CN114829579A - 具有改造后的乳糖渗透酶的微生物和含乳糖寡糖的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于，提供更高效的利用发酵生产的含乳糖寡糖的制造方法。根据本发明，通过使用具有生产如特定氨基酸残基被置换为其它氨基酸残基这样改造后的具有乳糖渗透酶活性的蛋白质的能力的微生物，能够与使用具有生产野生型的具有乳糖渗透酶活性的蛋白质的能力的微生物的情况相比更高效地制造2'‑岩藻糖基乳糖等含乳糖寡糖。
Description
技术领域
本发明涉及能够高效率地生产含乳糖寡糖的含乳糖寡糖的制造方法。
背景技术
据报道，人母乳中含有的乳寡糖(HMO)具有抵御致病菌感染的作用、作为益生元的功能，由于其生理活性而在作为婴幼儿用配方奶粉添加剂方面受到关注(非专利文献1)。
作为HMO，迄今为止已知有130种以上，其中的大部分为在还原末端具有游离乳糖单元的含乳糖寡糖。
在利用发酵生产的含乳糖寡糖的制造方法中，已知添加价格较低廉的乳糖作为底物的方法(非专利文献2)。另外，已知从微生物细胞外摄取乳糖是借助乳糖渗透酶进行的(非专利文献3)。
另一方面，使用具有突变型乳糖渗透酶的微生物的含乳糖寡糖的制造方法、以及乳糖渗透酶的突变对含乳糖寡糖的生产率的影响是未知的。另一方面，从含乳糖寡糖的关注度出发，需要含乳糖寡糖的更高效的制造方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：J Biotechnol(2016)235：61-83
非专利文献2：Curr Opin Biotechnol(2019)56：130-137
非专利文献3：J Biotechnol(2015)210：107-115
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，对于含乳糖寡糖，需要更高效的制造方法。本发明的目的在于，提供更高效的利用发酵生产的含乳糖寡糖的制造方法。
用于解决问题的方法
本发明涉及以下方案。
1.一种微生物，其具有由在下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质，并且该微生物生产含乳糖寡糖的能力高于亲株，
[1]由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质，
[2]由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的突变蛋白，
[3]由与序列号2所示的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的同源蛋白。
2.根据上述1所述的微生物，其具有由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向L-天冬氨酸或L-谷氨酸的置换的氨基酸序列构成的蛋白质。
3.根据上述1或2所述的微生物，其具有由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向L-谷氨酸的置换的氨基酸序列构成的蛋白质。
4.根据上述1～3中任一项所述的微生物，其通过用重组体DNA转化亲株而得到，所述重组体DNA含有编码由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA。
5.根据上述4所述的微生物，其通过在染色体中整合重组体DNA而得到，所述重组体DNA含有编码由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA。
6.根据上述1～5中任一项所述的微生物，其通过用重组体DNA转化亲株而得到，所述重组体DNA含有具有序列号3所示的碱基序列的DNA。
7.根据上述6所述的微生物，其通过在染色体中整合重组体DNA而得到，所述重组体DNA含有具有序列号3所示的碱基序列的DNA。
8.根据上述1～7中任一项所述的微生物，其中，上述亲株为具有生产含乳糖寡糖的能力的微生物。
9.一种含乳糖寡糖的制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述1～8中任一项所述的微生物，使含乳糖寡糖在培养物中生成。
10.根据上述9所述的制造方法，其中，上述含乳糖寡糖为2’-岩藻糖基乳糖。
发明效果
根据本发明，可以提供能够高效率地生产含乳糖寡糖的含乳糖寡糖的制造方法。
具体实施方式
1.本发明的微生物
本发明的微生物为具有以下的(1)或(2)中记载的蛋白质且生产含乳糖寡糖的能力高于亲株的微生物。
(1)由在下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质。
[1]由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质
[2]由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的突变蛋白。
[3]由与序列号2所示的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的同源蛋白。
(2)由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向L-谷氨酸的置换的氨基酸序列构成的上述(1)中记载的蛋白质。
上述[1]～[3]中任一项记载的成为基础的蛋白质的氨基酸序列中的与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基是指：在对该成为基础的蛋白质的氨基酸序列与序列号2的氨基酸序列进行比对时，排列在与序列号2的氨基酸序列中的第319位的氨基酸残基相同的位置的氨基酸残基。
关于上述(1)或(2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基被置换为其它氨基酸残基这一点，例如，可以通过对想要确认氨基酸残基的上述(1)或(2)中记载的蛋白质的氨基酸序列与成为基础的上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列进行比对来进行确认。
氨基酸序列的比对例如可以使用公知的比对程序ClustalW[Nucelic AcidsResearch 22，4673，(1994)]来创建。例如，可以由http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/(European Bioinformatics Institute)来利用ClustalW。在使用ClustalW创建比对时，参数可以使用例如默认值。
上述(1)中记载的其它氨基酸残基可以为天然型和非天然型。作为天然型氨基酸，可以列举L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。
以下示出可以相互置换的氨基酸的例子。同一组中包含的氨基酸可以相互置换。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组：苯丙氨酸、酪氨酸
作为上述(1)中记载的其它氨基酸残基，优选的是，优选为选自上述B组中记载的氨基酸残基(天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸)中的1种，更优选该氨基酸残基为L体。作为上述(1)中记载的其它氨基酸残基，进一步优选L-谷氨酸。
突变蛋白是指：使成为基础的蛋白质中的氨基酸残基人为地缺失或置换、或者在该蛋白质中人为地插入或添加氨基酸残基而得到的蛋白质。
突变蛋白中，缺失、置换、插入或添加氨基酸可以在同一序列中的任意位置缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸。
缺失、置换、插入或添加的氨基酸可以为天然型或非天然型。作为天然型氨基酸的例子，可以列举上述的天然型氨基酸。
可以相互置换的氨基酸的例子如前所述。包含在同一组中的氨基酸可以相互置换。
同源蛋白是指：自然界中存在的生物所具有的、进化上的起源来源于同一蛋白质的一组蛋白质。同源蛋白彼此之间结构和功能是类似的。氨基酸序列、碱基序列的一致性可以使用由Karlin和Altschul提出的算法BLAST[Pro.Nat.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)]、FASTA[Methods Enzymol.，183，63(1990)]来确定。基于该算法BLAST，开发出被称为BLASTN、BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。在使用基于BLAST的BLASTN分析碱基序列时，参数例如设为分数(Score)＝100、字长(wordlength)＝12。另外，使用基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如设为分数＝50、字长＝3。使用BLAST和Gap pedBLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是公知的。
