JP2021019518A - ビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来の製造法に比べて生産性が高く効率的なビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造方法の提供。【解決手段】L−トリプトファンオキシダーゼ活性を有する蛋白質、イミノフェニルピルビン酸ダイマーシンターゼ活性を有する蛋白質、FAD依存モノオキシゲナーゼ活性を有する蛋白質、ビオラセイン生合成酵素活性を有する蛋白質、及びトリプトファンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質の活性が増強した微生物を用いることにより、低温での培養を必要とせずに、効率的にビオラセイン又はデオキシビオラセインを製造することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、効率的なビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造法に関する。

ビオラセイン（Ｖｉｏｌａｃｅｉｎ）は、微生物により産生される二次代謝産物で、青紫色の天然色素である（特許文献１）。近年は、抗腫瘍活性、抗バクテリア活性、抗菌活性、抗ウイルス活性など、その機能性が注目されている。またビオラセインの構造類縁体であるデオキシビオラセインは、ビオラセインよりも優れた染色作用及び抗細菌活性を有していることが開示されている（特許文献１）。

ビオラセインの生合成機構は、ビオラセインを生産する微生物として知られるＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍを用いて詳細な検討がなされており、Ｌ−トリプトファンを出発基質として、ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤ、ＶｉｏＥによる５段階の酵素反応を経てビオラセインが生成されることが開示されている（非特許文献１）。またデオキシビオラセインは、該生合成経路の副生産物として生成される。

ビオラセインの製造法としては、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ又はＪａｎｔｈｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｖｉｄｕｍを培養し、該培養液又は培養菌体からビオラセインを抽出する方法（特許文献２、非特許文献２）、Ｄｕｇａｎｅｌｌａ属由来のビオラセイン生合成酵素遺伝子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに導入してビオラセインを生成させる方法（非特許文献３、４）などが開示されている。非特許文献５では、Ｄｕｎｇａｎｅｌｌａ ｓｐ．のビオラセイン生合成酵素遺伝子を、Ｌ−トリプトファン生産能が高い大腸菌に導入することで、安価なグルコースを原料とするビオラセインの直接発酵が可能であることが知られている。また、デオキシビオラセインの製造法としては、ビオラセイン生合成酵素遺伝子のうちＶｉｏＤをノックアウトする方法が開示されている（特許文献１）。

上記のように、ビオラセイン及びデオキシビオラセインの製造法は複数知られている。しかし、特許文献２など、ビオラセイン生産能を元来有する微生物を用いたビオラセインの製造法では、該微生物の培養時間が長いことが課題となっている。また、大腸菌などにビオラセイン合成酵素遺伝子を導入した組換え微生物を用いる製造法では、宿主菌体内における該導入酵素の安定性が悪いために、低温条件下で培養する必要がある（特許文献１）など、製造面で課題がある。この課題に対し、非特許文献４、５では、ＩＰＴＧ誘導下で温度シフトを利用したビオラセインの製造法が開示されているが、工業化に向けては課題が多い。

グラム陰性のプロテオバクテリアの一種であるＩｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓは、ビオラセインを生産する微生物として単離されたが（非特許文献６）、ビオラセイン製造における該微生物の有用性については明らかになっていない。

特許第５６３２３７０号公報 特開平６−２５３８６４号公報

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）４５（５１）：１５４４４−１５４５７． Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１８）９：１４９５． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）８６（４）：１０７７−１０８８． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（２０１６）１５（１）：１４８． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（２０１５）１４：８． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）３９（４）：４５０−４５６．

本発明の目的は、従来の製造法に比べて生産性が高く効率的なビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造方法を提供することにある。

