CN105734092B - 一种酶法制备d-塔格糖的方法 - Google Patents

一种酶法制备d-塔格糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶法制备D‑塔格糖的方法，包括1)单独构建含有半乳糖醇脱氢酶基因的工程菌以及含有NADH氧化酶基因的工程菌或者构建含有半乳糖醇脱氢酶基因与NADH氧化酶基因共表达的工程菌；2)将构建的工程菌进行发酵获得含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞；3)以含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞或半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的游离酶为催化剂，在弱碱性条件下，NAD+作为氢受体，催化半乳糖醇制备D‑塔格糖。本发明与传统依赖L‑阿拉伯糖异构酶的生产方法相比，其对底物的转化率高(>99.0％)、产物分离容易，并且本发明的方法中所使用的辅酶循环系统辅产物为水，对主产物分离纯化无影响。

Description

一种酶法制备D-塔格糖的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种基于半乳糖醇脱氢酶与NADH氧化酶双酶耦合的D-塔格糖生产方法。
背景技术
D-塔格糖(D-tagatose)为六碳糖，半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体，其甜度为蔗糖的92，但热量仅为蔗糖的38％。近年来，随着生活水平的提高以及糖尿病、肥胖等疾病的普遍化，将D-塔格糖作为功能性甜味剂以取代蔗糖的呼声日益高涨。D-塔格糖是天然存在的一种稀有单糖，在乔木分泌的树胶中，灭菌后的牛奶、热可可、奶酪和芝士等中均有发现，但很难从自然界中大规模直接获取。
目前工业上，D-塔格糖的生产主要采用以碱金属盐作为催化剂的化学法或依赖L-阿拉伯糖异构酶的生物法将D-半乳糖异构为D-塔格糖。Beadle等于1991年发明了利用Ca(OH)2异构D-半乳糖生产D-塔格糖的工艺，其原料D-半乳糖可以通过水解乳糖或者更为廉价的乳清(制作乳制品产生的废料)得到，工艺成本能被市场接受(Beadle J.R.et al.,WO92-12263,1992)。然而，这种方法的副产物众多，下游分离困难，同时伴有严重的废水污染。1993年，Cheetham等发现L-阿拉伯糖异构酶(简称L-AI酶，EC 5.3.1.4)能够催化D-半乳糖生成D-塔格糖；此后的20多年，通过对不同来源的L-AI酶进行异源表达、性质表征以及基因工程改造，学者们也已筛选到了多种适应工业上严苛生产条件的L-AI酶。但该项技术最大的瓶颈问题是：转化率受到化学平衡的限制，D-半乳糖的理论转化率仅在40％左右，需要增加下游分离等配套环节，加大了投入也提高了生产成本。
半乳糖醇脱氢酶(galactitol 2-dehydrogenase,EC 1.1.1.16)，现已发现存在于Aspergillus niger、Burkholderia cepacia、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonassp.等多种微生物中，能以NAD+作为氢受体，将底物半乳糖醇C2位的羟基氧化为酮基生成D-塔格糖。原料半乳糖醇价格低廉，是木糖醇生产过程中的副产品()，但这一过程要实现工业化亟需解决的关键技术难点是：1、开发具有工业化应用前景的半乳糖醇脱氢酶及其工程菌；2、建立适用于产业化放大的辅酶高效原位再生的体系。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种半乳糖醇脱氢酶基因及其工程菌，该基因编码的半乳糖醇脱氢酶能催化半乳糖醇与D-塔格糖相互转化，并将其与NADH氧化酶偶联建立高效的辅酶再生系统应用于D-塔格糖的制备，如图1所示。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种酶法制备D-塔格糖的方法，包括下列步骤：
(1)单独构建含有半乳糖醇脱氢酶基因的工程菌以及含有NADH氧化酶基因的工程菌或者构建含有半乳糖醇脱氢酶基因与NADH氧化酶基因共表达的工程菌；
(2)将上述构建的工程菌进行发酵获得含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞；
(3)以含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞或半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的游离酶为催化剂，在弱碱性条件下，NAD+作为氢受体，催化半乳糖醇制备D-塔格糖。
