Aufgabe der
Erfindung
Die
Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen
zur verbesserten Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin
und L-Tryptophan, bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand
der Erfindung sind erzeugte beziehungsweise isolierte Mutanten coryneformer
Bakterien, die bevorzugt Aminosäuren
ausscheiden, und welche ein Gen bzw. Allel enthalten, das für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität kodiert, dadurch gekennzeichnet,
dass das Polypeptid eine Aminosäuresequenz
umfasst, bei der an der Position 329 beziehungsweise einer entsprechenden
oder vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthalten ist. Der Austausch von L-Valin gegen
L-Methionin wird bevorzugt.
Bei
den coryneformen Bakterien wird die Gattung Corynebacterium bevorzugt.
Besonders bevorzugt sind Aminosäure-ausscheidende
Stämme,
die auf folgenden Arten beruhen:
Corynebacterium efficiens,
wie zum Beispiel der Stamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum,
wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,
Corynebacterium thermoaminogenes
wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539, und
Corynebacterium
ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871,
wobei die
Art Corynbacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.
Einige
Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik
auch unter anderen Artbezeichungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:
Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium lilium DSM20137
Corynebacterium
melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
Bekannte
Vertreter Aminosäure
ausscheidender Stämme
coryneformer Bakterien sind beispielsweise
die L-Lysin produzierenden
Stämme
Corynebacterium
glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) beschrieben in
EP 0 358 940 Corynebacterium
glutamicum MH20 (= DSM5714) beschrieben in
EP 0 435 132 Corynebacterium
glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382) beschrieben in
EP 1 108 790 Corynebacterium
thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) beschrieben in
US 5,250,423 oder die L-Tryptophan
produzierenden Stämme
Corynebacterium
glutamicum K76 (=FermBP-1847) beschrieben in
US 5,563,052 Corynebacterium
glutamicum BPS13 (=FermBP-1777) beschrieben in
US 5,605,818 Corynebacterium
glutamicum FermBP-3055 beschrieben in
US
5,235,940 Angaben
zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien
findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology
129, 1433–1477
(1983), Kämpfer
und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989–1005 (1996)),
Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41,
255–260
(1991) und in der US-A-5,250,434.
Stämme mit
der Bezeichnung „ATCC" können von
der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen
werden. Stämme
mit der Bezeichnung „DSM" können von
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
(AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)
bezogen werden. Die genannten Stämme
von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, FERM BP-1540,
FERM BP-1541 und FERM BP-1542) sind in der US-A 5,250,434 beschrieben.
Unter
proteinogenen Aminosäuren
versteht man die Aminosäuren,
die in natürlichen
Proteinen, das heißt
in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen
vorkommen. Hierzu gehören
insbesondere L-Aminosäuren, ausgewählt aus
der Gruppe L-Asparaginsäure,
L-Asparagin, L-Threonin,
L-Serin, L-Glutaminsäure,
L-Glutamin, Glycin,
L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin,
L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan,
L-Prolin und L-Arginin.
Die
Begriffe Protein und Polypeptid sind gegenseitig austauschbar.
Die
erfindungsgemäßen Mutanten
scheiden bevorzugt die genannten proteinogen Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin aus. Der Begriff Aminosäuren
umfasst auch deren Salze wie beispielsweise das Lysin-Monohydrochlorid
oder Lysin-Sulfat im Falle der Aminosäure L-Lysin.
Gegenstand
der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die
ein gnd-Allel enthalten, das für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert,
das die Aminsäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei an Position 329 jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthalten ist. Der Austausch L-Valin gegen L-Methionin
wird bevorzugt.
Gegenstand
der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die
ein gnd-Allel enthalten, das für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert,
das an der Position 329 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2
entsprechenden Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin, bevorzugt
L-Methionin enthält,
wobei das Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der Nukleotidsequenz
eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion
(PCR) unter Verwendung eines Primerpaars erhältlich ist, deren Nukleotidsequenzen
jeweils mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die
aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 226 von SEQ ID
NO:3 und aus der komplementären
Nukleotidsequenz zwischen Position 1866 und 1703 von SEQ ID NO:3
ausgewählt
werden. Beispiele für
derartige geeignete Primerpaare sind in SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8
und in SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10 dargestellt. Als Ausgangsmaterial
(„template"-DNA)) wird chromosomale DNA
coryneformer Bakterien bevorzugt, die insbesondere mit einem Mutagen
behandelt worden sind. Besonders bevorzugt wird die chromosomale
DNA der Gattung Corynebacterium und ganz besonders bevorzugt die der
Art Corynebacterium glutamicum.
Gegenstand
der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die
ein gnd-Allel enthalten, das für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert,
das eine Aminsäuresequenz
mit einer Länge
entsprechend 492 L-Aminosäuren
umfasst, wobei an Position 329 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen
L-Valin, bevorzugt
L-Methionin, enthalten ist.
Gegenstand
der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die
ein gnd-Allel enthalten, das für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert,
das an Position 324 bis 334 der Aminosäuresquenz die Aminosäuresequenz
entsprechend Position 324 bis 334 von SEQ ID NO:6 enthält. Bevorzugt
enthält
die Aminosäuresequenz
des kodierten Polypeptids eine Aminosäuresequenz entsprechend Position
313 bis 345 von SEQ ID NO:6 oder Position 297 bis 361 von SEQ ID
NO:6 oder Position 281 bis 377 von SEQ ID NO:6 oder Position 265
bis 393 von SEQ ID NO:6 oder Position 201 bis 457 von SEQ ID NO:6
oder Position 72 bis 492 von SEQ ID NO:6 oder Position 2 bis 492
von SEQ ID NO:6. Ganz besonders bevorzugt umfasst die Länge des
kodierten Proteins 492 Aminosäuren.
Gegenstand
der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die
ein gnd-Allel enthalten, das für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert,
welches an Position 329 beziehungsweise an der entsprechenden Position
der Aminosäuresequenz
jede Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthält,
wobei dem Austausch gegen L-Methionin der Vorzug gegeben wird und
dessen Aminosäuresequenz
außerdem
zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94%
oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97%
oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:6.
Gegenstand
der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die
ein gnd-Allel enthalten, das für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert,
welches an Position 329 beziehungsweise an der entsprechenden Position
der Aminosäuresequenz
jede Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthält,
wobei dem Austausch gegen L-Methionin der Vorzug gegeben wird und
dessen Nukleotidsequenz außerdem
zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94%
oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97%
oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Nukleotidsequenz
von SEQ ID NO:5.
Es
ist bekannt, dass konservative Aminosäureaustausche die Enzymaktivität nur unwesentlich
verändern.
Dementsprechend kann das in den erfindungsgemäßen Mutanten enthaltene gnd-Allel, das für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, zusätzlich zu
der in SEQ ID NO:6 gezeigten Aminosäuresequenz einen (1) oder mehrere
konservative Aminosäureaustausch(e)
enthalten. Bevorzugt enthält
das Polypeptid höchstens
zwei (2), höchstens
drei (3), höchstens
vier (4) oder höchstens
fünf (5) konservative
Aminosäuraustausche.
Bei
den aromatischen Aminosäuren
spricht man von konservativen Austauschen, wenn Phenylalanin, Tryptophan
und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben
Aminosäuren
spricht man von konservativen Austauschen, wenn Leucin, Isoleucin
und Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht
man von konservativen Austauschen, wenn Glutamin und Aparagin gegeneinander
ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen
Austauschen, wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht
werden. Bei den sauren Aminosäuren
spricht man von konservativen Austauschen, wenn Asparaginsäure und
Glutaminsäure
gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden
Aminosäuren
spricht man von konservativen Austauschen, wenn Serin und Threonin
gegeneinander ausgetauscht werden.
Bei
der Arbeit an der vorliegenden Erfindung wurde durch Vergleich der
Aminosäuresequenz
mit dem Clustal-Programm (Thompson et al., Nucleic Acids Research
22, 4637–4680
(1994)) festgestellt, dass die Aminosäuresequenzen der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase
verschiedener Bakterien wie bespielsweise Escherichia coli, Corynebacterium
efficiens, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus
subtilis, Streptomyces coelicolor und Streptomyces avermitilis ein
Sequenzmotiv bestehend aus der Abfolge Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp und auch ein
Sequenzmotiv bestehend aus der Abfolge Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala
enthalten. Die Bezeichnung „Bra" steht für die Aminosäuren Ile
oder Val, „Aro" für Trp oder
Phe und die Bezeichnung „Ali" für die Aminosäuren Gly
oder Ala.
Dementsprechend
sind solche Mutanten coryneformer Bakterien bevorzugt, die ein gnd-Allel
enthalten, das für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert,
welches mindestens eine Aminosäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp
und Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala umfasst und an Position
329 beziehungsweise der entsprechenden oder vergleichbaren Position
der Aminosäuresequenz
jede Aminosäure
ausgenommen L-Valin, bevorzugt L-Methionin, enthält.
Das
Aminosäuresequenzmotiv
Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp ist beispielsweise in der SEQ ID NO:6
von Position 262 bis 268 enthalten. Das Aminosäuresequenzmotiv Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala
ist beispielsweise in der SEQ ID NO:6 von Position 376 bis 385 enthalten.
Gegenstand
der Erfindung sind schließlich
Mutanten coryneformer Bakterien, die ein gnd-Allel enthalten, das
für ein
Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert,
welches die Amionosäuresequenz
von SEQ ID NO:6 umfasst.
Es
ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme, sogenannte Aminopeptidasen,
das endständige
Methionin bei der Proteinsynthese entfernt wird.
Unter
dem Begriff „einer
zu Position 329 der Aminosäuresequenz
entsprechenden Position" oder „einer
zu Position 329 der Aminosäuresequenz
vergleichbaren Position" versteht
man die Tatsache, dass durch Insertion oder Deletion eines für eine Aminosäure kodierenden
Kodons im N-terminalen
Bereich (bezogen auf die Position 329 von SEQ ID NO:6) des kodierten
Polypeptids die Positionsangabe und Längenangabe im Falle einer Insertion
formal um eine Einheit erhöht
oder im Falle einer Deletion um eine Einheit verringert wird. Beispielsweise
rückt durch
Deletion des für
die Aminosäure
L-Prolin kodierenden CCG-Kodons an Position 2 von SEQ ID NO:5 das
L-Methionin von Position 329 an Position 328. In gleicher Weise
wird durch Insertion oder Deletion eines für eine Aminosäure kodierenden
Kodons im C-terminalen Bereich (bezogen auf die Position 329) des
kodierten Polypeptids die Längenangabe
im Falle einer Insertion formal um eine Einheit erhöht oder
im Falle einer Deletion um eine Einheit verringert. Derartige vergleichbare
Positionen lassen sich durch Vergleich der Aminosäuresequenzen
in Form eines „alignments" beispielsweise mit
Hilfe des Clustal-Programmes leicht identifizieren. Durch derartige
Insertionen und Deletionen wird die enzymatische Aktivität im wesentlichen
nicht berührt. „Im wesentlichen
nicht berührt" bedeutet, dass sich
die enzymatische Aktivität
der genannten Varianten um maximal 20%, maximal 15%, maximal 10%,
maximal 7,5%, maximal 5%, maximal 2,5% oder maximal 1% von der Aktivität des Polypeptids
mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:6 unterscheidet.