上述的突变蛋白或同源蛋白具有乳糖渗透酶活性这一点例如可以通过以下方法来确认。首先，利用后述的方法制作具有编码想要确认上述活性的突变蛋白或同源蛋白的DNA的重组体DNA。然后，用该重组体DNA转化不具有乳糖渗透酶活性的微生物、例如乳糖渗透酶缺失的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110株。最后，在含有乳糖作为糖源的培养基中培养该微生物，确认到与亲株相比生长得到改善时，可以确认突变蛋白或同源蛋白具有乳糖渗透酶活性。
作为在上述(1)或(2)中记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的蛋白质的具体例，可以列举由序列号32所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
亲株是指：成为基因改造和转化等的对象的出发菌株。成为利用基因导入进行转化的对象的出发菌株也称为宿主株。
本发明的微生物的亲株只要是具有生产含乳糖寡糖的能力的微生物，则可以为任意微生物。
含乳糖寡糖是指：在还原末端具有乳糖单元的寡糖。作为含乳糖寡糖，可以列举例如2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’，3-二岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、3’-唾液酸-3-岩藻糖基乳糖等。
作为具有生产含乳糖寡糖的能力的微生物，可以优选使用人为地赋予了或增强了生产含乳糖寡糖的能力的选育株。
作为对用作亲株的微生物人为地赋予或增强生产含乳糖寡糖的能力的方法，可以列举下述方法：(a)增强与由糖生成含乳糖寡糖的生物合成途径相关的酶中的至少1个的表达的方法；(b)增加编码与由糖生成含乳糖寡糖的生物合成途径相关的酶的基因中的至少1种的拷贝数的方法；(c)使由糖生成含乳糖寡糖的生物合成途径的调控机制中的至少1个缓和或解除的方法；(d)减弱或阻断由糖生成含乳糖寡糖的生物合成途径向该目标物质以外的代谢产物分支的代谢通路中的至少1个的方法；等，上述公知的方法可以单独使用或组合使用。
作为上述的与由糖生成含乳糖寡糖的生物合成途径相关的酶的具体例，可以列举例如：具有以GDP-盐藻糖和乳糖为底物生成2’-岩藻糖基乳糖的α1，2-岩藻糖基转移酶活性的酶、具有以GDP-盐藻糖和乳糖为底物生成3-岩藻糖基乳糖的α1，3-岩藻糖基转移酶活性的酶、具有以CMP-唾液酸和乳糖为底物生成3’-唾液酸乳糖的α2，3-唾液酸转移酶活性的酶、和具有以CMP-唾液酸和乳糖为底物生成6’-唾液酸乳糖的α2，6-唾液酸转移酶活性的酶等公知的酶。
作为上述的赋予或增强生产含乳糖寡糖的能力的方法的具体例，可以列举例如通过各种基因工程来增强生产2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖的能力的方法(MetabolicEngineering(2017)41：23-38)等公知的方法。
另外，也可以使用对具有生产含乳糖寡糖的能力的微生物人为地赋予或强化供给作为前体的乳糖的能力而得到的选育株。
作为对用作亲株的微生物人为地赋予或强化由糖供给乳糖的能力的方法，可以列举：(a)使由糖生成乳糖的生物合成途径的调控机制中的至少1个缓和或解除的方法；(b)增强与由糖生成乳糖的生物合成途径相关的酶中的至少1种的表达的方法；(c)增加编码与由糖生成乳糖的生物合成途径相关的酶的基因中的至少1个的拷贝数的方法；(d)使乳糖分解机制中的至少1个缓和或解除的方法；(e)减弱或阻断由糖生成乳糖的生物合成途径向该目标物质以外的代谢产物分支的代谢通路中的至少1个的方法；等，上述公知的方法可以单独使用或组合使用。
作为上述的与由糖生成乳糖的生物合成途径相关的酶的具体例，可以列举例如具有以葡萄糖和UDP-半乳糖为底物生成乳糖的乳糖合酶活性的酶等公知的酶。
作为上述的赋予或增强供给乳糖的能力的方法的具体例，可以列举降低参与乳糖分解的β-半乳糖苷酶的活性的方法或使该酶失活的方法(Metabolic Engineering(2017)41：23-38)等公知的方法。
具有生产含乳糖寡糖的能力的微生物可以为任意微生物，可以优选列举原核生物或酵母菌株，更优选列举属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、微杆菌属或假单胞菌属等的原核生物、或者属于酵母菌属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毛孢菌属、许旺酵母属、毕赤酵母属或念珠菌属等的酵母菌株，最优选列举：大肠杆菌BL21codon plus、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue(均为Agilent Technologies，Ltd.制)；大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Merck Millipore制)；大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HST08Premium、大肠杆菌HST02、大肠杆菌HST04 dam-/dcm-、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌CJ236、大肠杆菌BMH71-18mutS、大肠杆菌MV1184、大肠杆菌TH2(均为Takara Bio Inc.制)；大肠杆菌W、大肠杆菌JM101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌W3110S(Kyow34、NationalBioResource Project)、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MCl000、大肠杆菌W1485、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌ATCC9637、大肠杆菌KY3591(保藏编号：NITE BP-03062)、无花果沙雷菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷菌(Serratia fonticola)、液化沙雷菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、未成熟短杆菌(Brevibacterium immariophilum)ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC14066、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒状杆菌ATCC14067、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354或假单胞菌(Pseudomonas)sp.D-0110等原核生物、或者酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、毕赤酵母(Pichia pastoris)或产朊假丝酵母(Candida utilis)等酵母菌株。
上述大肠杆菌KY3591保藏在位于日本千叶县木更津市かずさ镰足2丁目5-8 122号室(邮政编码292-0818)的独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)。保藏日(委托日)为令和元年(西历2019年)11月18日，保藏编号为NITE BP-03062。
此后对使用上述宿主株制作的具有上述(1)或(2)的蛋白质的微生物赋予或增强了生产含乳糖寡糖的能力而得到的微生物、以及对该微生物进一步赋予或增强了供给乳糖的能力的微生物、并且生产含乳糖寡糖的能力高于亲株的微生物也是本发明的微生物。
作为具有上述(1)或(2)中记载的蛋白质的微生物，可以列举例如：用具有以下的(3)～(6)中任一项记载的DNA的重组体DNA转化亲株而得到的微生物、以及通过在染色体中整合该重组体DNA而得到的微生物。
(3)编码上述(1)或(2)中记载的蛋白质的DNA
(4)编码由在由下述[4]～[6]中任一项记载的DNA编码的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA
[4]具有序列号1所示的碱基序列的DNA
[5]与由和序列号1所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交且编码具有乳糖渗透酶活性的同源蛋白的DNA
[6]由与序列号1所示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选为99％以上的一致性的碱基序列构成且编码具有乳糖渗透酶活性的同源蛋白的DNA
(5)上述(4)中记载的DNA，且编码由在其所编码的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向L-谷氨酸的置换的氨基酸序列构成的DNA
(6)具有序列号3所示的碱基序列的DNA