本発明は、以下の１〜４に関する。
１．親株よりも以下の（１）〜（５）に記載の蛋白質の活性が増強した微生物。
（１）配列番号２に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ（ＶｉｏＡ）活性を有する蛋白質
（２）配列番号４に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、イミノフェニルピルビン酸ダイマーシンターゼ（ＶｉｏＢ）活性を有する蛋白質
（３）配列番号６に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＦＡＤ依存モノオキシゲナーゼ（ＶｉｏＣ）活性を有する蛋白質
（４）配列番号１０に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ビオラセイン生合成酵素（ＶｉｏＥ）活性を有する蛋白質
（５）配列番号８に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＶｉｏＤ）活性を有する蛋白質
２．親株よりも上記１の（１）〜（４）に記載の蛋白質の活性が増強した微生物。
３．微生物が、大腸菌である、上記１又は２に記載の微生物。
４．上記１〜３のいずれか１つに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にビオラセイン又はデオキシビオラセインを生成、蓄積させ、該培養物中からビオラセイン又はデオキシビオラセインを採取することを特徴とする、ビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造法。

本発明によれば、低温での培養を必要とせず、かつ効率的なビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造方法が提供される。

＜本発明の微生物１＞
本発明の微生物は、親株よりも以下の（１）〜（５）に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である。
（１）配列番号２に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、Ｌ−トリプトファンオキシダーゼ活性（以下、ＶｉｏＡ活性という）を有する蛋白質。
（２）配列番号４に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、イミノフェニルピルビン酸ダイマーシンターゼ活性（以下、ＶｉｏＢ活性という）を有する蛋白質。
（３）配列番号６に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＦＡＤ依存モノオキシゲナーゼ活性（以下、ＶｉｏＣ活性という）を有する蛋白質。
（４）配列番号１０に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ビオラセイン生合成酵素活性（以下、ＶｉｏＥ活性という）を有する蛋白質。
（５）配列番号８に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、トリプトファンヒドロキシラーゼ活性（以下、ＶｉｏＤ活性という）を有する蛋白質。

上記（１）に記載の蛋白質としては、以下の［１］〜［３］のいずれか１つに記載のＶｉｏＡ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＡ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＡ活性を有する相同蛋白質。

上記（２）に記載の蛋白質としては、以下の［４］〜［６］のいずれか１つに記載のＶｉｏＢ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［４］配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
［５］配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＢ活性を有する変異蛋白質。
［６］配列番号４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＢ活性を有する相同蛋白質。

上記（３）に記載の蛋白質としては、以下の［７］〜［９］のいずれか１つに記載のＶｉｏＣ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［７］配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
［８］配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＣ活性を有する変異蛋白質。
［９］配列番号６で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＣ活性を有する相同蛋白質。

上記（４）に記載の蛋白質としては、以下の［１０］〜［１２］のいずれか１つに記載のＶｉｏＥ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［１０］配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
［１１］配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＥ活性を有する変異蛋白質。
［１２］配列番号１０で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＥ活性を有する相同蛋白質。

上記（５）に記載の蛋白質としては、以下の［１３］〜［１５］のいずれか１つに記載のＶｉｏＤ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［１３］配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
［１４］配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＤ活性を有する変異蛋白質。
［１５］配列番号８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｉｏＤ活性を有する相同蛋白質。

変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠如若しくは置換、又は該蛋白質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
相同蛋白質とは、自然界に存在する生物が有する蛋白質であって、進化上の起源が同一の蛋白質に由来する一群の蛋白質をいう。相同蛋白質は、互いに構造及び機能が類似している。
変異蛋白質において、アミノ酸が欠如、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１〜２０個のアミノ酸が欠如、置換、挿入又は付加されていてもよい。

欠如、置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システイン等が挙げられる。

以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン

アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ ｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。

上記の変異蛋白質又は相同蛋白質がＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤ、又はＶｉｏＥ活性を有していることは、例えば以下の方法により確認することができる。例えば、変異蛋白質又は相同蛋白質がＶｉｏＡ活性を有していることを確認するためには、まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする変異蛋白質又は相同蛋白質、並びに［４］、［７］、［１０］及び［１３］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、ビオラセイン又はデオキシビオラセイン生成活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。得られた画分を基質であるＬ−トリプトファンを含む水溶液と接触させ、最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のビオラセイン又はデオキシビオラセインを検出することにより、変異蛋白質又は相同蛋白質が、ＶｉｏＡ活性を有することを確認することができる。以下、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤ、又はＶｉｏＥ活性についても同様の方法で確認することができる。