Gegenstand
der Erfindung sind dementsprechend auch gnd-Allele, die für Polypeptid Varianten von SEQ
ID NO:6 kodieren, die eine oder mehrere Insertion(en) oder Deletion(en)
enthalten. Bevorzugt enthält
das Polypeptid maximal 5, maximal 4, maximal 3 oder maximal 2 Insertionen
oder Deletionen von Aminosäuren.
Die
Sequenzmotive Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp und Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala
werden durch derartige Insertionen/Deletionen vorzugsweise nicht
zerrissen.
Zur
Herstellung der erfindungsgemäßen Mutanten
können
klassische in-vivo Mutageneseverfahren mit Zellpopulationen coryneformer
Bakterien unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin
(MNNG) oder ultraviolettes Licht verwendet werden.
Mutagenesemethoden
sind beispielsweise im Manual of Methods for General Bacteriology
(Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington,
DC, USA, 1981) oder bei Tosaka et al. (Agricultural and Biological
Chemistry 42(4), 745–752
(1978)) oder bei Konicek et al (Folia Microbiologica 33, 337–343 (1988))
beschrieben. Typische Mutagenesen unter Verwendung von MNNG umfassen
Konzentrationen 50 bis 500 mg/l oder auch höhere Konzentrationen bis zu
maximal 1 g/l, eine Inkubationszeit von 1 bis 30 Minuten bei einem
pH von 5,5 bis 7,5. Unter diesen Bedingungen wird die Zahl der lebensfähigen Zellen
um einen Anteil von ca. 50% bis 90% oder ca. 50% bis 99% oder ca.
50% bis 99,9% oder mehr reduziert.
Aus
der mutagenisierten Zellpopulation werden Mutanten beziehungsweise
Zellen entnommen und vermehrt. Anschließend wird deren Fähigkeit
untersucht, in einer Satzkultur (batch) unter Verwendung eines geeigneten
Nährmediums
Aminosäuren,
bevorzugt L-Lysin oder L-Tryptophan, auszuscheiden. Geeignete Nährmedien
und Testbedingungen sind unter anderem in der
US 6,221,636 , in der
US 6,632,644 , in der WO 00/63388 und
WO 03/014330 beschrieben. Bei Verwendungen von geeigneten Roboteranlagen,
wie beispielsweise bei Zimmermann et al. (VDI Berichte Nr. 1841,
VDI-Verlag, Düsseldorf,
Deutschland 2004, 439–443) oder
Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), 426–428 (2005))beschrieben,
können
zahlreiche Mutanten in kurzer Zeit untersucht werden. Auf diese
Weise werden Mutanten identifiziert, die im Vergleich zum Elternstamm
beziehungsweise nicht mutagenisierten Ausgangsstamm vermehrt Aminosäuren in
das Nährmedium
auausscheiden. Dazu gehören
beispielsweise solche Mutanten, deren Aminosäuresekretion um mindestens
0,5% erhöht
ist.
Anschließend wird
aus den Mutanten DNA bereitgestellt beziehungsweise isoliert und
mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
unter Verwendung von Primerpaaren, die die Amplifizierung des gnd-Gens
beziehungsweise des erfindungsgemäßen gnd-Allels oder der erfindungsgemäßen Mutation
an Position 329 der Aminosäuresequenz
erlauben, das entsprechende Polynukleotid synthetisiert. Vorzugsweise
wird die DNA aus solchen Mutanten isoliert, die in erhöhter Weise
Aminosäuren
ausscheiden.
Hierzu
können
beliebige Primerpaare aus der stromaufwärts und stromabwärts der
erfindungsgemäßen Mutation
gelegenen Nukleotidsequenz und der dazu komplementären Nukleotidsequenz
ausgewählt
werden. Ein Primer eines Primerpaares umfasst hierbei bevorzugt
mindestens 15, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 21 oder
mindestens 24 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus
der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 1210 von SEQ ID NO:3
oder SEQ ID NO:19. Der dazugehörige
zweite Primer eines Primerpaares umfasst mindestens 15, mindestens
18, mindestens 20, mindestens 21 oder mindestens 24 aufeinanderfolgende
Nukleotide ausgewählt
aus der komplementären
Nukleotidsequenz von Position 1866 und 1214 von SEQ ID NO:3 oder
SEQ ID NO:19. Ist die Amplifikation der Kodierregion gewünscht, so
wird das Primerpaar vorzugsweise aus der Nukleotidsequenz zwischen
Position 1 und 226 von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:19 und aus der
komplementären
Nukleotidsequenz zwischen Position 1866 und 1703 von SEQ ID NO:3 oder
SEQ ID NO:19 ausgewählt.
Ist die Amplifikation eines Teils der Kodierregion, wie beispielsweise
in SEQ ID NO:11 und 13 dargestellt, erwünscht, so wird das Primerpaar
vorzugsweise aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 228 und
1210 von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:19 und aus der komplementären Nukleotidsequenz
zwischen Position 1701 und 1214 von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:19
ausgewählt.
Geeignete
Primerpaare sind beispielsweise das unter SEQ ID NO:7 und SEQ ID
NO:8 wiedergegebene Primerpaar gnd-A1 und gnd-E1 oder das unter
SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10 wiedergegebene Primerpaar gnd-FS1 und
gnd-FS-E.
Der
Primer kann überdies
mit Erkennungsstellen für
Restriktionsenzyme, mit einer Biotin-Gruppe oder weiteren Accessoirs,
wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, ausgerüstet sein.
Die Gesamtlänge
des Primers beträgt
im Allgemeinen maximal 30, 40, 50 oder 60 Nukleotide.
Für die Herstellung
von Polynukleotiden durch Amplifikation ausgewählter Sequenzen wie dem erfindungsgemäßen gnd-Allel
aus vorgelegter, beispielsweise chromosomaler DNA durch Amplifikation
mittels PCR werden im Allgemeinen thermostabile DNA-Polymerasen
eingesetzt. Beispiele derartiger DNA-Polymerasen sind die Taq-Polymerase
aus Thermus aquaticus, die unter anderem von der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland)
vertrieben wird, die Vent-Polymerase aus Thermococcus litoralis,
die unter anderem von der Firma New England Biolabs (Frankfurt,
Deutschland) vertrieben wird oder die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus,
die unter anderem von der Firma Stratagene (La Jolla, USA) vertrieben
wird. Bevorzugt werden Polymerasen mit „proof-reading"-Aktivität. „proof-reading"-Aktivität bedeutet,
dass diese Polymerasen in der Lage sind, fehlerhaft eingebaute Nukleotide
zu erkennen und den Fehler durch erneute Polymerisation zu beheben (Lottspeich
und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Deutschland (1998)). Beispiele für
Polymerasen mit „proof-reading"-Aktivität sind die
Vent-Polymerase und die Pfu-Polymerase.
Die
Bedingungen im Reaktionsansatz werden nach Angaben des Herstellers
eingestellt. Die Polymerasen werden vom Hersteller im Allgemeinen
zusammen mit dem gebräuchlichen
Puffer geliefert, welcher üblicherweise
Konzentrationen von 10–100
mM Tris/HCl und 6–55
mM KCL bei pH 7,5–9,3
aufweist. Magnesiumchlorid wird in einer Konzentration von 0,5 – 10 mM
zugesetzt, falls es nicht in dem vom Hersteller gelieferten Puffer
enthalten ist. Dem Reaktionsansatz werden weiterhin Desoxynucleosidtriphosphate
in einer Konzentration von 0,1–16,6
mM zugesetzt. Die Primer werden im Reaktionsansatz mit einer Endkonzentration
von 0,1–3 μM vorgelegt
und die Template-DNA im optimalen Fall mit 102 bis
105 Kopien. Die entsprechende Polymerase
wird dem Reaktionsansatz in einer Menge von 2–5 Units zugegeben. Ein typischer
Reaktionsansatz hat ein Volumen von 20–100 μl.
Als
weitere Zusätze
können
der Reaktion Rinderserumalbumin, Tween-20, Gelatin, Glycerin, Formamid
oder DMSO beigesetzt werden (Dieffenbach und Dveksler, PCR Primer – A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 1995).
Ein
typischer PCR-Verlauf besteht aus drei unterschiedlichen, sich aufeinanderfolgend
wiederholenden Temperaturstufen. Vorab wird die Reaktion mit einer
Temperaturerhöhung
auf 92°C–98°C für 4 bis
10 Minuten gestartet, um die vorgelegte DNA zu denaturieren. Dann
folgen sich wiederholend zuerst ein Schritt zur Denaturierung der
vorgelegten DNA von 10–60
Sekunden bei ungefähr
92–98°C, dann ein
Schritt zum Binden der Primer an die vorgelegte DNA von 10–60 Sekunden
bei einer bestimmten, von den Primern abhängigen Temperatur („Annealing-Temperatur"), die erfahrungsgemäß bei 50°C bis 60°C liegt und
sich für
jedes Primerpaar einzeln berechnen läßt. Genaue Informationen dazu
findet der Fachmann bei Rychlik et al. (Nucleic Acids Research 18
(21): 6409–6412).
Abschließend
folgt ein Synthese-Schritt zur Verlängerung der vorgelegten Primer
(„Extension") bei dem jeweils
für die
Polymerase angegebenen Aktivitätsoptimum, üblicherweise
je nach Polymerase im Bereich von 73°C bis 67°C bevorzugt 72°C bis 68°C. Die Dauer
dieses Extensionschrittes hängt
von der Leistungsfähigkeit
der Polymerase und Länge
des zu amplifizierenden PCR-Produktes ab. In einer typischen PCR
dauert dieser Schritt 0,5–8
Minuten, bevorzugt 2–4 Minuten.
Diese drei Schritte werden 30 bis 35 mal, gegebenenfalls bis zu
50 mal wiederholt. Ein abschließender „Extension"-Schritt von 4–10 Minuten
beendet die Reaktion. Die auf diese Weise hergestellten Polynukleotide
werden auch als Amplifikate bezeichnet; die Begriffe Nukleinsäurefragment
und Nukleinsäuremolekül sind ebenfalls
gebräuchlich.
Weitere
Details und Informationen zur PCR findet der Fachmann im Handbuch
PCR-Strategies (Innnis, Felfand und Sninsky, Academic Press, Inc.,
1995), in PCR Primer – a
laboratory manual, im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis:
A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton
und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland,
1994).
Die
Nukleotidsequenz wird anschließend
beispielsweise nach dem Kettenabbruchverfahren von Sanger et al.
(Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74,
5463-5467 (1977))
mit den von Zimmermann et al. (Nucleic Acids Research 18, 1067pp
(1990)) angegebenen Modifikationen bestimmt und das von dieser Nukleotidsequenz
kodierte Polypeptid insbesondere bezüglich der Aminosäuresequenz
analysiert. Dazu wird die Nukleotidsequenz in ein Programm zur Übersetzung
von DNA-Sequenz in eine Aminosäuresequenz
eingegeben. Geeignete Programme sind beispielsweise das Programm „Patentin", das bei Patentämtern, beispielsweise
dem US-Patentamt (USPTO) erhältlich
ist, oder das „Translate
Tool", das auf dem
ExPASy Proteomics Server im World Wide Web (Gasteiger et al., Nucleic
Acids Research 31, 3784-3788 (2003)) verfügbar ist.
