JP5951968B2 - Ｌ−アスパラギンの製造法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ−アスパラギンの製造法に関する。

Ｌ−アスパラギンは、医薬品、または食品として用いられている重要な化合物である。Ｌ−アスパラギンの製造法としては、植物からの抽出法、Ｌ−アスパラギン酸を原料とした化学合成法、微生物による発酵法が知られている。この微生物による発酵法は放線菌を用いた製造法（特許文献１）で、現在一般に用いられている他のアミノ酸を微生物により生産する技術に比べて、生産性が著しく劣るといわざるを得ない。しかしながら、現在のところ、微生物によって効率よくＬ−アスパラギンが生産できることは知られていない。
エシェリヒア属に属する微生物などにおいて、Ｌ−アスパラギンは、asnA遺伝子にコードされるアスパラギン合成酵素A（非特許文献１）とasnB遺伝子にコードされるアスパラギン合成酵素B（非特許文献２）によって生合成される。
一方、ansA遺伝子にコードされるＬ−アスパラギン分解酵素Ｉが細胞質に（非特許文献３）、ansB遺伝子にコードされるＬ−アスパラギン分解酵素ＩＩがペリプラズムに局在することが報告されている（非特許文献４）。また、iaaA遺伝子産物がアスパラギン分解活性を持つことも明らかにされている（非特許文献５）。
細胞内へのＬ−アスパラギンの取り込みに関してはサルモネラのansP遺伝子産物であるＬ−アスパラギンパーミアーゼが関与することが報告されている（非特許文献６）。
しかしながら、エシェリヒア属に属する微生物を含む微生物において、これらの遺伝子を改変することにより、培養液中に著量のＬ−アスパラギンを生成、蓄積することを報告した知見は存在しない。また、該微生物において、細胞外へのＬ−アスパラギンの排出に関与する因子に関する知見は報告されておらず、この因子を改変することによって、該微生物の培養液中へのＬ−アスパラギン生産量が増大することを報告した知見は存在しない。

特開昭５９−２２７２９８号

Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８１） Ｖｏｌ．９．ｐ４６６９−４６７６． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９４） Ｖｏｌ．２６９．Ｎｏ．１０．ｐ７４５０−７４５７． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （１９８６） Ｖｏｌ．１６６．ｐ１３５−１４２． Ｇｅｎｅ （１９９０） Ｖｏｌ．９１．ｐ１０１−１０５． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００４） Ｖｏｌ．２７１．ｐ３２１５−３２２６． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５） Ｖｏｌ．１４１．ｐ１４１−１４６．

本発明の課題は、著量のＬ−アスパラギンを培養液中に生成、蓄積する能力を有する微生物を用いたＬ−アスパラギンの製造法を提供することにある。

本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつＬ−アスパラギンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アスパラギンを生成、蓄積させ、該培養物中からＬ−アスパラギンを採取することを特徴とするＬ−アスパラギンの製造法。
（２）微生物が、親株に比べＬ−アスパラギン合成活性が増強した微生物である、上記（１）記載の製造法。
（３）微生物が、親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物である、上記（１）または（２）記載の製造法。
（４）微生物が、親株に比べＬ−アスパラギン排出活性が増強した微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造法。
（５）親株に比べＬ−アスパラギン排出活性が増強した微生物が、以下の［１］〜［６］のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物である、上記（４）記載の製造法。
［１］配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号１４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
[４] 配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［５］配列番号１３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［６］配列番号１３で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（６）微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の製造法。

本発明により、Ｌ−アスパラギンを生成、蓄積する能力を有する微生物を用いたＬ−アスパラギンを製造する方法が提供される。

本発明は、親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつＬ−アスパラギンを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アスパラギンを生成、蓄積させ、該培養物中からＬ−アスパラギンを採取することを特徴とするＬ−アスパラギンの製造法に関する。
１．本発明の製造法に用いられる微生物
本発明の製造法で用いられる微生物としては、以下の（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物をあげることができる。
（１）親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつＬ−アスパラギンを生産する能力を有する微生物
親株に比べＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物は、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）親株に比べ、該蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、および（ｂ）親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、をあげることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物をあげることができる。
Ｌ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、Ｌ−アスパラギンを分解する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］〜［１２］からなる群より選ばれる遺伝子、
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、
［５］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、
［６］配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、
［７］配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子、
［８］配列番号３で表される塩基配列を有する遺伝子、
［９］配列番号５で表される塩基配列を有する遺伝子、
［１０］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、
［１１］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、および、
［１２］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、
をあげることができる。