步骤(1)中所述工程菌通过重组DNA技术构建，获取能以NAD+或NADP+为辅酶，催化半乳糖醇为D-塔格糖的半乳糖醇脱氢酶基因序列，能氧化NADH或NADPH为NAD+或NADP+，产物为水的NADH氧化酶基因序列，构建重组表达载体得到工程菌。
所述表达载体为pUC18、pUC19、pBR322、pET系列，表达系统为大肠杆菌表达系统、酵母表达系统以及丝状真菌表达系统。
本发明优选的半乳糖醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，NADH氧化酶基因在Genbank中的收录号为NC_006449.1。
本发明优选的表达载体为pET-28a(+)，表达系统为大肠杆菌表达系统，表达宿主菌为大杆菌BL21(DE3)。
本发明步骤(2)中所述发酵用的为TB培养基：酵母提取物20～30g/L，蛋白胨10～20g/L，NaCl 5～15g/L，葡萄糖1～3g/L，乳糖2～4g/L，所述发酵温度为20～40℃。
优选的本发明步骤(2)中所述发酵用的为TB培养基：酵母提取物25g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L，乳糖3g/L，所述发酵温度为30℃。
本发明步骤(3)中催化反应体系是1.5～150g/L的半乳糖醇、50U～5KU的半乳糖醇脱氢酶、70U～8KU的NADH氧化酶和0.05～0.2mmol/L的NAD+，在pH7.5～9.0、反应温度45～55℃、搅拌转速180～280rpm以及通气量1～3VVM条件下反应1～24h，得到D-塔格糖转化液。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明利用半乳糖醇脱氢酶能氧化半乳糖醇为D-塔格糖的特性，并首次联合应用NADH氧化酶，开发出一种新的、简便的、易于规模化制备高纯度D-塔格糖的新方法，缩减了下游操作，降低了生产成本。
(2)本发明优选例中提供的是一种高活性、高选择性的半乳糖醇脱氢酶，能高效的氧化半乳糖醇为D-塔格糖，至今未发现编码该半乳糖醇脱氢酶的核苷酸酸序列及氨基酸序列的相关研究报道。
(3)本发明首次联合应用NADH氧化酶，不仅可以实现NAD+再生，且副产物为水，对主产物分离纯化无影响，同时可以促进主反应的平衡向产物D-塔格糖方向移动，转化率可达99％以上。
(4)本发明相较于传统依赖异构酶的生产方法，大大简化了后期分离等操作流程，降低了生产成本，具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1为基于双酶偶联的半乳糖醇到D-塔格糖的生物转化示意图；
图2为塔格糖转化率随反应时间变化过程曲线图；
图3为D-塔格糖及半乳糖醇的HPLC谱图。
具体实施方式
本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：半乳糖醇脱氢酶基因的来源及获得
本实施例提供了编码具有半乳糖醇脱氢酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，该核苷酸分子是由苏州金唯智生物科技有限公司人工合成，具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，它编码SEQ ID NO：2的239个氨基酸的多肽。
实施例2：重组表达载体pET-28a-gdh的构建
用NcoⅠ及BamHⅠ分别酶切pET-28a(购于Novagen默克中国)及含有两个酶切位点的目的基因(实施例1中人工合成获得)，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-28a与目的基因(SEQ ID NO：1所示的基因)用T4-DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行过夜连接，得到重组载体pET-28a-gdh；将10μL的连接产物加入100μL的大肠杆菌BL21感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激90s。冰上放置2min。加入预热的0.45mL SOC培养基(2％(W/V)蛋白胨，0.5％(W/V)酵母浸粉，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖)。220rpm，37℃，1h。将200μL菌液加入含有30μg/mL的卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12～16h，得到重组菌E.coli BL21(含pET-28a-gdh)。
实施例3：NADH氧化酶基因的克隆
