JP4074251B2 - 変異型６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＮＤと略す）活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ＤＮＡを染色体上に有する微生物、および該形質転換体もしくは該微生物を培地に培養することを特徴とする有用物質の製造法に関する。
背景技術
ＧＮＤは、ペントースリン酸回路中の酵素の１つであり、６−ホスホグルコン酸を酸化および脱炭酸してＤ−リブロース−５−リン酸を生成する酵素である。
ＧＮＤをコードするＤＮＡについては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来〔Ｇｅｎｅ，２７，２５３（１９８４）〕、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１３７４４（１９８６）〕等のＤＮＡが単離され、その塩基配列が報告されている。
コリネバクテリウム属に属する微生物については、コリネバクテリウム・グルタミカムのＧＮＤに関して、生化学的性質やＧＮＤをコードする遺伝子の塩基配列が報告されている［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１２５７（１９８７）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７，３４４２（２０００）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２８，７５４（２００１）、特開平９−２２４６６２、ＥＰ １１０８７９０］。
しかし、これまでに、ＧＮＤをコードするＤＮＡに変異を導入することによって代謝産物の生産性を向上させることができることは知られていない。さらに、ＧＮＤをコードするＤＮＡにどのような変異を導入すれば前記効果が得られるかについて記載および示唆した報告もない。
発明の開示
本発明の目的は、新規な変異型ＧＮＤ、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ＤＮＡを染色体上に有する微生物、または該形質転換体もしくは該微生物を用いる有用物質の製造法を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（２３）に関する。
（１） 以下の（ａ）〜（ｆ）記載のポリペプチドからなる群より選ばれるポリペプチド。
（ａ） コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｄ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｆ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、かつ第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（２） コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＧＮＤである上記（１）のポリペプチド。
（３） Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基がＳｅｒ残基である上記（１）または（２）のポリペプチド。
（４） Ｓｅｒ残基以外のアミノ酸残基がＰｈｅ残基である上記（１）または（２）のポリペプチド。
（５） Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基がＳｅｒ残基であり、かつＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基がＰｈｅ残基である上記（１）または（２）のポリペプチド。
（６） 上記（１）〜（５）いずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（７） 以下の（ａ）〜（ｆ）記載のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡ。
（ａ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｄ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｆ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がそれぞれＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンおよびＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（８） コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡが配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである上記（７）のＤＮＡ。
（９） Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｓｅｒ残基をコードするコドンである上記（７）または（８）のＤＮＡ。
（１０） Ｓｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンがＰｈｅ残基をコードするコドンである上記（７）または（８）のＤＮＡ。
（１１） Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｓｅｒ残基をコードするコドンであり、かつＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンがＰｈｅ残基をコードするコドンである上記（７）または（８）のＤＮＡ。
（１２） 上記（６）〜（１１）いずれか１つのＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
（１３） 上記（１２）の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体。
（１４） 形質転換体が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１３）の形質転換体。
（１５） 形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に属する微生物である、上記（１３）または（１４）の形質転換体。
（１６） 染色体上に上記（６）〜（１１）いずれか１つのＤＮＡの有する塩基配列を有する微生物。
（１７） 微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびミクロバクテリウム属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１６）の微生物。
（１８） 微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である上記（１６）または（１７）の微生物。
（１９） 上記（１３）〜（１８）いずれか１つの形質転換体または微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成蓄積させ、該培養物より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（２０） 有用物質が、Ｌ−アミノ酸、核酸もしくはその誘導体、糖、またはビタミンである、上記（１９）の製造法。
（２１） 有用物質が、ペントースリン酸回路を経て合成される物質、または生合成にＮＡＤＰＨが使用される物質である上記（１９）または（２０）の製造法。
（２２） 有用物質がＬ−アミノ酸または核酸もしくはその誘導体である、上記（１９）〜（２１）いずれか１項記載の製造法。
（２３） 有用物質が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アルギニン、フェニルアラニン、チロシンおよびＬ−トリプトファンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸である、上記（１９）〜（２２）いずれか１つの製造法。
以下、本願発明について詳細に説明する。
発明を実施するための最良の形態
（１）本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドからなる群より選ばれるポリペプチドである。
（ａ） コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、例えばコリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシェンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）等をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤとしては、上記コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤであれば、いずれのＧＮＤでもよい。
例えばＥＰ１１０８７９０号公報に記載されている配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＧＮＤをあげることができる。
該コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基とは、該コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列と配列番号１記載のアミノ酸配列とを比較し、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕等を用いて計算したときに両アミノ酸配列の相同性が最も高くなるように該アミノ酸配列同士を重ね合わせたとき、該コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列上で配列番号１記載の第１５８番目のアミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基である。同様にして、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基も決定できる。
配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基をＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換するときのアミノ酸残基としては、Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸であってもよいが、例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ等の中性極性側鎖をもつアミノ酸残基が好ましく、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の側鎖にヒドロキシル基をもつアミノ酸残基が更に好ましく、Ｓｅｒ残基が特に好ましい。
配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基をＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換するときのアミノ酸残基としては、Ｓｅｒ残基以外のアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸であってもよいが、例えば、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ等の非極性側鎖をもつアミノ酸残基または、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ等の側鎖に環構造を持つアミノ酸が好ましく、Ｐｈｅ残基が特に好ましい。
さらに、以下の（ｄ）〜（ｆ）記載のポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含される。
（ｄ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｆ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、かつ第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
上記（ｄ）〜（ｆ）のポリペプチドも、上記（ａ）〜（ｃ）と同様の方法で取得することができる。また、置換されるアミノ酸残基の決定は上記（ａ）〜（ｃ）における方法と同様の方法で行うことができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明のポリペプチドがＧＮＤ活性を有するためには、上記（ａ）〜（ｃ）いずれかに記載のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
本発明のポリペプチドのＧＮＤ活性は、アミノ酸の置換前と比べて低下していても向上していても同じであってもよいが、置換前にくらべて低下している場合は、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＧＮＤのＧＮＤ活性の１０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがさらに好ましい。
ＧＮＤ活性は公知の方法によって測定することができる。例えば、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１２５７（１９８７）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２８，７５４（２００１）等に記載の方法をあげることができる。
具体的には、下記（３）に述べる本発明の形質転換体または下記（４）に述べる微生物を培養して得られる培養液または、該培養液より得られる菌体、該菌体より得られる無細胞抽出液、該無細胞抽出液より精製して得られる本発明のポリペプチド等を酵素源として、該酵素源を含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ ５０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．５）、ＮＡＤＰ ０．５ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ２ １０ｍｍｏｌ／ｌ、６−ホスホグルコン酸 ２ｍｍｏｌ／ｌを含む反応液を３０℃で反応を行い、３４０ｎｍにおける吸光度の増加を測定して、生成されるＮＡＤＰＨを定量し、該酵素源のＧＮＤ活性を算出することができる。
上記本発明のポリペプチドは、〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）〕（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）〕（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いてコリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することによって取得することができる。
コリネバクテリウム属由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの例としては、例えば、ＥＰ１１０８７９０号公報に記載されている配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
なお、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基であり、第３６１番目のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基である場合は、かならずしも置換を行わなくてもよい。
（２） 本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）記載のＤＮＡをあげることができる。
（ａ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
上記本発明のＤＮＡは、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することによって取得することができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、上記（１）であげたコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＥＰ１１０８７９０号公報に記載されている配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域とは、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列と配列番号２記載の塩基配列とを比較し、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに最も相同性が高くなるように両塩基配列同士を重ね合わせたとき、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目に対応する領域である。同様にして、配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域も決定できる。
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡはＥＰ１１０８７９０号公報に記載された塩基配列の情報をもとに、コリネバクテリウム グルタミクムの野生株ＡＴＣＣ１３０３２由来の染色体ＤＮＡ〔斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］〕や下記方法で得られるｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ等の常法により得ることができる。その他の、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡも配列番号２記載の塩基配列の情報を用いてＰＣＲ等の常法により得ることができる。
本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡに、モレキュラー・クローニング第３版の記載にしたがって部位特異変異を導入して得てもよいし、公知の方法で合成して得てもよい。