上述中，杂交是指：使DNA杂交至具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分上的工序。因此，与该具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分进行杂交的DNA的碱基序列可以为作为Northern印迹分析或Southern印迹分析的探针有用的DNA、或可以作为PCR分析的寡核苷酸引物使用的长度的DNA。
作为用作探针的DNA，可以列举例如至少100个碱基以上、优选200个碱基以上、更优选500个碱基以上的DNA。另外，作为用作引物的DNA，可以列举例如至少10个碱基以上、优选15个碱基以上的DNA。
DNA的杂交实验方法是众所周知的，例如，可按照分子克隆第4版(Cold SpringHarbor Laboratory Press(2012))、Methods for General and Molecular Bacteriology(ASM Press(1994))、Immunology methods manual(Academic press(1997))等、以及多种其它的标准教科书来确定杂交条件并进行实验。
另外，按照市售的杂交试剂盒所附带的说明书，也可以获得在严谨条件下杂交的DNA。作为市售的杂交试剂盒，可以列举例如：利用随机引物法制作探针并在严谨条件下进行杂交的随机引物DNA标记试剂盒(Roche Diagnostics GmbH制)。
上述的严谨条件是指例如下条件：使固定有DNA的过滤器和探针DNA在含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM的氯化钠、75mM的柠檬酸钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％的硫酸葡聚糖和20μg/L的变性鱼精DNA的溶液中、在42℃下孵育一晚后，在例如约65℃的0.2×SSC溶液中洗涤该过滤器。
上述的各种条件也可以通过添加或改变用于抑制杂交实验的背景的封闭试剂来设定。也可以随着上述封闭试剂的添加而随之改变杂交条件，以使条件适宜。
作为上述的能够在严谨条件下杂交的DNA，可以列举例如：使用上述的BLAST、FASTA等程序基于上述参数进行计算时，与序列号1所示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列所构成的DNA。
用具有上述(3)～(6)中任一项记载的DNA的重组体DNA转化亲株而得到的微生物、以及通过在染色体中整合该重组体DNA而得到的微生物可以通过以下方法来制备。
上述(3)～(6)中任一项记载的DNA例如可以如下获得：使用编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，对编码位于该DNA上的与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基的部分的碱基序列，利用例如分子克隆第4版(Cold SpringHarbor Laboratory Press(2012))和Current Protocols in Molecular Biology(JOHNWILEY&SONS，INC.)等中记载的定点诱变法导入突变，置换为编码任意氨基酸残基的碱基序列，从而获得。或者，也可以使用PrimeSTAR MutagenesisBasal Kit(Takara Bio Inc.制)来得到本发明的DNA。
也可以通过同样的方法如下获得：使用编码由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的突变蛋白的DNA，对编码利用上述方法比对序列号2所示的氨基酸序列与该突变蛋白的氨基酸序列时在该突变蛋白的氨基酸序列中与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基的部分的碱基序列导入突变，从而获得。
另外，也可以如下获得：使用编码由与序列号2所示的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的同源蛋白的DNA，对编码利用上述方法比对该同源蛋白的氨基酸序列与序列号2所示的氨基酸序列时该同源蛋白的氨基酸序列中与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基的部分的碱基序列导入突变，从而获得。
编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA例如可以如下获得：使用可基于编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA的碱基序列设计的探针对微生物、优选埃希氏菌属、更优选大肠杆菌W3110株的染色体DNA文库进行Southern印迹杂交而得到，或者使用可基于编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA设计的引物DNA、以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板进行PCR[PCR Protocols，Academic Press(1990)]而得到。
大肠杆菌W3110(ATCC27325)株可以由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
作为编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，可以列举例如由序列号1所示的碱基序列构成的DNA。
编码上述[2]记载的、由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的突变蛋白的DNA例如可以如下获得：以由序列号1所示的碱基序列构成的DNA为模板，通过供于易错PCR等而获得。
或者，也可以通过使用在各自的5′端具有以可导入目标突变(缺失、置换、插入或添加)的方式设计的碱基序列的1组PCR引物的PCR[Gene，77，51(1989)]来获得编码上述[2]的由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的突变蛋白的DNA。
另外，按照市售的局部特异性突变导入试剂盒所附带的说明书，也可以获得该DNA。作为市售的局部特异性突变导入试剂盒，可以列举例如能够在想要导入目标突变的位置导入突变(缺失、置换、插入或添加)的PrimeSTAR(注册商标)Mutagenesis Basal Kit(Takara Bio Inc.制)。
即，首先将具有以导入目标突变(缺失、置换、插入或添加)的方式设计的碱基序列的质粒作为模板，设计5’侧的15个碱基重叠的一对突变导入用引物。此时，重叠部分包含目标突变。然后，使用该突变导入用引物，以具有想要导入目标突变的碱基序列的质粒为模板进行PCR。将由此得到的扩增片段转化至大肠杆菌，则可以得到具有导入了目标突变的碱基序列的质粒。
编码上述[3]记载的、由与序列号2所示的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的同源蛋白的DNA例如可以如下获得：对于各种基因序列数据库，检索与序列号2所示的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列，使用可基于通过该检索得到的碱基序列或氨基酸序列设计的探针DNA或引物DNA、以及具有该DNA的微生物，通过与上述的获得编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA的方法同样的方法获得。碱基序列、氨基酸序列的一致性可通过与上述相同的方法确定。
具有上述(3)～(6)中任一项记载的DNA的重组体DNA例如是指如下重组体DNA：该DNA在亲株中可自主复制，并且在能够转录上述(3)～(6)中任一项记载的DNA的位置处含有启动子的表达载体中整合有上述(3)～(6)中任一项以上所记载的DNA。
在亲株中能够整合于染色体的、上述(3)～(6)中任一项记载的重组体DNA也是具有上述(3)～(6)中任一项记载的DNA的重组体DNA。
重组体DNA在为能够整合于染色体的重组体DNA时也可以不含启动子。
使用细菌等原核生物作为宿主株时，在亲株中能够自主复制的重组体DNA优选由启动子、核糖体结合序列、上述(3)～(6)中任一项以上所记载的DNA和转录终止序列构成的重组体DNA。可以含有控制启动子的基因。
优选将作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间调整为合适的距离，例如6～18个碱基。
在亲株中可自主复制的重组体DNA中，转录终止序列对于该DNA的表达而言并非必需，但是优选在紧邻结构基因的下游配置转录终止序列。
