATCC9637/pCP20 yhbJ::catを薬剤無添加のLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加LB寒天培地、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地および100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地にレプリカして、30℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示す株を数株選択した。
(1)遺伝子欠損用DNA断片のクローニング
E. coli K12株の染色体DNA上に存在する配列番号19で表される塩基配列を有するグルコサミン取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子(manX-manY-manZ遺伝子)、および配列番号23で表される塩基配列を有するグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子(nagB遺伝子)の発現を支配するnagオペロン(nagB遺伝子の下流に配列番号23で表されるnagA、nagC、およびnagD遺伝子と、nagB遺伝子上流に逆向きにある配列番号28で表されるnagE遺伝子とでオペロンをなしている)のプロモーターを欠損させることを目的に、上記DNA合成機を用い、E. coli K12株の染色体DNA上におけるmanX-manY-manZ遺伝子の上流および下流に位置する400〜500bpからなる塩基配列と相同な配列を有するDNA断片を増幅するためのプライマーDNA、またnagB遺伝子の上流に位置するnagオペロンのプロモーター領域の上流および下流に位置する400〜500bpからなる塩基配列と相同な配列を有するDNA断片を増幅するためのプライマーDNAを合成した。
(2)yhbJ遺伝子が欠損し、グルコサミンの取り込み活性を有する蛋白質をコードする遺伝子およびnagオペロンのプロモーターが欠損した微生物の作製
実施例2(2)で得られたE. coli WyhbJ株をpKD46で形質転換した後、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択し、該形質転換体をE. coli WyhbJ/pKD46と命名した。
次に、実施例2(2)と同様の操作を行うことにより、pKD46が脱落しており、かつ染色体DNA上からクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠落した株を取得し、E. coliWyhbJManと命名した。
表2は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。
実施例1で造成したプラスミドpYbiV、pYbjI、pYcjU、pYidA、pYigL、pYniC、pYqaB、pCofおよび発現ベクターpTrS30を用いてE. coli ATCC9637株、実施例2で作製したWyhbJ株および実施例3で作製したWyhbJManNagを形質転換し、アンピシリン耐性を指標にして形質転換体を選択した。
比色法による分析は、二通りの定量法を用いて行った。(A)Ghoshらの方法[J. Biol. Chem., 235, 1265-1273(1960)]に従ってグルコサミンおよびN-アセチルグルコサミンの総量を測定し、(B)Reissigらの方法[J. Biol. Chem., 217, 959-966(1955)]に従ってN-アセチルグルコサミンの量を測定した。(A)で得た濃度から(B)で得た濃度を差し引いた値をグルコサミン濃度とした。本実施例中のグルコサミンの定量において、(B)の方法で有意な値を示すものは無かった。グルコサミンの定量結果を表3に示す。
配列番号31−人工配列の説明:合成DNA
配列番号32−人工配列の説明:合成DNA
配列番号33−人工配列の説明:合成DNA
配列番号34−人工配列の説明:合成DNA
配列番号35−人工配列の説明:合成DNA
配列番号36−人工配列の説明:合成DNA
配列番号37−人工配列の説明:合成DNA
配列番号38−人工配列の説明:合成DNA
配列番号39−人工配列の説明:合成DNA
配列番号40−人工配列の説明:合成DNA
配列番号41−人工配列の説明:合成DNA
配列番号42−人工配列の説明:合成DNA
配列番号43−人工配列の説明:合成DNA
配列番号44−人工配列の説明:合成DNA
配列番号45−人工配列の説明:合成DNA
配列番号46−人工配列の説明:合成DNA
配列番号47−人工配列の説明:合成DNA
配列番号48−人工配列の説明:合成DNA
配列番号49−人工配列の説明:合成DNA
配列番号50−人工配列の説明:合成DNA
配列番号51−人工配列の説明:合成DNA
配列番号52−人工配列の説明:合成DNA
配列番号53−人工配列の説明:合成DNA
配列番号54−人工配列の説明:合成DNA
配列番号55−人工配列の説明:合成DNA
配列番号56−人工配列の説明:合成DNA
配列番号57−人工配列の説明:合成DNA
Claims (3)
- 以下の(1)〜(3)より選ばれるいずれかの蛋白質の活性が野生株に比べて向上しており、かつ、以下の(4)または(5)の蛋白質の活性が野生株に比べて低下または喪失している微生物を培地に培養し、培養液中にグルコサミンを生成、蓄積せしめ、該培養液中からグルコサミンを採取することを特徴とする、グルコサミンの製造法。
(1)配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(2)配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質
(3)配列番号2、4、6、8、10、12、14または16で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質
(4)配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(5)配列番号18で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同一の活性を有する蛋白質である、請求項1記載のグルコサミンの製造法。 - グルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質が、以下の(1)または(2)のDNAにコードされる蛋白質である、請求項1に記載の製造法。
(1)配列番号1、3、5、7、9、11、13または15で表される塩基配列からなるDNA
(2)配列番号1、3、5、7、9、11、13または15で表される塩基配列と95%以上の同一性を有し、かつグルコサミン‐6‐リン酸脱リン酸活性を有する蛋白質をコードするDNA - 配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質と同一の活性を有する蛋白質が、以下の(1)または(2)のDNAにコードされる蛋白質である、請求項1または2に記載の製造法。
(1)配列番号17で表される塩基配列からなるDNA
(2)配列番号17で表される塩基配列と95%以上の同一性を有し、かつ、配列番号18で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同一の活性を有する蛋白質をコードするDNA
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