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製〕やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ストラタジーン社製〕を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作成するためのクローニングベクターとしては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、λ ｚａｐ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λ ｇｔ１０、λ ｇｔ１１〔ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λ ＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λ ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λ ＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕等をあげることができる。
ｃＤＮＡを組み込んだベクターを導入する微生物としては、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕等を用いることができる。
このようにして得られる本発明のＤＮＡとしては、例えば以下の（ａ−１）〜（ｃ−１）のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡをあげることができる。
（ａ−１）配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ−１）配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ−１）配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
具体的例としては、以下の（ａ−２）〜（ｃ−２）のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡ等をあげることができる。
（ａ−２）配列番号２記載の塩基配列の第４７２番目のシトシン残基がチミン残基に置換された塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ−２）配列番号２記載の塩基配列の第１０８２番目のシトシン残基が、チミン残基に置換された塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ−２）配列番号２記載の塩基配列の第４７２番目のシトシン残基がチミン残基に置換され、かつ第１０８２番目のシトシン残基がチミン残基に置換された塩基配列を有するＤＮＡ
さらに、上記（ａ）〜（ｃ）、（ａ−１）〜（ｃ−１）および（ａ−２）〜（ｃ−２）記載のＤＮＡ以外に、以下の（ｄ）〜（ｆ）記載のＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。
（ｄ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｆ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がそれぞれＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンおよびＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
該置換される領域の決定は、上記（ａ）〜（ｃ）における方法と同様な方法で行うことができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては上記（１）に記載したコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
（ｄ）〜（ｆ）記載のＤＮＡは、例えば、上記（ａ−２）〜（ｃ−２）いずれかに記載のＤＮＡの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのうち、第４７２〜４７４番目または第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に対応する領域がそれぞれ、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基をコードするコドンおよびＳｅｒ以外のアミノ酸残基をコードするコドンとして保存されているＤＮＡとして得ることができる。
（ａ−２）〜（ｃ−２）いずれかに記載のＤＮＡの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記（ａ−２）〜（ｃ−２）いずれかに記載のＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、上記（ａ−２）〜（ｃ−２）のいずれか１つに記載のＤＮＡの有する塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
なお、上記（ａ）〜（ｆ）記載のＤＮＡにおいて、置換される領域がコードするＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基としては、Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸であってもよいが、例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ等の中性極性側鎖をもつアミノ酸残基が好ましく、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の側鎖にヒドロキシル基をもつアミノ酸残基が更に好ましく、Ｓｅｒ残基が特に好ましい。また、Ｓｅｒ残基以外のアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸であってもよいが、例えば、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ等の非極性側鎖をもつアミノ酸残基または、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ等の側鎖に環構造を持つアミノ酸が好ましく、Ｐｈｅ残基が特に好ましい。
また、あらかじめ、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の第４７２〜４７４番目の領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、第１０８１〜１０８３番目の領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするＤＮＡである場合は、かならずしも置換を行わなくてもよい。
上記本発明のＤＮＡは、本発明のポリペプチドの製造、およびＬ−アミノ酸の製造のために有用である。
（３）本発明のポリペプチドの製造
上記（１）の本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記（２）の本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて製造することができる。
本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは本発明のポリペプチドの効率的製造に有用である。該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。該組換えベクターを、該組換えベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる細菌、または酵母であればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
とくに、宿主細胞が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、またはミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物であるときは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ等を使用することが好ましい。
より具体的には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ １３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ ＡＴＣＣ １５９９１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０６０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３８２６（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １４０２０（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕ ｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ ＡＴＣＣ １３８６８、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ ＡＴＣＣ １５９９０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ １７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ９２４４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ９２４５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ９２４６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ９２７７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ６８７１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ６８７２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ １４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＡＴＣＣ １３８２５、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ ＡＴＣＣ １９２４０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ １５３５４を使用することが好ましい。
宿主細胞が、上記のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物であるときは、本発明のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを作製するために用いられるベクターとして、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を用いることが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（例えば、特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８６４９）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）、電気穿孔法［例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７５，４０９６（１９９３）］に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する微生物、例えば、サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
酵母により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
本発明のポリペプチドは、上記方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成、蓄積させ、該培養物より本発明のポリペプチドを採取することで得ることができる。
該形質転換体の培養は、通常の培養法によって実施することができる。
培地としては、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２０℃〜４２℃が好適である。とくに３０℃〜４０℃が好ましい。培地中のｐＨは、５〜９に維持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養期間は通常１〜６日間である。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
本発明のＤＮＡを含む遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、上記（１）の（ａ）〜（ｆ）記載のポリペプチドからなる群より選ばれるポリペプチドをあげることができる。
（４）有用物質の製造に用いられる微生物
本発明において有用物質の製造に用いられる微生物には、上記（３）で得られる形質転換体、および染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物があげられる。
染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物は、通常の変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等を用いて、上記（２）であげた、形質転換体の宿主に使用される微生物の染色体上のＧＮＤをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入して得ることができる。部位特異的変異の導入は、モレキュラー・クローニング第３版、カレントプロトコールズ・イン・モレキュラー．バイオロジー、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、等に記載の方法に従って行うことができる。
また、相同組換え法を用いて、染色体上のＧＮＤをコードするＤＮＡを上記（２）の方法で得られる本発明のＤＮＡで置換することによっても、染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物を作製することができる。
具体的には、上記（２）の方法で得られる本発明のＤＮＡを、宿主細胞中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュクラーゼ遺伝子ｓａｃＢ［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）］を有するプラスミドに組み込み、上記（３）記載の方法に従い微生物に導入する。
該組換え体プラスミドは宿主細胞中で自律複製できないので、該組換え体プラスミド上に存在する抗生物質の耐性で選択することにより、該組換え体プラスミドがＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
つぎに、本発明のＤＮＡと共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利用した選択［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９２）］を行うことによって、宿主染色体上のＧＮＤをコードするＤＮＡが本発明のＤＮＡに置換された株を取得することができる。
以上の方法で、染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物を作製する方法としては、他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができる。例えば、相田 浩ら編、アミノ酸発酵、１９８６年、学会出版センターに記載の方法をあげることができる。
（５）有用物質の製造
上記（３）で得られる形質転換体、または上記（４）で得られる染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取することにより、有用物質を得ることができる。
該形質転換体または微生物を培養する方法は、上記（３）記載の形質転換体の培養法と同様である。
培養終了後、菌体などの沈殿物を除去して得られた培養液より、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することにより該有用物質を回収することができる。
有用物質としては、Ｌ−アミノ酸、核酸もしくはその誘導体、糖、ビタミン等の生合成によって得られる物質をあげることができるが、好ましくはＬ−アミノ酸または核酸もしくはその誘導体であって、かつペントースリン酸回路を経て合成される物質、または生合成にＮＡＤＰＨが使用される物質があげられる。
ペントースリン酸回路を経て合成される物質としては、ペントースリン酸回路を経て合成されるいずれの物質であってもよい。例えば、代謝経路上エリスロース４−リン酸を経由して生合成されるＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等のＬ−アミノ酸、代謝経路上リボース５−リン酸を経由して生合成されるＤ−リボース、Ｌ−ヒスチジン、プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビンヌクレオチド等の核酸もしくはその誘導体をあげることができる。
生合成にＮＡＤＰＨが使用される物質としては、生合成にＮＡＤＰＨが使用されるいずれの物質であってもよい。生合成にＮＡＤＰＨを必要とするＬ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン等をあげることができる。生合成にＮＡＤＰＨを必要とする核酸またはその誘導体としてはプリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド等をあげることができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のＰｒｏ残基がＳｅｒ残基に置換（Ｐｒｏ１５８Ｓｅｒ）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、ＰＣＲを用いる部位特異的変異法［モレキュラー・クローニング第３版］を用いて次のようにして取得した。
まず、コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型株ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］に従って調製した。