在使用属于埃希氏菌属的微生物作为亲株时，作为表达载体，可以列举例如：pColdI、pSTV28、pUC118(均为Takara Bio Inc.制)；pET21a、pCDF-1b、pRSF-1b(均为MerckMillipore制)；pMAL-c5x(New England Biolabs Inc.制)；pGEX-4T-1、pTrc99A(均为GEHealthcare Bio-Sciences制)；pTrcHis、pSE280(均为Thermo Fisher Scientific制)；pGEMEX-1(Promega Corp.公司制)；pQE-30、pQE-60、pQE80L(均为Qiagen公司制)；pET-3、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII KS(-)(均为Agilent Technologies，Ltd.制)；pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)；pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]；pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]；pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]；pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]；pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]；pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2007，Vol.73，No.20，p6378-6385]；pPE167(App1.Environ.Microbiol.2007，73：6378-6385)；pPAC31(国际公开第98/12343号)、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pPA1(日本特开昭63-233798号公报)等。
作为使用上述表达载体时的启动子，只要为在属于埃希氏菌属的微生物的细胞中起作用的启动子，则任一者均可，可以使用例如trp启动子、gapA启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来源于大肠杆菌、噬菌体等的启动子。另外，也可以使用将2个trp启动子串联而成的启动子、tac启动子、trc启动子、lacT5启动子、lacT7启动子、let I启动子之类的人为设计改造的启动子。
在使用棒状杆菌作为亲株时，作为表达载体，可以列举例如pCG1(日本特开昭57-134500号公报)、pCG2(日本特开昭58-35197号公报)、pCG4(日本特开昭57-183799号公报)、pCG11(日本特开昭57-134500号公报)、pCG116、pCE54、pCBl01(均在日本特开昭58-105999号公报中)、pCE51、pCE52、pCE53[均在Molecular and General Genetics，196，175(1984)中]等。
作为使用上述表达载体时的启动子，只要为在棒状杆菌的细胞中起作用的启动子，则任一者均可，可以使用例如P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，p674-679(2000)]。
在使用酵母菌株作为亲株时，作为表达载体，可以列举例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作为使用上述表达载体时的启动子，只要是在酵母菌株的细胞中起作用的启动子，则任一者均可，可以列举例如PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、ga110启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。
用该重组体DNA转化亲株而得到的微生物是指：通过以在亲株中能够自主复制的质粒形式导入该重组体DNA或在亲株的染色体中整合该重组体DNA、从而该DNA被转录而变得能生产该DNA所编码的蛋白质的微生物。
作为确认上述(3)～(6)记载的DNA被转录和变得能生产该DNA所编码的蛋白质的方法，例如，可以通过利用Northern印迹法测定该DNA的转录量或利用蛋白质印迹法测定该蛋白质的生产量来进行确认。
对于所获得的上述(3)～(6)记载的DNA，可直接或用适当的限制酶等切断后利用常规方法整合于载体，将得到的重组体DNA导入宿主细胞后，使用通常所用的碱基序列分析方法、例如双脱氧法[Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，74，5463(1977)]或Applied Biosystems3500基因分析仪、Applied Biosystems 3730DNA分析仪(均为Thermo Fisher Scientific制)等碱基序列分析装置进行分析，由此可确定该DNA的碱基序列。
作为确定本发明的DNA的碱基序列时可使用的宿主细胞，可以列举例如大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HST08 Premium、大肠杆菌HST02、大肠杆菌HST04 dam-/dcm-、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌CJ236、大肠杆菌BMH71-18mutS、大肠杆菌MV1184、大肠杆菌TH2(均为Takara Bio Inc.制)、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue(均为AgilentTechnologies，Ltd.制)、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌W1485、大肠杆菌W3110、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522等。
作为上述载体，可以列举pBluescriptII KS(+)、pPCR-Script Amp SK(+)(均为Agilent Technologies，Ltd.制)；pT7Blue(Merck Millipore制)；pCRII(Thermo FisherScientific制)、pCR-TRAP(GenHunter Corporation制)、和pDIRECT[Nucleic Acids Res.，18，6069(1990)]等。
作为重组体DNA的导入方法，只要是将DNA导入宿主细胞的方法，则任意方法均可使用，可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394号公报)、电穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]等。
在碱基序列确定结果是所获得的DNA为部分长度时，可以通过以该部分长度DNA为探针的针对染色体DNA文库的Southern印迹杂交法等来获得全长DNA。
进而，可以基于所确定的DNA的碱基序列用PerSeptive Biosystems，Inc.制造的8905型DNA合成装置等进行化学合成，由此制备目标DNA。
在此，通过对上述(3)～(6)记载的DNA的碱基序列进行碱基置换，使其成为适合于亲株的表达的密码子，由此可以提高该DNA所编码的蛋白质的表达量。宿主细胞中的密码子使用频率信息可以通过公共数据库来获得。
将如上制备的DNA片段插入上述合适的表达载体的启动子的下游，由此可以制作本发明的微生物所具有的重组体DNA。
作为这样的重组体DNA的例子，可以列举实施例中所述的pYHA2。
作为以在亲株中能够自主复制的质粒形式导入重组体DNA的方法，可以列举例如上述的使用钙离子的方法、原生质体法、电穿孔法等方法。
作为将重组体DNA整合到亲株染色体中的方法，可以列举例如同源重组法。作为同源重组法，可以列举例如使用同源重组用质粒的方法，所述同源重组用质粒是通过与在想要导入的宿主细胞内不能自主复制的具有抗药基因的质粒DNA连接而制作的。另外，作为在大肠杆菌中广泛使用的利用同源重组的方法，可以列举例如利用λ噬菌体的同源重组系统导入重组体DNA的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6641-6645(2000)]。
进而，使用利用由于与重组体DNA一起整合于染色体的枯草菌左旋蔗糖酶而使大肠杆菌变得对蔗糖敏感这一点的选择法、利用通过在具有链霉素抗性的突变rpsL基因的大肠杆菌中整合野生型rpsL基因而使大肠杆菌变得对链霉素敏感这一点的选择法[Mol.Microbiol.，55，137(2005)、Biosci.Biotechnol.Biochem.，71，2905(2007)]等，可以获得宿主细胞的染色体DNA上的目标区域被置换为重组体DNA的大肠杆菌。
关于用上述方法制得的微生物为生产含乳糖寡糖的能力高于亲株的微生物这一点，例如可以通过在培养基中分别培养亲株和所制得的微生物并比较含乳糖寡糖的生成量来确认。作为这样的微生物的例子，可以列举实施例中所述的KFL/pYHA2株。
2.本发明的含盐藻糖寡糖的制造方法
作为本发明的含盐藻糖寡糖的制造方法，可以列举特征在于在培养基中培养上述1的微生物并且使含盐藻糖寡糖在培养物中生成的含盐藻糖寡糖的制造方法。
培养上述1的微生物的方法可按照培养微生物时使用的常规方法来进行。作为培养该微生物的培养基，只要是含有该微生物可同化的碳源、氮原、无机盐类等而能够高效地进行该微生物的培养的培养基，则天然培养基和合成培养基中任一者均可使用。