Auf
diese Weise werden Mutanten identifiziert, deren gnd-Allele für Proteine
mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodieren, welche an Position
329 beziehungsweise der entsprechenden oder vergleichbaren Position
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthalten. Bevorzugt wird der Austausch gegen
L-Methionin.
Gegenstand
der Erfindung ist dementsprechend eine Mutante eines coryneformen
Bakteriums, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch folgende Schritte
erhältlich
ist:
- a) Behandlung eines coryneformen Bakteriums,
das die Fähigkeit
besitzt Aminosäuren
auszuscheiden, mit einem mutagenen Agenz,
- b) Isolierung und Vermehrung der in a) erzeugten Mutante,
- c) vorzugsweise Bestimmung der Fähigkeit der Mutante in einem
Medium mindestens 0,5% mehr Aminosäure auszuscheiden oder im Zellinneren
anzureichern als das in a) eingesetzte coryneforme Bakterium,
- d) Bereitstellung von Nukleinsäure aus der in b) erhaltenen
Mutante,
- e) Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion,
der Nukleinsäure
aus d), und eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer
umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus
der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 1210 von SEQ ID NO:3
oder SEQ ID NO:19 und einem zweitem Primer umfassend mindestens
15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz
zwischen Position 1866 und 1214 von SEQ ID NO:3.
- f) Bestimmung der Nukleotidsequenz des in e) erhaltenen Nukleinsäuremoleküls, und
Bestimmung der kodierten Aminosäuresequenz,
- g) gegebenfalls Vergleich der in f) bestimmten Aminosäuresesequenz
mit SEQ ID NO:6 oder 18, und
- h) Identifizierung einer Mutante, die ein Polynukleotid enthält, das
für ein
Polypeptid kodiert, welches an Position 329 oder an vergleichbarer
Position jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin, bevorzugt L-Methionin
enthält.
Die
auf diese Weise erzeugten Mutanten enthalten typischerweise eine
(1) Kopie des beschriebenen gnd Allels.
In
der SEQ ID NO:5 ist beispielhaft die Kodierregion eines gnd-Allels
einer erfindungsgemäßen Mutante
wiedergegeben. Die Kodierregion des Wildtypgens ist als SEQ ID NO:1
wiedergegeben. SEQ ID NO:1 enthält
an Position 985 die Nukleobase Guanin und SEQ ID NO:5 die Nukleobase
Adenin. Durch diese Guanin Adenin Transition entsteht an Position
985 bis 987 das für
die Aminosäure
L-Methionin kodierende ATG Kodon. Darüber hinaus kann die in SEQ
ID NO: 5 dargestellte Nukleotidsequenz weitere Basenaustausche enthalten, die
sich durch die Mutagenesebehandlung ergeben haben, sich jedoch nicht
in einer veränderten
Aminosäuresequenz äußern. Derartige
Mutationen werden in der Fachwelt auch als stille oder neutrale
Mutationen bezeichnet. Diese stillen Mutationen können ebenfalls
in dem für
Mutagenesebehandlung eingesetztem coryneformen Bakterium bereits
enthalten sein. Bei den genannten Basenaustauschen handelt es sich
beispielsweise um einen oder mehreren der Austausche ausgewählt aus
der Gruppe: an der Position 93 Guanin anstelle Cytosin, an der Position
375 Adenin anstelle Guanin, an der Position 510 Adenin anstelle
Guanin, an der Position 612 Guanin anstelle Cytosin, an der Position
786 Guanin anstelle Adenin, an der Position 813 Cytosin anstelle
Thymin, an der Position 1014 Guanin anstelle Thymin, an der Position
1380 Cytosin anstelle Adenin, an der Position 1470 Guanin anstelle
Thymin. In SEQ ID NO:17 ist die Nukleotidsequenz des gnd-Allels einer erfindungsgemäßen Mutante
wiedergegeben, welche insgesamt sechs derartige stille Mutationen
enthält.
Die
Formulierung „an
der Position 510 Adenin anstelle Guanin" – und
vergleichbare Formulierungen – bedeutet,
dass die in der Wildtypsequenz der Kodierregion an Position 510
vorhandene Nukleobase Guanin (Siehe SEQ ID NO:1) durch Adenin ersetzt
worden ist (Siehe SEQ ID NO:17).
Die
für die
Mutagenese verwendeten coryneformen Bakterien besitzen bevorzugt
bereits die Fähigkeit,
die gewünschte
Aminosäure
in das sie umgebende Nährmedium
beziehungsweise Fermentationsbrühe auszuscheiden
oder im Zellinneren anzureichern.
L-Lysin
produzierende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise eine „feed back" resistente beziehungsweise
desensibilisierte Aspartatkinase. Unter „feed back" resistenten Aspartatkinasen versteht
man Aspartatkinasen, die im Vergleich zur Wildform eine geringere
Empfindlichkeit gegenüber
der Hemmung durch Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen
von AEC (Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin allein oder
AEC allein aufweisen. Die für
diese desensibilisierten Aspartatkinasen kodierenden Gene beziehungsweise
Allele werden auch als lysC
FBR-Allele bezeichnet.
Im Stand der Technik (Tabelle 1) sind zahlreiche lysC
FBR-Allele
beschrieben, die für
Aspartatkinase-Varianten kodieren, welche Aminosäureaustausche im Vergleich
zum Wildtypprotein besitzen. Die Kodieregion des Wildtyp lysC-Gens
von Corynebacterium glutamicum entsprechend der Zugangsnummer AX756575
der NCBI Datenbank ist in SEQ ID NO:15 und das von diesem Gen kodierte
Protein in SEQ ID NO:16 dargestellt Tabelle
1 lysC
FBR-Allele kodierend für feed back resistente Aspartatkinasen
L-Lysin
ausscheidende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise einen
oder mehrere der in Tabelle 1 aufgelisteten Aminosäureaustausche.
Bevorzugt
werden folgende lysCFBR-Allele: lysC A279T
(Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID
NO: 16 gegen Threonin), lysC A279V (Austausch von Alanin an Position
279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 16 gegen Valin),
lysC S301F (Austausch von Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID
NO: 16 gegen Phenylalanin), lysC T308I (Austausch von Threonin an
Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID
NO: 16 gegen Isoleucin), lysC S301Y (Austausch von Serin an Position
308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 16 gegen Tyrosin),
lysC G345D (Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID
NO: 16 gegen Asparaginsäure),
lysC R320G (Austausch von Arginin an Position 320 des kodierten
Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID
NO: 16 gegen Glycin), lysC T311I (Austausch von Threonin an Position
311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 16 gegen Isoleucin),
lysC S381F (Austausch von Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID
NO: 16 gegen Phenylalanin), lysC S317A (Austausch von Serin an Position
317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 16 gegen Alanin)
und lysC T380I (Austausch von Threonin an Position 380 des kodierten
Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID
NO: 22 gegen Isoleucin).
Besonders
bevorzugt werden das lysCFBR-Allel lysC
T311I (Austausch von Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID
NO: 16 gegen Isoleucin) und ein lysCFBR-Allel
enthaltend mindestens einen Austausch ausgewählt aus der Gruppe A279T (Austausch
von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins
gemäß SEQ ID
NO: 16 gegen Threonin) und S317A (Austausch von Serin an Position
317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 16 gegen Alanin).
Das
lysCFBR-Allel lysC T311I ist in dem bei
der DSMZ hinterlegten Stamm DM1797 enthalten. DM1797 ist eine Mutante
von Corynebacterium glutamicum ATCC13032.
Nach
der oben beschriebenen Art und Weise wurde, ausgehend von Stamm
DM1797, eine als DM1798 bezeichnete Mutante isoliert, die ein gnd-Allel
enthält,
das für
ein Polypeptid kodiert, bei dem an Position 329 der Aminosäuresequenz
L-Methionin enthalten
ist. Die Nukleotidsequenz des gnd-Allels der Mutante DM1798 ist als SEQ
ID NO:17 und die Aminosäuresequenz
des kodierten Polypeptids als SEQ ID NO:18 dargestellt. Zusätzlich zu
der zum Aminosäureaustausch
an Position 329 der Aminosäuresequenz
des kodierten Polypeptids führenden
Guanin-Adenin Transition an Position 985 der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:5 enthält
das gnd-Allel der Mutante DM1798 folgende stille Mutationen:Guanin-Adenin
Transition an Position 510, Cytosin-Guanin Transversion an Position
612, Adenin-Guanin Transition an Position 786, Thymin-Cytosin Transition
an Position 813 und Thymin-Guanin Transversion an Position 1470.
In
der SEQ ID NO:19 sind die stromaufwärts (upstream) und stromabwärts (downstream)
von SEQ ID NO:17 gelegenen Nukleotidsequenzen mit angegeben.
Darüberhinaus
können
L-Lysin ausscheidende coryneforme Bakterien verwendet werden, die
eine abgeschwächte
Homoserin-Dehydrogenase oder Homoserinkinase aufweisen oder andere
Eigenschaften besitzen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt
sind.
L-Tryptophan
produzierende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise eine „feed back" resistente beziehungsweise
desensibilisierte Anthranilatsynthase. Unter „feed back" resistenter Anthranilatsynthase versteht
man Anthranilatsynthasen, die im Vergleich zur Wildform eine geringere
Empfindlichkeit gegenüber der
Hemmung (5 bis 10%, 10% bis 15% oder 10% bis 20%) durch Tryptophan
oder 5-Fluorotryptophan
(Matsui et al., Journal of Bacteriology 169 (11): 5330–5332(1987))
oder ähnliche
Analoga. aufweisen. Die für
diese desensibilisierten Anthranilatsynthasen kodierenden Gene beziehungsweise
Allele werden auch als trpE
FBR-Allele bezeichnet.
Beispiele für
derartige Mutanten beziehungsweise Allele sind beispielsweise in
der
US 6180373 und
EP0338474 beschrieben.
Die
erhaltenen Mutanten zeigen eine im Vergleich zum eingesetzten Ausgangsstamm
beziehungsweise Elternstamm erhöhte
Ausscheidung beziehungsweise Produktion der gewünschten Aminosäure in einem Fermentationsprozess.
Gegenstand
der Erfindung ist ebenfalls ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position
329 beziehungsweise an einer entsprechenden oder vergleichbaren
Position der Aminosäuresequenz
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthält,
wobei der Austausch gegen L-Methionin bevorzugt ist.
Das
erfindungsgemäße Polynukleotid
kann aus einer erfindungsgemäßen Mutante
isoliert werden.
Weiterhin
können
für die
Mutagenese des gnd-Gens in-vitro Methoden eingesetzt werden. Bei
der Verwendung von in-vitro Methoden werden isolierte Polynukleotide,
welche ein gnd-Gen
eines coryneformen Bakteriums, vorzugsweise das im Stand der Technik
beschriebene Wildtyp-Gen von Corynebacterium glutamicum, enthalten,
einer mutagenen Behandlung unterzogen.