本明細書において遺伝子とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含んでもよいＤＮＡである。
転写調節領域としては、染色体ＤＮＡ上におけるコーディング領域の５’末端より上流側100塩基、好ましくは50塩基からなるＤＮＡをあげることができ、プロモーター領域としては、-10および-35領域に相当する領域をあげることができる。
Ｌ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入は、該蛋白質の活性を親株より低下または喪失させる塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、プロモーターおよび転写調節領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは全部の領域の欠失、コーディング領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上、特に好ましくは200塩基以上、最も好ましくはコーディング領域全部の欠失をあげることができる。

塩基の置換としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる。
塩基の付加としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、50塩基以上、好ましくは100塩基以上、より好ましくは200塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上、特に好ましくは1kb以上のＤＮＡ断片を付加することをあげることができ、特に好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。
また、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内に１〜２塩基を付加または欠失して、フレームシフト変異を導入する付加または欠失を挙げることができる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997）、Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998)、Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] やFASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990) ］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法はよく知られている。
親株に比べ、該蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物を培養し、培養物を超音波等で処理したあと、該処理物にＬ−アスパラギンを加え、分解されたＬ−アスパラギン量をＨＰＬＣで測定、比較することにより確認できる。
親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。

上記でいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。

また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などをあげることができる。

上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。

上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１、３または５で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
Ｌ−アスパラギンを生産する能力とは、本発明に用いる微生物を培地に培養したときに、Ｌ−アスパラギンを培養物から回収できる程度に生産する能力をいう。

Ｌ−アスパラギンを生産する能力を有する微生物は、親株が当該性質を元来有している場合はその性質が強化された微生物であってもよく、親株が当該性質を有していない場合は、当該性質を人工的に付与した微生物をあげることができる。
本明細書において親株とは、遺伝子改変、および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。元株及び宿主株は野生株であってもよいし、人為的操作により例えばＬ−アスパラギンの生産能が野生株より向上した変異株であってもよい。

本発明で用いられる微生物は、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌、さらに好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネア(Salmonella)属およびモルガネラ(Morganella)属からなる群より選ばれる属に属する微生物、特に好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、最も好ましくはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）をあげることができる。
エシェリヒア・コリとしては、エシェリヒア・コリK-12株、B株、W株およびB/r株からなる群より選ばれる野生株またはその変異株を、好ましくは、エシェリヒア・コリXL1-Blue、エシェリヒア・コリXL2-Blue、エシェリヒア・コリDH1、エシェリヒア・コリMC1000、エシェリヒア・コリATCC 12435、エシェリヒア・コリW1485、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリNo.49、エシェリヒア・コリW3110、エシェリヒア・コリNY49、エシェリヒア・コリMP347、エシェリヒア・コリNM522、エシェリヒア・コリBL21、エシェリヒア・コリME8415、エシェリヒア・コリATCC9637等を挙げることができる。
（２）親株の微生物に比べＬ−アスパラギン合成活性が増強した微生物
本発明の製造法で用いられる微生物としては、（１）に記載の微生物を親株として、該親株の微生物に比べＬ−アスパラギン合成活性が増強しており、かつＬ−アスパラギンを生産する能力を有する微生物をあげることができる。
本明細書において、Ｌ−アスパラギン合成活性とは、糖からＬ−アスパラギンを合成する活性、好ましくはＬ−アスパラギン酸を基質としてＬ−アスパラギンを合成する活性をいう。
親株の微生物に比べＬ−アスパラギン合成活性が増強した微生物としては、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物、ならびにｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、および（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物を挙げることができる。
上記（ａ）のｉ）に記載の微生物としては、親株が有する該蛋白質のアミノ酸配列において１アミノ酸以上、好ましくは１〜１０アミノ酸、より好ましくは１〜５アミノ酸、さらに好ましくは１〜３アミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物をあげることができる。
親株に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および変異型蛋白質を有する微生物を培養し、培養物を超音波等で処理したあと、該処理物にＬ-アスパラギン酸とその他の基質を加え、合成されたＬ−アスパラギン量をＨＰＬＣで測定、比較することにより確認できる。
上記（ａ）のｉｉ）に記載の微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１〜１０塩基、より好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは１〜３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物をあげることができる。
親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。
上記（ｂ）に記載の微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において該遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
親株の染色体ＤＮＡ上において該遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該遺伝子を保有させた微生物であることは、例えば、微生物が元来、染色体ＤＮＡ上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法、および該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株と比較する方法等により確認することができる。
Ｌ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］〜［６］からなる群より選ばれる蛋白質、
［１］配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［３］配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質、
［４］配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質、
［５］配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質、および
［６］配列番号１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる。
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン合成活性を有する蛋白質は、後述の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。