次いで、該染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、添付のバッファーおよび後述のプライマーを用いてＰＣＲを行った。公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＧＮＤ遺伝子の塩基配列情報［ＥＰ１１０８７９０号公報］に基づき、該ＧＮＤ遺伝子中のＧＮＤをコードする領域（配列番号２）中で、該領域によりコードされるＧＮＤの有するアミノ酸配列（配列番号１）の第１５８番目のＰｒｏ残基をコードする領域（ｃｃａ）を含む２１塩基からなる領域（配列番号２の第４６２〜４８２番目）において、該Ｐｒｏ残基をコードする領域領域をＳｅｒ残基をコードするコドン（ｔｃａ）に置換した塩基配列（配列番号４）からなるＤＮＡ断片、およびその相補配列である配列番号５記載の２１塩基の塩基配列を有するＤＮＡ断片を常法に従い合成し、これらのＤＮＡ断片をＰＣＲ用のプライマーとした。
また、配列番号２記載の塩基配列のＮ末部分１４塩基およびその上流の塩基配列からなるＤＮＡ断片を合成した。該ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号３に示した。
配列番号２記載の塩基配列のＣ末部分２０塩基およびその下流の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡ断片を合成した。該ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号８に示した。
配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。
ＰＣＲにより得られた、約０．５ｋｂおよび約１．０ｋｂの増幅産物（配列番号２記載の塩基配列の第１〜４８２番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片、および第４６２〜１４７６番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、ＧＮＤの有するアミノ酸配列の第１５８番目のＰｒｏ残基をコードする領域（ｃｃａ）がＳｅｒをコードするコドン（ｔｃａ）に置換された約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１社製）を用いて抽出、精製した。
該ＤＮＡ断片をＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）、ｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニン残基を１塩基付加した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴＡクローニング法（モレキュラー・クローニング第３版）により、プラスミドｐＥＳＢ３０に挿入した。ｐＥＳＢ３０は、カナマイシン耐性遺伝子を有するベクターｐＨＳＧ２９９［Ｇｅｎｅ，６１，６３（１９８７）］のＰｓｔＩ切断部位に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のレバンシュクラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む２．６ｋｂのＰｓｔＩＤＮＡ断片［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）］を連結したプラスミドである。
具体的には、ｐＥＳＢ３０をＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断後、アガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１社製）を用いてｐＥＳＢ３０断片を抽出、精製した。得られたｐＥＳＢ３０断片の両末端をＤＮＡブランティングキット（ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ、宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに従って、平滑化した。平滑化したｐＥＳＢ３０断片をフェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により濃縮した後、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｄＴＴＰ存在下で７０℃、２時間反応させ、３’末端にチミン塩基を１塩基付加して、ｐＥＳＢ３０−Ｔ断片を調製した。このｐＥＳＢ３０−Ｔ断片と、上記で得られたアデニン塩基を付加した約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、リガーゼ反応を行った。得られた反応産物を用い、常法［モレキュラー・クローニング第３版］に従ってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。
該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整された培地］上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法［モレキュラー・クローニング第３版］によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、ｐＥＳＢ３０に上記で得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラスミドをｐＣｇｎｄ１５８と命名した。
実施例２
配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のＳｅｒ残基をコードする領域がＰｈｅ残基をコードする領域に置換（Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、実施例１と同様なＰＣＲを用いる部位特異的変異法を用いて次のようにして取得した。
配列番号２記載の塩基配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のＳｅｒ残基をコードする領域（ｔｃｃ）を含む２１塩基からなる領域（配列番号２記載の塩基配列の第１０７２〜１０９２番目）の該Ｓｅｒ残基をコードする領域をＰｈｅ残基をコードするコドン（ｔｔｃ）に置換した塩基配列（配列番号６）からなるＤＮＡ断片、およびその相補配列である２１塩基の塩基配列（配列番号７）からなるＤＮＡ断片を合成した。配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、該染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼと添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。
ＰＣＲにより得られた、約１．１ｋｂ、約０．４ｋｂの増幅産物（配列番号２記載の塩基配列の第１〜１０９２番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片、および第１０７２〜１４７６番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、ＧＮＤの有するアミノ酸配列の第３６１番目のＳｅｒ残基をコードする領域（ｔｃｃ）がＰｈｅ残基をコードするコドン（ｔｔｃ）に置換された、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。次いで、得られたＤＮＡ断片を含むＰＣＲ産物をＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）、ｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニン塩基を１塩基付加した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、実施例１と同様にしてプラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔに挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＣｇｎｄ３６１と命名した。
実施例３
配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のＰｒｏ残基がＳｅｒ残基に置換され、かつ第３６１番目のＳｅｒ残基がＰｈｅ残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、上記実施例１および２と同様なＰＣＲを用いる部位特異的変異法を用いて次のようにして取得した。
すなわち、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、実施例１で作製したプラスミドｐＣｇｎｄ１５８を鋳型として、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼと添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。
ＰＣＲにより得られた、約１．１ｋｂ、約０．４ｋｂの増幅産物（配列番号２記載の塩基配列の第１〜１０９２番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片、および第１０７２〜１４７６番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、ＧＮＤの有するアミノ酸配列の第１５８番目のＰｒｏ残基をコードする領域（ｃｃａ）がＳｅｒ残基をコードするコドン（ｔｃａ）に置換され、かつ第３６１番目のＳｅｒ残基をコードする領域（ｔｃｃ）がＰｈｅ残基をコードするコドン（ｔｔｃ）に置換された、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。次いで、得られたＤＮＡ断片を含むＰＣＲ産物をＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）、ｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニン塩基を１塩基付加した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、実施例１と同様にしてプラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔに挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＣｇｎｄ１５３６と命名した。
実施例４
上記実施例１〜３で作製したプラスミド、ｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を用い、遺伝子置換法によってＬ−リジン生産菌のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入することを試みた。
Ｌ−リジン生産菌としては、遺伝形質が明らかなコリネバクテリウム グルタミクムＡＨＰ−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３８２）を用いた。コリネバクテリウム グルタミクムＡＨＰ−３株は、コリネバクテリウム グルタミクムの野生株ＡＴＣＣ １３０３２の染色体上のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｏｍ）にアミノ酸置換変異Ｖａｌ５９Ａｌａ、アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）にアミノ酸置換変異Ｔｈｒ３３１Ｉｌｅ、およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）にアミノ酸置換変異Ｐｒｏ４５８Ｓｅｒを有する菌株である。
遺伝子置換法によるＬ−リジン生産菌ＡＨＰ−３株のＧＮＤ遺伝子への変異の導入は、次に示すような２回の組換え操作によって行った。まず、上記で作製した各プラスミド（ｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６）が、コリネ型細菌内では自律複製できないことを利用して、以下の方法で、これらのプラスミドが相同組換えでコリネバクテリウムグルタミクムＡＨＰ−３株の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた株を、それぞれ選択した。
具体的には、該プラスミドを用い、レストらの方法［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５２，５４１（１９９９）］に従って電気穿孔法にてＡＨＰ−３株を形質転換し、カナマイシン耐性株を選択した。選択したカナマイシン耐性株のうちの１株から得た染色体の構造をサザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）により調べた結果、プラスミドがＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確かめられた。このような株では、野生型および変異型のＧＮＤ遺伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で２回目の相同組換えが起こりやすくなっている。
該形質転換株（１回組換え体）をＳＵＣ寒天培地〔ショ糖１００ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して、生育するコロニーを選択した。ｓａｃＢ遺伝子が存在する株は、ショ糖を自殺基質に転換するので、この培地では生育できない［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９１）］。これに対し、染色体上に近接して存在する野生型と変異型のＧＮＤ遺伝子間での２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この２回目の相同組み換えの際には、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子のいずれかが、ｓａｃＢとともに欠失する。このとき野生型がｓａｃＢとともに欠失した株では、変異型への遺伝子置換が起こったことになる。
このようにして得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により調製し、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。これらのＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体のＧＮＤ遺伝子が野生型であるか変異型であるかを判定した。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＡＧＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＡＧＲ−３６１株、およびＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異ならびにＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＡＰＧ−１５３６株を取得した。
実施例５
取得したＡＧＦ−１５８株、ＡＧＲ−３６１株、ＡＰＧ−１５３６株、およびこれらの親株であるＡＨＰ−３株を、ＢＹＧ寒天培地〔グルコース１０ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕で３０℃で２４時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地〔スクロース５０ｇ、コーンスティープリカー４０ｇ、硫酸アンモニウム８．３ｇ、尿素１ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８３ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸銅５水和物１ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１０ｍｇ、β−アラニン１０ｍｇ、ニコチン酸５ｍｇ、チアミン塩酸塩１．５ｍｇ、ビオチン０．５ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕２５０ｍｌを含む２リットルバッフル付き三角フラスコに植菌し、３０℃で１２時間〜１６時間培養した。
得られた種培養液全量を、それぞれ本培養培地〔グルコース６０ｇ、コーンスティープリカー２０ｇ、塩化アンモニウム２５ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．７５ｇ、硫酸鉄７水和物５０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１３ｍｇ、塩化カルシウム２水和物５０ｍｇ、硫酸銅５水和物６．３ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１．３ｍｇ、塩化ニッケル６水和物５ｍｇ、塩化コバルト６水和物１．３ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物１．３ｍｇ、ニコチン酸１４ｍｇ、β−アラニン２３ｍｇ、チアミン塩酸塩７ｍｇ、ビオチン０．４２ｍｇを水１Ｌに含む培地〕１，４００ｍｌの入った５リットルジャーファーメンターに植菌し、３４℃、１ｖｖｍ、８００ｒｐｍ条件下で、ｐＨ７．０にアンモニア水で調整しながら培養した。
培地中のグルコースが消費された時点でグルコース・フィード液（グルコース４００ｇ、塩化アンモニウム４５ｇを水１Ｌに含む培地）を連続的に添加した。該フィード液の添加は、流加速度が４菌株間で同じになるように調整しながら行い、培養時間が２８時間に達したところで培養を終了した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−リジン塩酸塩の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を第１表に示す。
第１表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＡＧＦ−１５８株、ＡＧＲ−３６１株、およびＡＰＧ−１５３６株では、Ｌ−リジンの生産効率が親株ＡＨＰ−３に比べ、明らかに向上していた。
実施例６
実施例１〜３で作製したｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を導入する微生物としてコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ ２１６６０株（以下、ＡＴＣＣ ２１６６０株という）を用いる以外は実施例４と同様にしてＡＴＣＣ ２１６６０株のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入した。
