CN106754807B

CN106754807B - 生产l-亮氨酸菌株和生产l-亮氨酸的方法

Info

Publication number: CN106754807B
Application number: CN201611248621.7A
Authority: CN
Inventors: 常静; 胡丹; 程江红; 刁刘洋; 毛贤军
Original assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Current assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: CN106754807A

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及生产L‑亮氨酸菌株和生产L‑亮氨酸的方法。本发明以紫外线和亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌进行诱变，获得了两个有利于L‑亮氨酸产生的关键突变leuA^G561D和ilvB^G235S，研究表明，leuA^G561D和/或ilvB^G235S突变条件下，L‑亮氨酸的合成途径中的反馈抑制被解除，L‑亮氨酸的产量得到大幅提高，获得了能够大量产生L‑亮氨酸的菌株，保藏编号为CGMCC NO.13408，该菌株能够实现发酵过程中L‑亮氨酸的高效积累，L‑亮氨酸可达4.7g/L。

Description

生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法。

背景技术

L-亮氨酸即α-氨基-γ-甲基戊酸或α-氨基异己酸，属于支链氨基酸，是人体必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸是亮氨酸的左旋体，在医药、食品、化妆品、及饲料等行业中具有非常广泛的应用。

在L-亮氨酸的生产中常用提取法、化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法以其环保、条件温和、质量稳定等优点成为L-亮氨酸生产的主要方法。在L-亮氨酸生产行业中日本企业占主导地位，尤其是日本味之素公司，其在亮氨酸生产中具有非常明显的优势。

目前，随着生物学的不断发展进步，L-亮氨酸在棒杆菌属中的生物合成途径及其调控机制已掌握清楚。谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13869基因组测序的完成及谷氨酸棒杆菌基因操作技术的不断完善，使得通过基因工程手段对谷氨酸棒杆菌进行改造成为现实。研究表明，在L-亮氨酸的合成途径中，存在多个关键酶，其中，leuA编码α-异丙基苹果酸合酶，催化α-酮异戊酸合成α-异丙基苹果酸，是L-亮氨酸合成途径的关键酶，受终产物L-亮氨酸的反馈抑制。ilvBN编码乙酰羟酸合酶，受L-亮氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸的反馈抑制，其中ilvB编码乙酰羟酸合酶的大亚基，起催化作用。解除反馈抑制有助于提高L-亮氨酸等支链氨基酸的产量。现有的亮氨酸生物合成菌株和方法已经逐渐不能满足日益加大的市场需求，因此，利用生物工程方法，进一步开发能够大量生成亮氨酸的菌株和生产方法成为了研究的热点。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法，本发明提供的菌株产亮氨酸的量可达4.7g/L。

本发明提供了突变的leuA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了编码突变的leuA蛋白的DNA分子。

编码突变的leuA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了突变的ilvB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明提供了编码突变的ilvB蛋白的DNA分子。

编码突变的ilvB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

所述突变是指遗传物质发生改变，其可为点突变或片段突变。具体为氨基酸或碱基的添加、缺失或替换。其为紫外诱变后以亚硝基胍诱变获得。紫外诱变的条件为紫外15W，30cm，20分钟；亚硝基胍诱变的条件为0.5mg/mL，33℃，30分钟；诱变后，筛选对4-氮杂亮氨酸最具有抗性的突变菌株。培养基中，4-氮杂亮氨酸的浓度为1g/L。

含有1g/L的4-氮杂亮氨酸琼脂板基本培养基中还包括：葡萄糖20g/L、(NH4)₂SO₄2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、CaCl₂·2H₂O 0.01g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、Na₂HPO₄·12H₂O1.5g/L、生物素0.02mg/L、维生素B1 0.02mg/L、ZnSO₄ 0.01g/L、MnSO₄ 0.01g/L、KH₂PO₄1.5g/L、琼脂18g/L。pH值为7.0～7.3。