Bei
den isolierten Polynukleotiden kann es sich beispielsweise um isolierte
Gesamt-DNA beziehungsweise chromosomale DNA oder auch um Amplifikate
des gnd-Gens handeln, die mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion
(PCR) hergestellt wurden. Derartige Amplifikate werden auch als
PCR-Produkte bezeichnet; die Begriffe Nukleinsäuremolekül oder Nukleinsäurefragment
sind ebenfalls gebräuchlich.
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide
Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und
bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Deutschland, 1994). Es ist ebenfalls möglich das zu mutagenisierende
gnd-Gen zunächst
in einen Vektor, beispielsweise in einen Bakteriophagen oder ein
Plasmid einzubauen.
Geeignete
Methoden für
die in-vitro Mutagenese sind unter anderem die Behandlung mit Hydroxylamin
nach Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics.
A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related
Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
1992), die Verwendung mutagener Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie
für Einsteiger,
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 und R. M. Horton:
PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology
3, 93–99
(1995)) und der Einsatz einer Polymerasekettenreaktion unter Verwendung
einer DNA Polymerase, die eine hohe Fehlerquote aufweist. Eine derartige
DNA-Polymerase ist beispielsweise die Mutazyme DNA Polymerase (GeneMorph
PCR Mutagenesis Kit, Nr.600550) der Firma Stratagene (LaJolla, CA, USA).
Weitere
Anleitungen und Übersichten
zur Erzeugung von Mutationen in-vivo oder in-vitro können dem Stand
der Technik und bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers
(„Molekulare
Genetik", 6. Auflage,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker
(„Gene
und Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann
(„Allgemeine
Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase Enzymaktivität
kodiert, welches die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:2 umfasst, wobei an Position 329 der Aminosäuresequenz
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthalten ist. Bevorzugt wird der Austausch
gegen L-Methionin.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase Enzymaktivität
kodiert, welches eine Aminosäuresequenz
mit einer Länge
von 492 Aminoäuren
umfasst und wobei an Position 329 jede proteinogene L-Aminosäure ausgenommen
L-Valin, vorzugsweise L-Methionin, enthalten ist.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase Enzymaktivität
kodiert, welches von Position 324 bis 334 der Aminosäuresequenz
die Aminosäuresequenz
entsprechend Position 324 bis 334 von SEQ ID NO:6 enthält. Bevorzugt
enthält die
Aminosäuresequenz
des kodierten Polypeptids eine Aminosäuresequenz entsprechend Position
313 bis 345 von SEQ ID NO:6 oder Position 297 bis 361 von SEQ ID
NO:6 oder Position 281 bis 377 von SEQ ID NO:6 oder Position 265
bis 393 von SEQ ID NO:6 oder Position 201 bis 457 von SEQ ID NO:6
oder Position 72 bis 492 von SEQ ID NO:6 oder Position 2 bis 492
von SEQ ID NO:6. Ganz besonders bevorzugt umfasst die Länge des
kodierten Proteins 492 Aminosäuren.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase Enzymaktivität
kodiert, welches an Position 329 der Aminosäuresequenz beziehungsweise
einer entsprechenden oder vergleichbaren Position jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Valin, bevorzugt L-Methionin, enthält und das eine Nukleotidsequenz
umfasst, welche mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch
ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung
des Primerpaars erhältlich
ist, deren Nukleotidsequenzen jeweils mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen,
die aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 226 von SEQ
ID NO:3 und aus der komplementären
Nukleotidsequenz zwischen Position 1866 und 1703 von SEQ ID NO:3
ausgewählt
werden. Zwei Beispiele für
geeignete Primerpaare sind in SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 und in
SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10 dargestellt. Als Ausgangsmaterial („template") wird chromosomale
DNA coryneformer Bakterien bevorzugt, die insbesondere mit einem
Mutagen behandelt worden sind. Besonders bevorzugt wird die chromosomale
DNA der Gattung Corynebacterium und ganz besonders bevorzugt die
der Art Corynebacterium glutamicum.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das mit
zu SEQ ID NO:5 komplementären
Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert und
für ein
Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert,
welches an Position 329 der Aminosäuresequenz beziehungsweise
einer entsprechenden oder vergleichbaren Position jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Valin, bevorzugt L-Methionin, enthält.
Anleitungen
zur Hybridisierung von Nukleinsäuren
beziehungsweise Polynukleotiden findet der Fachmann unter anderem
im Handbuch "The
DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International
Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). Die Hybridisierung findet
unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet,
bei denen die Sonde d.h. ein Polynukleotid umfassend die zu SEQ
ID NO:5 komplementäre
Nukleotidsequenz und die Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten
Polynukleotide, mindestens 90% identisch sind. Es ist bekannt, dass
die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch
Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration
beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird
im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den
Waschschritten durchgeführt
(Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion
kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5 × SSC-Puffer bei einer Temperatur
von ca. 50°C–68°C eingesetzt
werden. Dabei können
Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 90%
Identität
zur Nukleotidequenz der eingesetzten Sonde aufweisen. Solche Hybride sind
weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen
entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration
auf 2 × SSC
und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter
Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995)
erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C–68°C, ca. 52°C–68°C, ca. 54°C–68°C, ca. 56°C–68°C, ca. 58°C–68°C, ca. 60°C–68°C, ca. 62°C–68°C, ca. 64°C–68°C, ca. 66°C–68°C eingestellt
wird. Temperaturbereiche von ca. 64°C–68°C oder ca. 66°C–68°C werden
bevorzugt. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration
bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2 × SSC oder 0,1 × SSC zu
senken. Gegebenenfalls enthält
der SSC-Puffer Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration
von 0,1%. Durch schrittweise Erhöhung
der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente
isoliert werden, die mindestens 90% oder mindestens 91%, bevorzugt
mindestens 92% oder mindestens 93% oder mindestens 94% oder mindestens
95% oder mindestens 96% und ganz besonders bevorzugt mindestens
97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% Identität zur Sequenz
der eingesetzten Sonde besitzen und für ein Polypeptid mit Phosphogluconat
Dehydrogenase Enzymaktivität
kodieren, welches den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch enthält. Die
Nukleotidsequenz des auf diese Weise erhaltenen Polynukleotids wird
mit bekannten Methoden bestimmt. weitere Anleitungen zur Hybridisierung
sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von
der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog
No. 1603558). Die so erhaltenen Nukleotidsequenzen kodieren für Polypeptide
mit Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität, die mindestens 90% bevorzugt
mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz
besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens
99% identisch sind mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:6
und den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch
enthalten.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position
329 beziehungsweise einer entsprechenden oder vergleichbaren Position
der Aminosäuresequenz
jede Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthält,
wobei der Austausch gegen L-Methionin der Vorzug gegeben wird und
das eine Aminosäuresequenz
umfasst, die außerdem
zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94%
oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97%
oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:6.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, welches an Position
329 beziehungsweise einer entsprechenden oder vergleichbaren Position
der Aminosäuresequenz
jede Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthält,
wobei der Austausch gegen L-Methionin der Vorzug gegeben wird und
das eine Nukleotidsequenz umfasst, die außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt
mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz
besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens
99% identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5.
Darüberhinaus
sind solche isolierte Polynukleotide bevorzugt, die für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodieren, welches an Position
329 der Aminosäuresequenz
beziehungsweise einer entsprechenden oder vergleichbaren Position
jede Aminosäure
ausgenommen L-Valin, bevorzugt L-Methionin, enthält und die mindestens ein Sequenzmotiv
beziehungsweise eine Aminosäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp
und Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala umfasst. Die Bezeichnung „Bra" steht für die Aminosäuren Ile
oder Val, „Aro" für Trp oder
Phe und die Bezeichnung „Ali" für die Aminosäuren Gly
oder Ala.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase Enzymaktivität
kodiert, welches die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:6 umfasst. Gegebenenfalls enthält das kodierte Polypeptid
einen (1) oder mehrere konservative Aminosäuraustausch(e). Bevorzugt enthält das Polypeptid
höchstens
zwei (2), höchstens
drei (3), höchstens
vier (4) oder höchstens
fünf (5)
konservative Aminosäureaustausche.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase Enzymaktivität
kodiert, welches die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:6 einschließlich
einer Verlängerung
am N- oder C-Terminus um mindestens eine (1) Aminosäure umfasst.
Diese Verlängerung
beträgt
nicht mehr als 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 oder 2 Aminosäuren beziehungsweise
Aminosäurereste.
Gegenstand
der Erfindung sind schließlich
auch gnd-Allele, die für
Polypeptid Varianten von SEQ ID NO:6 kodieren, die eine oder mehrere
Insertionen oder Deletionen enthalten. Bevorzugt enthalten diese
maximal 5, maximal 4, maximal 3 oder maximal 2 Insertionen oder
Deletionen von Aminosäuren.
Die Sequenzmotive Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp und Ile-Aro- Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala
werden durch derartige Insertionen/Deletionen vorzugsweise nicht
zerrissen.
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das die
Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:5 umfasst, wobei diese gegebenenfalls zusätzlich einen oder mehrere der
Basenaustausche umfasst ausgewählt
aus der Gruppe: an der Position 93 Guanin anstelle Cytosin, an der
Position 375 Adenin anstelle Guanin, an der Position 510 Adenin
anstelle Guanin, an der Position 612 Guanin anstelle Cytosin, an
der Position 786 Guanin anstelle Adenin, an der Position 813 Cytosin
anstelle Thymin, an der Position 1014 Guanin anstelle Thymin, an
der Position 1380 Cytosin anstelle Adenin, an der Position 1470
Guanin anstelle Thymin.
Gegenstand
der Erfindung ist schließlich
ein isoliertes Polynukleotid enthaltend das gnd-Allel der Mutante
DM1798. Die Nukleotidsequenz ist als SEQ ID NO:17 und die Aminosäuresequenz
des kodierten Polypeptids als SEQ ID NO:18 dargestellt. Zusätzlich zu
der zum Aminosäureaustausch
an Position 329 der Aminosäuresequenz
des kodierten Polypeptids führenden
Guanin-Adenin Transversion an Position 985 der Nukleotidsequenz
gemäß SEQ ID
NO:5 enthält
das gnd-Allel der Mutante DM1798 folgende stille Mutationen:Guanin-Adenin
Transition an Position 510, Cytosin-Guanin Transversion an Position
612, Adenin-Guanin Transition an Position 786, Thymin-Cytosin Transition
an Position 813 und Thymin-Guanin Transversion an Position 1470.
Gegenstand
der Erfindung ist außerdem
ein isoliertes Polynukleotid, das einen Teil der Kodierregion eines
erfindungsgemäßen gnd-Allels
umfasst, wobei das isolierte Polynukleotid in jedem Fall den Teil
der Kodierregion umfasst, der den Aminosäureaustausch an der Position
329 der Aminosäuresequenz
des kodierten Polypeptids enthält.