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ ２１６６０株は、コリネバクテリウム グルタミカムの野生株ＡＴＣＣ １３０３２から、メチオニン要求性変異、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）耐性変異、およびＳ−（２−アミノエチル）−システイン（ＡＥＣ）耐性変異を誘導することにより取得された変異株である〔Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６１１（１９７２）〕。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＴＨＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＴＨＲ−３６１株、およびＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異ならびにＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＴＨＧ−１５３６株を得た。
実施例７
実施例６で得たＴＨＦ−１５８株、ＴＨＲ−３６１株、ＴＨＧ−１５３６株およびＡＴＣＣ ２１６６０株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃で２４時間培養し、種培地（グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整した培地）１０ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液１ｍｌを本培養培地（グルコース１００ｇ、コーンスティープリカー５ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１０ｍｇ、ビオチン０．１ｍｇ、Ｌ−メチオニン０．１ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整後、炭酸カルシウムを２０ｇ加えた培地）１０ｍｌの入った太型試験管に植菌し、３０℃で７２時間、培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−スレオニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第２表に示す。
第２表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＴＨＦ−１５８株、ＴＨＲ−３６１株、およびＴＨＧ−１５３６株では、Ｌ−スレオニンの生産効率は親株ＡＴＣＣ ２１６６０に比べ、明らかに向上していた。
実施例８
実施例１〜３で作製したｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を導入する微生物としてコリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株（以下、ＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株という）を用いる以外は、実施例４と同様にしてＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入した。
コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株は、コリネバクテリウム グルタミカムの野生株から、アルギニン要求性、Ｓ−（２−アミノエチル）システイン耐性、フルオロピルビン酸感受性、リファンピシリン耐性およびスレオニンハイドロキサメート耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特開昭６２−１９５２９３）。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＩＬＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＩＬＲ−３６１株、Ｐｒｏ１５８Ｓｅｒ変異およびＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＩＬＧ−１５３６株を取得した。
実施例９
実施例８で得たＩＬＦ−１５８株、ＩＬＲ−３６１株、ＩＬＧ−１５３６株およびＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株を、ＢＹＧ寒天培地上で２８℃で２４時間培養し、種培地（グルコース５０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ、ペプトン１０ｇ、尿素３ｇ、塩化ナ
１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、２８℃で２４時間、振盪培養した。この種培養液２ｍｌを本培養培地〔廃糖蜜（グルコース換算）７０ｇ、コーン・スティープ・リカー５ｇ、塩化アンモニウム２０ｇ、尿素２ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物０．０１ｇ、塩化マンガン４水和物０．０１ｇ、硫酸銅５水和物０．０１ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０１ｇ、硫酸亜鉛７水和物１ｍｇ、塩化ニッケル１ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム・４水和物１ｍｇ、塩化コバルト６水和物１ｍｇ、パントテン酸カルシウ
水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整した培地〕２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種して７２時間、種培養と同様の方法で培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−イソロイシンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第３表に示す。
第３表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＩＬＦ−１５８株、ＩＬＲ−３６１株、およびＩＬＧ−１５３６株では、Ｌ−イソロイシンの生産効率は親株ＦＥＲＭ ＢＰ−９８６に比べ、有意に向上していた。
実施例１０
実施例１〜３で作製したｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を導入する微生物としてコリネバクテリウム グルタミカムＫＹ１０６７１（ＦＥＲＭ Ｐ−３６１６）株（以下、ＫＹ１０６７１株という）を用いる以外は実施例４と同様にしてＫＹ１０６７１株のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入することを試みた。
ＫＹ１０６７１株は、コリネバクテリウム グルタミカムの野生株から、Ｄ−セリン感受性変異、Ｄ−アルギニン耐性変異、アルギニンハイドロキサメート耐性変異、および６−アザウラシル耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特開昭５３−１２４９１、特開平１−２５７４８６）。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＡＲＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＡＲＲ−３６１株、およびＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異ならびにＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＡＲＧ−１５３６株を取得した。
実施例１１
ＡＲＦ−１５８株、ＡＲＲ−３６１株、およびＡＲＧ−１５３６株およびＫＹ１０６７１株を、それぞれＢＹＧ寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、種培地（グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）６ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液２ｍｌを本培養培地〔廃糖蜜１５０ｇ（グルコース換算）、コーンスティープリカー５ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、尿素３ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム２水和物０．２５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−アルギニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第４表に示す。
第４表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＡＲＦ−１５８株、ＡＲＲ−３６１株、およびＡＲＧ−１５３６株では、Ｌ−アルギニンの生産効率は親株ＫＹ１０６７１に比べ、明らかに向上していた。
実施例１２
実施例１〜３で作製したｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を導入する微生物としてコリネバクテリウム グルタミカムＢＰＳ−１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７）株（以下、ＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７株という）を用いる以外は実施例４と同様にしてＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７株のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入することを試みた。
ＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７株は、コリネバクテリウム グルタミカムの野生株から、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンの要求性変異、種々の芳香族アミノ酸アナログに対する耐性変異、および３−ブロモピルビン酸の感受性変異を誘導することにより取得された変異株である（特許第２５７８４８８号）。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＴＲＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＴＲＲ−３６１株、およびＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異ならびにＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＴＲＧ−１５３６株を取得した。
実施例１３
ＴＲＦ−１５８株、ＴＲＲ−３６１株、およびＴＲＧ−１５３６株およびＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、種培地（グルコース２０ｇ、ポリペプトン１５ｇ、酵母エキス１５ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、尿素１ｇ、Ｌ−フェニルアラニン２００ｍｇ、Ｌ−チロシン２００ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）６ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液２ｍｌを本培養培地（グルコース６０ｇ、コーンスティープリカー１０ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２５ｇ、硫酸マンガン７水和物１０ｍｇ、ビオチン０．０３ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを２０ｇ加えた培地）２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−トリプトファンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第５表に示す。
第５表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するＴＲＦ−１５８株、ＴＲＲ−３６１株、およびＴＲＧ−１５３６株では、Ｌ−トリプトファンの生産効率は親株ＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７に比べ、明らかに向上していた。
試験例１ ＧＮＤ活性の測定
上記実施例４で得たＡＧＦ−１５８株、ＡＧＲ−３６１株、ＡＰＧ−１５３６株およびこれらの親株であるＡＨＰ−３株のＧＮＤ活性を、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１２５７（１９８７）およびＥｎｚｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２８，７５４（２００１）に記載の方法に準じて以下の方法で測定した。
なお、コリネバクテリウム グルタミクムＡＨＰ−３株には、ＧＮＤ活性に関与する変異は一切導入されておらず、該菌株のＧＮＤ活性は、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ １３０３２株と同等である。
ＡＴＣＣ １３０３２株、ＡＨＰ−３株、ＡＧＦ−１５８株、ＡＧＲ−３６１株およびＡＰＧ−１５３６株を、それぞれＭＭＹＥ培地〔グルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム１０ｇ、尿素３ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．４ｇ、塩化ナトリウム５０ｍｇ、硫酸鉄７水和物２ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２ｍｇ、チアミン塩酸塩０．２ｍｇ、ビオチン０．０５ｍｇ、酵母エキス（ディフコ社製）１ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕２００ｍｌに植菌し、３０℃で培養した。
培養中、培養液の濁度を分光光度計等で測定し、培養液のＯＤ．６６０ｎｍが７〜８になった時点で培養を終了した。培養終了後、培養液を４，０００ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離した。該遠心分離で得られた菌体を、氷冷した溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）［Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ５０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．５）、塩化カリウム５００ｍｍｏｌ／ｌ、２−メルカプトエタノール２ｍｍｏｌ／ｌ、グリセロール５％を含む］で２回洗浄した。洗浄後、溶解緩衝液１０ｍｌを添加し、菌体を該溶解緩衝液に懸濁した。
この懸濁液中の菌体を超音波破砕機を用いて破砕した。破砕した菌体を含む懸濁液を４℃で３０分間遠心分離し、得られた上清を最終タンパク質濃度が５〜１５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解緩衝液に懸濁し、粗酵素液とした。
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ５０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．５）、ＮＡＤＰ０．５ｍｍｏｌ／ｌ、塩化マグネシウム１０ｍｍｏｌ／ｌ、６−ホスホグルコン酸２ｍｍｏｌ／ｌを含む反応液に粗酵素液を加えて１．５ｍｌとし、１ｍｌのキュベット内にて３０℃で反応を行い、３４０ｎｍの吸光度の増加を測定した。ＮＡＤＰＨのモル吸光係数を６２２０として１分間に生成されるＮＡＤＰＨを算出した。１分間にタンパク質１ｍｇ当たり生成されるＮＡＤＰＨの生成量をＧＮＤ比活性とした。
第６表に、ＡＴＣＣ １３０３２株、ＡＨＰ−３株、ＡＧＦ−１５８株、ＡＧＲ−３６１株、およびＡＰＧ−１５３６株のＧＮＤ比活性を示した。
産業上の利用可能性
本発明によれば、改変されたＧＮＤおよび該ＧＮＤをコードするＤＮＡが得られ、該改変ＧＮＤを用いることにより、微生物による有用物質の生産効率を高めることができる。
配列表フリーテキスト
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
本発明は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＮＤと略す）活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ＤＮＡを染色体上に有する微生物、および該形質転換体もしくは該微生物を培地に培養することを特徴とする有用物質の製造法に関する。
背景技術
ＧＮＤは、ペントースリン酸回路中の酵素の１つであり、６−ホスホグルコン酸を酸化および脱炭酸してＤ−リブロース−５−リン酸を生成する酵素である。
ＧＮＤをコードするＤＮＡについては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来〔Ｇｅｎｅ，２７，２５３（１９８４）〕、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１３７４４（１９８６）〕等のＤＮＡが単離され、その塩基配列が報告されている。
コリネバクテリウム属に属する微生物については、コリネバクテリウム・グルタミカムのＧＮＤに関して、生化学的性質やＧＮＤをコードする遺伝子の塩基配列が報告されている［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１２５７（１９８７）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６７，３４４２（２０００）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２８，７５４（２００１）、特開平９−２２４６６２、ＥＰ １１０８７９０］。
しかし、これまでに、ＧＮＤをコードするＤＮＡに変異を導入することによって代謝産物の生産性を向上させることができることは知られていない。さらに、ＧＮＤをコードするＤＮＡにどのような変異を導入すれば前記効果が得られるかについて記載および示唆した報告もない。
発明の開示
本発明の目的は、新規な変異型ＧＮＤ、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ＤＮＡを染色体上に有する微生物、または該形質転換体もしくは該微生物を用いる有用物質の製造法を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（２３）に関する。
（１） 以下の（ａ）〜（ｆ）記載のポリペプチドからなる群より選ばれるポリペプチド。