作为碳源，为该微生物可同化的碳源即可，可以使用例如：葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等糖；乙酸或丙酸等有机酸；或者甘油、乙醇或丙醇等醇类等。
作为氮原，可以使用例如：氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵或磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐；其它含氮化合物；以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕、大豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机盐，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养通常优选在振荡培养或深部通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度通常为15～40℃，培养时间通常为5小时～7天。培养中的培养液pH通常保持在3.0～9.0。pH的调节可使用无机酸或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等来进行。
另外，培养中可根据需要向培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。在培养用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体转化而成的微生物时，可根据需要向培养基中添加诱导剂。例如，培养用使用lac启动子的表达载体转化的微生物时，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等，在培养用使用trp启动子的表达载体转化的微生物时，可向培养基中添加吲哚丙烯酸等。
上述培养中，可以根据需要向培养基中添加乳糖、N-乙酰乳糖胺等含乳糖寡糖的生成所必需的前体。
通过上述培养而在培养物中生成、积累含乳糖寡糖，通过从该培养物中采集含乳糖寡糖，可以制造含乳糖寡糖。
生成的含乳糖寡糖可以使用糖离子色谱法等常规方法进行分析。从上述培养物或该培养物的处理物中采集含乳糖寡糖可以通过使用活性碳、离子交换树脂等常规方法进行。在含乳糖寡糖积累在菌体内时，例如可以通过活性碳、离子交换树脂等从利用超声波等破碎菌体并通过离心分离除去菌体后得到的上清液中采集含乳糖寡糖。
[分析例]
实施例中，通过以下所示的步骤进行2’-岩藻糖基乳糖的分析、定量。对培养后的含有微生物的培养液进行离心分离，回收上清液。利用糖分析装置ICS-5000(ThermoFisher Scientific制)分析该上清液中所含的2’-岩藻糖基乳糖。
[分析条件]
色谱柱：CarboPAC PA1
柱温：25℃
流动相：(流动相A)水
(流动相B)500mmol/L氢氧化钠
(流动相C)300mmol/L乙酸钠
流动相A、流动相B和流动相C的混合比：
(0～10分钟)80∶20∶0至70∶20∶10的梯度
(10～18分钟)70∶20∶10
(18～25分钟)80∶20∶0
流速：0.8mL/分钟
检测器：脉冲电流检测器
实施例
以下示出实施例的详细情况，但是本发明不受这些实施例限定。
[实施例1]2’-岩藻糖基乳糖的制造中使用的微生物的制备
(1)基因缺失时用作标志物的DNA片段的获得
将由表1的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组、将表1的“模板”中记载的DNA作为模板而进行PCR，得到各扩增DNA片段。
[表1]
枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA按照常规方法制备。扩增DNA片段cat含有pHSG396上的cat基因的上游约200bp至下游约50bp。扩增DNA片段sacB含有枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA上的sacB基因的上游约300bp至下游约100bp。
然后，使用扩增DNA片段的cat和sacB作为模板、使用由序列号3和6所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR，得到含有cat基因和sacB基因的DNA(以下称为cat-sacB。)片段。
(2)失去了β-半乳糖苷酶活性、乳糖渗透酶活性和胆烷酸生成活性的大肠杆菌的制备
通过以下方法制备编码β-半乳糖苷酶的DNA(以下称为lacZ基因。)、编码乳糖渗透酶的DNA(以下称为lacy基因。)和编码胆烷酸生成相关蛋白质的DNA(以下称为wcaJ、wzxC、wcaK、wcaL或wcaM基因。)发生了缺损的大肠杆菌。需要说明的是，lacZ和lacY(以下称为lacZY。)以及wcaJ、wzxC、wcaK、wcaL和wcaM(以下称为wcaJ-wzxC-wcaKLM。)在大肠杆菌基因组上分别形成操纵子。
使用按照常规方法制备的大肠杆菌KY3591株的基因组DNA作为模板、使用由表2的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR，得到各扩增DNA片段。
[表2]
lacZ上游1和lacZ上游2含有lacZ基因的起始密码子起的、其上游约900bp。lacY下游1和lacY下游2含有lacY基因的终止密码子起的、其下游约800bp。
使用lacZ上游1、lacY下游1和cat-sacB片段的等摩尔比率混合物作为模板、使用由序列号8和10所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR，得到由在lacZ和lacY基因周边区域的序列中插入了cat-sacB片段的序列构成的DNA(以下称为lacZY：：cat-sacB。)片段。
使用lacZ上游2和lacY下游2的等摩尔比率混合物作为模板、使用由序列号8和10所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR，得到不含lacZ和lacy、由lacZ上游与lacY下游直接连接的序列构成的DNA(以下称为ΔlacZY。)片段。
利用电穿孔法将lacZY：：cat-sacB片段导入保持有含有编码λ重组酶的基因的质粒pKD46[Datsenko，K.A.，Warner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，Vol.97，6640-6645(2000)]的大肠杆菌W3110株中，得到显示氯霉素抗性且显示蔗糖敏感性的转化体(lacZ和lacY基因被置换为lacZY：：cat-sacB的转化体)。
将ΔlacZY片段利用电穿孔法导入该转化体，得到显示氯霉素敏感性且显示蔗糖抗性的转化体(lacZY：：cat-sacB被置换为ΔlacZY的转化体)。由它们进一步得到显示氨苄青霉素敏感性的转化体(pKD46丢失的转化体)。将该转化体命名为W3110ΔlacZY。
同样地使用大肠杆菌KY3591株(保藏编号为NITE BP-03062)的基因组DNA作为模板、使用由表3的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR，得到各扩增DNA片段。
[表3]
wcaJ上游1和wcaJ上游2含有wcaJ基因的起始密码子起的、其上游约900bp。wcaM下游1和wcaM下游2含有wcaM基因的终止密码子起的、其下游约800bp。
使用wcaJ上游1、wcaM下游1和cat-sacB片段的等摩尔比率混合物作为模板、使用由序列号14和16所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR，得到了由在wcaJ-wzxC-wcaKLM操纵子周边区域的序列中插入了cat-sacB片段的序列构成的DNA(以下称为wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB。)片段。
使用wcaJ上游2和wcaM下游2的等摩尔比率混合物作为模板、使用由序列号14和16所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR，得到了不含wcaJ-wzxC-wcaKLM、由wcaJ上游和wcaM下游直接连接的序列构成的DNA(以下称为ΔwcaJ-wzxC-wcaKLM。)片段。
将wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB片段利用电穿孔法导入上述所制备的W3110ΔlacZY株，得到显示氯霉素抗性且显示蔗糖敏感性的转化体(wcaJ-wzxC-wcaKLM被置换为wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB的转化体)。
将ΔwcaJM片段利用电穿孔法导入该转化体，得到显示氯霉素敏感性且显示蔗糖抗性的转化体(wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB被置换为AwcaJ-wzxC-wcaKLM的转化体)。进而得到显示氨苄青霉素敏感性的转化体(pKD46丢失的转化体)。将该转化体命名为KFL株。
(3)来源于大肠杆菌的乳糖渗透酶(LacY)表达载体的制备