leuA编码α-异丙基苹果酸合酶，催化α-酮异戊酸合成α-异丙基苹果酸，是L-亮氨酸合成途径的关键酶。本发明中leuA蛋白的突变是指在野生型leuA蛋白的氨基酸序列中发生突变，具体的：突变的leuA蛋白为，天冬氨酸取代野生型leuA蛋白的序列中561位的甘氨酸。实验表明，leuA蛋白中发生G561D突变后，L-亮氨酸合成途径中的反馈机制得到解除，L-亮氨酸的产量得到提高。

ilvBN编码乙酰羟酸合酶，受L-亮氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸的反馈抑制，其中ilvB编码乙酰羟酸合酶的大亚基，起催化作用。本发明中ilvB蛋白的突变是指在野生型ilvB蛋白的氨基酸序列中发生突变，具体的：突变的ilvB蛋白为，丝氨酸取代野生型ilvB蛋白的序列中235位的甘氨酸。实验表明，ilvB蛋白中发生G235S突变后，L-亮氨酸合成途径中的反馈机制得到解除，L-亮氨酸的产量得到提高。

本发明提供了一种重组菌株，其表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子。

这一重组菌株的起始菌株为谷氨酸棒杆菌。

表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子的重组菌株在生产L-亮氨酸中的应用。

该菌株的构建方法为：以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子，构建入质粒载体后，电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌株。

所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13869；其感受态细胞的获得方式参照谷棒经典方法。

获得起始表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子的方法为：

采用SEQ ID NO:5～6所示引物对和SEQ ID NO:7～8所示引物对分别对谷氨酸棒杆菌ATCC13869的基因组DNA进行扩增，获得上游片段(leuA-up)和下游片段(leuA-dn)；

以leuA-up、leuA-dn两片段混合物为模板，以SEQ ID NO:5所示引物和SEQ ID NO:8所示引物进行扩增，获得起始表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子(SEQ ID NO:2)。

所述质粒载体为pK18mobsacB。所述构建入质粒载体的酶切位点为XbaI、SalI。构得载体记为pK18mobsacB-leuA^G561D。

表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子的重组菌株获得后，参照谷棒经典方法制备其感受态细胞。

本发明提供了一种重组菌株，其表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子。

其起始菌株为谷氨酸棒杆菌。

本发明提供的重组菌株在生产L-亮氨酸中的应用。

该菌株的构建方法为：以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子，构建入质粒载体后，电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌株。

获得起始表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子的方法为：

采用SEQ ID NO:9～10所示引物对和SEQ ID NO:11～12所示引物对分别对谷氨酸棒杆菌ATCC13869的基因组DNA进行扩增，获得上游片段(ilvB-up)和下游片段(ilvB-dn)；

以ilvB-up、ilvB-dn两片段混合物为模板，以SEQ ID NO:9所示引物和SEQ ID NO:12所示引物进行扩增，获得起始表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子(SEQ ID NO:4)。

所述质粒载体为pK18mobsacB。所述构建入质粒载体的酶切位点为XbaI、SalI。构得载体记为pK18mobsacB-ilvB^G235S。

表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子的重组菌株获得后，参照谷棒经典方法制备其感受态细胞。

本发明提供了一种重组菌株，其表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子，且表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子。

其起始菌株为谷氨酸棒杆菌。

本发明提供的重组菌株在生产L-亮氨酸中的应用。

该菌株的构建方法为：

以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子，构建入质粒载体，电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌，获得leuA^G561D重组菌株；

所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13869；感受态细胞的获得方式参照谷棒经典方法。

以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子，构建入质粒载体，电穿孔法转化入leuA^G561D重组菌株，获得ilvB^G235S突变和leuA^G561D突变的重组菌株。

或者：以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的ilvB蛋白的DNA分子，构建入质粒载体，电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌，获得ilvB^G235S重组菌株；

以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，拼接PCR获得起始表达编码突变的leuA蛋白的DNA分子，构建入质粒载体，电穿孔法转化入ilvB^G235S重组菌株，获得ilvB^G235S突变和leuA^G561D突变的重组菌株。

其起始菌株为谷氨酸棒杆菌，优选为谷氨酸棒杆菌ATCC13869。

优选的，本发明提供的重组菌株的保藏编号为CGMCC NO.13408。

本发明提供的重组菌株在生产L-亮氨酸中的应用。

上述菌株的投建方法中，电穿孔转化后，细胞经过选择培养基培养和普通液体脑心浸液培养，获得重组菌株。

所述选择性培养基中，含有浓度为15mg/L的卡那霉素；培养的温度为33℃，倒置培养。所述普通液体脑心浸液培养的培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。