（ａ） コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｄ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｆ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、かつ第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（２） コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＧＮＤである上記（１）のポリペプチド。
（３） Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基がＳｅｒ残基である上記（１）または（２）のポリペプチド。
（４） Ｓｅｒ残基以外のアミノ酸残基がＰｈｅ残基である上記（１）または（２）のポリペプチド。
（５） Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基がＳｅｒ残基であり、かつＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基がＰｈｅ残基である上記（１）または（２）のポリペプチド。
（６） 上記（１）〜（５）いずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（７） 以下の（ａ）〜（ｆ）記載のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡ。
（ａ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｄ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｆ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がそれぞれＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンおよびＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（８） コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡが配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである上記（７）のＤＮＡ。
（９） Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｓｅｒ残基をコードするコドンである上記（７）または（８）のＤＮＡ。
（１０） Ｓｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンがＰｈｅ残基をコードするコドンである上記（７）または（８）のＤＮＡ。
（１１） Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｓｅｒ残基をコードするコドンであり、かつＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンがＰｈｅ残基をコードするコドンである上記（７）または（８）のＤＮＡ。
（１２） 上記（６）〜（１１）いずれか１つのＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
（１３） 上記（１２）の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体。
（１４） 形質転換体が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１３）の形質転換体。
（１５） 形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に属する微生物である、上記（１３）または（１４）の形質転換体。
（１６） 染色体上に上記（６）〜（１１）いずれか１つのＤＮＡの有する塩基配列を有する微生物。
（１７） 微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびミクロバクテリウム属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１６）の微生物。
（１８） 微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である上記（１６）または（１７）の微生物。
（１９） 上記（１３）〜（１８）いずれか１つの形質転換体または微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成蓄積させ、該培養物より該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
（２０） 有用物質が、Ｌ−アミノ酸、核酸もしくはその誘導体、糖、またはビタミンである、上記（１９）の製造法。
（２１） 有用物質が、ペントースリン酸回路を経て合成される物質、または生合成にＮＡＤＰＨが使用される物質である上記（１９）または（２０）の製造法。
（２２） 有用物質がＬ−アミノ酸または核酸もしくはその誘導体である、上記（１９）〜（２１）いずれか１項記載の製造法。
（２３） 有用物質が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アルギニン、フェニルアラニン、チロシンおよびＬ−トリプトファンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸である、上記（１９）〜（２２）いずれか１つの製造法。
以下、本願発明について詳細に説明する。
発明を実施するための最良の形態
（１）本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドからなる群より選ばれるポリペプチドである。
（ａ） コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、例えばコリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシェンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）等をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤとしては、上記コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤであれば、いずれのＧＮＤでもよい。
例えばＥＰ１１０８７９０号公報に記載されている配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＧＮＤをあげることができる。
該コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基とは、該コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列と配列番号１記載のアミノ酸配列とを比較し、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕等を用いて計算したときに両アミノ酸配列の相同性が最も高くなるように該アミノ酸配列同士を重ね合わせたとき、該コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列上で配列番号１記載の第１５８番目のアミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基である。同様にして、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基も決定できる。
配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基をＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換するときのアミノ酸残基としては、Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸であってもよいが、例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ等の中性極性側鎖をもつアミノ酸残基が好ましく、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の側鎖にヒドロキシル基をもつアミノ酸残基が更に好ましく、Ｓｅｒ残基が特に好ましい。
配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基をＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換するときのアミノ酸残基としては、Ｓｅｒ残基以外のアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸であってもよいが、例えば、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ等の非極性側鎖をもつアミノ酸残基または、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ等の側鎖に環構造を持つアミノ酸が好ましく、Ｐｈｅ残基が特に好ましい。
さらに、以下の（ｄ）〜（ｆ）記載のポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含される。
（ｄ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｆ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基に置換され、かつ第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基に置換され、該置換された位置のアミノ酸残基以外の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
上記（ｄ）〜（ｆ）のポリペプチドも、上記（ａ）〜（ｃ）と同様の方法で取得することができる。また、置換されるアミノ酸残基の決定は上記（ａ）〜（ｃ）における方法と同様の方法で行うことができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明のポリペプチドがＧＮＤ活性を有するためには、上記（ａ）〜（ｃ）いずれかに記載のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
本発明のポリペプチドのＧＮＤ活性は、アミノ酸の置換前と比べて低下していても向上していても同じであってもよいが、置換前にくらべて低下している場合は、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＧＮＤのＧＮＤ活性の１０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがさらに好ましい。
ＧＮＤ活性は公知の方法によって測定することができる。例えば、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１２５７（１９８７）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２８，７５４（２００１）等に記載の方法をあげることができる。
具体的には、下記（３）に述べる本発明の形質転換体または下記（４）に述べる微生物を培養して得られる培養液または、該培養液より得られる菌体、該菌体より得られる無細胞抽出液、該無細胞抽出液より精製して得られる本発明のポリペプチド等を酵素源として、該酵素源を含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ ５０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．５）、ＮＡＤＰ ０．５ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ２ １０ｍｍｏｌ／ｌ、６−ホスホグルコン酸 ２ｍｍｏｌ／ｌを含む反応液を３０℃で反応を行い、３４０ｎｍにおける吸光度の増加を測定して、生成されるＮＡＤＰＨを定量し、該酵素源のＧＮＤ活性を算出することができる。
上記本発明のポリペプチドは、〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）〕（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）〕（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いてコリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することによって取得することができる。
コリネバクテリウム属由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの例としては、例えば、ＥＰ１１０８７９０号公報に記載されている配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
なお、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸残基がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基であり、第３６１番目のアミノ酸残基がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基である場合は、かならずしも置換を行わなくてもよい。
（２） 本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）記載のＤＮＡをあげることができる。
（ａ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
上記本発明のＤＮＡは、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することによって取得することができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、上記（１）であげたコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＥＰ１１０８７９０号公報に記載されている配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域とは、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列と配列番号２記載の塩基配列とを比較し、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに最も相同性が高くなるように両塩基配列同士を重ね合わせたとき、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目に対応する領域である。同様にして、配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域も決定できる。
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡはＥＰ１１０８７９０号公報に記載された塩基配列の情報をもとに、コリネバクテリウム グルタミクムの野生株ＡＴＣＣ１３０３２由来の染色体ＤＮＡ〔斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］〕や下記方法で得られるｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ等の常法により得ることができる。その他の、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡも配列番号２記載の塩基配列の情報を用いてＰＣＲ等の常法により得ることができる。
本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡに、モレキュラー・クローニング第３版の記載にしたがって部位特異変異を導入して得てもよいし、公知の方法で合成して得てもよい。
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製〕やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ストラタジーン社製〕を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作成するためのクローニングベクターとしては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、λ ｚａｐ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λ ｇｔ１０、λ ｇｔ１１〔ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λ ＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λ ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λ ＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕等をあげることができる。
ｃＤＮＡを組み込んだベクターを導入する微生物としては、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕等を用いることができる。
このようにして得られる本発明のＤＮＡとしては、例えば以下の（ａ−１）〜（ｃ−１）のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡをあげることができる。
（ａ−１）配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ−１）配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ−１）配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
具体的例としては、以下の（ａ−２）〜（ｃ−２）のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡ等をあげることができる。
（ａ−２）配列番号２記載の塩基配列の第４７２番目のシトシン残基がチミン残基に置換された塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ−２）配列番号２記載の塩基配列の第１０８２番目のシトシン残基が、チミン残基に置換された塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ−２）配列番号２記載の塩基配列の第４７２番目のシトシン残基がチミン残基に置換され、かつ第１０８２番目のシトシン残基がチミン残基に置換された塩基配列を有するＤＮＡ