Insbesondere
ist ein Nukleinsäure-Molekül beziehungsweise
DNA-Fragment umfasst, das für
mindestens eine Aminosäuresequenz
entsprechend Position 313 bis 345 von SEQ ID NO:2, oder das für mindestens eine
Aminosäuresequenz
entsprechend Position 297 bis 361 von SEQ ID NO:2, oder das für mindestens
eine Aminosäuresequenz
entsprechend Position 281 bis 377 von SEQ ID NO:2, oder das für mindestens
eine Aminosäuresequenz
entsprechend Position 265 bis 393 von SEQ ID NO:2, oder das für mindestens
eine Aminosäuresequenz
entsprechend Position 201 bis 457 von SEQ ID NO:2, oder das für mindestens
eine Aminosäuresequenz
entsprechend Position 102 bis 492 von SEQ ID NO:2, oder das für mindestens
eine Aminosäuresequenz
entsprechend Position 72 bis 492 von SEQ ID NO:2 kodiert, beziehungsweise
ein entsprechendes Leseraster beinhaltet, wobei an der Position
entsprechend 329 von SEQ ID NO:2 jede proteinogene Aminsäure ausgenommen
L-Valin, bevorzugt L-Methionin, enthalten ist.
Ein
Beispiel eines erfindungsgemäßen Leserasters
umfassend ein Polynukleotid, das für mindestens die Aminosäuresequenz
von Position 313 bis 345 entsprechend SEQ ID NO:2 kodiert, wobei
an der Position entsprechend 329 der Aminosäuresequenz jede proteinogene
Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthalten ist, ist nachfolgend aufgeführt:
Es
ist ebenfalls als SEQ ID NO:11 dargestellt. Die von diesem Leseraster
kodierte Aminosäuresequenz
ist als SEQ ID NO:12 dargestellt.
Bevorzugt
werden Nukleinsäuremoleküle, die
für mindestens
eine Aminosäuresequenz
entsprechend Position 313 bis 345 von SEQ ID NO:6, oder mindestens
entsprechend Position 297 bis 361 von SEQ ID NO:6, oder mindestens
entsprechend Position 281 bis 377 von SEQ ID NO:6, oder mindestens entsprechend
Position 265 bis 393 von SEQ ID NO:6, oder mindestens entsprechend
Position 201 bis 457 von SEQ ID NO:6, oder mindestens entsprechend
Position 102 bis 492 von SEQ ID NO:6, oder mindestens entsprechend
Position 72 bis 492 von SEQ ID NO:6 kodieren.
Ein
Beispiel eines erfindungsgemäßes Leserasters
umfassend ein Polynukleotid, das für mindestens die Aminosäuresequenz
entprechend Position 313 bis 345 von SEQ ID NO:5 kodiert, ist nachfolgend
aufgeführt:
Es
ist ebenfalls als SEQ ID NO:13 dargestellt. SEQ ID NO:14 zeigt die
von diesem Leseraster kodierte Aminosäuresequenz.
Ganz
besonders bevorzugt werden Nukleinsäuremoleküle, die mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend
Position 937 bis 1035 von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:17, oder mindestens
eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 889 bis 1083 von SEQ
ID NO:5 oder SEQ ID NO:17, oder mindestens eine Nukleotidsequenz
entsprechend Position 841 bis 1131 von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:17,
oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 793
bis 1179 von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:17, oder mindestens eine
Nukleotidsequenz entsprechend Position 601 bis 1372 von SEQ ID NO:5
oder SEQ ID NO:17, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend
Position 304 bis 1476 von SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:17, oder mindestens
eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 214 bis 1476 von SEQ
ID NO:5 oder SEQ ID NO:17 umfassen.
Die
erfindungsgemäßen Leseraster,
wie sie beispielhaft in SEQ ID NO:11 und 13 als Nukleotidsequenz und
in SEQ ID NO:12 und SEQ ID NO:14 als kodierte Aminosäuresequenz gezeigt
sind, können
darüberhinaus eine
oder mehrere Mutationen enthalten, die zu einem oder mehreren konservativen
Aminosäureaustauschen führen. Bevorzugt
führen
die Mutationen zu maximal 4%, zu maximal 2% oder zu maximal 1% konservativen Aminosäureaustauschen.
Weiterhin können
die erfindungsgemäßen Leseraster
eine oder mehrere stille Mutationen enthalten. Bevorzugt enthalten
die erfindungsgemäßen Leseraster
höchstens
4% und besonders bevorzugt höchstens
2% bis höchstens
1% stille Mutationen.
Die
erfindungsgemäßen, isolierten
Polynukleotide können
dazu verwendet werden, um rekombinante Stämme von Mikroorganismen herzustellen,
die im Vergleich zum Ausgangs- beziehungsweise Elternstamm in verbesserter
Weise Aminosäuren
in das sie umgebende Medium abgeben oder im Zellinneren anhäufen.
Eine
verbreitete Methode zum Einbau von Mutationen in Gene coryneformer
Bakterien ist die des Allelaustausches, die auch unter der Bezeichnung „gene replacement" bekannt ist. Bei
diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment, welches die interessierende
Mutation enthält,
in den gewünschten
Stamm eines coryneformen Bakteriums überführt und die Mutation durch
wenigstens zwei Rekombinationsereignisse beziehungsweise „cross
over"-Ereignisse
in das Chromosom des gewünschten
Stammes inkorporiert beziehungsweise die im betreffenden Stamm vorhandene
Sequenz eines Gens gegen die mutierte Sequenz ausgetauscht.
Von
Schwarzer und Pühler
(Bio/Technology 9, 84–87
(1991) wurde diese Methode verwendet um ein lysA-Allel, welches
eine Deletion trug, und um ein lysA-Allel, welches eine Insertion
trug in das Chromosom von C. glutamicum anstelle des Wildtypgens
einzubauen. von Schäfer
et al. (Gene 145, 69–73
(1994)) wurde diese Methode eingesetzt um eine Deletion in das hom-thrB
Operon von C. glutamicum einzubauen. Von Nakagawa et al. (
EP 1108790 ) wurde diese
Methode eingesetzt um verschiedene Mutationen ausgehend von den isolierten
Allelen in das Chromosom von C. glutamicum einzubauen. Auf diese
Weise gelang es Nakagawa et al. eine als Val59Ala bezeichnete Mutation
in das Homoserin-Dehydrogenase
Gen (hom), eine als Thr311I1e bezeichnete Mutation in das Aspartatkinase-Gen
(lysC bzw. ask), eine als Pro458Ser bezeichnete Mutation in das
Pyruvat-Carboxylase-Gen
(pyc) und eine als Ala213Thr bezeichnete Mutzation in das Glucose-6-phoshat-Dehydrogenase
Gen (zwf) von C. glutamicum Stämmen
einzubauen.
Für ein erfindungsgemäßes Verfahren
kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
verwendet werden, welches die gesamte Kodierregion umfasst, wie
beispielsweise in SEQ ID NO:5 gezeigt, oder welches einen Teil der
Kodierregion umfasst, wie beispielsweise die Nukleotidsequenz, die
für mindestens
die Aminosäuresequenz
entsprechend Position 313 bis 345 von SEQ ID NO:6 kodiert und die
als SEQ ID NO:14 dargestellt ist. Der Teil der Kodierregion entsprechend
SEQ ID NO:14 hat eine Länge
von 99 Nukleobasen. Bevorzugt werden solche Teile der Kodierregion,
deren Länge ≥ 195 Nukleobasen
beträgt,
wie beispielsweise Nukleinsäuremoleküle, die
für mindestens
eine Aminosäuresequenz
entsprechend Position von 297 bis 361 von SEQ ID NO:6 oder SEQ ID
NO:18 kodieren. Besonders bevorzugt werden solche Teile der Kodierregion,
deren Länge ≥ 291 Nukleobasen
beträgt,
wie beispielsweise Nukleinsäuremoleküle, die
für mindestens
eine Aminosäuresequenz
entsprechend Position von 281 bis 377 von SEQ ID NO:6 oder SEQ ID
NO:18 kodieren.
Das
DNA-Fragment enthaltend die interessierende Mutation liegt bei dieser
Methode typischerweise in einem Vektor, insbesondere einem Plasmid,
vor, das vorzugsweise von dem mit der Mutation zu versehenden Stamm
nicht oder nur begrenzt repliziert wird. Als Hilfs- oder Zwischenwirt,
in dem der Vektor replizierbar ist, wird im Allgemeinen ein Bakterium
der Gattung Escherichia bevorzugt der Spezies Escherichia coli verwendet.
Beispiele
für derartige
Plasmidvektoren sind die von Schäfer
et al. (Gene 145, 69–73
(1994)) beschriebenen pK*mob und pK*mobsacB Vektoren, wie beispielsweise
pK18mobsacB, und die in der WO 02/070685 und WO 03/014362 beschriebenen
Vektoren. Diese sind in Escherichia coli aber nicht in coryneformen
Bakterien replikativ. Besonders geignet sind Vektoren, die ein konditional
negativ dominant wirkendes Gen wie beispielsweise das sacB-Gen (Levansucrase-Gen)
von beispielsweise Bacillus oder das galK-Gen (Galaktosekinase)
von beispielsweise Escherichia coli enthalten. (Unter einem konditional
negativ dominant wirkenden Gen versteht man ein Gen, das unter bestimmten
Bedingungen nachteilig beispielsweise toxisch für den Wirt ist, unter anderen
Bedingungen aber keine negativen Auswirkungen auf den das Gen tragenden
Wirt hat.) Diese ermöglichen
die Selektion auf Rekombinationsereignisse, bei denen der Vektor
aus dem Chromosom eliminiert wird. Weiterhin wurde von Nakamura
et al. (US-A-6,303,383) ein Temperatur-sensitives Plasmid für coryneforme
Bakterien beschrieben, das lediglich bei Temperaturen unterhalb
von 31°C
replizieren kann.
Der
Vektor wird anschließend
durch Konjugation beispielsweise nach der Methode von Schäfer (Journal
of Bacteriology 172, 1663–1666
(1990)) oder Transformation beispielsweise nach der Methode von
Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) oder der Methode
von Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29,
356–362
(1988)) in das coryneforme Bakterium überführt. Gegebenenfalls kann die Überführung der
DNA auch durch Partikelbeschuss erzielt werden.
Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und
eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"- Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz
erreicht man den Einbau der Mutation und erhält ein rekombinantes Bakterium.
Zur
Identifizierung und Charakterisierung der erhaltenen Stämme können unter
anderem die Methoden der Southern Blotting Hybridisierung, der Polymerase-Kettenreaktion,
der Sequenzbestimmung, die Methode des „Fluorescence Resonance Energy
Transfer" (FRET)
(Lay et al. Clinical Chemistry 43, 2262–2267 (1997)) oder Methoden
der Enzymologie eingesetzt werden.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren
zur Herstellung eines coryneformen Bakteriums, bei dem man
- a) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid in ein coryneformes
Bakterium überführt,
- b) das im Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhandene 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase Gen, das für
eine Aminosäuresequenz
mit L-Valin an Position 329 oder vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz
kodiert, gegen das Polynukleotid aus a) austauscht, das für eine Aminosäuresequenz
kodiert, die an der Position 329 oder einer vergleichbaren Position
der Aminosäuresequenz
eine andere L-Aminosäure,
vorzugsweise L-Methionin besitzt, und
- c) das gemäß Schritt
a) und b) erhaltene coryneforme Bakterium vermehrt.