配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどが挙げられる。

以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
アミノ酸配列の同一性は、上記１（１）記載のアルゴリズムBLASTやFASTAを用いて決定することができる。
配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、アスパラギン合成活性を有する蛋白質であることは、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、培地で培養し、培養物中のＬ−アスパラギン量を測定することにより確認することができる。
Ｌ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［７］〜［１３］からなる群より選ばれるＤＮＡ、
［７］上記［１］〜［６］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［８］配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［９］配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［１０］配列番号７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１１］配列番号９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１２］配列番号７で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および、
［１３］配列番号９で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることがでる。

上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は、上記１（１）の記載と同じである。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号７または９で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
（３）親株の微生物に比べＬ−アスパラギン取込活性が低下、または喪失した微生物
本発明の製造法で用いられる微生物としては、上記（１）または（２）に記載の微生物を親株として、該親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつＬ−アスパラギンを生産する能力を有する微生物をあげることができる。
本明細書において、Ｌ−アスパラギン取込活性とは、細胞外から細胞内にＬ−アスパラギンを取込む活性をいう。
親株に比べＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物は、染色体ＤＮＡ上に存在する変異が入っていない野生型のＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）親株に比べ、該蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、および（ｂ）親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、をあげることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物をあげることができる。
Ｌ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、Ｌ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］〜［４］からなる群より選ばれる遺伝子、
［１］配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号１２で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号１１で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号１１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、
をあげることができる。
Ｌ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入、およびアミノ酸配列や塩基配列の同一性についての記載は、上記１（１）の記載と同じである。
親株に比べ、Ｌ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をＬ−アスパラギンを含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のＬ−アスパラギン比を比較することにより確認できる。
親株に比べ、該蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。

上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は上記１（１）の記載と同じである。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
（４）親株の微生物に比べＬ−アスパラギン排出活性が増強した微生物
本発明の製造法で用いられる微生物としては、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物を親株として、該親株に比べＬ−アスパラギン排出活性が増強しており、かつＬ−アスパラギンを生産する能力を有する微生物をあげることができる。
本明細書において、Ｌ−アスパラギン排出活性とは、細胞内から細胞外にＬ−アスパラギンを排出する活性をいう。
親株の微生物に比べＬ−アスパラギン排出活性が増強した微生物としては、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物、ならびにｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、および（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物を挙げることができる。
上記（ａ）のｉ）に記載の微生物としては、親株が有する該蛋白質のアミノ酸配列において１アミノ酸以上、好ましくは１〜１０アミノ酸、より好ましくは１〜５アミノ酸、さらに好ましくは１〜３アミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物をあげることができる。
親株に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、該蛋白質をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる形質転換株の培養物とＬ−アスパラギンとを緩衝液中に存在せしめ、水性媒体中に生成、蓄積したＬ−アスパラギン量を該親株のそれと比較することにより確認できる。
上記（ａ）のｉｉ）に記載の微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１〜１０塩基、より好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは１〜３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物をあげることができる。
親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。
上記（ｂ）に記載の微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において該遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
親株の染色体ＤＮＡ上において該遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該遺伝子を保有させた微生物であることは、例えば、微生物が元来、染色体ＤＮＡ上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法、および該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株と比較する方法等により確認することができる。
Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質、
［１］配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質、および、
［３］配列番号１４で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質、
をあげることができる。
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン排出活性を有する蛋白質は、後述の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。

配列番号１４で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、上記１（２）の記載と同じである。
アミノ酸配列の同一性は、上記１（１）記載のアルゴリズムBLASTやFASTAを用いて決定することができる。
配列番号１４で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質であることは、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、培地で培養し、菌体中のＬ−アスパラギン排出活性を測定することにより確認することができる。
Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［４］〜［７］からなる群より選ばれるＤＮＡ、
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［６］配列番号１３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および、
［７］配列番号１３で表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることがでる。

上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は、上記１（１）の記載と同じである。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
２．本発明の製造法で用いられる微生物の造成法
（１）上記１（１）の微生物の造成法
上記１（１）の微生物は、例えば、Ｌ−アスパラギン分解活性を有する微生物を親株とし、該親株のＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質の活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等をあげることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、試験管内でＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、相同組換えにより該遺伝子を親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法をあげることができる。
Ｌ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、例えば上記１（１）のＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネア属またはモルガネラ属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒアの染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ [PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。