親株とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
親株は、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは、原核生物又は酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ−／ｄｃｍ−、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１−１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。

また親株としては、好ましくは、糖からＬ−トリプトファンを生成する能力を人工的に付与又は強化した育種株を用いることができる。
親株として用いる微生物に、糖からＬ−トリプトファンを生成する能力を人工的に付与又は強化する方法としては、（ａ）糖からＬ−トリプトファンを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）糖からＬ−トリプトファンを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）糖からＬ−トリプトファンを生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｄ）糖からＬ−トリプトファンを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び（ｅ）野生株に比べ、Ｌ−トリプトファンのアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、などを挙げることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。

上記、Ｌ−トリプトファンを生成する能力を付与又は強化する方法の具体例としては、ランダム変異導入による方法（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３９：４７１−４７６，１９９３）や各種遺伝子操作による方法（Ｊ Ｉｎｄｕｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４６：５５−６５，２０１９）等、公知の方法を挙げることができる。

糖からＬ−トリプトファンを生成する能力が付与又は強化された微生物であることは、育種株と親株をそれぞれ培地に培養し、Ｌ−トリプトファンの生成量を比較することにより確認することができる。
親株よりも上記（１）〜（５）に記載の蛋白質の活性が増強した微生物としては、以下の（６）〜（１０）に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもビオラセイン又はデオキシビオラセイン生成活性が増強された微生物を挙げることができる。

（６）以下の［１６］〜［１９］のいずれか１つに記載のＶｉｏＡ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［１６］上記（１）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［１７］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［１８］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｉｏＡ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１９］配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｉｏＡ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ

（７）以下の［２０］〜［２３］のいずれか１つに記載のＶｉｏＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［２０］上記（２）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２１］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２２］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｉｏＢ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［２３］配列番号３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｉｏＢ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ

（８）以下の［２４］〜［２７］のいずれか１つに記載のＶｉｏＣ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［２４］上記（３）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２５］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２６］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｉｏＣ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［２７］配列番号５で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｉｏＣ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ

（９）以下の［２８］〜［３１］のいずれか１つに記載のＶｉｏＥ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［２８］上記（４）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２９］配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［３０］配列番号９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｉｏＥ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［３１］配列番号９で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｉｏＥ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ

（１０）以下の［３２］〜［３５］のいずれか１つに記載のＶｉｏＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［３２］上記（５）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［３３］配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［３４］配列番号７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｉｏＤ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［３５］配列番号７で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｉｏＤ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。

プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（１９９７））の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。

また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を挙げることができる。

上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。

上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算した時に、配列番号１、３、５、７、又は９で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。

上記（６）〜（１０）に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡとは、例えば、該ＤＮＡが親株において自律複製可能なＤＮＡであって、上記（６）〜（１０）のいずれか１つ以上に記載のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに、上記（６）〜（１０）のいずれか１つ以上に記載のＤＮＡが組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。

親株において染色体中への組込が可能なＤＮＡであって、上記（６）〜（１０）のいずれか１つ以上に記載の組換え体ＤＮＡもまた、上記（６）〜（１０）に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡである。
組換え体ＤＮＡが、親株の染色体ＤＮＡへの組込が可能なＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記（６）〜（１０）のいずれか１つ以上に記載のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節した組換え体ＤＮＡを用いることが好ましい。
親株にて自律複製可能な組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８(いずれもタカラバイオ社製)、ｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ−ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＴｒｃ９９Ａ (いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製)、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）]、ｐＴｒＳ３０ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９/ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調整］、ｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９/ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調整］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８−６３８５］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８/１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８号公報）等を挙げることができる。

上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーターやｉｌｖプロモーター等のアミノ酸生合成に関与する遺伝子のプロモーター、ｕｓｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター、Ｐ_ＳＥプロモーター等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いることもできる。