在选择培养基培养的过程中，突变基因由于同源性被插入到染色体中。液体脑心浸液培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。

普通液体脑心浸液培养后，将培养物做连续梯度稀释(10^-2连续稀释至10^-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h，获得目的重组菌株

蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，鉴定重组菌株。

本发明还提供了一种生产L-亮氨酸的方法，发酵本发明提供的重组菌株。

本发明中，发酵的温度为33℃、摇床110rpm，发酵培养基包括水和：

本发明中，发酵前还经过活化的步骤。

所述活化的培养基包括水和：

活化后种子液的接种量为10％。

本发明以紫外线和亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌进行诱变，获得了两个有利于L-亮氨酸产生的关键突变leuA^G561D和ilvB^G235S，研究表明，leuA^G561D和/或ilvB^G235S突变条件下，L-亮氨酸的合成途径中的反馈抑制被解除，L-亮氨酸的产量得到大幅提高，获得了能够大量产生L-亮氨酸的菌株，保藏编号为CGMCC NO.13408，该菌株能够实现发酵过程中L-亮氨酸的高效积累，L-亮氨酸可达4.7g/L。

生物保藏说明

生物材料MHZ-1200-5，分类命名：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.13408。

具体实施方式

本发明提供了生产L-亮氨酸菌株和生产L-亮氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

本发明中涉及的基因名称解释如下：

leuA：α-异丙基苹果酸合酶；

ilvB：乙酰羟酸合酶大亚基；

以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示：

表1、引物序列信息

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1:制备具有亮氨酸类似物4-氮杂亮氨酸抗性的突变菌株

ATCC13869菌株先用紫外15W，30cm，20分钟进行常规诱变处理，再用亚硝基胍(0.5mg/m L，33℃，30分钟)进行常规的诱变处理，然后涂布在含有1g/L的4-氮杂亮氨酸琼脂板基本培养基(葡萄糖20g/L、(NH4)₂SO₄ 2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、CaCl₂·2H₂O0.01g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 1.5g/L、生物素0.02mg/L、维生素B10.02mg/L、ZnSO4 0.01g/L、MnSO₄ 0.01g/L、KH₂PO₄1.5g/L、琼脂18g/L，pH 7.0-7.3)，在33℃静置2-6天后，挑选对4-氮杂亮氨酸最具有抗性的突变菌株MHZ-1200-1。

将获得的MHZ-1200-1在脑心浸液固体培养基上活化，33℃培养16-20h；将菌体从平板上刮下一环，接种于30mL的种子培养基中(葡萄糖20g/L、尿素5g/L、酵母粉10g/L、MgSO₄·7H₂O 1.0g/L、豆粕水解液10g/L、HCl调pH4.0)，33℃转速110rpm培养5-8h，OD₅₆₂控制在1；2mL种子液转接到20mL的发酵培养基(葡萄糖60g/L、(NH4)₂SO₄25g/L、KH₂PO₄2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 1.0g/L、豆粕水解液10g/L、CaCO₃30g/L、NaOH调pH7.0)，往复摇床33℃、110rpm发酵培养直至残糖耗尽，测MHZ-1200-1发酵产L-亮氨酸结果见表2。

表2、诱变菌株的L-亮氨酸生产

组别	菌株	OD562	L-亮氨酸(g/L)
				对照组	ATCC13869	54.7	0.05
实验组	MHZ-1200-1	50.6	3.8

由表1可知，ATCC13869菌株发酵不产L-亮氨酸，诱变菌株MHZ-1200-1产L-亮氨酸，从无到有具有显著进步。利用比较基因组学分析诱变菌株MHZ-1200-1，发现其具有两个关键突变leuA^G561D和ilvB^G235S发生。在L-亮氨酸的合成途径中，leuA编码α-异丙基苹果酸合酶，催化α-酮异戊酸合成α-异丙基苹果酸，是L-亮氨酸合成途径的关键酶，受终产物L-亮氨酸的反馈抑制。ilvBN编码乙酰羟酸合酶，受L-亮氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸的反馈抑制，其中ilvB编码乙酰羟酸合酶的大亚基，起催化作用。这两个位点的突变可能有助于解除了L-亮氨酸的合成途径中反馈抑制。