また、各種の遺伝子配列データベースに対して上記１（１）記載のＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する微生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]または3700 ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。

上記のベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。

塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。

上記方法で取得することができる遺伝子としては、配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、配列番号１、３または５で表される塩基配列を有する遺伝子をあげることができる。
試験管内でＬ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法としては、例えばMolecular cloning:a laboratory manual,3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)〔以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す〕、Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley & Sons(1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)等に記載されている部位特異的変異導入法に準ずる方法をあげることができる。
上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法としては、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］をあげることができる。

さらに、変異体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法[Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が上記の方法で調製した遺伝子に置換された株を取得することができる。

また上記の方法に限らず、微生物の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることができる。
親株に比べ、Ｌ−アスパラギン分解活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、上記１（１）記載の方法で確認することができる。
（２）上記１（２）の微生物の造成法
上記１（２）の微生物のうち、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記２（１）の方法で造成される微生物を親株として、該親株のＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。
突然変異処理法は、上記１（１）の方法をあげることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、Ｌ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記２（１）の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。

Ｌ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、上記１（２）の該ＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、上記２（１）のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号８または１０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および配列番号７または９で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。

上記方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、上記１（２）の方法を用いて、該微生物と親株のＬ−アスパラギン合成活性を測定し、比較することにより、確認することができる。
上記１（２）の微生物のうち、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記２（１）の方法で造成される微生物を親株として、該親株のＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
突然変異処理法は、上記２（１）の方法をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有するＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記２（１）記載の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。

また、親株のＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
そのようなプロモーターとしては、親株としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、エシェリヒア・コリで機能するtrpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、Ｐ_Lプロモーター、Ｐ_Rプロモーター、Ｐ_SEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを、親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合、バチルス・サチルスで機能するＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターもあげることができる。
上記方法にて取得した微生物が、親株の微生物に比べ、Ｌ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、上記１（２）の方法で確認することができる。
上記１（２）の微生物のうち、（ｂ）Ｌ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。

上記の方法で得られるＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。

該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで、上記２（１）の方法で造成される微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、Ｌ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。

原核生物を宿主細胞として用いる場合は、該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、宿主細胞にエシェリヒア・コリを用いる場合、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p.6378-6385] pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。

上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、Ｐ_Lプロモーター、Ｐ_Rプロモーター、Ｐ_SEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合、バチルス・サチルスで機能するＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等も用いることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。

リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
Ｌ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するpTK_asnA、およびpTK_asnBをあげることができる。
また、上記の方法で得られるＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを、上記２（１）の相同組換え法を用いることで、染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
上記の方法で取得した微生物が、親株よりもＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物であることは、上記１（２）の方法を用いて確認することができる。
（３）上記１（３）の微生物の造成法
上記１（３）の微生物は、例えば、上記２（１）または（２）の方法で取得できる微生物を親株とし、該親株のＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質の活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。
突然変異処理法は、上記１（１）の方法をあげることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、試験管内でＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、上記２（１）の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。
Ｌ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、例えば上記１（３）のＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、上記２（１）のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。

上記方法で取得することができる遺伝子としては、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、配列番号１１で表される塩基配列を有する遺伝子をあげることができる。
試験管内でＬ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法、および、上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法は、上記２（１）の方法と同じである。
親株に比べ、Ｌ−アスパラギン取込活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、上記１（３）の方法で確認することができる。
（４）上記１（４）の微生物の造成法
上記１（４）の微生物のうち、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記２（１）〜（３）のいずれかに記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
突然変異処理法は、上記２（１）の方法をあげることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードする遺伝子と、上記２（１）の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。

Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、上記１（４）に従い、該ＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、上記２（１）のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。

上記方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、上記１（４）の方法を用いて確認することができる。
上記１（４）の微生物のうち、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記２（１）〜（３）のいずれかに記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
突然変異処理法は、上記１（１）の方法をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有するＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するＬ−アスパラギン合成活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記２（１）の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。

また、親株のＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
そのようなプロモーターとしては、上記２（２）のプロモーターをあげることができる。
上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、上記１（４）の方法で確認することができる。
上記１（４）の微生物のうち、（ｂ）Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。

上記の方法で得られるＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。

該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで、上記２（１）〜（３）のいずれかに記載の方法で造成される微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。

