CN109576253A - 一种提高l-缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体 - Google Patents

一种提高l-缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体 Download PDF

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柳亚迪
胡晓清
丁志祥
朱丽飞
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    • C12N9/88—Lyases (4.)
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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Abstract

本发明公开了一种提高L‑缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体，属于代谢工程领域。本发明通过定点突变的方法，将乙酰羟酸合酶第二底物结合位点附近侧链残基较短的丙氨酸突变成侧链残基长的缬氨酸，改变了乙酰羟酸合酶与底物结合的空间位阻，提高了低pH下，乙酰羟酸合酶的酶活，并在L‑缬氨酸合成的过程中，提高了L‑缬氨酸的产量。用改造后的酶在生成L‑缬氨酸中，可以提高生产效率，减少杂酸。

Description

一种提高L-缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体
技术领域
本发明涉及一种提高L-缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体，属于代谢工程领域。
背景技术
乙酰羟酸合酶(Acetohydroxyacid synthase,AHAS)是催化支链氨基酸(L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸)生物合成途径中的第一个关键性的酶。它是一种焦磷酸硫胺素(Thiamindiphosphate,TPP)依赖酶，在TPP和金属离子和黄素腺嘌呤二核苷酸的辅助作用下，即可以催化两分子的丙酮酸缩合形成乙酰乳酸，即L-缬氨酸和L-亮氨酸的前体，又可以催化一分子的丙酮酸和一分子的2-酮丁酸催化形成2-乙酰-2-羟基丁酸，即使代谢途径走向合成L-异亮氨酸。L-缬氨酸是人体必需氨基酸之一，是合成一种免疫抗生素的重要中间体，在食品，医药等方面有广泛的应用。
乙酰羟酸合酶在自然界中广泛存在，迄今为止研究较多的是大肠杆菌中的三种同工酶AHAS I,II,III，但在谷氨酸棒状杆菌中，只存在一个AHAS。AHAS对第一底物丙酮酸的特异性较高，但对第二底物的选择性较差。因此为了高效专一的合成L-缬氨酸，乙酰羟酸合酶对底物的特异性结合就有着非常重要的意义。
由于L-缬氨酸合成的工业方法中，直接提取法的成本较高，化学合成法的反应条件多变，副产物多，成本也高，所以目前微生物发酵法是目前世界上L-缬氨酸工业化生产的方法。利用基因工程技术将乙酰羟酸合酶克隆到谷氨酸棒状杆菌中，获得了乙酰羟酸合酶的高效表达，利用基因工程菌株提高L-缬氨酸的合成，已成为非常重要的代谢工程改造手段。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种乙酰羟酸合酶突变体，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明的第二个目的是提供编码所述乙酰羟酸合酶突变体的基因，
在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述乙酰羟酸合酶突变体的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括细菌细胞或真菌细胞。
本发明的第五个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌，表达SEQ ID NO.1所示的乙酰羟酸合酶突变体。
在本发明的实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌以C.glutamicum ATCC14067为宿主，以pJYW-4为表达载体。
本发明的第六个目的是提供一种提高乙酰羟酸合酶突变体底物亲和力的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示乙酰羟酸合酶的第138位丙氨酸突变为缬氨酸。
本发明的第七个目的是提供一种产L-缬氨酸的方法，以所述谷氨酸棒杆菌为发酵菌株发酵生产L-缬氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将所述谷氨酸棒杆菌在28～30℃发酵72～108h。
本发明还要求保护所述乙酰羟酸合酶突变体及所述谷氨酸棒杆菌在生产L-缬氨酸或含有L-缬氨酸的产品方面的应用。
有益效果：本发明通过定点突变的方式，将乙酰羟酸合酶分子内部侧链较短的丙氨酸突变为侧链较长的缬氨酸，改变了底物和酶结合的空间位阻，提高了乙酰羟酸合酶底物结合的特异性，pH5.6酶促反应条件下，测得突变体比酶活为179.9μmol/mg/min，较未突变提高了1.28倍。改造后的酶在C.glutamicum ATCC14067，L-缬氨酸产量提高了51.3％，杂酸丙氨酸降低了67.3％。
附图说明
图1谷氨酸棒状杆菌中突变体发酵HPLC检测结果。
具体实施方式
LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L
LBB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、脑心浸液18.5g/L
LBHIS培养基：蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、氯化钠5g/L、脑心浸液18.5g/L、山梨醇91g/L
种子培养基：葡萄糖30g/L、(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 0.4g/L、玉米浆30g/L，pH 7。
发酵培养基：葡萄糖100g/L、(NH4)2SO4 35g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 0.4g/L、FeSO40.04g/L、MnSO4 0.07g/L、玉米浆15g/L，pH 7。
实施例1：乙酰羟酸合酶表达菌株的构建
根据NCBI中谷氨酸棒状杆菌的乙酰羟酸合酶基因序列设计引物，如下
上游引物：CGCGGATCCAGAAGGAGGTATAGTAGTGAATGTGGCAGCTTCTCAACA
下游引物：GGAATTCTTAGATCTTGGCCGGAG
将乙酰羟酸合酶的PCR产物连接到质粒pJYW-4(构建方法公开于Construction ofa novel expression system for use in Corynebacterium glutamicum)后，化转E.coliJM109感受态细胞，在1mL的LB培养基中培养40min，取50μl菌液涂布于含有卡那霉素的固体LB平板，37℃培养10h，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后，提取质粒，酶切验证正确后，转化子由天霖公司测序，从而获得构建重组表达质粒pJYW4-ilvBN。
取500ng重组表达质粒pJYW4-ilvBN电转C.glutamicum ATCC14067感受态细胞后，在1mL的LBHIS培养基中培养1h，取50μl菌液涂布于含有卡那霉素的固体LBB平板，30℃培养48h，挑取阳性菌落划格子到固体LBB平板，30℃培养16h，挑取格子中的菌株转接到5mL液体LBB试管，30℃培养16h后提取质粒，酶切验证正确后，从而获得可以高效表达乙酰羟酸合酶的谷氨酸棒状杆菌ATCC14067pJYW4-ilvBN。
实施例2：底物特异性增强的突变株的获得
利用定点突变，引物设计如下：
F：ATGCTTTCCAGGAAGTCGATATCCGCGGC
R：GCCGCGGATATCGACTTCCTGGAAAGCAT