使用由表4的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组、使用表4的“模板”中记载的DNA作为模板而进行PCR，得到各扩增DNA片段。
[表4]
大肠杆菌W3110株的基因组DNA通过常规方法制备。另外，序列号2和3、序列号4和5所示的碱基序列含有与各自的5’末端互补的序列。
将lacY、HMFT和rcsA片段的等摩尔比率混合物作为模板、使用由序列号25和26所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR，得到3个片段连接而成的DNA(以下称为lacY-HMFT-rcsA)片段。
将由序列号27和28所示的碱基序列构成的DNA作为引物组、将质粒pPE167(Appl.Environ.Microbiol.2007，73：6378-6385)作为模板进行PCR，得到约4.4kb的载体片段。此时，序列号25和28、序列号26和27所示的碱基序列含有与各自的5’末端互补的序列。
将上述得到的lacY-HMFT-rcsA片段和载体片段用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio Inc.制)连接，由此得到表达质粒pYHA1。
(4)表达突变型Lacy的微生物的制备
将上述(2)中得到的质粒pYHA1作为模板，使用Prime STAR Mutagenesis BasalKit(Takara Bio Inc.制)制作将LacY的氨基酸序列中第319位的L-赖氨酸残基置换为L-谷氨酸残基的质粒pYHA2。作为引物组，使用由序列号29和30所示的碱基序列构成的DNA。
使用(3)中得到的质粒pYHA1和上述pYHA2转化上述(2)中制备的KFL株，得到KFL/pYHA1株和KFL/pYHA2株。
[实施例2]通过使用表达突变型LacY的微生物的发酵法制造2’-岩藻糖基乳糖
将实施例1中得到的KFL/pYHA1株和KFL/pYHA2株在LB平板上在30℃下培养24小时，接种于装有5mL的含有100mg/L卡那霉素的LB培养基的大型试管，在30℃下振荡培养16小时。然后，将得到的培养液中的0.1mL接种于装有5mL的含有100mg/L的卡那霉素的生产培养基[葡萄糖30g/L、乳糖一水合物5g/L、硫酸镁七水合物2g/L、磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸一水合物1g/L、酪蛋白氨基酸5g/L、盐酸硫胺素10mg/L、硫酸亚铁七水合物50mg/L、硫酸锰五水合物10mg/L(除了葡萄糖、乳糖一水合物和硫酸镁七水合物以外，用氢氧化钠水溶液调节为pH7.2后进行高压灭菌)(含有葡萄糖、乳糖一水合物和硫酸镁七水合物的水溶液在另行制备后高于灭菌，分别冷却后混合)]的大型试管，在30℃下振荡培养30小时。
培养结束后，将培养液适当稀释后进行离心分离，利用HPLC分析上清液中所含的2’-岩藻糖基乳糖。将结果示于表5。
[表5]
| 菌株名 | 2’-岩藻糖基乳糖(g/L) |
| KFL/pYHA1 | 0.38 |
| KFL/pYHA2 | 2.58 |
其结果是，与KFL/pYHA1株相比，KFL/pYHA2株显示出更高的2’-岩藻糖基乳糖生产率。
由以上可知，通过使用具有突变型LacY的微生物，与具有野生型LacY的微生物相比可提高2’-岩藻糖基乳糖的生产率。
参照特定方式详细地说明了本发明，但是可在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种变更和修正，这对于本领域技术人员是显而易见的。需要说明的是，本申请基于2019年12月16日提出申请的日本专利申请(日本特愿2019-226278)，通过引用而援引其整体。另外，本申请所引用的全部参照作为整体而引入。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供使用具有生产具有改造后的乳糖渗透酶活性的蛋白质的能力的微生物的含乳糖寡糖的制造方法。
序列表
<110> 协和发酵生化株式会社
<120> 具有改造后的乳糖渗透酶的微生物和含乳糖寡糖的制造方法
<130> W530413
<150> JP2019-226278
<151> 2019-12-16
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1254
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 1
atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60
tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120
agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180
ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240
accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300
tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360
ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420
ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480
atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540
gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600
gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660
aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac 720
caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780
tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840
ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900
gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960
ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020
tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080
gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140
gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200
agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254
<210> 2
<211> 417
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 2
Met Tyr Tyr Leu Lys Asn Thr Asn Phe Trp Met Phe Gly Leu Phe Phe
1 5 10 15
Phe Phe Tyr Phe Phe Ile Met Gly Ala Tyr Phe Pro Phe Phe Pro Ile
20 25 30
Trp Leu His Asp Ile Asn His Ile Ser Lys Ser Asp Thr Gly Ile Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Leu Phe Gln Pro Leu Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Ser Asp Lys Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Trp Ile Ile
65 70 75 80
Thr Gly Met Leu Val Met Phe Ala Pro Phe Phe Ile Phe Ile Phe Gly
85 90 95
Pro Leu Leu Gln Tyr Asn Ile Leu Val Gly Ser Ile Val Gly Gly Ile
100 105 110
Tyr Leu Gly Phe Cys Phe Asn Ala Gly Ala Pro Ala Val Glu Ala Phe
115 120 125
Ile Glu Lys Val Ser Arg Arg Ser Asn Phe Glu Phe Gly Arg Ala Arg
130 135 140
Met Phe Gly Cys Val Gly Trp Ala Leu Cys Ala Ser Ile Val Gly Ile