原核生物を宿主細胞として用いる場合は、該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、宿主細胞にエシェリヒア・コリを用いる場合、上記２（２）の発現ベクターをあげることができる。

上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、上記２（２）のプロモーターをあげることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するpTrs_rarD、およびpSTV_rarDをあげることができる。
また、上記の方法で得られるＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを、上記２（１）の相同組換え法を用いることで、染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
上記の方法で取得した微生物が、親株よりもＬ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物であることは、上記１（４）の方法を用いて確認することができる。
３．本発明のＬ-アスパラギンの製造法
上記２の方法で調製することができる微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アスパラギンを生成、蓄積させ、該培養物からＬ−アスパラギンを採取することにより、Ｌ−アスパラギンを製造することができる。

本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩など本発明の微生物の増殖、およびL-アスパラギンの生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えばグルコース、糖蜜、フラクトース、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類などをあげることができる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、アミン等の窒素化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、ペプトン、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。

その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。

培養は、振とう培養や深部通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は20〜50℃、好ましくは20〜42℃、より好ましくは28〜38℃である。培地のｐＨは５〜１１の範囲で、好ましくは６〜９の中性付近の範囲に維持して培養を行う。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、ｐＨ緩衝液などを用いて行う。

培養時間は、5時間〜６日間、好ましくは16時間〜3日間である。培養物中に蓄積したＬ−アスパラギンは、通常の精製方法によって採取することができる。例えばＬ−アスパラギンは、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、濃縮、結晶分別等の公知の方法を併用することによって採取することができる。
微生物が、L-アスパラギンを生成、蓄積する能力を有することは、該微生物を培地に培養し、該培地中に生成、蓄積するL-アスパラギンを公知の方法、例えばHPLCを用いた分析またはバイオアッセイ等により容易に確認することができる。

以下に本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

遺伝子欠損株の造成
（ａ）遺伝子欠損用マーカー遺伝子の構築
相同組換えを用いたエシェリヒア・コリの遺伝子欠損および遺伝子置換のためのマーカー遺伝子として用いるcat遺伝子およびsacB遺伝子を以下の方法で単離した。
配列番号１５および１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用い、pHSG396を鋳型としてPCRを行い、cat遺伝子の上流約200bpから下流約100bpを含むDNA断片を得た。PCRはKOD-Plus-（東洋紡績社製）を用いて、添付説明書に従って行った。また配列番号１７および１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用い、常法により調製したバチルス・ズブチリス１６８株の野生型株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、sacB遺伝子の上流約300bpから下流約100bpを含むDNA断片を得た。

両DNA断片をそれぞれ精製した後、制限酵素SalIで切断した。フェノール／クロロホルム処理、およびエタノール沈殿を行い、両DNA断片を等モルの比率で混合してライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該連結反応液をフェノールクロロホルム処理、およびエタノール沈殿にて精製したものを鋳型とし、配列番号１６および１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてPCRを行い、得られた増幅DNAを精製し、cat遺伝子およびsacB遺伝子を含むDNA断片(以後、cat-sacB断片という。)を取得した。
（ｂ）ansA遺伝子欠損株の造成
配列番号１９および２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号２２および２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれansA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。

精製した両DNA断片と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１９および２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片を分離し、cat-sacB断片が挿入されたasnA周辺領域を含むDNA断片を得た。
上記オリゴヌクレオチドのうち、配列番号２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１６で表される塩基配列と相補的な配列を、配列番号２２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１８で表される塩基配列と相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcat-sacB断片を挟み込んだ形で連結できるように設計されている。

また、配列番号１９ならびに２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号２３ならびに２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、エシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれansA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。

精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号１９および２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片を分離し、ansA遺伝子が欠損したansA周辺領域を含むDNA断片を得た。
上記オリゴヌクレオチドのうち、配列番号２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列を一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでansA遺伝子が欠損するように設計されている。
次に、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpKD46［Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645（2000）］を保持するエシェリヒア・コリ W3110株に、上記で取得したcat-sacB断片の挿入されたansA周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入した。

得られた形質転換体を、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート（LB+クロラムフェニコール）に塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。相同組換えが生じた株はクロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示すので、選択したコロニーを、6％シュクロースを含むLB寒天プレート(LB+シュクロース)およびLB+クロラムフェニコールプレートにレプリカし、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した株を選択した。