Streptococcus thermophiles购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。嗜热链球菌培养用MRS培养基(g·L-1)：牛肉提取物10.0，酵母提取物5.0，酪蛋白胨10.0，葡萄糖5.0，乙酸钠5.0，柠檬酸二胺2.0，吐温80 1.0，磷酸氢二钾2.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，碳酸钙20.0，完全溶解于950mL去离子水中，以5mmol·L-1的NaOH调节pH至6.8，定容1L，110℃，高压蒸汽灭菌15min。
将嗜热链球菌接种于5mL MRS液体培养基中，42℃培养至对数生长期，使用DNAKit(TIANGEN,China)提取嗜热链球菌基因组。构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下：
上游引物(NOX-sense含NcoⅠ)为：
5'-CATGCCATGGATGTCAAAAATCGTAGTTGTCGGTG-3'
下游引物(NOX-anti含BamHⅠ)为：
5'-CGGGATCCTTATTCAGCGGAGATAGCTGCTTTA-3'
所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基因的PCR条件为94℃变性5min，按如下参数循环30次：94℃变性1min，56℃退火60s，72℃延伸1.5min。最后72℃延伸10min。PCR反应所得到的产物分别用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析结果。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，采用TaKaRa公司的DNA纯化回收试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNAPurification)回收目的片段用于重组表达载体pET-28a-nox的构建。
实施例4：重组表达载体pET-28a-nox的构建
用NcoⅠ及BamHⅠ分别酶切pET-28a(购于Novagen默克中国)及所扩增含有两个酶切位点的目的基因(实施例3中通过PCR扩增获得)，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-28a与目的基因(Genbank中的收录号为NC_006449.1)用T4-DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行过夜连接，得到重组载体pET-28a-nox；将10μL的连接产物加入100μL的大肠杆菌BL21感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激90s。冰上放置2min。加入预热的0.45mL SOC培养基(2％(W/V)蛋白胨，0.5％(W/V)酵母浸粉，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖)。220rpm 37℃1h。将200μL菌液加入含有30μg/mL的卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12～16h，得到重组菌E.coli BL21(含pET-28a-nox)。
实施例5：重组菌的发酵及冻干细胞的制备
在100L发酵罐中培养重组菌(实施例2及实施例4中构建的重组菌)。发酵的种子培养基采用LB培养基。发酵培养基为TB培养基：酵母提取物25g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L，乳糖3g/L。发酵培养基灭菌前调节pH至7.2，于110℃灭菌20min。发酵开始时，按1.5％接种量接种OD600约为1.0的新鲜种子液至发酵罐中。控制发酵液的温度在30℃和维持溶氧在10～30％。发酵结束后8000rpm离心10min收集菌体，称量湿细胞重量。将湿细胞用0.85％生理盐水洗涤1次后放置-80℃冰箱中冷冻，再置于冻干机中进行冷冻干燥即可制得冻干细胞。
将冻干细胞用缓冲液充分悬浮，超声破碎后，10000r·min-1，4℃离心10min，取上清。半乳糖醇脱氢酶酶活的测定：酶反应体系包括100mMTris-HCl缓冲(pH 8.5)，1mM NAD+，50mM半乳糖醇，45℃，340nm处测定吸光值的上升。酶活定义为每分钟内生成1μmol NADH所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示，对照菌E.coliBL21(含pET-28a)的比酶活为0，而重组菌E.coli BL21(含pET-28a-gdh)的比酶活为20U/mg。