さらに、上記（ａ）〜（ｃ）、（ａ−１）〜（ｃ−１）および（ａ−２）〜（ｃ−２）記載のＤＮＡ以外に、以下の（ｄ）〜（ｆ）記載のＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。
（ｄ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｅ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｆ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該置換された領域がそれぞれＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンおよびＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
該置換される領域の決定は、上記（ａ）〜（ｃ）における方法と同様な方法で行うことができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては上記（１）に記載したコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。
（ｄ）〜（ｆ）記載のＤＮＡは、例えば、上記（ａ−２）〜（ｃ−２）いずれかに記載のＤＮＡの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのうち、第４７２〜４７４番目または第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に対応する領域がそれぞれ、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基をコードするコドンおよびＳｅｒ以外のアミノ酸残基をコードするコドンとして保存されているＤＮＡとして得ることができる。
（ａ−２）〜（ｃ−２）いずれかに記載のＤＮＡの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記（ａ−２）〜（ｃ−２）いずれかに記載のＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、上記（ａ−２）〜（ｃ−２）のいずれか１つに記載のＤＮＡの有する塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
なお、上記（ａ）〜（ｆ）記載のＤＮＡにおいて、置換される領域がコードするＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基としては、Ｐｒｏ残基以外のアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸であってもよいが、例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ等の中性極性側鎖をもつアミノ酸残基が好ましく、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の側鎖にヒドロキシル基をもつアミノ酸残基が更に好ましく、Ｓｅｒ残基が特に好ましい。また、Ｓｅｒ残基以外のアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸であってもよいが、例えば、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ等の非極性側鎖をもつアミノ酸残基または、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ等の側鎖に環構造を持つアミノ酸が好ましく、Ｐｈｅ残基が特に好ましい。
また、あらかじめ、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列の第４７２〜４７４番目の領域がＰｒｏ残基以外のアミノ酸残基をコードするコドンであり、第１０８１〜１０８３番目の領域がＳｅｒ残基以外のアミノ酸残基をコードするＤＮＡである場合は、かならずしも置換を行わなくてもよい。
上記本発明のＤＮＡは、本発明のポリペプチドの製造、およびＬ−アミノ酸の製造のために有用である。
（３）本発明のポリペプチドの製造
上記（１）の本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記（２）の本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて製造することができる。
本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは本発明のポリペプチドの効率的製造に有用である。該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。該組換えベクターを、該組換えベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる細菌、または酵母であればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換えベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
とくに、宿主細胞が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、またはミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物であるときは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ等を使用することが好ましい。
より具体的には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ １３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ ＡＴＣＣ １５９９１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０６０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３８２６（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １４０２０（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕ ｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ ＡＴＣＣ １３８６８、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９（旧属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ ＡＴＣＣ １５９９０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ １７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ９２４４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ９２４５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ９２４６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ９２７７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ６８７１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ６８７２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ １４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＡＴＣＣ １３８２５、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ ＡＴＣＣ １９２４０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ １５３５４を使用することが好ましい。
宿主細胞が、上記のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物であるときは、本発明のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを作製するために用いられるベクターとして、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を用いることが好ましい。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（例えば、特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８６４９）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）、電気穿孔法［例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７５，４０９６（１９９３）］に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリュイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する微生物、例えば、サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
酵母により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
本発明のポリペプチドは、上記方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成、蓄積させ、該培養物より本発明のポリペプチドを採取することで得ることができる。
該形質転換体の培養は、通常の培養法によって実施することができる。
培地としては、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２０℃〜４２℃が好適である。とくに３０℃〜４０℃が好ましい。培地中のｐＨは、５〜９に維持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養期間は通常１〜６日間である。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
本発明のＤＮＡを含む遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、上記（１）の（ａ）〜（ｆ）記載のポリペプチドからなる群より選ばれるポリペプチドをあげることができる。
（４）有用物質の製造に用いられる微生物
本発明において有用物質の製造に用いられる微生物には、上記（３）で得られる形質転換体、および染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物があげられる。
染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物は、通常の変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等を用いて、上記（２）であげた、形質転換体の宿主に使用される微生物の染色体上のＧＮＤをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入して得ることができる。部位特異的変異の導入は、モレキュラー・クローニング第３版、カレントプロトコールズ・イン・モレキュラー．バイオロジー、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、等に記載の方法に従って行うことができる。
また、相同組換え法を用いて、染色体上のＧＮＤをコードするＤＮＡを上記（２）の方法で得られる本発明のＤＮＡで置換することによっても、染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物を作製することができる。
具体的には、上記（２）の方法で得られる本発明のＤＮＡを、宿主細胞中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュクラーゼ遺伝子ｓａｃＢ［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）］を有するプラスミドに組み込み、上記（３）記載の方法に従い微生物に導入する。
該組換え体プラスミドは宿主細胞中で自律複製できないので、該組換え体プラスミド上に存在する抗生物質の耐性で選択することにより、該組換え体プラスミドがＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
つぎに、本発明のＤＮＡと共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利用した選択［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９２）］を行うことによって、宿主染色体上のＧＮＤをコードするＤＮＡが本発明のＤＮＡに置換された株を取得することができる。
以上の方法で、染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物を作製する方法としては、他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができる。例えば、相田 浩ら編、アミノ酸発酵、１９８６年、学会出版センターに記載の方法をあげることができる。
（５）有用物質の製造
上記（３）で得られる形質転換体、または上記（４）で得られる染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物中より該有用物質を採取することにより、有用物質を得ることができる。
該形質転換体または微生物を培養する方法は、上記（３）記載の形質転換体の培養法と同様である。
培養終了後、菌体などの沈殿物を除去して得られた培養液より、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することにより該有用物質を回収することができる。
有用物質としては、Ｌ−アミノ酸、核酸もしくはその誘導体、糖、ビタミン等の生合成によって得られる物質をあげることができるが、好ましくはＬ−アミノ酸または核酸もしくはその誘導体であって、かつペントースリン酸回路を経て合成される物質、または生合成にＮＡＤＰＨが使用される物質があげられる。
ペントースリン酸回路を経て合成される物質としては、ペントースリン酸回路を経て合成されるいずれの物質であってもよい。例えば、代謝経路上エリスロース４−リン酸を経由して生合成されるＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等のＬ−アミノ酸、代謝経路上リボース５−リン酸を経由して生合成されるＤ−リボース、Ｌ−ヒスチジン、プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビンヌクレオチド等の核酸もしくはその誘導体をあげることができる。
生合成にＮＡＤＰＨが使用される物質としては、生合成にＮＡＤＰＨが使用されるいずれの物質であってもよい。生合成にＮＡＤＰＨを必要とするＬ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン等をあげることができる。生合成にＮＡＤＰＨを必要とする核酸またはその誘導体としてはプリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド等をあげることができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のＰｒｏ残基がＳｅｒ残基に置換（Ｐｒｏ１５８Ｓｅｒ）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、ＰＣＲを用いる部位特異的変異法［モレキュラー・クローニング第３版］を用いて次のようにして取得した。
まず、コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型株ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］に従って調製した。
次いで、該染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、添付のバッファーおよび後述のプライマーを用いてＰＣＲを行った。公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＧＮＤ遺伝子の塩基配列情報［ＥＰ１１０８７９０号公報］に基づき、該ＧＮＤ遺伝子中のＧＮＤをコードする領域（配列番号２）中で、該領域によりコードされるＧＮＤの有するアミノ酸配列（配列番号１）の第１５８番目のＰｒｏ残基をコードする領域（ｃｃａ）を含む２１塩基からなる領域（配列番号２の第４６２〜４８２番目）において、該Ｐｒｏ残基をコードする領域領域をＳｅｒ残基をコードするコドン（ｔｃａ）に置換した塩基配列（配列番号４）からなるＤＮＡ断片、およびその相補配列である配列番号５記載の２１塩基の塩基配列を有するＤＮＡ断片を常法に従い合成し、これらのＤＮＡ断片をＰＣＲ用のプライマーとした。
また、配列番号２記載の塩基配列のＮ末部分１４塩基およびその上流の塩基配列からなるＤＮＡ断片を合成した。該ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号３に示した。
配列番号２記載の塩基配列のＣ末部分２０塩基およびその下流の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡ断片を合成した。該ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号８に示した。
配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。
ＰＣＲにより得られた、約０．５ｋｂおよび約１．０ｋｂの増幅産物（配列番号２記載の塩基配列の第１〜４８２番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片、および第４６２〜１４７６番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、ＧＮＤの有するアミノ酸配列の第１５８番目のＰｒｏ残基をコードする領域（ｃｃａ）がＳｅｒをコードするコドン（ｔｃａ）に置換された約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１社製）を用いて抽出、精製した。