選択した株について、配列番号１９および２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、ansA遺伝子の位置にcat-sacB断片が挿入されていることを確認した後、上記で得られたansA遺伝子が欠損したansA周辺領域を含むDNA断片をエレクトロポレーションにより導入した。
得られた形質転換体からクロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した株を選択した。選択された株の中からさらにアンピシリン感受性を示す株、すなわちpKD46が脱落した株を選択し、その株について配列番号１９および２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、ansA遺伝子が欠損していることを確認した。

上記のようにしてansA遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリW3110ansA株と命名した。
（ｃ）ansB遺伝子欠損株の造成
配列番号２５および２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号２８および２９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、ansB遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansB遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。

精製した両DNA断片と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号２５および２９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片を分離し、cat-sacB断片が挿入されたansB周辺領域を含むDNA断片を得た。
また、配列番号２５ならびに２７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号２９ならびに３０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、ansB遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansB遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。

精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号２５および２９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片を分離し、ansB遺伝子が欠損したansB周辺領域を含むDNA断片を得た。
上記で取得したDNA断片、およびエシェリヒア・コリ W3110株にpKD46を形質転換して得られた株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、ansB遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリW3110ansB株と命名した。

また、エシェリヒア・コリW3110ansA株にpKD46を形質転換して得られた株を用い、同様にして、ansB遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリ W3110ansAansB株と命名した。
（ｄ）iaaA遺伝子欠損株の造成
配列番号３１ならびに３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号３４ならびに３５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれansA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。
精製した両DNA断片と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号３１および３５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片を分離し、cat-sacB断片が挿入されたiaaA周辺領域を含むDNA断片を得た。

また、配列番号３１ならびに３３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号３５ならびに３６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれansA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。
精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号３１および３５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片を分離し、iaaA遺伝子が欠損したiaaA周辺領域を含むDNA断片を得た。

上記で取得したDNA断片、およびエシェリヒア・コリ W3110ansAansB株にpKD46を形質転換して得られた形質転換株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、iaaA遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリW3110ansAansBiaaA株と命名した。
（ｅ）ansP遺伝子欠損株の造成
配列番号３７および３８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号４０および４１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、ansP遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansP遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。
精製した両方DNA断片と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号３７および４１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片を分離し、cat-sacB断片が挿入されたansP周辺領域を含むDNA断片を得た。

また、配列番号３７ならびに３９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号４１ならびに４２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、ansP遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびansP遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。
精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号３７および４１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片を分離し、ansP遺伝子が欠損したansP周辺領域を含むDNA断片を得た。

上記で取得したDNA断片、およびエシェリヒア・コリW3110ansAansBiaaAansP株にpKD46を形質転換して得られた形質転換株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、ansP遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリW3110ansAansBiaaAansP株と命名した。
（ｆ）argA遺伝子欠損株の造成
配列番号４３ならびに４４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号４６ならびに４７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、argA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびargA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。
精製した両DNA断片と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号４３および４７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたargA周辺領域を含むDNA断片を得た。

また、配列番号４３ならびに４５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号４７ならびに４８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒア・コリW3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、それぞれ、argA遺伝子の開始コドン付近からその上流約1500bp、およびargA遺伝子の終止コドン付近からその下流約1500bpを含むDNA断片を取得した。

精製した両DNA断片を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号４３および４７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いて分離し、argA遺伝子が欠損したargA周辺領域を含むDNA断片を得た。

上記で取得したDNA断片、およびエシェリヒア・コリW3110ansAansBiaaAansP株にpKD46を形質転換して得られた形質転換株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、argA遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリW3110ansAansBiaaAansPargA株と命名した。
表1は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名を示す。

アスパラギン合成酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドの造成
エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４９ならびに配列番号５０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号５１ならびに配列番号５２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、それぞれ、asnA遺伝子領域を含む約1.0 kbのＤＮＡ断片（以下、asnA遺伝子増幅断片という）、およびasnB遺伝子領域を含む約1.7 kbのＤＮＡ断片（以下、asnB遺伝子増幅断片という）を得た。

上記で得られたasnA遺伝子増幅断片を制限酵素HindIIIおよびFbaIで、asnB遺伝子増幅断片を制限酵素HindIIIおよびBamHIで消化した後、アガロース電気泳動により該当する増幅産物を切り出し、精製した。
また、trpプロモーターを含むエシェリヒア・コリの発現ベクターpTK31（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p. 6378-6385）を制限酵素HindIIIおよびBamHIで消化後、上記と同様の方法により約4.9 kbのＤＮＡ断片を精製した。