親株にコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、又はミクロバクテリウム属に属する微生物等のコリネ型細菌を用いる場合は、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることがきる。

上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、又はミクロバクテリウム属に属する微生物等のコリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４−６７９（２０００）］を用いることができる。

親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などを挙げることができる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。

親株を該組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる微生物とは、該組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡが転写され、該ＤＮＡがコードする蛋白質を生産するようになった微生物をいう。
上記（６）〜（１０）に記載のＤＮＡが転写されること、及び該ＤＮＡがコードする蛋白質を生産するようになったことを確認する方法としては、例えば該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、又は該タンパク質の生産量をウエスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。

親株を、上記（６）〜（１０）に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる微生物は、以下の方法で造成することができる。
上記（６）〜（１０）のＤＮＡのうち、上記［１］、［４］、［７］、［１０］、又は［１３］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［１７］、［２１］、［２５］、［２９］、又は［３３］のＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、９、又は７で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはＩｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、より好ましくはＩｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ ＮＢＲＣ１０２５０５株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。

Ｉｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ ＮＢＲＣ１０２５０５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）又はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手することができる。
上記（６）〜（１０）のＤＮＡのうち、上記［２］、［５］、［８］、［１１］、又は［１４］に記載の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、９、又は７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。

また、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が挿入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、上記［２］、［５］、［８］、［１１］、又は［１４］に記載の変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
すなわち、まず該ＤＮＡの５’端に対応するセンスプライマーと、５’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（５’側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの５’端から変異導入部位までの断片Ａ（３’側に変異が導入されている）を増幅する。次いで、５’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（３’側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの３’端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、５’端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から３’端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入されたＤＮＡが増幅する。

上記（６）〜（１０）のＤＮＡのうち、上記［３］、［６］、［９］、［１２］、又は［１５］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、上記［１８］、［２２］、［２６］、［３０］、又は［３４］のＤＮＡ、及び、［１９］、［２３］、［２７］、［３１］、又は［３５］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１、３、５、９、又は７で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２、４、６、１０、又は８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡまたはプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等によって取得することができる。

取得した上記（６）〜（１０）に記載のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］、又はアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。

ＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができる宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ−／ｄｃｍ−、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１−１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２等を挙げることができる
上記のベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］等を挙げることができる。

組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等を挙げることができる。

塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。

ここで、該ＤＮＡの塩基配列を宿主での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。本発明の製造方法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
上記のようにして調製したＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造方法に用いられる微生物が有する組換え体ＤＮＡを作製することができる。

このような組換え体ＤＮＡの例としては、実施例において後述するｐＳＴＶ２９＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＡ、ｐＭＷ１１９＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＢ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＣ、及びｐＣＤＦＤｕｅｔ＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＤ＿ＩｆＶｉｏＥを挙げることができる。
組換え体ＤＮＡを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、上記のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等の方法を挙げることができる。

上記の方法で造成した微生物が、親株よりもＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤ、及びＶｉｏＥ活性を有する蛋白質の活性が増強された微生物であることは、例えば、親株と造成した微生物をそれぞれ培地に培養し、ビオラセイン又はデオキシビオラセインの生成量を比較することにより、確認することができる。
このような微生物の例としては、実施例において後述するＷ３１１０ΔｔｎａＡ＿ＩｆＶｉｏＡＢＣＤＥ株を挙げることができる。

＜本発明の微生物２＞
親株よりも上記（１）〜（４）に記載の蛋白質の活性が増強した微生物もまた、本発明の微生物である。
親株よりも上記（１）〜（４）に記載の蛋白質の活性が増強した微生物及び該微生物の造成方法については、上記と同様である。

上記の変異蛋白質又は相同蛋白質がＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、又はＶｉｏＥ活性を有していることを確認する方法については、上述の通りである。
親株よりも上記（１）〜（４）に記載の蛋白質の活性が増強した微生物としては、上記（６）〜（９）に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもデオキシビオラセイン生成活性が増強された微生物を挙げることができる。