Auf
diese Weise erhält
man ein rekombinantes coryneformes Bakterium, welches anstelle des
Wildtyp gnd-Gens ein erfindungsgemäßes gnd-Allel enthält.
Ein
weiteres erfindungsgemässes
Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus besteht darin, dass
man
- a) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, das für ein Polypeptid
mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodiert, in einen Mikrorganismus überführt,
- b) das Polynukleotid in dem Mikroorganismus repliziert, und
- c) den gemäß Schritt
a) und b) erhaltenen Mikroorganismus vermehrt.
Auf
diese Weise erhält
man einen rekombinanten Mikroorganismus, welcher mindestens eine
(1) Kopie oder mehrere Kopien eines erfindungsgemäßen Polynukleotids
enthält,
das für
eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, die an Position 329
oder einer vergleichbaren Position der Aminosäuresequenz des kodierten Proteins,
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthält,
wobei der Austausch gegen L-Methionin bevorzugt wird.
Weitere
Gegenstände
der Erfindung sind dementsprechend Wirte beziehungsweise Wirtszellen,
bevorzugt Mikroorganismen besonders bevorzugt coryneforme Bakterien
und Bakterien der Gattung Escherichia, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide
enthalten. Gegenstand der Erfindung sind gleichfalls Mikrorganismen,
die unter Verwendung der isolierten Polynukleotide hergestellt wurden.
Derartige Mikroorganismen oder Bakterien werden auch als rekombinante
Mikroorganismen oder rekombinante Bakterien bezeichnet. In gleicher
Weise sind Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten,
Gegenstand der Erfindung. Schließlich sind Wirte, die diese
Vektoren enthalten, ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die
erfindungsgemäßen, isolierten
Polynukleotide können
weiterhin zur Erzielung einer Überexpression
der von ihnen kodierten Polypeptide verwendet werden.
Unter Überexpression
versteht man allgemein eine Erhöhung
der intrazellulären
Konzentration oder Aktivität
einer Ribonukleinsäure,
eines Proteins oder eines Enzyms. Im Falle der vorliegenden Erfindung
werden gnd-Allele beziehungsweise Polynukleotide überexprimiert,
die für
6-Phosphogluconat
Dehydrogenasen kodieren, die an Position 329 der Aminosäuresequenz
des kodierten Proteins jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Valin enthalten,
wobei der Austausch gegen L-Methionin bevorzugt wird.
Es
ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme – sogenannte Aminopeptidasen – N-terminale
Aminosäuren,
insbesondere das N-terminale Methionin, vom gebildeten Polypeptid
abgespalten werden können.
Die
genannte Erhöhung
der Konzentration oder Aktivität
eines Genproduktes lässt
sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der
entsprechenden Polynukleotide um mindestens eine Kopie erhöht.
Eine
weit verbreitete Methode zur Erhöhung
der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende Gen oder
Allel in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem
coryneformen Bakterium repliziert wird. Geeignete Plasmidvektoren
sind beispielsweise pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology
(1989) 64: 549–554)
oder die von Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)) beschriebenen
pSELF-Vektoren. Ein Übersichtsartikel
zum Thema Plasmide in Corynebacterium glutamicum findet sich bei
Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27–40 (2003)).
Eine
andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Überexpression ist das Verfahren
der chromosomalen Genamplifikation. Bei dieser Methode wird mindestens
eine zusätzliche
Kopie des interessierenden Gens oder Allels in das Chromosom eines
coryneformen Bakteriums eingefügt.
In
einer Ausführungsform,
wie sie beispielsweise bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental
Microbiology 60, 126–132)
für das
hom-thrB-Operon beschrieben ist, wird ein in C. glutamicum nicht-replikatives Plasmid,
welches das interessierende Gen enthält, in ein coryneformes Bakterium überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines „cross over"-Ereignisses enthält der resultierende
Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens beziehungsweise
Allels.
In
einer anderen Ausführungsform,
die in der WO 03/040373 und US-2003-0219881-A1 beschrieben ist,
wird eine oder mehrere Kopie(n) des interessierenden Gens mittels
mindestens zweier Rekombinationsereignisse in einen gewünschten
Ort des Chromosoms von C. glutamicum eingefügt. Auf diese Weise wurde beispielsweise
eine Kopie eins lysC-Allels,
das für
eine L-Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, in das gluB-Gen
von C. glutamicum eingebaut.
In
einer weiteren Ausführungsform,
die in der WO 03/014330. und US-2004-0043458-A1 beschrieben ist,
wird mittels mindestens zweier Rekombinationsereignisse am natürlichen
Ort mindestens eine weitere Kopie, vorzugsweise in tandem-Anordnung zu dem
bereits vorhandenen Gen oder Allel, des interessierenden Gens eingebaut.
Auf diese Weise wurde beispielsweise eine tandem-Duplikation eines
lysCFBR-Allels am natürlichen lysC-Genort erzielt.
Eine
weitere Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht darin,
das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise
(operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette
zu verknüpfen.
Geeignete Promotoren für
Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in dem Übersichtsartikel
von Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1–3), 311–323 (2003) beschrieben. Weiterhin
können
die hinlänglich
bekannten von Amann et al. (Gene 69(2), 301–315 (1988)) und Amann und Brosius
(Gene 40(2–3),
183–190
(1985)) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und
trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise
stromaufwärts
des gnd-Allels, typischerweise im Abstand von ungefähr 1–500 Nukleotiden
vom Startkodon, eines rekombinanten coryneformen Bakteriums eingefügt werden,
welches anstelle der an Position 329 natürlicherweise vorhanden Aminosäure L-Valin
eine andere proteinogene Aminsäure
enthält.
Ein derartiger Promotor kann naturgemäß ebenfalls stromaufwärts des
gnd-Allels einer erfindungsgemäßen Mutante
eingefügt
werden. Es ist weiterhin möglich
ein erfindungsgemäßes isoliertes
Polynukleotid, das für
eine erfindungsgemäße Variante
der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase kodiert, mit einem Promotor
zu verknüpfen
und die erhaltene Expressionseinheit in ein extrachromosomal replizierendes
Plasmid oder in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums einzubauen.
Darüberhinaus
kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle,
die sich stromaufwärts
des Strukturgens befindet, mutiert werden. Durch Maßnahmen
zur Verlängerung
der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls
die Enzymaktivität
verstärkt.
Alternativ kann weiterhin eine Überexpression
des betreffenden Gens oder Allels durch Veränderung der Medienzusammensetzung
und Kulturführung
erreicht werden.
Durch
die Maßnahmen
der Überexpression
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins/Polypeptids im allgemeinen
um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration
des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus beziehungsweise Elternstammes
erhöht.
Unter einem Ausgangs-Mikroorganismus oder Elternstamm versteht man
einen Mikroorganismus, an dem die Massnahmen der Erfindung durchgeführt werden.
Eine
Methode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase ist
bei Moritz et al. (European Journal of Biochemistry 267, 3442–3452 (2000))
beschrieben.
Die
Konzentration des Proteins kann über
1- und 2-dimensionale
Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung
der Proteinkonzentration mit enttprechender Auswertesoftware im
Gel bestimmt werden. Eine gebräuchliche
Methode zur Präparation
der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung
der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712–23 (2001))
beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls
durch Western-Blot-Hybridisierung
mit einem für
das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular
cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)
und anschließender
optischer Auswertung mit ensprechender Software zur Konzentrationsbestimmung
(Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32–39; Lottspeich, Angewandte
Chemie 111: 2630–2647
(1999)) bestimmt werden.
Gegenstand
der Erfindung sind dementsprechend verfahren zur Überexpression
der erfindungsgemäßen 6-Phosphogluconat
Dehydrogenasen. Ein erfindungsgemässes Verfahren zur Überexpression
besteht unter anderem darin, dass man die Kopienzahl eines erfindungsgemässen Polynukleotids,
das für
eine 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Variante kodiert, bei der an
Position 329 oder entsprechenden Position der kodierten Aminosäuresequenz
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthalten ist, um mindestens eine (1) oder um
mehrere Kopien erhöht.
Ein weiteres erfindungsgemässes
Verfahren besteht darin, dass man einen Promotor funktionell mit
dem Polynukleotid verknüpft.
Gegenstand
der Erfindung sind weiterhin Mikroorganismen, die eine erhöhte Konzentration
oder Aktivität
der erfindungsgemäßen 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase Varianten in ihrem Zellinneren aufweisen.
Zusätzlich kann
es für
die verbesserte Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft
sein, in den erfindungsgemäßen Mutanten
oder rekombinanten Stämme
eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse,
der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus,
des Pentosephosphat-Zyklus,
des Aminosäure-Exports
und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren. Die Verwendung
endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.
Unter „endogenen
Genen" oder „endogenen
Nukleotidsequenzen" versteht
man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise
Nukleotidsequenzen oder Allele.
So
kann für
die Herstellung von L-Lysin eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe
- • ein
für ein
Dihydrodipicolinat-Synthase kodierendes Gen dapA, wie beispielsweise
das in der EP 0 197 335 beschriebene
dapA-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
- • ein
für eine
Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierendes Gen zwf, wie beispielsweise
das in der JP-A-09224661 und EP-A-1108790 beschriebene zwf-Gen des
Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
- • die
in der US-2003-0175911-A1 beschriebenen zwf-Allele von Corynebacterium
glutamicum, die für
ein Protein kodieren, bei dem beispielsweise das L-Alanin an Position
243 der Aminosäuresequenz
durch L-Threonin ersetzt ist oder bei dem die L-Asparaginsäure an Position
245 durch L-Serin ersetzt ist,
- • ein
für eine
Pyruvat-Carboxylase kodierendes Gen pyc, wie beispielsweise das
in der DE-A-198 31 609 und EP
1108790 beschriebene pyc-Gen des Wildtyps von Corynbebacterium
glutamicum,
- • das
für das
in der EP 1 108 790 beschriebene
pyc-Allel von Corynebacterium glutamicum, das für ein Protein kodiert, bei
dem L-Prolin an Position 458 der Aminosäuresequenz durch L-Serin ersetzt
ist, und
- • die
in der WO 02/31158 beschriebene pyc-Allele von Corynebacterium glutamicum,
die für
Proteine kodieren, welche gemäß Aspruch
1 einen oder mehrere der Aminosäureaustausche
ausgewählt
aus der Gruppe L-Glutaminsäure an Position
153 ersetzt durch L-Asparaginsäure, L-Alanin
an Position 182 ersetzt durch L-Serin,
L-Alanin an Position 206 ersetzt durch L-Serin, L-Histidin an Position
227 ersetzt durch L-Arginin, L-Alanin
an Position 452 ersetzt durch Glycin und L-Asparaginsäure an Position 1120 ersetzt
durch L-Glutaminsäure tragen
(2A von WO 02/31158 gibt zwei verschiedene
Startpositionen für
die Pyruvat-Carboxylase an, die sich um eine Länge entsprechend 17 Aminosäuren unterscheiden.