上記のとおり制限酵素処理したasnA遺伝子増幅断片および発現ベクターpTK31をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。同様に、制限酵素処理したasnB遺伝子増幅断片および発現ベクターpTK31を連結した。得られた各連結ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリNM522株を形質転換し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を選択した。

該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、それぞれの遺伝子発現ベクターが取得されていることを確認し、pTK_asnAおよびpTK_asnBと命名した。

Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドの造成
エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５３および５４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、約0.9 kbのＤＮＡ断片が増幅したことを確認し、該ＤＮＡ断片を常法に従って精製した。該ＤＮＡ断片およびtrpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30［エシェリヒア・コリJM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製］をそれぞれ制限酵素HindIII、SacIで消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、rarD遺伝子を含む約0.9 kbの断片とpTrs30の制限酵素消化断片とをライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。

該連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリNM522株（タカラバイオ社製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、trpプロモーター下流にrarD遺伝子が連結されたプラスミドであるpTrs_rarDが取得されていることを確認した。

次にpTrs_rarDおよびプラスミドpSTV28(タカラバイオ社製)をそれぞれ制限酵素EcoRIおよびSacIで切断し、trpプロモーターの下流にrarD遺伝子が連結された1.6kbの断片とpSTV28の制限酵素消化断片を上記と同様の方法で回収した。
上記と同様の方法で連結し、得られた連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリNM522株を形質転換した後、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を選択した。

選択した形質転換体のコロニーを液体培養し、得られた培養液から公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、trpプロモーター下流にrarDが連結された発現ベクターが得られていることを確認し、該発現ベクターをpSTV_rarDと命名した。

発酵法によるＬ−アスパラギンの製造法
実施例２で造成したプラスミドpTK_asnBを用いて、エシェリヒア・コリW3110株、実施例１で造成したエシェリヒア・コリW3110 ansA株、エシェリヒア・コリW3110 ansB株、エシェリヒア・コリW3110 ansAansB株、エシェリヒア・コリW3110 ansAansBiaaA株、エシェリヒア・コリW3110 ansAansBiaaAansP株、およびエシェリヒア・コリW3110 ansAansBiaaAansPargA株を形質転換し、それぞれW3110/pTK_asnB、W3110ansA/pTK_asnB、W3110ansB/pTK_asnB、W3110ansAansB/pTK_asnB、W3110ansAansBiaaA/pTK_asnB、W3110ansAansBiaaAansP/pTK_asnB、W3110ansAansBiaaAansPargA/pTK_asnBを得た。
また、実施例２で造成したプラスミドpTK_asnAを用いて、実施例１で造成したエシェリヒア・コリW3110 ansAansBiaaA株を形質転換し、W3110ansAansBiaaA/pTK_asnAを得た。
また、プラスミドpTK31を用いて、実施例１で造成したエシェリヒア・コリW3110 ansAansBiaaA株を形質転換し、W3110ansAansBiaaA/pTK31を得た。
また、上記操作で得られた形質転換体W3110ansAansBiaaA/pTK_asnB、W3110ansAansBiaaAasnP/pTK_asnB、およびW3110ansAansBiaaAasnPargA/pTK_asnBに実施例３で造成したプラスミドpSTV_rarDを形質転換し、W3110ansAansBiaaA/pTK_asnB/pSTV_rarD、W3110ansAansBiaaAasnP/pTK_asnB/pSTV_rarD、およびW3110ansAansBiaaAasnPargA /pTK_asnB/pSTV_rarDを得た。
（ａ）試験管培養によるＬ−アスパラギンの製造
上記操作で得られた形質転換体のうち、W3110/pTK_asnB、W3110ans/pTK_asnB、W3110ansB/pTK_asnB、W3110ansAansB/pTK_asnB、W3110ansAansBiaaA/pTK_asnB、W3110ansAansBiaaA/pTK_asnA、およびW3110ansAansBiaaA株/pTK31をそれぞれLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養した。必要に応じて、100mg/Lのカナマイシン、25mg/Lのクロラムフェニコールを添加した。試験管生産培地［グルコース 30g/L、硫酸マグネシウム７水和物 0.5 g/L、イーストエキストラクト 2g/L、硫酸アンモニウム 20g/L、リン酸二水素カリウム 2 g/L、塩化ナトリウム0.6 g/L、チアミン塩酸塩 100mg/L、硫酸第一鉄七水和物 20 mg/L、硫酸マンガン五水和物 20 mg/L、100 mg/L L-イソロイシン、100 mg/L ウラシル、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.5に調整後、炭酸カルシウム 30 g/L、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が5mL入った太型試験管に0.5mL植菌し、30℃で48時間、振盪培養した。
培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のL-アスパラギン濃度をHPLCにて定量した。HPLC分析は、分離カラムにDevelosil ODS-HG-3 3.0 X 100 mm、移動相として、クエン酸三ナトリウム二水和物2.94 g/L、硫酸ナトリウム（無水）1.42 g/L、1-プロパノール16.7 ml/L、ラウリル硫酸ナトリウム3 g/Lを硫酸によってpH2.4に調整した溶液を、反応相として、ほう酸18.5 g/L、水酸化ナトリウム 10.7 g/L、Brij-35(20%液) 3.5 ml/L、o-フタルアルデヒド 0.6 g/L、N-アセチル−L−システイン 4.9 g/Lを用い、カラム温度は60℃で行った。アミノ酸の検出、定量は、分離カラムからの移動相溶出液と、反応相溶液とを混合した後、励起波長360nm、吸収波長440nmの蛍光分析により行った。結果を表２に示す。