上記の方法で造成した微生物が、親株よりもＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、及びＶｉｏＥ活性が増強された微生物であることは、例えば、親株と造成した微生物をそれぞれ培地に培養し、デオキシビオラセインの生成量を比較することにより、確認することができる。
＜本発明のビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造法＞
本発明のビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造法としては、上述の本発明の微生物を培地に培養し、培養物中にビオラセイン又はデオキシビオラセインを生成、蓄積させ、該培養物中からビオラセイン又はデオキシビオラセインを採取することを特徴とする、ビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造法を挙げることができる。

上述の微生物のうち、上記（１）〜（５）に記載の蛋白質の活性が増強した微生物を用いることで、ビオラセイン又はデオキシビオラセイン、あるいはその両方を製造することができる。また、上記（１）〜（４）に記載の蛋白質の活性が増強した微生物を用いることで、デオキシビオラセインのみを選択的に製造することができる。
上述の、本発明の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素原、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等を用いることができる。

窒素原としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。

無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用することができる。
培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常１５〜４０℃であり、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。

また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

上記の培養により、培養物中にビオラセイン又はデオキシビオラセインを生成、蓄積させ、該培養物中からビオラセイン又はデオキシビオラセインを採取することにより、ビオラセイン又はデオキシビオラセインを製造することができる。
培養物中に生成、蓄積したビオラセイン又はデオキシビオラセインは、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣ、又は分光光度計［Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９４（６）：１５２１−１５３２（２０１２）］を用いて分析することができる。
上記の培養物中からのビオラセイン又はデオキシビオラセインの採取は、ＯＤＳシリカゲル充填剤などを用いる通常の方法によって行うことができる。微生物菌体内にビオラセイン又はデオキシビオラセインが蓄積する場合には、例えば微生物菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって微生物菌体を除去して得られる上清からＯＤＳシリカゲル充填剤等によって、ビオラセイン又はデオキシビオラセインを採取することができる。

ビオラセイン又はデオキシビオラセインを採取する際には、微生物菌体からの抽出用溶媒として、エタノールやメタノール等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類等を使用することができる。
微生物菌体からのビオラセイン又はデオキシビオラセインの採取は、培養物中にビオラセイン及びデオキシビオラセインの両方が蓄積している場合には、ビオラセイン及びデオキシビオラセインを混合物として採取してもよい。
ビオラセイン又はデオキシビオラセインを微生物菌体から抽出する際の、抽出用溶媒の濃度、量、抽出時間、温度等の条件は、微生物菌体から物質を抽出する通常の方法によって適宜設定することができる。

［分析例］
実施例において、ビオラセイン又はデオキシビオラセインの分析、定量は以下に示す手順で行った。
培養後の微生物を含む培養液１ｍＬを１３０００回転で３分間遠心分離して上清を除去し、残りの菌体に０．１ｍｍのガラスビーズと１ｍＬのエタノールを加えた。該菌体をマルチビーズショッカー（安井機械社製）にて破砕し、菌体内に蓄積されたビオラセインをエタノールに溶解させた。該サンプルに含まれるビオラセイン又はデオキシビオラセインをＨＰＬＣ（島津製作所社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５ ５μｍ ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ（野村化学社製）
カラム温度：３０℃
移動相：５０％（ｖ／ｖ）エタノール
流速：０．５ｍＬ／分
検出波長：５７５ｎｍ

以下に実施例の詳細を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例１］ビオラセイン及びデオキシビオラセイン生成活性が増強した微生物の造成
（１）遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。

バチルス・サチルス １６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｃａｔ遺伝子の上流約２００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、ｓａｃＢ遺伝子の上流約３０ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。配列番号２１で表される塩基配列からなるＤＮＡにはＢａｍＨＩ認識サイトが、配列番号２３で表される塩基配列からなるＤＮＡにはＳｐｈＩ認識サイトが付与されている。また、配列番号２２および２４で表される塩基配列からなるＤＮＡにはＳａｌＩ認識サイトが付与されている。