以已构建的质粒pJYW4-ilvBN为模板，进行PCR，将乙酰羟酸合酶的第138位的丙氨酸突变为缬氨酸。PCR条件为95℃5min，34个循环(95℃5min、55℃30min、68℃10min)，72℃10min，4℃保温。PCR扩增体系：模板0.5μl，上下游引物各0.5μl，5×PS Buffer5μl，dNTPmix 2μl，primeSTAR 0.25μl，ddH2O 16.25μl。取5μl进行核酸电泳验证，剩余加1μlDpnI去除模板，37℃1h，进行化转。转化子由天霖公司进行测序，转化子命名为pJYW4-ilvBN-A138V。通过实例1中电转方法，电转到谷氨酸棒状杆菌ATCC14067，从而获得可以高效表达乙酰羟酸合酶突变体的谷氨酸棒状杆菌ATCC14067pJYW4-ilvBN-A138V。
实施例3：高特异性乙酰羟酸合酶在谷氨酸棒状杆酶活测定
将实施例1和2中测序正确的菌株，和出发菌株ATCC 14067pJYW4，分别在相同条件下划线于固体LBB平板进行菌种活化，30℃培养48h，将活化菌株分别以三个绿豆粒大小的量，转接50mL种子培养基，30℃ 200rpm培养12h，至初始OD562nm为1时转接50mL发酵培养基，30℃200rpm发酵36h，取3mL发酵液离心收集菌体细胞，用磷酸缓冲液重悬至OD562nm为7，用超声破碎仪对细胞进行超声破碎20min，12000rpm离心15min，上清即为乙酰羟酸合酶酶液，利用酶活检测方法，测得pH5.8时，测得突变体比酶活为91.28U/mg，较未突变的出发菌株提高了1.28倍。突变体较未突变前更适合在低pH条件下催化酶促反应。
实施例4：高特异性乙酰羟酸合酶催化谷氨酸棒状杆菌合成L-缬氨酸
将实施例1和2中测序正确的菌株，和对照菌株(携带pJYW-4的菌株的ATCC14067)，分别划线固体LBB平板进行菌种活化，30℃培养48h，将活化菌株以三个绿豆粒大小的量，转接50mL种子培养基，30℃200rpm培养12h，按照初始OD562nm为1转接50mL发酵培养基，30℃200rpm发酵96h。取1mL发酵液，12000rpm离心2min取上清，用三氯乙酸稀释20倍，4℃沉淀4h，12000rpm离心20min，过0.45μm水相针式过滤器，所得反应液采用高效液相色谱法进行检测，使用Hypersil ODS-2 25×4.6mm 5μm色谱柱，色谱柱条件：柱温：40℃；流动相A相：3.01g/L无水乙酸盐，5mL四氢呋喃，200μl三乙胺，pH 7.2；流动相B相：3.01g/L无水乙酸盐200mL，pH7.2，400mL色谱纯甲醇，400mL色谱纯乙腈；进样量：5μl；检测器：DAD；流速0.8ml/min。结果显示，杂酸L-丙氨酸由2.13g/L降低到0.58g/L，降低了2.67倍。同时，原始菌株每克葡萄糖转化为L-缬氨酸的量为0.117g，突变菌株每克葡萄糖转化为L-缬氨酸的量为0.194g，提高了65.8％，L-缬氨酸的产量由5.99g/L提高到了9.06g/L。
对比例1：
按照实施例1～2相同的策略，利用引物F：CCCTGTCCAAGGAAGTTGGCCCCGACGCAA；
R：TTGCGTCGGGGCCAACTTCCTTGGACAGGG对另一与底物结合区域相关的氨基酸位点，第404位氨基酸进行突变，由缬氨基酸突变为丙氨基酸，按照实施例3相同条件进行发酵，结果显示，酶活为79.22U/mg，较未突变的菌株降低了3.6％，每克葡萄糖转化为L-缬氨酸的量为0.104g，降低了11.1％，L-缬氨酸产量为5.71g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高L-缬氨酸合成效率的乙酰羟酸合酶突变体
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 626
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Gln Ala Ile
20 25 30
Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro
35 40 45
Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys
50 55 60
Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn
100 105 110
Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Ser
115 120 125
Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Val Asp Ile Arg Gly Ile Thr
130 135 140
Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile
145 150 155 160
Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro
165 170 175
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu
180 185 190
Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val
195 200 205
Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly
210 215 220
Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala
225 230 235 240
Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu His Thr Gly Ile Pro
245 250 255
Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu
260 265 270
Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly
275 280 285
Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp
290 295 300
Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile
305 310 315 320
Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val
325 330 335
Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu
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Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp
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Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile
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Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala
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Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn
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Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro
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Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala
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Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr
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<210> 2
<211> 1881