Dementsprechend entspricht die Position 153 nach Anspruch 1 von
WO 02/31158 der Position 170 von 2A von
WO 02/31158, die Position 182 nach Anspruch 1 der Position 199 von 2A, die Position 206 nach Anspruch 1 der
Position 223 von 2A, die Position
227 nach Anspruch 1 der Position 244 von 2A,
die Position 452 nach Anspruch 1 der Position 469 von 2A, die Position 1120 nach Anspruch 1
der Position 1137 von 2B. In 2A von WO 02/31158 ist weiterhin ein Aminosäureaustausch
A (Alanin) gegen G (Glycin) an Position 472 angegeben. Die Position
472 des Proteins mit der N-terminalen Sequenz MTA entspricht der
Position 455 des Proteins mit der N-terminalen Sequenz MST gemäß 2A. In 2B von WO
02/31158 ist weiterhin ein Aminosäureaustausch D (Asparaginsäure) gegen
E (Glutaminsäure)
an Position 1133 des Proteins mit dem N-Terminus MTA angegeben.),
- • ein
für eine
Aspartatkinase kodierendes lysC Gen wie beispielsweise das als SEQ
ID NO:281 in der EP-A-1108790 (Siehe auch Zugangsnummer AX120085
und 120365) und das als SEQ ID NO:25 in der WO 01/00843 (Siehe Zugangsnummer
AX063743) beschriebene von lysC-Gen des Wildtyps von Corynebacterium
glutamicum
- • ein
für eine
feed-back resistente Aspartatkinase Variante kodierendes lysCFBR Allel, insbesondere entsprechend Tabelle
1,
- • ein
für ein
Lysin-Export-Protein kodierendes Gen lysE, wie beispielsweise das
in der DE-A-195 48 222 beschriebene lysE-Gen von des Wildtyps Corynebacterium
glutamicum,
- • das
für das
Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 des Wildtyps von Corynebacterium
glutamicum ( US 6,632,644 )
überexprimiert
werden.
Weiterhin
kann es für
die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Verwendung
der erfindungsgemäßen Allele
des gnd-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der endogenen Gene,
ausgewählt
aus der Gruppe
- • ein für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase
kodierendes Gen pgi, wie beispielsweise das in der US 6,586,214 und US 6,465,238 beschriebene pgi-Gen
von Corynebacterium glutamicum,
- • ein
für die
Fructose-1,6-Bisphosphat Aldolase kodierendes Gen fda, wie beispielsweise
das unter der Accession No. X17313 und bei von der Osten et al.
(Molecular Microbiology 3 (11), 1625-1637 (1989)) beschriebene fda-Gen
von Corynebacterium glutamicum,
- • ein
für die
Homoserin-Dehydrogenase kodierendes Gen hom, wie beispielsweise
das in der EP-A-0131171 beschriebene hom-Gen von Corynebacterium
glutamicum,
- • ein
für die
Homoserin-Kinase kodierendes Gen thrB, wie beispielsweise das von
Peoples et al. (Molecular Microbiology 2 (1988): 63–72)) beschriebene
thrB-Gen von Corynebacterium glutamicum und
- • ein
für die
Phosphofruktokinase kodierendes Gen pfkB, wie beispielsweise das
in der WO 01/00844 (Sequenz Nr. 57) beschriebene pfkB-Gen von Corynebacterium
glutamicum,
abzuschwächen
oder auszuschalten.
Der
Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen
schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet,
das für
ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert
bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen
kombiniert.
Durch
die Maßnahmen
der Abschwächung
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins,
beziehungsweise der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
Als
Mutationen zur Erzeugung einer Abschwächung kommen Transitionen,
Transversionen, Insertionen und Deletionen von mindestens einem
(1) Basenpaar bzw. Nukleotid in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des
durch die Mutation hervorgerufenen Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen
(„missense mutations") oder Nichtsinnmutationen
(„nonsense
mutations") gesprochen. Die
Fehlsinnmutation führt
zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen
eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nicht-konservative Aminosäureaustausch
handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins
beeinträchtigt
und auf einen Wert von 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10%
oder 0 bis 5% reduziert. Die Nichtsinnmutation führt zu einem Stop-Kodon im
Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der
Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar
in einem Gen führen
zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass
falsche Aminosäuren
eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als
Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies
ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Deletionen
von mindestens einem (1) oder mehreren Kodonen führen typischerweise ebenfalls
zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität.
Anleitungen
zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können
bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers
(„Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker
(„Gene
und Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann
(„Allgemeine
Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden. Weitere Maßnahmen
sind im Stand der Technik beschrieben.
Die
durch die Massnahmen der Erfindung erhaltenen isolierten coryneformen
Bakterien zeigen eine im Vergleich zum eingesetzten Ausgangsstamm
beziehungsweise Elternstamm erhöhte
intrazelluläre
Bereitstellung von NADPH und/oder eine erhöhte Ausscheidung beziehungsweise
Produktion der gewünschten
Aminosäure
in einem Fermentationsprozess.
Unter
isolierten Bakterien sind die erfindungsgemäßen, isolierten beziehungsweise
erzeugten Mutanten und rekombinanten Bakterien, insbesonders coryneformer
Bakterien, zu verstehen, welche ein gnd-Allel enthalten, das für eine 6-Phosphogluconat
Dehydrogenase kodiert, die den beschriebenen Aminosäureaustausch
an Position 329 der Aminosäuresequenz
enthält.
Die
Leistung der isolierten Bakterien bzw. des Fermentationsprozesses
unter Verwendung derselben bezüglich
eines oder mehrerer der Parameter ausgewählt aus der Gruppe der Produkt-Konzentration
(Produkt pro Volumen), der Produkt-Ausbeute (gebildetes Produkt
pro verbrauchter Kohlenstoff-Quelle) und der Produkt-Bildung (gebildetes
Produkt pro Volumen und Zeit) oder auch anderer Prozess-Parameter und Kombinationen
davon, wird um mindestens 0,5%, mindestens 1%, mindestens 1,5% oder
mindestens 2% bezogen auf den Ausgangstamm bzw. Elternstamm bzw.
den Fermentationsprozess unter Verwendung derselben verbessert.
Die
erfindungsgemäßen, isolierten
coryneformen Bakterien können
kontinuierlich – wie
beispielsweise in der PCT/EP2004/008882 beschrieben- oder diskontinuierlich
im batch – Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated
fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der
Produktion von L-Aminosäuren
kultiviert werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden
ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.
Das
zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium
muß in
geeigneter Weise den Ansprüchen
der jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch „Manual
of Methods for General Bacteriology„ der American Society for
Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Die Begriffe
Kulturmedium und Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind
gegenseitig austauschbar.
Als
Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose,
Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrüben- oder Zuckerrohrherstellung,
Stärke,
Stärkehydrolysat
und Cellulose, Öle
und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnußöl und Kokosfett,
Fettsäuren,
wie zum Beispiel Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische
Säuren,
wie zum Beispiel Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als
Stickstoffquelle können
organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das
Kulturmedium muß weiterhin
Salze beispielsweise in Form von Chloriden oder Sulfaten von Metallen
wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen
enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die
für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich
können
essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin
und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu
den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete
Vorstufen der jeweiligen Aminosäure
zugesetzt werden.
Die
genannten Einsatzstoffe können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
Zur
pH – Kontrolle
der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder
Schwefelsäure
in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen
Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle
der Schaumentwicklung können
Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt
werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in
die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid
angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird
die Fermentation bei Überdruck,
beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die
Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Bei batch-Verfahren
wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum
der gewünschten
Aminosäure
gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden
bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten
möglich.
Methoden
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel
so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung
erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie
bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben.
Gegenstand
der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung
einer L-Aminosäure
bei dem man
- a) ein isoliertes coryneformes
Bakterium in einem geeignetem Medium fermentiert, wobei das Bakterium ein
für ein
Protein mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Enzymaktivität kodierendes
Gen enthält,
wobei in den Aminosäuresequenzen
des Proteins das L-Valin an der Position 329 oder der entsprechenden
Position durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist, und
- b) die L-Aminosäure
in der Fermentationsbrühe
oder in den Zellen des isolierten coryneformen Bakteriums anreichert.
Die
auf diese Weise hergestellte Fermentationsbrühe wird anschließend zu
einem festen oder flüssigen
Produkt weiterverarbeitet.
Unter
einer Fermentationsbrühe
versteht man ein Fermentationsmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse
Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das Fermentationsmedium
beziehungsweise die während
der Fermentation eingesetzten Medium enthält/enthalten sämtliche
Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Vermehrung des
Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten Aminosäure sicherstellt.
Bei
Abschluss der Fermentation enthält
die entstandene Fermentationsbrühe
dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des Mikroorganismus
entstandene Biomasse des Mikroorganismus, b) die im Laufe der Fermentation
gebildete gewünschte
Aminosäure,
c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte
und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile
des/der eingesetzten Fermentationsmediums/Fermentationsmedien beziehungsweise
der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin, Aminosäuren wie
Homoserin oder Salze wie Magnesiumsulfat.
Zu
den organischen Nebenprodukte gehören Stoffe, die von den bei
der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben
der jeweiligen erwünschten
L-Aminosäure erzeugt
und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu zählen L-Aminosäuren, die
im Vergleich zur erwünschten
Aminosäure
weniger als 30%, 20% oder 10% ausmachen. Hierzu gehören weiterhin
organische Säuren,
die ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Apfelsäure oder
Fumarsäure. Schließlich gehören dazu
auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.
Typische
für industrielle
Zwecke geeignete Fermentationsbrühen
haben einen Aminosäuregehalt
von 40 g/kg bis 180 g/kg oder 50 g/kg bis 150 g/kg. Der Gehalt an
Biomasse (als getrocknete Biomasse) beträgt im Allgemeinen 20 bis 50
g/kg.
Im
Falle der Aminosäure
L-Lysin sind im Stand der Technik im wesentlichen vier verschiedene
Produktformen bekannt.
Eine
Gruppe L-Lysin haltiger Produkte umfasst konzentrierte, wässrige,
alkalische Lösungen
von aufgereinigtem L-Lysin (EP-B-0534865). Eine weitere Gruppe,
wie beispielsweise in der
US
6,340,486 und
US 6,465,025 beschrieben,
umfasst wässrige,
saure, Biomasse-haltige Konzentrate von L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühen. Die
bekannteste Gruppe fester Produkte umfasst pulverförmige oder
kristalline Formen von aufgereinigtem beziehungsweise reinem L-Lysin,
das typischerweise in Form eines Salzes wie zum Beispiel L-Lysin-Monohydrochlorid
vorliegt. Eine weitere Gruppe fester Produktformen ist beispielsweise
in der EP-B-0533039 beschrieben. Die dort beschriebene Produktform
enthält
neben L-Lysin den größten Teil
der während
der fermentativen Herstellung verwendeten und nicht verbrauchten
Einsatzstoffe und gegebenfalls die Biomasse des eingesetzten Mikroorganismus
mit einem Anteil von >0%–100%.
Entsprechend
der verschiedenen Produktformen kennt man verschiedenste Verfahren,
bei denen die L-Aminosäure
aus der Fermentationsbrühe
gesammelt, isoliert oder gereinigt wird, um das L-Aminosäure haltige
Produkt oder die gereinigte L-Aminosäure herzustellen.