实施例2：重组质粒pK18mobsacB-leuA^G561D的构建及在ATCC13869菌株中引leuA^G561D突变

以ATCC13869基因组为模板，用leuA-1f/leuA-1r引物对进行PCR扩增，得到上游片段leuA-up；以ATCC13869基因组为模板，用leuA-2f/leuA-2r引物对进行PCR扩增，得到下游片段leuA-dn。以leuA-up、leuA-dn两片段的混合物为模板，leuA-1f/leuA-2r引物对进行PCR扩增获得leuA^G561D突变目的片段。leuA^G561D突变目的片段与pK18mobsacB载体用XbaI、SalI进行双酶切。将两个酶切产物以T4 DNA Ligase连接1h，连接产物转化Trans1 T1感受态细胞，得到重组质粒pK18mobsacB-leuA^G561D。

按照C.glutamicum Handbook，Charpter 23中的方法制备ATCC13869感受态，用电穿孔法将重组质粒pK18mobsacB-leuA^G561D转化到该感受态细胞中，在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选一次重组转化子，并将筛得的转化子在普通液体脑心浸液培养基过夜培养，培养条件为33℃、220rpm振荡培养。在此培养的过程中，一次重组转化子发生二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。连续梯度稀释培养物10^-2至10^-4，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃倒置培养48h。此时，在蔗糖培养基上生长的菌株基因组中不携带插入载体序列。利用Pid-leuA^G561D/leuA-2r两个引物PCR扩增及核苷酸测序分析，获得leuA^G561D突变菌株，命名MHZ-1200-2，按实施例1中方法发酵测产酸，结果见表3。

表3、leuA^G561D突变菌株的L-亮氨酸生产

组别	菌株	OD562	L-亮氨酸(g/L)
				对照组	ATCC13869	57.3	0.08
实验组	MHZ-1200-2	53.3	2.3

由表3可知，ATCC13869菌株发酵不产L-亮氨酸，leuA^G561D突变菌株具有生产L-亮氨酸的能力，leuA^G561D突变有助于解除L-亮氨酸合成途径中的反馈抑制。

实施例3：重组质粒pK18mobsacB-ilvB^G235S的构建及在ATCC13869菌株中引ilvB^G235S突变

以ATCC13869基因组为模板，用ilvB-1f/ilvB-1r引物对进行PCR扩增，得到上游片段ilvB-up；ATCC13869基因组为模板，用ilvB-2f/ilvB-2r引物对进行PCR扩增，得到下游片段ilvB-dn。以ilvB-up、ilvB-dn两片段的混合物为模板，ilvB-1f/ilvB-2r引物对进行PCR扩增获得ilvB^G235S突变目的片段。ilvB^G561D突变目的片段与pK18mobsacB载体用XbaI、SalI进行双酶切。将两个酶切产物以T4 DNA Ligase连接1h，连接产物转化Trans1 T1感受态细胞，得到重组质粒pK18mobsacB-ilvB^G235S。

按照C.glutamicum Handbook，Charpter 23中的方法制备ATCC13869感受态，用电穿孔法将重组质粒pK18mobsacB-ilvB^G235S转化该感受态细胞，在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选一次重组转化子，并将筛得的转化子在普通液体脑心浸液培养基过夜培养，培养条件为33℃、220rpm振荡培养。在此培养的过程中，一次重组转化子发生二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。连续梯度稀释培养物10^-2至10^-4，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃倒置培养48h。此时，在蔗糖培养基上生长的菌株基因组中不携带插入载体序列。利用Pid-ilvB^G235S/ilvB-2r两个引物PCR扩增及核苷酸测序分析，获得ilvB^G235S突变菌株，命名MHZ-1200-3，按实施例1中方法发酵测产酸，结果见表4。