145 150 155 160
Met Phe Thr Ile Asn Asn Gln Phe Val Phe Trp Leu Gly Ser Gly Cys
165 170 175
Ala Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu Phe Phe Ala Lys Thr Asp Ala Pro
180 185 190
Ser Ser Ala Thr Val Ala Asn Ala Val Gly Ala Asn His Ser Ala Phe
195 200 205
Ser Leu Lys Leu Ala Leu Glu Leu Phe Arg Gln Pro Lys Leu Trp Phe
210 215 220
Leu Ser Leu Tyr Val Ile Gly Val Ser Cys Thr Tyr Asp Val Phe Asp
225 230 235 240
Gln Gln Phe Ala Asn Phe Phe Thr Ser Phe Phe Ala Thr Gly Glu Gln
245 250 255
Gly Thr Arg Val Phe Gly Tyr Val Thr Thr Met Gly Glu Leu Leu Asn
260 265 270
Ala Ser Ile Met Phe Phe Ala Pro Leu Ile Ile Asn Arg Ile Gly Gly
275 280 285
Lys Asn Ala Leu Leu Leu Ala Gly Thr Ile Met Ser Val Arg Ile Ile
290 295 300
Gly Ser Ser Phe Ala Thr Ser Ala Leu Glu Val Val Ile Leu Lys Thr
305 310 315 320
Leu His Met Phe Glu Val Pro Phe Leu Leu Val Gly Cys Phe Lys Tyr
325 330 335
Ile Thr Ser Gln Phe Glu Val Arg Phe Ser Ala Thr Ile Tyr Leu Val
340 345 350
Cys Phe Cys Phe Phe Lys Gln Leu Ala Met Ile Phe Met Ser Val Leu
355 360 365
Ala Gly Asn Met Tyr Glu Ser Ile Gly Phe Gln Gly Ala Tyr Leu Val
370 375 380
Leu Gly Leu Val Ala Leu Gly Phe Thr Leu Ile Ser Val Phe Thr Leu
385 390 395 400
Ser Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Leu Arg Arg Gln Val Asn Glu Val
405 410 415
Ala
<210> 3
<211> 1254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 3
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tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120
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tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360
ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420
ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480
atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540
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gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660
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caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780
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agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成DNA
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accaggcgtt taagggcacc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 5
gactacgggc ctaaagtcga cagaataaat aaatcctggt gtccc 45
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 6
gtcgacttta ggcccgtagt ctgcaaat 28
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 7
tacggttagc catttgcctg c 21
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 8
ggtgccctta aacgcctggt agctgtttcc tgtgtgaaat tgtt 44
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成DNA
<400>
tcgcgcaacg cgtcagtgg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 10
gcaggcaaat ggctaaccgt aatgaacatg tcgatgacag aaag 44
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
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tgcgctgtgt gtcgttgggc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成DNA
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ttctgtcatc gacatgttca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgtt 45
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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aagctggtga ttaactccgg g 21
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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gcacatagcg accaacggcc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成DNA
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atttgcgacc attcctggaa aaa 23
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<211> 28
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<400> 20
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<400> 21
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<220>
<223> 合成DNA
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<220>
<223> 合成DNA
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agggcatcgg tcgacttagc gcatgttgac aaaaatacc 39
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 28
gtcgaccgat gcccttgaga g 21