増幅ＤＮＡ断片のｃａｔを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩ、ｓａｃＢを制限酵素ＳｐｈＩとＳａｌＩで切断した。ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断した。
上記３つのＤＮＡ断片をＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、ｐＨＳＧ−ｃａｔｓａｃＢを造成した。得られたプラスミドｐＨＳＧ−ｃａｔｓａｃＢを鋳型に、配列番号２５及び２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ（以下、ｃａｔ−ｓａｃＢという。）断片を得た。

（２）トリプトファナーゼ活性が喪失した微生物の造成
トリプトファナーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｔｎａＡ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。
定法により調製したエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。

ｔｎａＡ上流１及びｔｎａＡ上流２は、ｔｎａＡ遺伝子の開始コドンからその上流約８００ｂｐを含む。ｔｎａＡ下流１及びｔｎａＡ下流２は、ｔｎａＡ遺伝子の終止コドンからその下流約１４００ｂｐを含む。
ｔｎａＡ上流１、ｔｎａＡ下流１、及びｃａｔ−ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３３及び３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｔｎａＡ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ−ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｔｎａＡ：：ｃａｔ−ｓａｃＢという。）断片を得た。

ｔｎａＡ上流２及びｔｎａＡ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３３及び３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｔｎａＡを含まず、ｔｎａＡ上流とｔｎａＡ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｔｎａＡという。）断片を得た。
ｔｎａＡ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ.，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０−６６４５（２０００）］を保持するエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつスクロース感受性を示した形質転換体（ｔｎａＡ遺伝子がｔｎａＡ：：ｃａｔ−ｓａｃＢに置換された形質転換体）を得た。
ΔｔｎａＡ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつスクロース耐性を示す形質転換体（ｔｎａＡ：：ｃａｔ−ｓａｃＢがΔｔｎａＡに置換した形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＷ３１１０ΔｔｎａＡと命名した。

（３）Ｉｏｄｏｂａｃｔｅｒ由来のビオラセイン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
ｕｓｐＡプロモーター下にＩｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ由来のビオラセイン生合成遺伝子（ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、ｖｉｏＥ）を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。

エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３５及び３６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｕｓｐＡプロモーターとその下流に位置するリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片を増幅した。
Ｉｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ ＮＢＲＣ１０２５０５株を周知の培養方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号３７及び３８で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＶｉｏＡ蛋白質（配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号３６及び３７で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。またＶｉｏＡ蛋白質をコードするＤＮＡの断片増幅に使用したプライマーは、ｖｉｏＡ遺伝子の開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに置換するよう設計した。

得られたｕｓｐＡプロモーターをコードするＤＮＡ断片及びＶｉｏＡ蛋白質をコードするＤＮＡ断片の混合物を鋳型に、配列番号３５及び３８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、両断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＡという。）断片を得た。
上記で得られたＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＳＴＶ２９＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＡを得た。

続いて、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３５及び３９で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｕｓｐＡプロモーターとその下流に位置するリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片を増幅した。
同様に、上記で得たＩｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ ＮＢＲＣ１０２５０５株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４０及び４１で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｉｏＢ蛋白質（配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号３９及び４０で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。

得られたｕｓｐＡプロモーターをコードするＤＮＡ断片及びＶｉｏＢをコードするＤＮＡ断片の混合物を鋳型に、配列番号３５及び４１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、両断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＢという。）断片を得た。
上記で得られたＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＢ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＭＷ１１９＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＢを得た。

続いて、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４２及び４３で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｕｓｐＡプロモーターとその下流に位置するリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片を増幅した。
同様に、上記で得たＩｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ ＮＢＲＣ１０２５０５株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４４及び４５で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｉｏＣ蛋白質（配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号４３及び４４で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。

得られたｕｓｐＡプロモーターをコードするＤＮＡ断片及びＶｉｏＣをコードするＤＮＡ断片の混合物を鋳型に、配列番号４２及び４５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、両断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＣという。）断片を得た。
上記で得られたＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＣ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１（メルクミリポア社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＣを得た。