表4、ilvB^G235S突变菌株的L-亮氨酸及支链氨基酸生产

组别	菌株	OD562	L-亮氨酸(g/L)	L-异亮氨酸(g/L)	L-缬氨酸(g/L)
						对照组	ATCC13869	54.3	0.1	0.05	0.08
实验组	MHZ-1200-3	52.4	2.1	1.7	1.9

由表4可知，ATCC13869菌株发酵不产支链氨基酸L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸，经过改造后的ilvB^G235S突变菌株可产支链氨基酸L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸，从无到有，具有非常显著的进步，ilvB^G235S突变有助于解除支链氨基酸合成途径中的反馈抑制。

实施例4：在MHZ-1200-2中引ilvB^G235S突变

按照C.glutamicum Handbook，Charpter 23中的方法制备MHZ-1200-2感受态，用电穿孔法将重组质粒pK18mobsacB-ilvB^G235S转化该感受态细胞，在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选一次重组转化子，并将筛得的转化子在普通液体脑心浸液培养基过夜培养，培养条件为33℃、220rpm振荡培养。在此培养的过程中，一次重组转化子发生二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。连续梯度稀释培养物10^-2至10^-4，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃倒置培养48h。此时，在蔗糖培养基上生长的菌株基因组中不携带插入载体序列。利用Pid-ilvB^G235S/ilvB-2r两个引物PCR扩增及核苷酸测序分析，获得ilvB^G235S突变菌株，命名MHZ-1200-5，按实施例1中方法发酵测产酸，结果见表5。

表5、leuA^G561D突变和ilvB^G235S突变菌株的L-亮氨酸生产

由表5可知，leuA^G561D突变和ilvB^G235S突变叠加菌株MHZ-1200-5的L-亮氨酸产量为4.7g/L，较leuA^G561D突变菌株MHZ-1200-2的L-亮氨酸生产增加1.35倍，较ilvB^G235S突变菌株MHZ-1200-3的L-亮氨酸生产增加约1.24倍。

综上所述，利用leuA^G561D突变、ilvB^G235S突变对菌株进行改造，有助于增加支链氨基酸特别是L-亮氨酸的产量，对该菌株进行生物保藏，保藏编号为CGMCC NO.13408。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司

<120> 生产L-亮氨酸的菌株和生产L-亮氨酸的方法

<130> MP1623786

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr

1 5 10 15

Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg

20 25 30

Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val

35 40 45

Glu Asp Ile Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr

50 55 60

Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala

65 70 75 80

Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu

85 90 95

Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala

100 105 110

Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Asp Met

115 120 125

Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His

130 135 140

Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile

145 150 155 160

Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe

165 170 175

Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu

180 185 190

Leu Ile Lys Thr Val Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp

195 200 205

Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys

210 215 220

Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn

225 230 235 240

Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn

245 250 255

Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg

260 265 270

Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly

275 280 285

Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu

290 295 300

Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val

305 310 315 320

Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp

325 330 335

Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln

340 345 350

Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr

355 360 365

Ala Phe Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala

370 375 380

Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp

385 390 395 400

Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp

405 410 415

Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser

420 425 430

Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly

435 440 445

Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln

450 455 460

Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp

465 470 475 480

Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln

485 490 495

Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser

500 505 510

Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly

515 520 525

His Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu

530 535 540

Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala Arg Thr Ser

545 550 555 560

Asp Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly

565 570 575

Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser

580 585 590

Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His

595 600 605

Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val

610 615

<210> 2

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60

cgcaatgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120

tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180

aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240

ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300

ggattcaagg aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360

cgtgagatca tcgaaaagga catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420

gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480

gtgcacttct acaactcaac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540

gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactga tcaagaccgt cgctcaggat 600

tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660

gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720

ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780

tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840

ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900

gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960

accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020

cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080

tacggcggcg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140

ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200

gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260

ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320

tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380

accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440

gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500

gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560

ggcaaggacg tcaccgtcga tggccacggc aacggcccac tggctgctta cgccaacgcg 1620

ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccgcacctcg 1680

gacgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740

ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800

aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851

<210> 3

<211> 626

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser

1 5 10 15

Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Gln Ala Ile

20 25 30

Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro

35 40 45

Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys

50 55 60

Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala

65 70 75 80

Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr

85 90 95

Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn

100 105 110

Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Ser

115 120 125

Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr

130 135 140

Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile

145 150 155 160

Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro

165 170 175

Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu

180 185 190

Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val

195 200 205

Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly

210 215 220

Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Ser Gly Val Ile Lys Ala

225 230 235 240

Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu His Thr Gly Ile Pro

245 250 255

Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu

260 265 270

Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly

275 280 285

Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp

290 295 300

Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile

305 310 315 320

Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val

325 330 335

Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu

340 345 350

Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Ser Glu Asp Ile Ser Glu Trp

355 360 365

Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp

370 375 380

Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu

385 390 395 400

Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln

405 410 415

His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr

420 425 430

Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala

435 440 445

Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile

450 455 460

Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala

465 470 475 480

Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn

485 490 495

Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr

500 505 510

Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val

515 520 525

Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala

530 535 540

Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg

545 550 555 560

Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro

565 570 575

Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly

580 585 590

Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala

595 600 605

Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr

610 615 620

Glu Ala

625

<210> 4

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60

gccgcccctg agcggatgac aggtgcacag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120

gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180

tcctccacaa aggtgcgcca cgtcctagtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240

accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccaggc 300

gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360

atcaccggcc aggtcggaag tagcctgctg ggtaccgatg ctttccagga agccgatatc 420

cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc caacgacatt 480

ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg tcctgttcta 540

gtggatatcc ccaaggatgt tcagaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600

gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccgcatgctc gacagattga gcaggctgtc 660

aaactgatcg gtgagtctaa gaagcctgtc ctttacgttg gcagcggcgt tatcaaggct 720

gatgcccacg aagagcttcg tgcgttcgct gagcacaccg gcattccagt tgtcaccaca 780

ttgatggcgc tgggaacctt cccagagtcc cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840

catggcactg tgtccgctgt tggtgcactg cagcgcagcg acctgctgat tgctatcggc 900

tcccgctttg atgaccgcgt caccggtgac gttgacactt tcgcacctga tgccaagatc 960

attcacgccg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020

gtgggcgatg cccgcgaggt tcttgctcgt ctgctcgaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080

gagtctgagg acatctccga gtgggttgac tacctcaagg gcctcaaggc acgtttccca 1140

cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200

tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccagatgtgg 1260

gcagctcagt tcgttgactt cgaaaagcca cgcacctggc tcaactccgg tggactgggc 1320

accatgggct acgcagttcc tgcggctctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380

gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440

gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggtatggtt 1500

cgccaatggc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560

ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620

gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680

ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740

ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800

gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860

gttgaatcga ccgaggcata a 1881

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctctagact ccactgaagt ttcttgggag ca 32

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggctgcttc tgcatcgtcg tccgaggtgc gggcgtgctg g 41

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcacctcgg acgacgatgc agaagcagcc g 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tctgtcgacc cgaccccaac ttcaccacag 30

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctctagatc ctagtgcgcc acgagcag 28

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atcagccttg ataacgccgc tgccaacgta aaggacaggc t 41

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttacgttggc agcggcgtta tcaaggctga t 31

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tctgtcgacg gacagggttt caatgacaaa c 31

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccagcacgcc cgcacctcgt a 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaagcctgtc ctttacgttg gta 23

Claims

1.突变的ilvB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.编码权利要求1所述突变的ilvB蛋白的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.一种重组菌株，其特征在于，表达权利要求2或3所述的DNA分子且表达编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示leuA蛋白突变体的DNA分子；编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示leuA蛋白突变体的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；其起始菌株为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。

5.保藏编号为CGMCC NO.13408的谷氨酸棒杆菌。

6.权利要求4所述的重组菌株或权利要求5所述的谷氨酸棒杆菌在生产L-亮氨酸中的应用。

7.一种生产L-亮氨酸的方法，其特征在于，发酵权利要求4所述的重组菌株或权利要求5所述的谷氨酸棒杆菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为33℃、摇床110rpm，发酵培养基包括：

葡萄糖 60g/L；

(NH4)₂SO₄ 25g/L；

KH₂PO₄ 2.0g/L；

MgSO₄·7H₂O 1.0g/L；

豆粕水解液 10g/L；

CaCO₃ 30g/L。