該ＤＮＡ断片をＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）、ｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニン残基を１塩基付加した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴＡクローニング法（モレキュラー・クローニング第３版）により、プラスミドｐＥＳＢ３０に挿入した。ｐＥＳＢ３０は、カナマイシン耐性遺伝子を有するベクターｐＨＳＧ２９９［Ｇｅｎｅ，６１，６３（１９８７）］のＰｓｔＩ切断部位に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のレバンシュクラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む２．６ｋｂのＰｓｔＩＤＮＡ断片［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）］を連結したプラスミドである。
具体的には、ｐＥＳＢ３０をＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断後、アガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１社製）を用いてｐＥＳＢ３０断片を抽出、精製した。得られたｐＥＳＢ３０断片の両末端をＤＮＡブランティングキット（ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ、宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに従って、平滑化した。平滑化したｐＥＳＢ３０断片をフェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により濃縮した後、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｄＴＴＰ存在下で７０℃、２時間反応させ、３’末端にチミン塩基を１塩基付加して、ｐＥＳＢ３０−Ｔ断片を調製した。このｐＥＳＢ３０−Ｔ断片と、上記で得られたアデニン塩基を付加した約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、リガーゼ反応を行った。得られた反応産物を用い、常法［モレキュラー・クローニング第３版］に従ってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。
該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整された培地］上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法［モレキュラー・クローニング第３版］によりプラスミドを調製した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、ｐＥＳＢ３０に上記で得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラスミドをｐＣｇｎｄ１５８と命名した。
実施例２
配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のＳｅｒ残基をコードする領域がＰｈｅ残基をコードする領域に置換（Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、実施例１と同様なＰＣＲを用いる部位特異的変異法を用いて次のようにして取得した。
配列番号２記載の塩基配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のＳｅｒ残基をコードする領域（ｔｃｃ）を含む２１塩基からなる領域（配列番号２記載の塩基配列の第１０７２〜１０９２番目）の該Ｓｅｒ残基をコードする領域をＰｈｅ残基をコードするコドン（ｔｔｃ）に置換した塩基配列（配列番号６）からなるＤＮＡ断片、およびその相補配列である２１塩基の塩基配列（配列番号７）からなるＤＮＡ断片を合成した。配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、該染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼと添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。
ＰＣＲにより得られた、約１．１ｋｂ、約０．４ｋｂの増幅産物（配列番号２記載の塩基配列の第１〜１０９２番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片、および第１０７２〜１４７６番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、ＧＮＤの有するアミノ酸配列の第３６１番目のＳｅｒ残基をコードする領域（ｔｃｃ）がＰｈｅ残基をコードするコドン（ｔｔｃ）に置換された、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。次いで、得られたＤＮＡ断片を含むＰＣＲ産物をＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）、ｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニン塩基を１塩基付加した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、実施例１と同様にしてプラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔに挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＣｇｎｄ３６１と命名した。
実施例３
配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のＰｒｏ残基がＳｅｒ残基に置換され、かつ第３６１番目のＳｅｒ残基がＰｈｅ残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、上記実施例１および２と同様なＰＣＲを用いる部位特異的変異法を用いて次のようにして取得した。
すなわち、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、実施例１で作製したプラスミドｐＣｇｎｄ１５８を鋳型として、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼと添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。
ＰＣＲにより得られた、約１．１ｋｂ、約０．４ｋｂの増幅産物（配列番号２記載の塩基配列の第１〜１０９２番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片、および第１０７２〜１４７６番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、ＧＮＤの有するアミノ酸配列の第１５８番目のＰｒｏ残基をコードする領域（ｃｃａ）がＳｅｒ残基をコードするコドン（ｔｃａ）に置換され、かつ第３６１番目のＳｅｒ残基をコードする領域（ｔｃｃ）がＰｈｅ残基をコードするコドン（ｔｔｃ）に置換された、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。次いで、得られたＤＮＡ断片を含むＰＣＲ産物をＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）、ｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニン塩基を１塩基付加した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、実施例１と同様にしてプラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔに挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＣｇｎｄ１５３６と命名した。
実施例４
上記実施例１〜３で作製したプラスミド、ｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を用い、遺伝子置換法によってＬ−リジン生産菌のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入することを試みた。
Ｌ−リジン生産菌としては、遺伝形質が明らかなコリネバクテリウム グルタミクムＡＨＰ−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３８２）を用いた。コリネバクテリウム グルタミクムＡＨＰ−３株は、コリネバクテリウム グルタミクムの野生株ＡＴＣＣ １３０３２の染色体上のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｏｍ）にアミノ酸置換変異Ｖａｌ５９Ａｌａ、アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）にアミノ酸置換変異Ｔｈｒ３３１Ｉｌｅ、およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）にアミノ酸置換変異Ｐｒｏ４５８Ｓｅｒを有する菌株である。
遺伝子置換法によるＬ−リジン生産菌ＡＨＰ−３株のＧＮＤ遺伝子への変異の導入は、次に示すような２回の組換え操作によって行った。まず、上記で作製した各プラスミド（ｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６）が、コリネ型細菌内では自律複製できないことを利用して、以下の方法で、これらのプラスミドが相同組換えでコリネバクテリウムグルタミクムＡＨＰ−３株の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた株を、それぞれ選択した。
具体的には、該プラスミドを用い、レストらの方法［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５２，５４１（１９９９）］に従って電気穿孔法にてＡＨＰ−３株を形質転換し、カナマイシン耐性株を選択した。選択したカナマイシン耐性株のうちの１株から得た染色体の構造をサザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）により調べた結果、プラスミドがＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確かめられた。このような株では、野生型および変異型のＧＮＤ遺伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で２回目の相同組換えが起こりやすくなっている。
該形質転換株（１回組換え体）をＳＵＣ寒天培地〔ショ糖１００ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して、生育するコロニーを選択した。ｓａｃＢ遺伝子が存在する株は、ショ糖を自殺基質に転換するので、この培地では生育できない［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９１）］。これに対し、染色体上に近接して存在する野生型と変異型のＧＮＤ遺伝子間での２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この２回目の相同組み換えの際には、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子のいずれかが、ｓａｃＢとともに欠失する。このとき野生型がｓａｃＢとともに欠失した株では、変異型への遺伝子置換が起こったことになる。
このようにして得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により調製し、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。これらのＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体のＧＮＤ遺伝子が野生型であるか変異型であるかを判定した。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＡＧＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＡＧＲ−３６１株、およびＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異ならびにＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＡＰＧ−１５３６株を取得した。
実施例５
取得したＡＧＦ−１５８株、ＡＧＲ−３６１株、ＡＰＧ−１５３６株、およびこれらの親株であるＡＨＰ−３株を、ＢＹＧ寒天培地〔グルコース１０ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕で３０℃で２４時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地〔スクロース５０ｇ、コーンスティープリカー４０ｇ、硫酸アンモニウム８．３ｇ、尿素１ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８３ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸銅５水和物１ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１０ｍｇ、β−アラニン１０ｍｇ、ニコチン酸５ｍｇ、チアミン塩酸塩１．５ｍｇ、ビオチン０．５ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕２５０ｍｌを含む２リットルバッフル付き三角フラスコに植菌し、３０℃で１２時間〜１６時間培養した。
得られた種培養液全量を、それぞれ本培養培地〔グルコース６０ｇ、コーンスティープリカー２０ｇ、塩化アンモニウム２５ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．７５ｇ、硫酸鉄７水和物５０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１３ｍｇ、塩化カルシウム２水和物５０ｍｇ、硫酸銅５水和物６．３ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１．３ｍｇ、塩化ニッケル６水和物５ｍｇ、塩化コバルト６水和物１．３ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物１．３ｍｇ、ニコチン酸１４ｍｇ、β−アラニン２３ｍｇ、チアミン塩酸塩７ｍｇ、ビオチン０．４２ｍｇを水１Ｌに含む培地〕１，４００ｍｌの入った５リットルジャーファーメンターに植菌し、３４℃、１ｖｖｍ、８００ｒｐｍ条件下で、ｐＨ７．０にアンモニア水で調整しながら培養した。
培地中のグルコースが消費された時点でグルコース・フィード液（グルコース４００ｇ、塩化アンモニウム４５ｇを水１Ｌに含む培地）を連続的に添加した。該フィード液の添加は、流加速度が４菌株間で同じになるように調整しながら行い、培養時間が２８時間に達したところで培養を終了した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−リジン塩酸塩の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を第１表に示す。
実施例６
実施例１〜３で作製したｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を導入する微生物としてコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ ２１６６０株（以下、ＡＴＣＣ ２１６６０株という）を用いる以外は実施例４と同様にしてＡＴＣＣ ２１６６０株のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入した。
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ ２１６６０株は、コリネバクテリウム グルタミカムの野生株ＡＴＣＣ １３０３２から、メチオニン要求性変異、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨＶ）耐性変異、およびＳ−（２−アミノエチル）−システイン（ＡＥＣ）耐性変異を誘導することにより取得された変異株である〔Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６１１（１９７２）〕。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＴＨＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＴＨＲ−３６１株、およびＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異ならびにＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＴＨＧ−１５３６株を得た。
実施例７
実施例６で得たＴＨＦ−１５８株、ＴＨＲ−３６１株、ＴＨＧ−１５３６株およびＡＴＣＣ ２１６６０株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃で２４時間培養し、種培地（グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整した培地）１０ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液１ｍｌを本培養培地（グルコース１００ｇ、コーンスティープリカー５ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１０ｍｇ、ビオチン０．１ｍｇ、Ｌ−メチオニン０．１ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整後、炭酸カルシウムを２０ｇ加えた培地）１０ｍｌの入った太型試験管に植菌し、３０℃で７２時間、培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−スレオニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第２表に示す。
実施例８