続いて、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４２及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｕｓｐＡプロモーターとその下流に位置するリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片を増幅した。
上記で得たＩｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ ＮＢＲＣ１０２５０５株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４７及び４８で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｉｏＤ蛋白質（配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。

同様に、該染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４９及び５０で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｉｏＥ蛋白質（配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号４６及び４７、配列番号４８及び４９で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。

得られたｕｓｐＡプロモーターをコードするＤＮＡ断片、ＶｉｏＤをコードするＤＮＡ断片、及びＶｉｏＥをコードするＤＮＡ断片の混合物を鋳型に、配列番号４２及び５０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、全断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＤ＿ＩｆＶｉｏＥという。）断片を得た。

上記で得られたＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＤ＿ＩｆＶｉｏＥ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ（メルクミリポア社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＤ＿ＩｆＶｉｏＥを得た。
上記、発現プラスミドｐＳＴＶ２９＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＡ、ｐＭＷ１１９＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＢ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＣ、及びｐＣＤＦＤｕｅｔ＿ＰｕｓｐＡ＿ＩｆＶｉｏＤ＿ＩｆＶｉｏＥを用いて、実施例１（２）で造成したＷ３１１０ΔｔｎａＡ株を形質転換することで、Ｉｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ ＮＢＲＣ１０２５０５株由来のビオラセイン生合成遺伝子を有する大腸菌を造成し、Ｗ３１１０ΔｔｎａＡ＿ＩｆＶｉｏＡＢＣＤＥ株と命名した。

［比較例１］Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のビオラセイン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
ｕｓｐＡプロモーター下にＪａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｖｉｄｕｍ由来のビオラセイン生合成遺伝子（ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、ｖｉｏＥ）を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。

エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３５及び５１で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｕｓｐＡプロモーターとその下流に位置するリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片を増幅した。
Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｖｉｄｕｍ ＮＢＲＣ１２６１３株を周知の培養方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号５２及び５３で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＶｉｏＡ蛋白質（配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号５１及び５２で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。またＶｉｏＡ蛋白質をコードするＤＮＡの断片増幅に使用したプライマーは、ｖｉｏＡ遺伝子の開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに置換するよう設計した。

得られたｕｓｐＡプロモーターをコードするＤＮＡ断片及びＶｉｏＡをコードするＤＮＡ断片の混合物を鋳型に、配列番号３５及び５３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、両断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＡという。）断片を得た。
上記で得られたＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＳＴＶ２９＿ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＡを得た。

続いて、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３５及び５４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｕｓｐＡプロモーターとその下流に位置するリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片を増幅した。
同様に、上記で得たＪａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｖｉｄｕｍ ＮＢＲＣ１２６１３株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号５５及び５６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｉｏＢ蛋白質（配列番号１４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号５４及び５５で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。

得られたｕｓｐＡプロモーターをコードするＤＮＡ断片及びＶｉｏＢをコードするＤＮＡ断片の混合物を鋳型に、配列番号３５及び５６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、両断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＢという。）断片を得た。
上記で得られたＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＢ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＭＷ１１９＿ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＢを得た。

続いて、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４２及び５７で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｕｓｐＡプロモーターとその下流に位置するリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片を増幅した。
同様に、上記で得たＪａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｖｉｄｕｍ ＮＢＲＣ１２６１３株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号５８及び５９で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｉｏＣ蛋白質（配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号５７及び５８で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。

得られたｕｓｐＡプロモーターをコードするＤＮＡ断片及びＶｉｏＣをコードするＤＮＡ断片の混合物を鋳型に、配列番号４２及び５９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、両断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＣという。）断片を得た。
上記で得られたＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＣ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１（メルクミリポア社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１＿ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＣを得た。

続いて、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４２及び６０で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｕｓｐＡプロモーターとその下流に位置するリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片を増幅した。
上記で得たＪａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｖｉｄｕｍ ＮＢＲＣ１２６１３株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号６１及び６２で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｉｏＤ蛋白質（配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。