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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gccgcccctg agcggatgac aggtgcacag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120
gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180
tcctccacaa aggtgcgcca cgtcctagtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240
accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccaggc 300
gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360
atcaccggcc aggtcggaag tagcctgctg ggtaccgatg ctttccagga agtcgatatc 420
cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc caacgacatt 480
ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg tcctgttcta 540
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gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccgcatgctc gacagattga gcaggctgtc 660
aaactgatcg gtgagtctaa gaagcctgtc ctttacgttg gcggcggcgt tatcaaggct 720
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ttgatggcgc tgggaacctt cccagagtcc cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840
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cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200
tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccagatgtgg 1260
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gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440
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<211> 626
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Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro
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Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu
340 345 350
Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Ser Glu Asp Ile Ser Glu Trp
355 360 365
Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp
370 375 380
Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu
385 390 395 400
Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln
405 410 415
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr
420 425 430
Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala
435 440 445
Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala
465 470 475 480
Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn
485 490 495
Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr
500 505 510
Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val
515 520 525
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala
530 535 540
Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg
545 550 555 560
Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro
565 570 575
Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly
580 585 590
Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala
595 600 605
Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr
610 615 620
Glu Ala
625
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgctttcca ggaagtcgat atccgcggc 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccgcggata tcgacttcct ggaaagcat 29
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccctgtccaa ggaagttggc cccgacgcaa 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttgcgtcggg gccaacttcc ttggacaggg 30

Claims (10)

1.一种乙酰羟酸合酶突变体，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述乙酰羟酸合酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.表达权利要求1所述乙酰羟酸合酶突变体的细胞。
5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，包括细菌细胞或真菌细胞。
6.一种谷氨酸棒杆菌，其特征在于，表达SEQ ID NO.1所示的乙酰羟酸合酶突变体。
7.根据权利要求6所述的一种谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以C.glutamicum ATCC14067为宿主，以pJYW-4为表达载体。
8.一种提高乙酰羟酸合酶突变体底物亲和力的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQID NO.3所示乙酰羟酸合酶的第138位丙氨酸突变为缬氨酸。
9.一种产L-缬氨酸的方法，其特征在于，以权利要求6或7所述的谷氨酸棒杆菌为发酵菌株发酵生产L-缬氨酸。
10.权利要求1所述的乙酰羟酸合酶突变体或权利要求6所述的谷氨酸棒杆菌在生产L-缬氨酸或含有L-缬氨酸的产品方面的应用。
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