（ｂ）ジャーファーメンター培養によるＬ−アスパラギンの製造
W3110ansAansBiaaA/pTK_asnB、W3110ansAansBiaaA/pTK_asnB/pSTV_rarD、W3110ansAansBiaaAansP/pTK_asnB/pSTV_rarD、およびW3110ansAansBiaaAansPargA /pTK_asnB/pSTV_rarDを、それぞれ50mg/Lのカナマイシンおよび25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLBプレート上で30℃にて一晩培養し（W3110ansAansBiaaA/pTK_asnBは50mg/Lのカナマイシンのみを含むLBプレート）、グルコース15g/L、イーストエキストラクト10g/L、NaCl 2.5g/L、CaCO₃ 15g/L、50mg/Lカナマイシン、25 mg/Lクロラムフェニコールからなる培地（W3110ansAansBiaaA/pTK_asnBは50mg/L カナマイシンのみを含む培地）200mlが入ったバッフル付き2リットル三角フラスコへ植菌して、30℃で12時間、振盪培養した。
培養終了後、80mLの培養物を600mlの発酵培地［グルコース30g/L（別途オートクレーブにて調製）、コーンスティープリカー3g/L、硫酸アンモニウム 20g/L、リン酸二水素カリウム 44.2g/L、硫酸マグネシウム７水和物2.5g/L、硫酸ナトリウム0.7g/L、塩化カルシウム２水和物 0.23g/L、硫酸第一鉄七水和物 20mg/L、硫酸マンガン７水和物10mg/L、硫酸亜鉛７水和物 2mg/L、硫酸銅５水和物2mg/L、塩化ニッケル６水和物 2mg/L、塩化コバルト６水和物 2mg/L、ベータアラニン50mg/L、ニコチン酸50mg/L、チアミン塩酸塩40mg/L、ビオチン490μg/L、100mg/L L-イソロイシン、100mg/L ウラシル］が入ったジャーファーメンターに接種し、1200rpmで攪拌しながら35℃、2L/分の通気量で培養した。培養中、pHを7.3に維持するためにアンモニア溶液を加えた。argA欠失株の培養には、上記600mLの発酵培地に１g/LのＬ−アルギニンを添加した。
培養物中のグルコースが完全に消費された時点よりフィード培地［グルコース550g/L］を流加して、該フィード培地を400ml添加するまで培養を継続した。培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のL-アスパラギンの蓄積濃度をHPLCにて定量した。結晶が培養液中に析出している場合は十分に懸濁した状態で希釈するよう留意した。 表３にL-アスパラギンの蓄積濃度を示す。

本発明により、Ｌ−アスパラギンを効率よく製造することができる。

配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (4)

1. 親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン分解活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつL-アスパラギンを生産する能力を有する、以下の［１］〜［５］のいずれかに記載のDNAを有する組換え体DNAで親株を形質転換して得られる微生物を培地に培養し、培養物中にL-アスパラギンを生成、蓄積させ、該培養物中からL-アスパラギンを採取することを特徴とするL-アスパラギンの製造法。
   ［１］配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA
   ［２］配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA
   ［３］配列番号１４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA
   ［４］配列番号１３で表される塩基配列を有するDNA
   ［５］配列番号１３で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつL-アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするDNA
2. 微生物が、親株に比べL-アスパラギン合成活性が増強した微生物である、請求項１記載の製造法。
3. 微生物が、親株の染色体DNA上にあるL-アスパラギン取込活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物である、請求項１または２記載の製造法。
4. 微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。