同様に、該染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号６３及び６４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｉｏＥ蛋白質（配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。このとき、配列番号６０及び６１、配列番号６２及び６３で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。

得られたｕｓｐＡプロモーターをコードするＤＮＡ断片、ＶｉｏＤをコードするＤＮＡ断片、及びＶｉｏＥをコードするＤＮＡ断片の混合物を鋳型に、配列番号４２及び６４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、全断片を連結したＤＮＡ（以下、ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＤ＿ＪｌＶｉｏＥという。）断片を得た。

上記で得られたＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＤ＿ＪｌＶｉｏＥ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ（メルクミリポア社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ＿ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＤ＿ＪｌＶｉｏＥを得た。
上記、発現プラスミドｐＳＴＶ２９＿ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＡ、ｐＭＷ１１９＿ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＢ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１＿ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＣ、及びｐＣＤＦＤｕｅｔ＿ＰｕｓｐＡ＿ＪｌＶｉｏＤ＿ＪｌＶｉｏＥを用いて、実施例１（２）で造成したＷ３１１０ΔｔｎａＡ株を形質転換することで、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｖｉｄｕｍ ＮＢＲＣ１２６１３株由来のビオラセイン生合成遺伝子を有する大腸菌を造成し、Ｗ３１１０ΔｔｎａＡ＿ＪｌＶｉｏＡＢＣＤＥ株と命名した。

［実施例２］ビオラセイン及びデオキシビオラセインの製造
（１）試験管培養試験
実施例１及び比較例１で得られたＷ３１１０ΔｔｎａＡ＿ＩｆＶｉｏＡＢＣＤＥ株、及びＷ３１１０ΔｔｎａＡ＿ＪｌＶｉｏＡＢＣＤＥ株をＬＢプレート上で２８℃にて２４時間培養し、前培養培地［グルコース２０ｇ／Ｌ、乾燥酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２．５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１０ｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．４に調整後、炭酸カルシウム１０ｇ／Ｌを添加しオートクレーブ］６ｍＬが入った太型試験管に植菌して、２８℃で２４時間、振盪培養した。必要に応じて１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、及び５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを添加した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース５０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム２ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム２ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム１０ｇ/Ｌ、コーンスティープリカー２ｇ/Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１０ｇ／Ｌ、トリプトファン１ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物１０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ、硫酸亜鉛七水和物１．５ｍｇ/Ｌ、塩化カルシウム二水和物１５ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．６に調整した後、炭酸カルシウム１０ｇ/Ｌ、リン酸三マグネシウム八水和物４０ｇ/Ｌを添加してオートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．４ｍＬ植菌し、２８℃で４８時間培養した。必要に応じて１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、及び５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを添加した。

培養終了後、培養液を遠心分離して上清を除去し、残りの菌体を破砕して得られた菌体内ビオラセイン及びデオキシビオラセインをＨＰＬＣにて分析した。結果を表３に示す。

本発明により、Ｉｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓに由来するビオラセイン生合成関連酵素の活性が増強した微生物を用いることにより、従来の製造法のような低温での培養を必要としない、効率的なビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造方法が提供される。

Claims (4)

1. 親株よりも以下の［１］〜［５］に記載の蛋白質の活性が増強した微生物。
   ［１］配列番号２に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、L−トリプトファンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
   ［２］配列番号４に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、イミノフェニルピルビン酸ダイマーシンターゼ活性を有する蛋白質
   ［３］配列番号６に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、FAD依存モノオキシゲナーゼ活性を有する蛋白質
   ［４］配列番号１０に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ビオラセイン生合成酵素活性を有する蛋白質
   ［５］配列番号８に表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、トリプトファンヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質
2. 親株よりも上記［１］〜［４］に記載の蛋白質の活性が増強した微生物。
3. 微生物が、大腸菌である、請求項１又は２に記載の微生物。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にビオラセイン又はデオキシビオラセインを生成、蓄積させ、該培養物中からビオラセイン又はデオキシビオラセインを採取することを特徴とする、ビオラセイン又はデオキシビオラセインの製造法。