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 29
ggttaatttc tcctctttaa tatcg 25
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 30
cagcgtttcc agaataacca cttccag 27
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 31
attctggaaa cgctgcatat gtttgaa 27
<210> 32
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工蛋白
<400> 32
Met Tyr Tyr Leu Lys Asn Thr Asn Phe Trp Met Phe Gly Leu Phe Phe
1 5 10 15
Phe Phe Tyr Phe Phe Ile Met Gly Ala Tyr Phe Pro Phe Phe Pro Ile
20 25 30
Trp Leu His Asp Ile Asn His Ile Ser Lys Ser Asp Thr Gly Ile Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Leu Phe Gln Pro Leu Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Ser Asp Lys Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Trp Ile Ile
65 70 75 80
Thr Gly Met Leu Val Met Phe Ala Pro Phe Phe Ile Phe Ile Phe Gly
85 90 95
Pro Leu Leu Gln Tyr Asn Ile Leu Val Gly Ser Ile Val Gly Gly Ile
100 105 110
Tyr Leu Gly Phe Cys Phe Asn Ala Gly Ala Pro Ala Val Glu Ala Phe
115 120 125
Ile Glu Lys Val Ser Arg Arg Ser Asn Phe Glu Phe Gly Arg Ala Arg
130 135 140
Met Phe Gly Cys Val Gly Trp Ala Leu Cys Ala Ser Ile Val Gly Ile
145 150 155 160
Met Phe Thr Ile Asn Asn Gln Phe Val Phe Trp Leu Gly Ser Gly Cys
165 170 175
Ala Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu Phe Phe Ala Lys Thr Asp Ala Pro
180 185 190
Ser Ser Ala Thr Val Ala Asn Ala Val Gly Ala Asn His Ser Ala Phe
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Ser Leu Lys Leu Ala Leu Glu Leu Phe Arg Gln Pro Lys Leu Trp Phe
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Leu Ser Leu Tyr Val Ile Gly Val Ser Cys Thr Tyr Asp Val Phe Asp
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Gln Gln Phe Ala Asn Phe Phe Thr Ser Phe Phe Ala Thr Gly Glu Gln
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Gly Thr Arg Val Phe Gly Tyr Val Thr Thr Met Gly Glu Leu Leu Asn
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Ala Ser Ile Met Phe Phe Ala Pro Leu Ile Ile Asn Arg Ile Gly Gly
275 280 285
Lys Asn Ala Leu Leu Leu Ala Gly Thr Ile Met Ser Val Arg Ile Ile
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Gly Ser Ser Phe Ala Thr Ser Ala Leu Glu Val Val Ile Leu Glu Thr
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Leu His Met Phe Glu Val Pro Phe Leu Leu Val Gly Cys Phe Lys Tyr
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Ile Thr Ser Gln Phe Glu Val Arg Phe Ser Ala Thr Ile Tyr Leu Val
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Cys Phe Cys Phe Phe Lys Gln Leu Ala Met Ile Phe Met Ser Val Leu
355 360 365
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Leu Gly Leu Val Ala Leu Gly Phe Thr Leu Ile Ser Val Phe Thr Leu
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Ser Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Leu Arg Arg Gln Val Asn Glu Val
405 410 415
Ala
PCT/RO/134表
Claims (10)
1.一种微生物，其具有由在下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质，并且该微生物生产含乳糖寡糖的能力高于亲株，
[1]由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质，
[2]由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的突变蛋白，
[3]由与序列号2所示的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成且具有乳糖渗透酶活性的同源蛋白。
2.根据权利要求1所述的微生物，其具有由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向L-天冬氨酸或L-谷氨酸的置换的氨基酸序列构成的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其具有由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向L-谷氨酸的置换的氨基酸序列构成的蛋白质。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的微生物，其通过用重组体DNA转化亲株而得到，所述重组体DNA含有编码由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA。
5.根据权利要求4所述的微生物，其通过在染色体中整合重组体DNA而得到，所述重组体DNA含有编码由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中含有与序列号2所示的氨基酸序列的第319位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的微生物，其通过用重组体DNA转化亲株而得到，所述重组体DNA含有具有序列号3所示的碱基序列的DNA。
7.根据权利要求6所述的微生物，其通过在染色体中整合重组体DNA而得到，所述重组体DNA含有具有序列号3所示的碱基序列的DNA。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的微生物，其中，所述亲株为具有生产含乳糖寡糖的能力的微生物。
9.一种含乳糖寡糖的制造方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求1～8中任一项所述的微生物，使含乳糖寡糖在培养物中生成。
10.根据权利要求9所述的制造方法，其中，所述含乳糖寡糖为2’-岩藻糖基乳糖。
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