NADH氧化酶酶活的测定：酶反应体系包括100mM Tris-HCl缓冲(pH 8.5)，1mmol·L-1NADH，45℃，340nm处测定吸光值的下降。一个酶活力单位(U)定义为每分钟消耗1μmolNADH所需要的酶量。蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示，对照菌E.coli BL21(含pET-28a)的比酶活为0，而重组菌E.coli BL21(含pET-28a-nox)的比酶活为27U/mg。
实施例6
取实施例5中冻干细胞各10g，悬浮于200mL的pH 8.5Tris-HCl缓冲中。使用高压均质机(-20℃、8.0×107Pa)对细胞进行破碎。细胞破碎液经4℃、10000r/min离心30min后，弃沉淀，上清即为含有半乳糖醇脱氢酶5KU及NADH氧化酶8KU的粗酶液。加入塔格糖150g/L，NAD+0.1mmol/L，在反应温度45℃，搅拌转速280rpm以及通气量3VVM的条件下反应24h，并在0，1，3，6，9，12和24小时取样。样品在95℃中加热5min，10000r·min-1，离心5min取上清进行HPLC检测半乳糖醇及D-塔格糖的含量。在双酶耦合的反应体系中，D-塔格糖浓度随时间不断增加，24h后浓度达到150g/L，并且转化率大于99％。D-塔格糖转化率随反应时间变化的曲线如图2所示。
产物的检测方法：
采用高效液相色谱(HPLC)测定D-半乳糖醇及D-塔格糖。高效液相色谱仪采用美国戴安(DIONEX)公司UltiMate3000，色谱柱为美国Bio-Rad公司Aminex HPX-87H column(300x 7.8mm)色谱柱；流动相为5mM H2SO4；流速0.6mL/min；柱温为65℃；采用示差检测器。液相谱图见图3。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种酶法制备D-塔格糖的方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)单独构建含有半乳糖醇脱氢酶基因的工程菌以及含有NADH氧化酶基因的工程菌或者构建含有半乳糖醇脱氢酶基因与NADH氧化酶基因共表达的工程菌；
(2)将上述构建的工程菌进行发酵获得含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞；
(3)以含有半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的整细胞或半乳糖醇脱氢酶、NADH氧化酶的游离酶为催化剂，在弱碱性条件下，NAD+作为氢受体，催化半乳糖醇制备D-塔格糖；
步骤(3)中催化反应体系是1.5～150g/L的半乳糖醇、50U～5KU的半乳糖醇脱氢酶、70U～8KU的NADH氧化酶和0.05～0.2mmol/L的NAD+，在pH7.5～9.0、反应温度45～55℃、搅拌转速180～280rpm以及通气量1～3VVM条件下反应1～24h，得到D-塔格糖转化液。
2.根据权利要求1所述的酶法制备D-塔格糖的方法，其特征在于步骤(1)中所述工程菌通过重组DNA技术构建，获取能以NAD+或NADP+为辅酶，催化半乳糖醇为D-塔格糖的半乳糖醇脱氢酶基因序列，能氧化NADH或NADPH为NAD+或NADP+，产物为水的NADH氧化酶基因序列，构建重组表达载体得到工程菌。
3.根据权利要求2所述的酶法制备D-塔格糖的方法，其特征在于所述表达载体为pUC18、pUC19、pBR322或pET系列，表达系统为大肠杆菌表达系统、酵母表达系统或丝状真菌表达系统。
4.根据权利要求1所述的酶法制备D-塔格糖的方法，其特征在于所述半乳糖醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述NADH氧化酶基因在Genbank中的收录号为NC_006449.1。
5.根据权利要求4所述的酶法制备D-塔格糖的方法，其特征在于所述表达载体为pET-28a(+)，所述表达系统为大肠杆菌表达系统，表达宿主菌为大杆菌BL21(DE3)。
6.根据权利要求1至5任一所述的酶法制备D-塔格糖的方法，其特征在于步骤(2)中所述发酵用的为TB培养基：酵母提取物20～30g/L，蛋白胨10～20g/L，NaCl 5～15g/L，葡萄糖1～3g/L，乳糖2～4g/L，所述发酵温度为20～40℃。
7.根据权利要求6所述的酶法制备D-塔格糖的方法，其特征在于步骤(2)中所述发酵用的为TB培养基：酵母提取物25g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L，乳糖3g/L，所述发酵温度为30℃。
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