実施例１〜３で作製したｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を導入する微生物としてコリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株（以下、ＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株という）を用いる以外は、実施例４と同様にしてＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入した。
コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株は、コリネバクテリウム グルタミカムの野生株から、アルギニン要求性、Ｓ−（２−アミノエチル）システイン耐性、フルオロピルビン酸感受性、リファンピシリン耐性およびスレオニンハイドロキサメート耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特開昭６２−１９５２９３）。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＩＬＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＩＬＲ−３６１株、Ｐｒｏ１５８Ｓｅｒ変異およびＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＩＬＧ−１５３６株を取得した。
実施例９
実施例８で得たＩＬＦ−１５８株、ＩＬＲ−３６１株、ＩＬＧ−１５３６株およびＦＥＲＭ ＢＰ−９８６株を、ＢＹＧ寒天培地上で２８℃で２４時間培養し、種培地（グルコース５０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ、ペプトン１０ｇ、尿素３ｇ、塩化ナ
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−イソロイシンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第３表に示す。
実施例１０
実施例１〜３で作製したｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を導入する微生物としてコリネバクテリウム グルタミカムＫＹ１０６７１（ＦＥＲＭ Ｐ−３６１６）株（以下、ＫＹ１０６７１株という）を用いる以外は実施例４と同様にしてＫＹ１０６７１株のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入することを試みた。
ＫＹ１０６７１株は、コリネバクテリウム グルタミカムの野生株から、Ｄ−セリン感受性変異、Ｄ−アルギニン耐性変異、アルギニンハイドロキサメート耐性変異、および６−アザウラシル耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特開昭５３−１２４９１、特開平１−２５７４８６）。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＡＲＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＡＲＲ−３６１株、およびＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異ならびにＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＡＲＧ−１５３６株を取得した。
実施例１１
ＡＲＦ−１５８株、ＡＲＲ−３６１株、およびＡＲＧ−１５３６株およびＫＹ１０６７１株を、それぞれＢＹＧ寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、種培地（グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）６ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液２ｍｌを本培養培地〔廃糖蜜１５０ｇ（グルコース換算）、コーンスティープリカー５ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、尿素３ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム２水和物０．２５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−アルギニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第４表に示す。
実施例１２
実施例１〜３で作製したｐＣｇｎｄ１５８、ｐＣｇｎｄ３６１およびｐＣｇｎｄ１５３６を導入する微生物としてコリネバクテリウム グルタミカムＢＰＳ−１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７）株（以下、ＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７株という）を用いる以外は実施例４と同様にしてＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７株のＧＮＤ遺伝子にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異、またはその両変異を導入することを試みた。
ＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７株は、コリネバクテリウム グルタミカムの野生株から、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンの要求性変異、種々の芳香族アミノ酸アナログに対する耐性変異、および３−ブロモピルビン酸の感受性変異を誘導することにより取得された変異株である（特許第２５７８４８８号）。
その結果、ＧＮＤ遺伝子内部にＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異を有する２回組換え体であるＴＲＦ−１５８株、Ｓｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＴＲＲ−３６１株、およびＰｒｏ１５８Ｓｅｒ変異ならびにＳｅｒ３６１Ｐｈｅ変異を有する２回組換え体であるＴＲＧ−１５３６株を取得した。
実施例１３
ＴＲＦ−１５８株、ＴＲＲ−３６１株、およびＴＲＧ−１５３６株およびＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、種培地（グルコース２０ｇ、ポリペプトン１５ｇ、酵母エキス１５ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、尿素１ｇ、Ｌ−フェニルアラニン２００ｍｇ、Ｌ−チロシン２００ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）６ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液２ｍｌを本培養培地（グルコース６０ｇ、コーンスティープリカー１０ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．２５ｇ、硫酸マンガン７水和物１０ｍｇ、ビオチン０．０３ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを２０ｇ加えた培地）２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−トリプトファンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第５表に示す。
試験例１ ＧＮＤ活性の測定
上記実施例４で得たＡＧＦ−１５８株、ＡＧＲ−３６１株、ＡＰＧ−１５３６株およびこれらの親株であるＡＨＰ−３株のＧＮＤ活性を、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１２５７（１９８７）およびＥｎｚｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２８，７５４（２００１）に記載の方法に準じて以下の方法で測定した。
なお、コリネバクテリウム グルタミクムＡＨＰ−３株には、ＧＮＤ活性に関与する変異は一切導入されておらず、該菌株のＧＮＤ活性は、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ １３０３２株と同等である。
ＡＴＣＣ １３０３２株、ＡＨＰ−３株、ＡＧＦ−１５８株、ＡＧＲ−３６１株およびＡＰＧ−１５３６株を、それぞれＭＭＹＥ培地〔グルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム１０ｇ、尿素３ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．４ｇ、塩化ナトリウム５０ｍｇ、硫酸鉄７水和物２ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２ｍｇ、チアミン塩酸塩０．２ｍｇ、ビオチン０．０５ｍｇ、酵母エキス（ディフコ社製）１ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕２００ｍｌに植菌し、３０℃で培養した。
培養中、培養液の濁度を分光光度計等で測定し、培養液のＯＤ．６６０ｎｍが７〜８になった時点で培養を終了した。培養終了後、培養液を４，０００ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離した。該遠心分離で得られた菌体を、氷冷した溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）［Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ５０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．５）、塩化カリウム５００ｍｍｏｌ／ｌ、２−メルカプトエタノール２ｍｍｏｌ／ｌ、グリセロール５％を含む］で２回洗浄した。洗浄後、溶解緩衝液１０ｍｌを添加し、菌体を該溶解緩衝液に懸濁した。
この懸濁液中の菌体を超音波破砕機を用いて破砕した。破砕した菌体を含む懸濁液を４℃で３０分間遠心分離し、得られた上清を最終タンパク質濃度が５〜１５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解緩衝液に懸濁し、粗酵素液とした。
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ５０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．５）、ＮＡＤＰ０．５ｍｍｏｌ／ｌ、塩化マグネシウム１０ｍｍｏｌ／ｌ、６−ホスホグルコン酸２ｍｍｏｌ／ｌを含む反応液に粗酵素液を加えて１．５ｍｌとし、１ｍｌのキュベット内にて３０℃で反応を行い、３４０ｎｍの吸光度の増加を測定した。ＮＡＤＰＨのモル吸光係数を６２２０として１分間に生成されるＮＡＤＰＨを算出した。１分間にタンパク質１ｍｇ当たり生成されるＮＡＤＰＨの生成量をＧＮＤ比活性とした。
第６表に、ＡＴＣＣ １３０３２株、ＡＨＰ−３株、ＡＧＦ−１５８株、ＡＧＲ−３６１株、およびＡＰＧ−１５３６株のＧＮＤ比活性を示した。
本発明によれば、改変されたＧＮＤおよび該ＧＮＤをコードするＤＮＡが得られ、該改変ＧＮＤを用いることにより、微生物による有用物質の生産効率を高めることができる。
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配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
Claims (20)
- 以下の（ａ）〜（ｃ）記載のポリペプチドからなる群より選ばれるポリペプチド。
（ａ） コリネバクテリウム属に属する微生物由来の６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＮＤと略す）の有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤの有するアミノ酸配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基に置換され、第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチド - コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＧＮＤである請求項１記載のポリペプチド。
- 配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基である請求項１または２記載のポリペプチド。
- 配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｈｅ残基である請求項１または２記載のポリペプチド。
- 配列番号１記載のアミノ酸配列の第１５８番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＳｅｒ残基であり、かつ配列番号１記載のアミノ酸配列の第３６１番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸残基がＰｈｅ残基である請求項１または２記載のポリペプチド。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
- 以下の（ａ）〜（ｆ）記載のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡ。
（ａ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ）コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡの有する塩基配列において、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列を有し、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列がＳｅｒ、Ｔｈｒ、 Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列がＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンに置換され、かつ第１０８１〜１０８３番目の塩基配列がＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンに置換された塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列および第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域がそれぞれＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンおよびＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンであり、かつＧＮＤ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ - コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＧＮＤをコードするＤＮＡが配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである請求項７記載のＤＮＡ。
- 配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｓｅｒ残基をコードするコドンである請求項７または８記載のＤＮＡ。
- 配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域のＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｐｈｅ残基をコードするコドンである請求項７または８記載のＤＮＡ。
- 配列番号２記載の塩基配列の第４７２〜４７４番目の塩基配列に相応する領域のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＴｙｒから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｓｅｒ残基をコードするコドンであり、かつ配列番号２記載の塩基配列の第１０８１〜１０８３番目の塩基配列に相応する領域のＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＰｒｏおよびＴｒｐから選ばれるアミノ酸残基をコードするコドンが、Ｐｈｅ残基をコードするコドンである請求項７または８記載のＤＮＡ。
- 請求項６〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
- 請求項１２記載の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体。
- 形質転換体が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびミクロバクテリウム属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である請求項１３記載の形質転換体。
- 形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である、請求項１３または１４記載の形質転換体。
- 染色体上に請求項６〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡの有する塩基配列を有する微生物。
- 微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびミクロバクテリウム属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である請求項１６記載の微生物。
- 微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である請求項１６または１７記載の微生物。
- 請求項１３〜１８のいずれか1項記載の形質転換体または微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸、核酸、糖またはビタミンであって、かつペントースリン酸回路を経て合成される物質、または生合成にＮＡＤＰＨが使用される物質を生成蓄積させ、該培養物より該物質を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸、核酸、糖またはビタミンの製造法。
- Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アルギニン、フェニルアラニン、チロシンおよびＬ−トリプトファンからなる群より選ばれる、請求項１９記載の製造法。
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