Zur
Herstellung von festen, reinen L-Aminosäuren werden im wesentlichen
Methoden der Ionenaustauschchromatographie gegebenfalls unter Verwendung
von Aktivkohle und Methoden der Kristallinierung angewendet. Im
Falle des Lysin erhält
man auf diese Weise die entsprechende Base oder ein entsprechendes Salz
wie beispielsweise das Monohydrochlorid (Lys-HCl) oder das Lysinsulfat
(Lys2-H2SO4).
Im
Falle des Lysin ist in der EP-B-0534865 ein Verfahren zur Herstellung
wässriger,
basischer L-Lysin haltiger Lösungen
aus Fermentationsbrühen
beschrieben. Bei dem dort beschriebenen Verfahren wird die Biomasse
aus der Fermentationsbrühe
abgetrennt und verworfen. Mittels einer Base wie beispielsweise
Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid wird ein pH-Wert zwischen
9 bis 11 eingestellt. Die mineralischen Bestandteile (anorganischen Salze)
werden nach Konzentrierung und Abkühlung durch Kristallisation
aus der Brühe
abgetrennt und entweder als Dünger
verwendet oder verworfen.
Bei
Verfahren zur Herstellung von Lysin unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bakterien
werden solche Verfahren bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden,
die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten. Diese werden
insbesondere als Tierfuttermitteladditive verwendet.
Je
nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden
wie z.B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder
einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt
oder vollständig
in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse beziehungsweise
die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes
inaktiviert beispielsweise durch thermische Behandlung (Erhitzen)
oder durch Säurezugabe.
In
einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt,
sodass keine (0 %) oder höchstens
30%, höchstens
20%, höchstens
10%, höchstens
5%, höchstens
1% oder höchstens 0,1%
Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer weiteren Verfahrensweise
wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt, sodass
sämtliche
(100%) oder mehr als 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder 99,9% Biomasse
im hergestellten Produkt verbleibt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren
wird dementsprechend die Biomasse in Anteilen ≥ 0% bis ≤ 100% entfernt.
Schließlich kann
die nach der Fermentation erhaltene Fermentationsbrühe vor oder
nach der vollständigen
oder teilweisen Entfernung der Biomasse mit einer anorganischen
Säure wie
beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder
Phosphorsäure
oder organischen Säure
wie beispielsweise Propionsäure
auf einen sauren pH Wert gestellt werden (GB 1,439,728 oder
EP 1 331 220 ). Es ist gleichfalls
möglich
die Fermentationsbrühe
mit der vollständig
enthaltenen Biomasse anzusäuern.
Schließlich
kann die Brühe
auch durch Zusatz von Natriumbisulfit (NaHSO
3,
GB 1,439,728 ) oder einem
anderen Salz beispielsweise Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalz
der schwefligen Säure
stabilisiert werden.
Bei
der Abtrennung der Biomasse werden gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene
organische oder anorganische Feststoffe teilweise oder ganz entfernt.
Die in der Fermentationsbrühe
gelösten organischen
Nebenprodukte und die gelösten
nicht verbrauchten Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe)
bleiben mindestens teilweise (> 0%),
bevorzugt zu mindestens 25%, besonders bevorzugt zu mindestens 50%
und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75% im Produkt. Gegebenenfalls
bleiben diese auch vollständig
(100%) oder nahezu vollständig
das heißt > 95% oder > 98% im Produkt. In
diesem Sinne bedeutet der Begriff „Fermentationsbrühebasis", dass ein Produkt
mindestens einen Teil der Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält.
Anschließend wird
der Brühe
mit bekannten Methoden wie z.B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers,
Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose oder durch Nanofiltration
Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt oder konzentriert. Diese
aufkonzentrierte Fermentationsbrühe
kann anschließend
durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation
oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden
Wirbelschicht gemäß PCT/EP2004/006655
beschrieben, zu rieselfähigen
Produkten insbesondere zu einem feinteiligen Pulver oder vorzugsweise
grobkörnigem
Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls wird aus dem erhaltenen
Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein gewünschtes
Produkt isoliert.
Es
ist ebenfalls möglich,
die Fermentationsbrühe
direkt d. h. ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung
oder Sprühgranulation
zu trocknen.
Unter „rieselfähig" versteht man Pulver,
die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen Auslauföffnungen
mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5
mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Öle, Fette,
Wachse 94, 12 (1968)).
Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem
Anteil (> 50 %) einer
Korngröße von 20
bis 200 μm Durchmesser
gemeint.
Mit „grobkörnig" ist ein Produkt
mit einem überwiegendem
Anteil (> 50 %) einer
Korngröße von 200 bis
2000 μm
Durchmesser gemeint.
Die
Korngrößenbestimmung
kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden.
Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur „Teilchengrößenmessung
in der Laborpraxis" von
R. H. Müller
und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart
(1996) oder im Lehrbuch „Introduction
to Particle Technology" von
M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons
(1998) beschrieben.
Das
rieselfähige,
feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder
Granulier-Verfahren in ein grobkörniges,
gut rieselfähiges,
lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.
Der
Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt
lediglich geringe Anteile (< 5
%) an Körngrößen unter 100 μm Durchmesser
enthält.
„Lagerbar", im Sinne dieser
Erfindung, bedeutet ein Produkt, das mindestens ein (1) Jahr oder
länger, bevorzugt
mindestens 1,5 Jahre oder länger,
besonders bevorzugt zwei (2) Jahre oder länger in trockener und kühler Umgebung
gelagert werden kann ohne das ein wesentlicher Verlust (< 5%) der jeweiligen
Aminosäure auftritt.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren
zur Herstellung eines L-Aminosäure,
bevorzugt L-Lysin oder L-Tryptophan, haltigen Produktes, bevorzugt
Tierfuttermittel-Additivs, aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die
Schritte
- a) Kultivierung und Fermentation eines
L-Aminosäure
ausscheidenden coryneformen Bakteriums, welches mindestens ein gnd-Allel
enthält,
das für
ein Polypeptid mit 6-Phosphogluconat Dehydrogenase Aktivität kodiert,
welches eine Aminosäuresequenz
umfasst, bei der an Position 329 oder der vergleichbaren Position
jede proteinogene Aminosäure
ausgenommen L-Valin enthalten ist, in einem Fermentationsmedium,
- b) Entfernung der während
der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100
Gew.-%, und
- c) Trocknung der gemäß a) und/oder
b) erhaltenen Fermentationsbrühe,
um das Produkt in der gewünschten
Pulver- oder Granulatform zu erhalten
wobei gegebenenfalls
vor Schritt b) oder c) eine Säure
ausgewählt
aus der Gruppe Schwefelsäure,
Phosphorsäure
oder Salzsäure
hinzugefügt
wird.
Vorzugsweise
wird im Anschluss an Schritt a) oder b) Wasser aus der L-Aminosäure haltigen
Fermentationsbrühe
entfernt (Aufkonzentration).
Vorteilhaft
bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen
organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie
Stärke,
Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise
in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-,
oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen
wie zum Beispiel Kieselsäuren,
Silikaten (
EP0743016A )
Stearaten.
Weiterhin
ist es vorteilhaft die Oberfläche
der erhaltenen Granulate mit Ölen
zu versehen so wie es in der WO 04/054381 beschrieben ist. Als Öle können Mineralöle, pflanzliche Öle oder
Mischungen pflanzlicher Öle
verwendet werden. Beispiele für
derartige Öle
sind Sojaöl,
Olivenöl,
Sojaöl/Lecithingemische.
In gleicher Weise sind auch Silikonöle, Polyethylenglykole oder
Hydroxyethycellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflächen mit
den genannten Ölen
erzielt man eine erhöhte
Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils.
Der Gehalt an Öl
im Produkt beträgt
0,02 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz besonders
bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs.
Bevorzugt
sind Produkte mit einem Anteil von ≥ 97 Gew.-% einer Korngröße von 100
bis 1800 μm
oder einem Anteil von ≥ 95
Gew.-% einer Korngröße von 300
bis 1800 μm
Durchmesser. Der Anteil an Staub d. h. Partikeln mit einer Korngrösse < 100 μm liegt bevorzugt
bei > 0 bis 1 Gew.-
besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%.
Alternativ
kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung
bekannten und üblichen
organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate,
Schrote, Kleien, Mehle, Stärken
Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln
vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren
hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132
(1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Schließlich kann
das Produkt auch durch Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise
Metallcarbonate, Kieselsäuren,
Silikate, Alginate, Stearate, Stärken,
Gummis und Celluloseether, wie in der DE-C-4100920 beschrieben,
in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der
Verdauung durch Tiermägen
insbesondere dem Magen von Wiederkäuern ist.
Zur
Einstellung einer gewünschten
Aminosäurekonzentration
im Produkt kann je nach Anforderung die entsprechende Aminosäure während des
Verfahrens in Form eines Konzentrates oder gebenenfalls einer weitgehend
reinen Substanz beziehungsweise dessen Salz in flüssiger oder
fester Form hinzugefügt
werden. Diese können
einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder auf konzentrierten
Fermentationsbrühe,
oder auch während
des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden.
Im
Falle des Lysin wird bei der Herstellung Lysin-haltiger Produkte
das Verhältnis
der Ionen so eingestellt, dass das Ionenverhältnis entsprechend nachstehender
Formel 2 × [SO
4 2–] + [Cl
–] – [NH
4 +] – [Na
+] – [K
+] – 2 × [Mg
+] – 2 × [Ca
2+]/[L-Lys] 0,68 bis 0,95, bevorzugt 0,68
bis 0,90 ergibt so wie von Kushiki et al. in der
US 20030152633 beschrieben.
Im
Falle des Lysin hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt
auf Fermentationsbrühebasis einen
Lysingehalt (als Lysinbase) von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-% oder 20
Gew.-% bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 Gew.-% bis 70 Gew.-% und ganz
besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 70 Gew.-% bezogen auf die
Trockenmasse des Produkts. Maximale Gehalte an Lysinbase von 71
Gew.-%, 72 Gew.-%, 73 Gew.-% sind ebenfalls möglich.
Im
Falle einer elektrisch neutralen Aminosäure wie dem L-Tryptophan hat das
auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis
einen Aminosäuregehalt von
mindestens 5 Gew.-%, 10 Gew.-%, 20 Gew.-%, 30 Gew.-% und maximal
50 Gew.-%, 60 Gew.-%, 70 Gew.-%, 80 Gew.-%, 90 Gew.-% oder bis 95
Gew.-%.
Der
Wassergehalt des festen Produktes beträgt bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt
bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt weniger als 3 Gew.-%.
Eine
Mutante von Corynebacterium glutamicum mit der Bezeichnung DM1797,
die den Aminosäureaustausch
lysC T311I in der Aspartatkinase enthält, wurde am 28. Oktober 2004
bei der Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)
als DSM 16833 hinterlegt.
Die
erfindungsgemäße Mutante
Corynebacterium glutamicum DM1798, die den Aminosäureaustausch
gnd V329M enthält,
wurde am 28. Oktober 2004 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 16834 hinterlegt.
